專利名稱：一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純l-乳酸的工程菌及其構(gòu)建的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵及基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種乙酸代謝途徑缺失的、可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
乳酸在食品、醫(yī)藥、化妝品、皮革制造業(yè)、紡織工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。乳酸還是一種重要的化工平臺化合物。并且由于近年對可生物降解的聚乳酸的關(guān)注，乳酸的廉價獲得再次引起研究者的重視。相比于化學(xué)合成方法，微生物發(fā)酵生成乳酸具有低溫、低能耗禾口低成本等優(yōu)點(Datta, R. and Μ. Henry.，Lactic acid :recent advances in products,processes and technologies—a review. Journal of Chemical Technology and Biotechnology, 2006,81 (7) :1119-1129)。且生物發(fā)酵所獲得的多為光學(xué)純L型或D型乳酸，而L型乳酸的光學(xué)純度對制備高品質(zhì)聚乳酸是至關(guān)重要的。隨著化石能源危機的不斷加重，研究者希望以廉價生物質(zhì)能源如糖蜜、淀粉或纖維素類廢棄物為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，從而進(jìn)一步降低乳酸發(fā)酵的生產(chǎn)成本。上述的各類廉價生物質(zhì)能源，因為纖維類生物質(zhì)具有廉價、來源廣泛和不會影響糧食安全等優(yōu)點，而更加受至IJ研究者的青昧(Tan，T. W. ，F(xiàn). Shang， et al. Current development of biorefinery in China. Biotechnology Advances, 2010, 28 (5) :543-555)。纖維素類生物質(zhì)主要由葡萄糖和木糖構(gòu)成。但傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵菌株通常不能利用木糖為碳源發(fā)酵。因此如何獲得可有效利用木糖發(fā)酵高產(chǎn)乳酸的菌株，是纖維素類生物質(zhì)生產(chǎn)乳酸工業(yè)中至為關(guān)鍵的一點(Wang, L. Μ. , B. Zhao, etal. , Efficient production of L-Iactic acid from corncob molasses， a waste by-productin xylitol production， by a newly isolated xylose utilizing Bacillus sp strain. Bioresource Technology,2010，101 (20) :7908-7915)。 一些如 Bacillus sp. (Wang, LM.，B. Zhao, et al.，Efficient production of L-Iactic acid from corncob molasses, awaste by-product in xylitol production, by a newly isolated xylose utilizing Bacillussp strain. Bioresource Technology,2010， 101 (20) :7908-7915), Lactobacilluspentosus, Lactobacillus brevis and Pichia stipitis (Ilmen，M.，K. Koivuranta, et al.，Efficient production of L-Iactic acid from xylose by Pichia stipitis. Applied AndEnvironmental Microbiology,2007， 73 (1) 117-123)Rhizopus (Skory, C. D. Lacticacid production by Rhizopus oryzae transformants with modified lactatedehydrogenase activity. Applied Microbiology and Biotechnology,2004,64(2) :237-242. Skory, C. D. Isolation and expression of lactate dehydrogenase genes fromRhizopus oryzae. Applied And Environmental Microbiology，2000，66 (6) :2343-2348) , Saccharomyces(Hetenyi, K. ， A. Nemeth， et al. Role of pH—regulation inlactic acid fermentation :Second steps in a process improvement. ChemicalEngineering And Processing，2011，50 (3) :293-299)等相繼被才艮道能夠以木糖為底物發(fā)酵生產(chǎn)乳酸。嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)具有可減少原料前處理過程纖維素酶添加量、能夠有效利用木糖、代謝產(chǎn)物簡單等優(yōu)點，而受到研究者白勺青 1 (0-Thong, S.，P. Prasertsan, et al. Thermophilic fermentativehydrogen production by the newly isolated Thermoanaerobacteriumthermosaccharolyticum PSU-2. International Journal of Hydrogen Energy,200833(4) :1204-1214., Sommer, P. , T. Georgieva, et al. Potential for using thermophi1icanaerobic bacteria for bioethanol production from hemicellulose. Biochem ical SocietyTransactions, 2004,32 :283-289. , Li, S. , C. Lai, et al. High efficiency hydrogenproduction from glucose/xylose by the ldh-deleted Thermoanaerobacterium strain. Bioresource Technology，2010，101 (22) :8718-8724.)。 特另Ij 的，因 Thermoanaerobacterium aotearoence S⑶T27的最適發(fā)酵溫度為55°C，能夠抑制絕大部分常溫微生物的生長，因此該菌株可對發(fā)酵工藝過程無菌要求不高，能夠大幅度降低生產(chǎn)成本。該菌株的野生型液相代謝產(chǎn)物包括乳酸、乙酸和乙醇，雖然乳酸為其主要代謝產(chǎn)物，但乳酸轉(zhuǎn)化率尚有提高空間。

發(fā)明內(nèi)容
為了克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌。本發(fā)明的另一目的在于提供上述可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌的構(gòu)建方法，該方法的關(guān)鍵是將嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacteriumaotearoence SCUT27)丙酮酸代謝生成乙酸的代謝支路阻斷，實現(xiàn)碳代謝流重新分配，促進(jìn)L-乳酸大幅度積累。本發(fā)明的再一目的在于提供上述可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌的用途。本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，是將嗜熱厭氧桿菌 (Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)丙酮酸代謝生成乙酸過程的兩個關(guān)鍵
Sl-ZiIitBI (phosphotransacetylase,pta)禾口乙01 (acetatekinase,ack) M
基因敲除(knock-out)后得到的。一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，具體是由以下步驟構(gòu)建得到的(1)合成卡那抗性基因(aph基因)，并將其插入到大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體中；(2)PCR擴增乙酸激酶編碼基因的某一段序列，為pta-up序列；再將pta-up序列插入到步驟(1)的已插入卡那抗性基因的大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體中，構(gòu)建得到攜帶有乙酸激酶基因部分同源序列的自殺載體1 ；(3) PCR擴增磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因的某一段序列，為ack-down序列；再將 ack-down序列插入到自殺載體1中，獲得攜帶有磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶部分同源序列的
4自殺載體PPuKAd ；(4)將自殺載體pPuKAd轉(zhuǎn)化入嗜熱厭氧桿菌，并經(jīng)抗性篩選后得到可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌。根據(jù)同源重組的原理，所述步驟( 和(3)中擴增磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶的哪一部分序列并不重要，只要是其同源序列即可。優(yōu)選地，步驟(2)所述的某一段序列為乙酸激酶編碼基因的N端部分序列；步驟C3)所述的某一段序列為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因的C 端部分序列；步驟⑴所述的大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體為pUC18、pUC19、pBlUeSCript II SK(+) (Li, S.Yang XF. , et al. Engineering of a thermophilic anaerobicbacterium to produce optically pure L-Iactic acid through non-sterilized fermentation, unpublished results)>pSGD8(Shaw,A. J. ,K. K. Podkaminer,et al. Metabolicengineering of a thermophilic bacterium to produce ethanol at high yield. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2008,105 (37) 13769-13774)或 pSGD9 (US20100015678A1)，優(yōu)選 pBluescriptll SK (+)；步驟(4)所述轉(zhuǎn)化的方法為熱激法、電轉(zhuǎn)化法、結(jié)合轉(zhuǎn)化、雙親本雜交等現(xiàn)有方法；步驟(4)所述的嗜熱厭氧桿菌為能夠發(fā)酵代謝生成乙酸和乳酸的革蘭氏陽性菌， 優(yōu)選嗜熱厭氧桿菌屬Thermoanaerobacterium sp.或梭菌屬Clostridium sp.；特另Ij優(yōu)選嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)。上述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌可應(yīng)用于發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純 L-乳酸。本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點及效果1、本發(fā)明利用同源重組的方法，使丙酮酸產(chǎn)乙酸的代謝支路關(guān)鍵酶磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶和乙酸激酶沉默，從而得到高產(chǎn)乳酸的工程菌。2、用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)，不產(chǎn)生乙酸，碳代謝流進(jìn)行了重新分配，促進(jìn)了目標(biāo)產(chǎn)物乳酸的大量積累。而且由于副產(chǎn)物種類減少，也可簡化后提取工藝。3、將本發(fā)明的工程菌分別以50g/L葡萄糖或木糖為底物，按常規(guī)發(fā)酵72小時， 乳酸濃度可達(dá)47g/L和38g/L，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)0. 94g/g和0. 76g/g，L-乳酸的光學(xué)純度達(dá) 99. 5%以上。當(dāng)以50g/L的葡萄糖和木糖混合糖(1 1)為底物，培養(yǎng)基不經(jīng)滅菌直接發(fā)酵72h，乳酸產(chǎn)量可達(dá)45g/L，底物轉(zhuǎn)化率達(dá)0. 89g/g。4、本發(fā)明對在利用纖維素類生物質(zhì)發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)中降低生產(chǎn)成本發(fā)揮重要作用，具有廣闊的應(yīng)用前景。


圖1為乙酸代謝支路阻斷原理示意圖；其中，A為pta/ack基因簇示意圖，pta/ack 基因簇l_904bp為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(phosphotransacetylase，pta)編碼基因，pta/ack基因簇1005_2217bp為乙酸激酶(acetate kinase,ack)編碼基因，用于同源重組的兩個同源臂 pta-up和ack-down分別位于基因簇的_275_904bp和1358_1984bp，圖中probe所示位置為Southern blotting過程中使用的探針位置，位于pta/ack基因簇389_874bp ；B為同源重組載體PPuKAd示意圖，在同源臂pta-up和ack-down之間插入卡那抗性基因表達(dá)盒。圖2為實施例1工程菌PCR擴增產(chǎn)物電泳圖；泳道M :1 1Λ DNA marker,泳道1 野生型菌株；泳道2:工程菌。圖3為實施例1工程菌Southern blotting電泳圖；泳道1 野生型菌株；泳道2
工程菌。
具體實施例方式下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實施方式不限于此。下列實施例中有未注明具體條件的實驗方法，則是按照常規(guī)的分子克隆手冊所述的條件進(jìn)行操作。實施例1一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌的構(gòu)建一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌的構(gòu)建是通過在編碼乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶的基因中間，插入耐熱的卡那抗性編碼基因，實現(xiàn)乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因的敲除，從而阻斷乙酸代謝支路，且可通過卡那抗性篩選，初步鑒定陽性重組子。具體阻斷過程原理如圖1所示，具體操作包括以下步驟(1)構(gòu)建攜帶有卡那抗性表達(dá)盒的大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體 pBlue-aph 根據(jù)卡那抗性基因(GenBank :V01547)進(jìn)行全基因合成aph基因，插入到大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體pBluescript II SK(+)的EcoR I和BamHI位點中。(2)構(gòu)建攜帶有乙酰激酶同源序列的pBlue-pta-aph載體以嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)基因組DNA(SEQ ID No. 5)為模板，PCR擴增乙酰激酶編碼基因(GenBank :HM802208,pta)同源序列約1. 2kb。 引物序列如下Primer 1(正向引物)5' -AACTAGGTACCAGCGCTGTACGAAATTGCCACTC-3 ‘。下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Kpn I識別位點。Primer 2 (反向引物)5' -GTACTGAATTCCACCCATTCCTTGTGTTATAGG-3‘下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶EcoR I識別位點。將上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)Kpn I和EcoR I雙酶切后與同樣雙酶切的pBlue-aph載體連接，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR和酶切驗證陽性克隆，獲得pBlue-pta-aph載體。(3)構(gòu)建同時攜帶乙酰基酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶同源序列的重組載體PPuKAd以嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)基因組DNA(SEQ ID No. 5)為模板，PCR擴增酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因(GenBank :HM802208，ack)同源序列約 0.61Λ。引物序列如下Primer 3 (正向引物)5' -TGAGCGGATCCGCATAGAATTAGCTCCACTGC-3 ‘。下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶BamH I識別位點。Primer 4(反向引物)5' -TGACTGCGGCCGCCGACGCCTCCCATAGCTG-3‘。下劃線堿基為限制性內(nèi)切酶Not I識別位點。
將上述PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)BamH I和Not I雙酶切后與同樣雙酶切的pBlue-pta-aph 載體連接，然后轉(zhuǎn)入到大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，挑取轉(zhuǎn)化子，通過菌落PCR和酶切驗證陽性克隆，獲得PPuKAd載體。(4)將構(gòu)建好的pPuKAd載體，通過電轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入到Thermoanaerobacterium aotearoence S⑶T27感受態(tài)細(xì)胞中，涂布在含有50 μ g/ml的卡那抗生素平板培養(yǎng)基上，在 50°C條件下培養(yǎng)2-3天。長出菌落后，通過PCR和Southern blotting雜交鑒定陽性克隆， 鑒定方法和結(jié)果如下A、PCR 鑒定提取步驟(4)卡那抗生素平板上菌落的基因組DNA，以引物2(SEQ ID No. 2)和引物3(SEQ ID No.3)作為擴增引物。對于野生型菌株(即Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)，PCR產(chǎn)物片段約為2. 21Λ，而乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因敲除獲得的重組菌的PCR產(chǎn)物片段應(yīng)為3. 31Λ。PCR結(jié)果如圖2所示。B、Southern blotting提取野生型(即Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)和工程菌(即步驟(4)卡那抗生素平板上菌落)的基因組DNA，用I^st I酶切后，與探針(SEQID No. 5)雜交 (原理如圖1所示)。野生型菌株雜交顯色后在1. 2kb處有條帶，而突變株雜交顯色后條帶大小應(yīng)為2. 21Λ (如圖3所示)。PCR和Southern blotting實驗均表明，獲得的工程菌中，乙酸激酶和磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶基因被成功敲除，所得陽性克隆即為可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌。IL卡那抗生素平板培養(yǎng)基含有NH4Cl (氯化銨)0. 90g、NaCl (氯化鈉)0. 90g、 MgCl2 ·6Η20(氯化鎂)0. 40g、KH2PO4 (磷酸二氫鉀)0. 75g、K2HPO4 (磷酸氫二鉀)1. 50g、胰酶 2. 00g、酵母粉1. 00g、微量元素溶液1. 00ml、FeCl3 · 6H20(氯化鐵)2. 50mg、木糖5. 00g、鹽酸-半胱氨酸0. 75g、Resazurin (刃天青)0. 50mg、瓊脂IOg,余量為水，調(diào)pH至6. 5。IL微量元素溶液含有25 % HCl (鹽酸)10ml、FeCl2 · 4H20(氯化亞鐵)1. 5g、 ZnCl2 (氯化鋅)0. 07g、MnCl2 · 4H20 (氯化錳)0. lg、H3BO3 (硼酸)0. 006g、CoCl2 · 6H20 (氯化鈷)0. 19g、CuCl2 · 2H20 (氯化銅)0. 002g、NiCl2 · 6H20 (氯化鎳)0. 024g、Na2MoO4 · 2H20 (鉬酸鈉)0. 036g，余量為水。實施例2可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌與其野生型乳酸產(chǎn)量對比(1)種子培養(yǎng)將實施例1的工程菌接入到裝有IOml種子培養(yǎng)基的20ml血清瓶中，55°C、150r/ min培養(yǎng)12h，使OD值達(dá)到0. 8以上。以1 5比例接種到裝有50ml種子培養(yǎng)基的125ml 血清瓶中，55°C、150r/min培養(yǎng)12h，使OD值達(dá)到1. O以上。(2)搖瓶培養(yǎng)按10%接種量將步驟(1)培養(yǎng)的種子液接入裝有50ml發(fā)酵培養(yǎng)基的125ml血清瓶中，充氮氣至壓力為0.04MPa。以10g/L木糖為底物連續(xù)培養(yǎng)Mh。野生型菌株的操作同上。經(jīng)HPLC檢測代謝產(chǎn)物，比較結(jié)果如表1所示。結(jié)果表明，工程菌培養(yǎng)液中檢測到乙酸，而乳酸產(chǎn)量較野生型菌株提高了 1.8倍。
表1 T. aotearoense SCUT27乙酸代謝支路陽斷前后代謝產(chǎn)物變化
權(quán)利要求
1.一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于是由以下步驟構(gòu)建得到(1)合成卡那抗性基因，并將其插入到大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體中；(2)PCR擴增乙酸激酶編碼基因的某一段序列，為pta-up序列；再將pta-up序列插入到步驟(1)的已插入卡那抗性基因的大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體中，構(gòu)建得到自殺載體1;(3)PCR擴增磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因的某一段序列，為ack-down序列；再將ack-down 序列插入到自殺載體1中，獲得自殺載體PPuKAd ；(4)將自殺載體pPuKAd轉(zhuǎn)化入嗜熱厭氧桿菌，并經(jīng)抗性篩選后得到可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于 步驟( 所述的某一段序列為乙酸激酶編碼基因的N端部分序列。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于 步驟C3)所述的某一段序列為磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因的C端部分序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于步驟(1)所述的大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體為PUC18、pUC19、pBluescript II SK⑴、pS⑶8或pS⑶9。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于 步驟(1)所述的大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體為PBluescript IISK(+)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于 步驟(4)所述轉(zhuǎn)化的方法為熱激法、電轉(zhuǎn)化法、結(jié)合轉(zhuǎn)化或雙親本雜交。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于 步驟(4)所述的嗜熱厭氧桿菌為嗜熱厭氧桿菌屬ThermoanaercAacterium sp.或梭菌屬 Clostridium sp.。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌，其特征在于步驟(4)所述的嗜熱厭氧桿菌為嗜熱厭氧桿菌(Thermoanaerobacterium aotearoence SCUT27)。
9.權(quán)利要求1-8任一項所述的可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌在發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用，該工程菌由以下步驟構(gòu)建得到合成卡那抗性基因，并將其插入到大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體中；擴增乙酸激酶編碼基因的某一段序列，為pta-up序列；再將pta-up序列插入到大腸桿菌和嗜熱厭氧桿菌穿梭載體中，構(gòu)建得到自殺載體1；擴增磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶編碼基因的某一段序列，為ack-down序列；再將ack-down序列插入到自殺載體1中，獲得自殺載體pPuKAd；將自殺載體pPuKAd轉(zhuǎn)化入嗜熱厭氧桿菌，并經(jīng)抗性篩選后得到可利用木糖發(fā)酵生產(chǎn)光學(xué)純L-乳酸的工程菌。用本發(fā)明的工程菌進(jìn)行乳酸的發(fā)酵生產(chǎn)，不產(chǎn)生乙酸，碳代謝流進(jìn)行了重新分配，促進(jìn)了目標(biāo)產(chǎn)物L(fēng)-乳酸的大量積累，所得L-乳酸的光學(xué)純度達(dá)99.5％以上。
文檔編號C12P7/56GK102433293SQ20111045368
公開日2012年5月2日 申請日期2011年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月29日
發(fā)明者于平儒, 李爽, 楊曉鋒, 王小寧, 王菊芳 申請人:華南理工大學(xué)