專利名稱：增強(qiáng)子Hr3的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物基因工程，特別涉及家蠶的轉(zhuǎn)基因領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著21世紀(jì)生物工程以及基因工程的迅速發(fā)展，人們對醫(yī)用、藥用、食用、美容、 保健等各種用途的功能性蛋白需求量日益增大，依靠天然來源的蛋白質(zhì)提取和生產(chǎn)已無法滿足快速增長的市場需求。建立和完善各種高效的原核和真核表達(dá)系統(tǒng)，并利用菌株、細(xì)胞和昆蟲等作為宿主生物反應(yīng)器，是實(shí)現(xiàn)低成本、規(guī)?；a(chǎn)具有生物學(xué)活性的重組外源蛋白的有效和可持續(xù)方法，并成為當(dāng)今世界研究的熱點(diǎn)。利用中國倉鼠卵巢細(xì)胞作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)外源蛋白是目前最為標(biāo)準(zhǔn)的表達(dá)模式，但其運(yùn)營成本和對環(huán)境的要求極為苛刻， 嚴(yán)重限制了其大規(guī)模推廣應(yīng)用。為了建立低成本、規(guī)?；?、安全可持續(xù)的高效生產(chǎn)外源蛋白的生物工廠，自2000年以來，科研人員開始嘗試?yán)棉D(zhuǎn)基因生物，如哺乳動物、鳥類、昆蟲以及植物的器官作為生物反應(yīng)器來生產(chǎn)重組外源蛋白。家蠶以泌絲著稱，是最早被人類所完全馴化利用的經(jīng)濟(jì)動物(昆蟲)之一。絹絲腺是合成、分泌蠶絲蛋白的唯一器官，為整個蠶絲業(yè)的生物學(xué)基礎(chǔ)。經(jīng)過數(shù)千年的人工馴化， 家蠶的絹絲腺具備了超強(qiáng)的蛋白質(zhì)合成與分泌能力，一頭體重5g左右家蠶能合成分泌約 0. 5g蠶絲蛋白，為目前已知昆蟲之最。蠶絲蛋白主要由絲素蛋白(fibroin)和覆被在其外層的絲膠蛋白(sericin)構(gòu)成絲素蛋白是蠶絲的主體，約占75%，由蠶的后部絲腺合成，包括fib-H鏈、fib-L鏈和P25三種主要組分，均不溶于水；其余為絲膠蛋白，約占25%，由蠶的中部絲腺合成，包括絲膠1 (5ferici/ l )、絲膠2 {Sericin2)和絲膠3 {Sericin ,)三種主要組分，其中又以絲膠1蛋白含量最高，均可溶于水。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展，家蠶絹絲腺的高效合成與分泌絲蛋白這一特征，以及所具備的糖基化、甲基化等對外源蛋白保持活性極其重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾加工能力，飼養(yǎng)成本低，可工廠化生產(chǎn)，對人畜安全等特點(diǎn)，使其成為理想的生物反應(yīng)器模型，備受各國研究人員關(guān)注并競相開發(fā)利用。2000年，田村等人利用pBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)顯微注射家蠶蠶卵并獲得了穩(wěn)定遺傳的轉(zhuǎn)基因家蠶；2003年，夏慶友等人完成了家蠶基因組計(jì)劃，家蠶絲腺中涉及絲蛋白合成的重要編碼基因如絲素重鏈(FibH chain)基因、絲素輕鏈(FibL chain)基因、絲膠 I(Sericinl)基因、絲膠2 (Sericin2)基因、絲膠3 (Sericin3)基因以及P25基因等的啟動子調(diào)控元件被鑒定和克隆，這些基礎(chǔ)研究結(jié)果使得利用轉(zhuǎn)基因家蠶組織特異表達(dá)系統(tǒng)，在絲腺中大規(guī)模生產(chǎn)重組外源蛋白成為可能。近年來，國內(nèi)外利用PBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)以及家蠶組織特異啟動子元件在絲腺中嘗試表達(dá)了多個外源蛋白，包括在后部絲腺表達(dá)了絲素重鏈融合的EGFP(Zhao et al. 2010)、貓干擾素(Kurihara et al. 2007)、 蜘蛛絲牽引蛋白(Zhu et al. 2010)、人III型膠原蛋白的部分肽段(Tomita et al. 2003)、 增強(qiáng)型紅色熒光蛋白(Tomita et al. 2003)，絲素輕鏈融合的羥基脯氨酸膠原部分肽段 (Adachi et al. 2006)、成纖維細(xì)胞生長因子(Hino et al. 2006)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Shimizu et al. 2007)、部分膠原蛋白月太段(Yanagisawa et al. 2007)，以及 P25 融合的紅色熒光蛋白(Royer et al. 200 等；在中部絲腺表達(dá)了人血清白蛋白(Ogawa et al. 2007)、增強(qiáng)型綠色熒光蛋白(Tomita et al. 2007)、鼠單克隆抗體(Iizuka et al. 2009)、人膠原蛋白α鏈基因(Adachi et al. 2010)以及可溶性GM-Csf受體α (Urano et al. 2010)等。但總體上，上述研究成果的產(chǎn)業(yè)化推進(jìn)頗為困難，主要原因在于在絲素中生產(chǎn)的外源蛋白雖具有較高的含量，但重組蛋白極難純化且易破壞其生物活性；在絲膠中生產(chǎn)的外源蛋白雖較容易純化，但利用現(xiàn)有絲膠表達(dá)系統(tǒng)獲得的重組蛋白含量極低而難以實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。因此，針對外源蛋白表達(dá)合成的各個關(guān)鍵環(huán)節(jié)，改造并建立新的高效、穩(wěn)定的表達(dá)系統(tǒng)，并通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)實(shí)現(xiàn)外源蛋白的高效生產(chǎn)，是解決上述瓶頸的根本出路。 也是今后家蠶生物反應(yīng)器開發(fā)的核心所在。外源基因在真核細(xì)胞、組織中的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控(包括mRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)和穩(wěn)定性調(diào)控)、翻譯效率、翻譯后調(diào)控以及蛋白分泌等一系列調(diào)控，這些調(diào)控是由啟動子調(diào)控區(qū)、外源基因ORF中的順式作用元件與宿主體內(nèi)的反式調(diào)控因子協(xié)同完成，該過程極其精密和復(fù)雜。另一方面，基于PBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的家蠶轉(zhuǎn)基因是由PBac攜帶外源基因以隨機(jī)方式插入整合至家蠶基因組中，這種隨機(jī)插入往往會使外源基因受到基因組插入位點(diǎn)位置效應(yīng)的影響，使得外源基因的表達(dá)量降低。因此，我們需要對外源基因的表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行改造，從轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄水平、翻譯效率以及轉(zhuǎn)基因mRNA的穩(wěn)定性三個方面進(jìn)行系統(tǒng)性的優(yōu)化，以實(shí)現(xiàn)外源基因的高效和穩(wěn)定表達(dá)，建立高效穩(wěn)定的家蠶轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，以期利用該系統(tǒng)規(guī)?；a(chǎn)具有高附加值的重組外源蛋白，打破家蠶只能作為傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)的壁壘，為家蠶新型生物產(chǎn)業(yè)的開發(fā)提供可靠技術(shù)體系保障。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種增強(qiáng)子及其制備方法和應(yīng)用，其可以提高啟動子的活性及轉(zhuǎn)錄水平。另外，本發(fā)明還提供含有所述增強(qiáng)子的重組表達(dá)載體，其無論是在轉(zhuǎn)錄水平，還是mRNA的翻譯效率，或是mRNA在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸與定位及其穩(wěn)定性等方面均有所提
尚ο上述目的的實(shí)現(xiàn)是通過如下技術(shù)手段獲得的1)從家蠶桿狀病毒BmNPV株系 (重慶株)中克隆獲得的增強(qiáng)子ArJ，增強(qiáng)子通過提高啟動子的活性從而提高外源基因的轉(zhuǎn)錄水平；2)克隆兩種含有不同長度5’ UTR的家蠶肌動蛋白4基因啟動子(BmAct4-57， BmAct4-114)，以提高mRNA的翻譯效率；3)從家蠶絲腺三個重要基因fibH,fibL和Serl基因中克隆獲得的3’ UTR序列，以提高mRNA在細(xì)胞內(nèi)的運(yùn)輸與定位及其穩(wěn)定性。4)構(gòu)建基于家蠶肌動蛋白4啟動子的熒光素酶報告基因HUO表達(dá)檢測系統(tǒng)，在細(xì)胞水平對上述功能元件進(jìn)行鑒定，確定促進(jìn)外源基因表達(dá)的最佳組合。5)利用最佳組合的功能元件構(gòu)建轉(zhuǎn)基因家蠶絲膠1表達(dá)系統(tǒng)，并制備轉(zhuǎn)基因家蠶，從轉(zhuǎn)基因水平評價該表達(dá)系統(tǒng)用于表達(dá)外源重組蛋白的效率。具體技術(shù)方案為
增強(qiáng)子Hr3，由如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列組成。增強(qiáng)子Hr3的制備方法，以BmNPV基因組作為模板，涉及上游引物 5'catgccatggaaaaagaagccgtgccca 3',^Φ] 5'catgccatggcagcgtcgtgaaaagagg 3，，利用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30秒，54°C退火30秒，72 °C延伸45秒，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸10分鐘，得增強(qiáng)子hr3。所述的增強(qiáng)子Hr3在家蠶中制備重組外源蛋白的應(yīng)用。含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述增強(qiáng)子Hr3通過其NcoI酶切位點(diǎn)與不含增強(qiáng)子的載體的啟動子上游的NcoI酶切位點(diǎn)連接，共同組成含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體。所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體的終止子如 SEQ ID NO:3 所示。所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體的終止子如 SEQ ID NO:5 所示。所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體的終止子如 SEQ ID NO:6 所示。所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體具體為ρ Bac [3xp3EGFP-hr3PserlspRedsv40]，其中，含增強(qiáng)子 Hr3、啟動子 Pserlsp (如 SEQ ID NO: 10所示)、紅色熒光蛋白基因Red和終止子SV40的表達(dá)框通過ASCI連接于轉(zhuǎn)座子 pBac [3xp3EGFPaf]轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體上。所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體具體為pBac [ 3xp3EGFP-hr3PserlspRedsv40]，具體為將 pBac [3xp3EGFP_hr3PserlspRedsv40]中終止子 SV40被如SEQ ID NO:6所示的SerlPA置換。所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:2所
7J\ ο所述的含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID N0:3所
7J\ ο有益效果在于
本發(fā)明是關(guān)于利用一系列具有提高基因表達(dá)量功能的調(diào)控元件對轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體進(jìn)行系統(tǒng)的優(yōu)化改造，構(gòu)建高效穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)系統(tǒng)，提高外源基因在轉(zhuǎn)基因家蠶中的表達(dá)水平。轉(zhuǎn)基因在真核生物體內(nèi)基因的表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄、翻譯、以及翻譯后修飾等一系列復(fù)雜的調(diào)控；同時，作為一種外在性的基因表達(dá)產(chǎn)物，為了減少因外源基因的表達(dá)而造成對宿主自身的不良影響，宿主自身會抑制外源基因的表達(dá)，導(dǎo)致重組蛋白在轉(zhuǎn)基因家蠶中的表達(dá)水平很低，嚴(yán)重制約了其實(shí)用化開發(fā)。本發(fā)明針對上述問題對表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了系統(tǒng)的改造， 具有以下優(yōu)點(diǎn)①本發(fā)明首先利用家蠶肌動蛋白4基因iBmActi0n4、啟動子BmA4_57建立了一種能在昆蟲細(xì)胞中進(jìn)行的瞬時表達(dá)的載體系統(tǒng)，同時還對BmA4-57啟動子中的非編碼區(qū)序列5’ UTR進(jìn)行了優(yōu)化，提高了載體的翻譯效率，為快速鑒定增強(qiáng)元件的功能提供一套高效的報告系統(tǒng)。②本發(fā)明利用上述報告系統(tǒng)鑒定從家蠶NPV病毒(重慶株系)中分離得到的ArJ增強(qiáng)子元件的功能，發(fā)現(xiàn)其能顯著提高報告基因的轉(zhuǎn)錄水平，進(jìn)一步將hr3用于提高轉(zhuǎn)基因絲膠1表達(dá)系統(tǒng)的轉(zhuǎn)錄活性，證實(shí)ArJ能提高重組外源蛋白RFP在轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺的蛋白表達(dá)水平達(dá)7倍，在此基礎(chǔ)之上，從家蠶NPV病毒(重慶株系)中分離得到的IE 基因能進(jìn)一步提高重組外源蛋白RFP的表達(dá)水平達(dá)2. 1倍。③本發(fā)明還利用上述報告系統(tǒng)鑒定FibL終止子(FibLPA)，F(xiàn)ibH終止子(FibHPA)以及krl終止子(SerlPA)的功能，發(fā)現(xiàn)它們都能提高報告基因mRNA的穩(wěn)定性，其中krlPA的效果最為顯著，進(jìn)一步將krlPA 用于提高轉(zhuǎn)基因絲膠1表達(dá)系統(tǒng)的mRNA穩(wěn)定性，實(shí)驗(yàn)證實(shí)krlPA亦能提高重組外源蛋白
5RFP在轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺的蛋白表達(dá)水平達(dá)2. 14倍。通過以上系統(tǒng)改進(jìn)，使得重組紅色熒光蛋白(RFP)在繭殼中的含量提高累計(jì)達(dá)31. 5倍。至此，本發(fā)明利用以上調(diào)控元件建立了高效的轉(zhuǎn)基因家蠶絲膠I表達(dá)系統(tǒng)，該系統(tǒng)可用于其他重組外源蛋白在轉(zhuǎn)基因家蠶中進(jìn)行特異高量表達(dá)。


圖1為載體的結(jié)構(gòu)示意圖。 圖 2 為 psl 1180 [BmAct4-57LUCsv40]以及 psl 1180 [BmAct4_l 14LUCsv40]質(zhì)粒 DNA 轉(zhuǎn)染細(xì)胞LUC熒光素酶活性分析圖，其中，A為熒光素酶活性值，B為相對熒光素酶酶活值/ μ g蛋白，C為LUCmRNA相對拷貝數(shù)。圖3為及LUC mRNA拷貝數(shù)分析圖，其中，A為。圖4為絲膠I(Sericinl)的啟動子測序鑒定圖，其中，A為Pserlsp的測序鑒定，B為Pserl測序鑒定。黑色字體帶灰色背景序列(_52纊+1)為絲膠1基因啟動子調(diào)控區(qū)，黑色大寫字體的序列為絲膠I(Sericinl)基因的5 ‘UTR，黑色小寫字體的序列為絲膠 I(sericinl)基因的信號肽，促使重組蛋白分泌表達(dá)。TSS為轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)，signal peptide 為信號肽起始密碼，Initiation codon of Red為紅色熒光蛋白的起始密碼子。圖5為重組載體結(jié)構(gòu)示意圖，其中，A為pBac[3xp3_EGFP，PserlspRedsv40]基礎(chǔ)絲膠1表達(dá)載體，B為pBac[3xp3-EGFP, hr3PserlspRedsv40]轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，C為 pBac[3xp3-Red, Pserlieisv40]，D 為 pBac [3xp3_EGFP, hr3PserlspRedserlPA]。圖6為在宏觀體視熒光顯微鏡下檢測紅色熒光蛋白表達(dá)的照片，其中，A為絲膠 1啟動子Pserlsp的驅(qū)動下，紅色熒光蛋白基因在家蠶的中部絲腺特異表達(dá)照片，標(biāo)尺為 0. 5cm, B為對hSRSV轉(zhuǎn)基因家蠶的5齡第6天的中部絲腺進(jìn)行冷凍切片并熒光觀察照片， 標(biāo)尺為1. 0mm。圖 7 為 SRSV，hSRSV 和 hSRSV+Siel 的 Gl 代轉(zhuǎn)基因家蠶 SDS-Page 以及 Western blotting檢測紅色熒光蛋白表達(dá)量的圖片，其中，A為SDS-Page，B和C為Western blotting。圖 8 為 pslll80[hr3-BmAct4-114LUCsv40]， psl1180[hr3-BmAct4-lHLUCFibH PA], psl1180[hr3-BmAct4-l14LUCFibLPA]和 psl1180[hr3-BmAct4-l14LUCSer1PA]質(zhì)粒 DNADNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞LUC熒光素酶活性分析圖，其中，A為LUC熒光素酶活性分析圖，B為相對熒光素酶酶活值/μ g蛋白，C為LUC mRNA拷貝數(shù)分析圖。圖 9 為 hSRSV，hSRSE 轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)重組 RFP 的 SDS-Page 以及 Western blotting 檢測圖片，其中A為SDS-Page圖片，B為Western blotting圖片。
具體實(shí)施例方式1為了實(shí)現(xiàn)快速檢測調(diào)控元件的增強(qiáng)功能，本發(fā)明首先以pSLfallSOfa載體 (Carsten Horn, et al 2000)為骨架，構(gòu)建一個適用于在昆蟲細(xì)胞水平進(jìn)行瞬時表達(dá)的表達(dá)系統(tǒng)pslll80[BmAct4-57LUCSV40]，該載體中依次含有(從5’到3’ )家蠶肌動蛋白 4 (^ciio/？力的啟動子BmAct4-57，其核苷酸序列如SEQ ID N0:2所示，熒光素酶報告基因iluciferase)和sv40轉(zhuǎn)錄終止子(sv40)。為提高該表達(dá)系統(tǒng)的效率，本發(fā)明還對 BmAct4-57啟動子的5’UTR進(jìn)行改造形成改進(jìn)型的啟動子BmAct4-114，其核苷酸序列如SEQ ID N0:3 所示，用以替換 BmAct4-57 形成 pslll80[BmAct4-114LUCsv40]；
2從重慶株家蠶桿狀病毒(BmNPV CQ strain)的基因組中克隆增強(qiáng)子Hr3， 其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，將其置于BmAct4-114啟動子前面，形成 psl 1180 [hr3BmAct4-l 14LUCsv40]。利用轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞系、熒光素酶報告基因檢測系統(tǒng)以及實(shí)時熒光定量PCR (real time PCR)技術(shù)對該載體中的Hr3進(jìn)行功能鑒定。3 以 pBac[3xp3EGFPaf]轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體骨架(Carsten Horn, et al 2000)為基礎(chǔ)，構(gòu)建一個轉(zhuǎn)基因家蠶絲膠表達(dá)載體pBac[3Xp3EGFP-PserlSpRedSV40]，該載體以眼神經(jīng)組織特異啟動子3xp3驅(qū)動的綠色熒光蛋白基因EGFP為篩選標(biāo)記，其中，以絲膠1基因、SeriCini)啟動子調(diào)控區(qū)序列作為啟動子，紅色熒光蛋白基因Red作為報告基因，以及 SV40轉(zhuǎn)錄終止信號，該轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體能在家蠶中部絲腺特異表達(dá)紅色熒光蛋白，并分泌到家蠶絲腺腺腔中。4構(gòu)建又一個轉(zhuǎn)基因家蠶絲膠表達(dá)載體pBac[3xp3EGFP, hr3PserlspRedsv40]， 與載體pBac[3xp3EGFP-PserlspRedsv40]不同的是該載體中的絲膠I基因(Sericinl) 的啟動子調(diào)控區(qū)序列前連接了增強(qiáng)子U，以檢測Hr3在轉(zhuǎn)基因水平對外源基因表達(dá)的增強(qiáng)效果。構(gòu)建又一個轉(zhuǎn)基因家蠶絲膠表達(dá)載體pBaC[3Xp3-Red，I^serliWsMO]，該載體以pBac[3xp3Redaf] (Aichun Zhao, et al 2000)轉(zhuǎn)基因家蠶表達(dá)載體為骨架，以眼神經(jīng)組織特異啟動子3xp3驅(qū)動的紅色熒光蛋白基因Red為篩選標(biāo)記，其中，以絲膠I基因 (sericinl)啟動子調(diào)控區(qū)序列作為啟動子，從重慶本地感染家蠶的桿狀病毒株系(BmNPV CQ strain)的基因組中克隆的轉(zhuǎn)錄激活因子IEl作為目的基因，以及sv40轉(zhuǎn)錄終止信號。5將步驟3、4中構(gòu)建的兩個轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體分別與輔助質(zhì)粒PHA4PIG —起顯微注射到家蠶蠶卵中，通過GO代自交制種后的熒光篩選獲得含有以上四種基因型的轉(zhuǎn)基因家蠶，分別命名為SRSV, hSRSV和Siel。6將SRSV轉(zhuǎn)基因家蠶，hSRSV轉(zhuǎn)基因家蠶分別與正常的大造品系家蠶回交制種，另外將Siel轉(zhuǎn)基因家蠶與hSRSV轉(zhuǎn)基因家蠶進(jìn)行雜交制種，將SRSV，hSRSV以及 hSRSV+Siel轉(zhuǎn)基因家蠶的繭殼用于SDS-Page以及flfestern blotting檢測其中紅色熒光蛋白表達(dá)量，以檢測hr3和IEl在轉(zhuǎn)基因水平對重組蛋白表達(dá)量的提高效果。7克隆獲得家蠶絲蛋白合成相關(guān)的三個基因fibH, fibL和Serl基因的3，UTR 命名為 fibHPA(如 SEQ ID N0:4 所示)，fibLPA(如 SEQ ID N0:5 所示)禾口 SerlPA(如 SEQ ID N0:6 所示)，分別將其替換 pslll80[hr3BmAct4-114LUCsv40]載體中的 sv40 形成 psl1180[hr3BmAct4-57LUCfibHPA], psl1180[hr3BmAct4-l14LUCfibLPA], psl 1180 [hrfBmAct4-l 14LU(^erlPA]，利用細(xì)胞表達(dá)載體系統(tǒng)對以上3個UTR的功能進(jìn)行檢測。8構(gòu)建又一個轉(zhuǎn)基因家蠶絲膠表達(dá)載體pBac [3xp3EGFP_hr3PserlspRedSerlPA]， 與表達(dá)載體pBacDxpSEGFP-hrfl^serlspRedsv^]不同的是該載體中的sv40終止信號被 SerlPA置換掉，用于檢測krlPA對轉(zhuǎn)基因mRNA穩(wěn)定性的影響，提高轉(zhuǎn)基因的表達(dá)量。9將pBac[3xp3EGFP_hr3PserlspRedSerlPA]表達(dá)載體與輔助質(zhì)粒pHA4PIG —起顯微注射到家蠶蠶卵中，通過GO代自交制種后的熒光篩選獲得含有標(biāo)記基因型的轉(zhuǎn)基因家蠶，并命名為hSRSE。10將hSRSV轉(zhuǎn)基因家蠶，hSRSE轉(zhuǎn)基因家蠶分別與正常的大造品系家蠶回交制種，將hSRSV，hSRSE轉(zhuǎn)基因家蠶的繭殼用于SDS-Page以及^festern blotting檢測其中紅色熒光蛋白表達(dá)量，其中以hSRSV作為比較，以檢測krlPA在轉(zhuǎn)基因水平對重組蛋白表達(dá)量的提高效果。實(shí)施例1基于家蠶Act4啟動子的細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的建立與優(yōu)化 1表達(dá)載體構(gòu)建
A.家蠶肌動蛋白4基因啟動子的克隆U Iii0W)以家蠶二化性品種大造基因組為模板，根據(jù)NCBI公布的家蠶A4啟動子序列(GenBank登陸號GI 1794195)設(shè)計(jì)一條上游引物含有一個Ml I位點(diǎn)5’GCgtcgacTCATCTTGTCACACCTA 3’和下游引物含有一個 BamH I 位點(diǎn)5’ cccggatccCTTGAATTAGTTTTTAATTAAATAGTTCTATTATAA 3，利用 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸30秒，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸10 min,4 °C保存。將回收獲得的A4啟動子片段，命名為BmAct4-57， 其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，并連接到測序載體上進(jìn)行測序鑒定。B. 報告基因螢火蟲熒光素酶基因(Firefly luciferase)的克隆根據(jù)熒光素酶報告基因的編碼區(qū)CDS設(shè)計(jì)一條上游引物含有BamH I位點(diǎn)5’ GCggatccATGGAAGACGCCAAAAACA 3’ 和一條下游引物含有 Not I 位點(diǎn)5’ ATTTgcggccgcT TACACGGCGATCTTTCC3’，以PGL3_Basic (promega)載體為模板，利用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為 94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30秒，60°C退火30秒，72 °C延伸1. 5分鐘，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸10 min,4 °C保存。將回收獲得的熒光素酶報告基因連接到測序載體上進(jìn)行測序鑒定。 C. Sv40終止子的克隆以pBac[3xp3EGFPaf]轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體骨架(Carsten Horn, et al 2000)為模板，設(shè)計(jì)上游引物 Sv40PA_F: 5’ CCgcggccgcGACTCTAGATCATAATCAG CCATACC3，含有一個 Not I 位點(diǎn)和下游引物 Sv40PA_R: 5' CATGaagcttTAAGTACATTGATGAGTT TGGACAA3'含有一個Hind III位點(diǎn)，利用PCR擴(kuò)增獲得Sv40終止子，并連接到測序載體上進(jìn)行測序鑒定。D.家蠶肌動蛋白4基因儀mori Action^啟動子5’ UTR的優(yōu)化以家蠶二化性品種大造基因組為模板，根據(jù)NCBI公布的家蠶A4啟動子序列(GenBank登陸號 GI 1794195)設(shè)計(jì)一條上游引物含有一個 Ml I 位點(diǎn)5’ GCgtcgacTCATCTTGTCACACCTA 3’ 和一條下游引物含有一個BamH I位點(diǎn)R5' CCggatccACCAATCCTCTAACAAC 3'，利用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94 V預(yù)變性4分鐘，94 V變性30秒，54 V退火30秒，72 V延伸30秒， 共30個循環(huán)；最后72 °C延伸10 min,4 °C保存，將回收獲得的A4啟動子片段，命名為 BmAct4-114，并連接到測序載體上進(jìn)行測序鑒定。將克隆獲得的家蠶肌動蛋白4基因的啟動子(上游為Mil，下游為BamHI)、熒光素酶報告基因LUC (上游為BamHI，下游為NotI)以及來自SV40的3，UTR sv40 (上游為NotI， 下游為HindIII)依次(從5，端到3，端)連接至pSLfall80fa載體(Carsten Horn, et al 2000)之上，形成基礎(chǔ)瞬時表達(dá)載體，命名為pslll80[BmAct4-57LUCsv40](圖1)。在上述構(gòu)建的基礎(chǔ)瞬時表達(dá)載體之上，將優(yōu)化了 5’ UTR的啟動子BmAct4-118通過Mil和BamHI限制性內(nèi)切酶，置換原來的BmAct4-57，形成的載體命名Spsll 180 [BmAct4-l 14LUCsv40](圖1)。2 LUC熒光素酶活性檢測
采用Qiagen超純質(zhì)粒提取試劑盒提取pslll80 [BmAct4-57LUCsv40]以及 psl 1180 [BmAct4-l 14LUCsv40]質(zhì)粒 DNA，細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照 Cellfectin II Reagent 標(biāo)準(zhǔn)步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)染前一天，用無抗生素的Grace培養(yǎng)基將狀態(tài)良好(>95%存活率)的sf9細(xì)胞重懸并鋪板至對孔板內(nèi)，細(xì)胞終濃度為8X105/孔。利用無抗生素的Grace培養(yǎng)基按體積質(zhì)量=100 μ L :1 μ g比稀釋待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，利用無抗生素的Grace培養(yǎng)基按體積體積=100 μ L 5 μ L稀釋脂質(zhì)體，然后將稀釋后的質(zhì)粒與脂質(zhì)體按等體積混合，室溫靜置0. 5 h后，按照每孔0. Iug的DNA量轉(zhuǎn)染Sf9以及BmE細(xì)胞，72 h后檢測熒光素酶活性，共進(jìn)行3次平行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。利用Luciferase Assay System細(xì)胞裂解液裂解、收集細(xì)胞后，利用Multi-Detection Microplate Reader (FLX800，ΒΙ0-ΤΕΚ公司)測定熒光素酶吸光值，然后采用BCA試劑盒對細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白濃度測定，熒光素酶活性值以相對熒光素酶酶活值/ μ g蛋白(RLU/ μ g蛋白)表示。細(xì)胞瞬時轉(zhuǎn)染的結(jié)果表明增加5’ leader length的長度即從57bp到 114bp能夠提高熒光素酶活性，其中在SF9細(xì)胞系中提高3. 4倍，BmE中提高1. 1倍(圖2A， 2B)。3 LUC mRNA拷貝數(shù)檢測
采用Qiagen超純質(zhì)粒提取試劑盒提取上述構(gòu)建的2個表達(dá)載體的DNA質(zhì)粒，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。從轉(zhuǎn)染后0h，20h，39h，4 i，7ai，％h等6個時間點(diǎn)收集sf9細(xì)胞，按照Omega RNA抽提試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。利用定時實(shí)量PCR即 Realtime PCR 方法，試劑選用日本TAKARA 公司的 STOR Green Realtime PCR Master mix, 儀器選用Biorad公司IQ5實(shí)時定量PCR儀，LUC的引物為 LUC-F 5' acggattaccagggatttcagt 3' LUC-R 5' gacacctttaggcagaccagtaga 3' 內(nèi)參基因選用sf9-rPL3基因的引物為 sf9_rPL3_F: 5' ggtaatcgctcacacccaaat 3' sf9-rPL3-R: 5' agcaaacacagagtccacagg3'
反應(yīng)體系為
cDNA 模板1.0 μ ；
Realtime Master MixΙΟμ ；
引物 1 QO μΜ)0. 5μ ；
引物 2 (20 μΜ)0. 5μ ；
ddH20至 20μ 。 反應(yīng)條件選用三步法條件為95°C預(yù)變性1 min，95°C變性5s，55°C退火15 s，2°C 延伸15s，40個循環(huán)。以內(nèi)參基因的循環(huán)數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算目的基因相對內(nèi)參基因表達(dá)水平的變化，將最低相對值設(shè)為1，其它值分別與最低值進(jìn)行比較即可。檢測上述2個的表達(dá)載體的報告基因LUC在轉(zhuǎn)染后的6個時間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平的變化。定量PCR結(jié)果顯示在sf9細(xì)胞中，增加A4啟動子5’ leader length的長度從57bp到114bp之后，LUC的mRNA水平出現(xiàn)了明顯降低(圖2C)，但是LUC的活性卻提高了 3. 4倍(圖2A)，因此增加A4啟動子5’ leader length的長度提高了 LUC的mRNA的翻譯效率。
實(shí)施列2.來源于家蠶桿狀病毒(BmNPV)重慶株系的hr3的功能鑒定與應(yīng)用 1細(xì)胞表達(dá)載體構(gòu)建
A.家蠶桿狀病毒(BmNPV)同源重復(fù)性序列hr3的克隆從感染桿狀病毒的重慶本地家蠶大造(P50)品系中分離、純化獲得BmNPV基因組作為模板，根據(jù)NCBI已經(jīng)公布家蠶桿狀病毒T3株系(BmNPV T3 strain) (GenBank登陸號1^4902)的hr3同源重復(fù)序列設(shè)計(jì)一條上游引物含有一個Nco I位點(diǎn)F: 5’ CATGccatggAAAAAGAAGCCGTGCCCA 3’，和一條下游引物含有一個 Nco I 位點(diǎn) R: 5，CATGccatggCAGCGTCGTGAAAAGAGG 3，，利用 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30秒，54°C退火30秒，72 °C延伸45秒，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸10 min,4 ！保存，將回收獲得的重慶本地株系的桿狀病毒同源重復(fù)序列(ArJ)連接到測序載體上進(jìn)行測序鑒定。得如SEQ ID NO: 1所示的核苷酸序列。在上述構(gòu)建的Pslll80[BmAct4-114LUCsv40]瞬時表達(dá)載體之上，將克隆獲得的hr3增強(qiáng)子序列通過NcoI限制性內(nèi)切酶構(gòu)建到啟動子上游，形成的載體命名為 psl1180[hr3-BmAct4-l14LUCsv40](圖 1)。B.家蠶桿狀病毒(BmNPV)轉(zhuǎn)錄激活因子基因的克隆從感染桿狀病毒的重慶本地家蠶大造(P50)品系中分離、純化獲得BmNPV基因組作為模板，根據(jù)NCBI已經(jīng)公布家蠶桿狀病毒T3株系(BmNPV T3 strain)GenBank登陸號GI :438817的iel基因序列設(shè)計(jì)一條上游引物含有一個 BamH I 位點(diǎn) F: 5’ CGCggatccATGACGCAAATTAATTTTAA 3，和一條下游引物含有一個Not I酶切位點(diǎn)R: 5’ ATTTgcggccgcTTAATTAAATTCAA 3’，利用PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30秒，55°C退火30秒，72 °C延伸90秒，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸10 min,4 °C保存，將回收獲得的重慶本地株系的桿狀病毒IEl基因連接到測序載體上進(jìn)行測序鑒定，如SEQ ID NO:7所示，其氨基酸序列如SEQ ID N0:8所示。在上述構(gòu)建的Pslll80[BmAct4-114LUCsv40]瞬時表達(dá)載體之上，將克隆獲得的hr3增強(qiáng)子序列通過NcoI限制性內(nèi)切酶構(gòu)建到啟動子上游，形成的載體命名為 psl1180[hr3-BmAct4-l14LUCsv40](圖 1)。2 LUC熒光素酶活性檢測
采用Qiagen超純質(zhì)粒提取試劑盒提取pslll80 [BmAct4-114LUCsv40]以及 psl 1180 [hr3-BmAct4-l 14LUCsv40]質(zhì)粒DNA，細(xì)胞轉(zhuǎn)染與熒光素酶活性檢測均按照實(shí)施例 1中所述步驟進(jìn)行，結(jié)果顯示hr3增強(qiáng)子能顯著增強(qiáng)提高A4-114啟動子的活性，其中在 SF9中提高5倍，BmE中提高2.4倍(圖3A，2B)。3 LUC mRNA拷貝數(shù)檢測
采用Qiagen超純質(zhì)粒提取試劑盒提取上述構(gòu)建的2個表達(dá)載體的DNA質(zhì)粒，準(zhǔn)備進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。細(xì)胞轉(zhuǎn)染按照實(shí)施例1所述步驟進(jìn)行，從轉(zhuǎn)染后011，2011，3911，4 1，7 1，9^1等6 個時間點(diǎn)收集sf9細(xì)胞，按照Omega RNA抽提試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)步驟提取細(xì)胞總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA。按照實(shí)施例1所述的定時實(shí)量PCR方法檢測pslll80[BmAct4-114LUCsv40] 以及Pslll80[hr3-BmAct4-114LUCsv40]載體中LUC在轉(zhuǎn)染后的6個時間點(diǎn)轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果顯示在sf9細(xì)胞中，從家蠶NPV病毒重慶株系基因組中分離的ArJ增強(qiáng)子能顯著增強(qiáng)A4-114啟動子的轉(zhuǎn)錄活性(圖3C)，使報告基因LUC的活性提高達(dá)到5倍(圖3A、B)。 因此，本發(fā)明獲得的hr3具有提高外源基因轉(zhuǎn)錄水平功能。4含Hr3增強(qiáng)子和IEl的雙元雜交轉(zhuǎn)基因絲膠1表達(dá)載體的構(gòu)建以品種大造基因組為模板，根據(jù)家蠶9倍基因組數(shù)據(jù)庫設(shè)計(jì)絲膠I基因(sericinl) 啟動子區(qū)域特異引物Serl-F: 5，CAAAgtcgacGAAAACAGCACACACACTAC 3，，Serl-R: 5，AAAAggatccAGACCCGATGATAAGACG 3，Jerlsignal peptide-R: 5，AAAAggatccTGTATCTC GATTGCCGGGGTGGTGACCGAAGGCTTTTACGCTgagcgcagccaacgcaatc’ 3，通過 PCR 擴(kuò)增獲得兩條絲膠I(Sericinl)的啟動子，其中一條不含信號肽進(jìn)行胞內(nèi)表達(dá)，命名為I^serl，圖4A，其核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，一條含信號肽進(jìn)行分泌表達(dá)，命名為I^erlsp (圖4B)，其核苷酸序列如SEQ ID N0:9所示，并克隆到T載體進(jìn)行測序鑒定。本發(fā)明所使用的轉(zhuǎn)基因骨架載體pBac[3xp3_EGFPaf] (Carsten Horn, et al 2000)以及pBac[3xp3-Redaf] (Aichun Zhao, et al 2010)是基于鱗翅目昆蟲細(xì)胞系的桿狀病毒的轉(zhuǎn)座子PBac的轉(zhuǎn)基因載體。轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體的構(gòu)建過程為以pSLfallSOfa載體(Carsten Horn, et al 2000)為中間載體，將中部絲腺特異表達(dá)的絲膠1基因啟動子 I^serlsp(上游為Sail，下游為BamHI)、紅色熒光蛋白基因Red(上游為BamHI，下游為NotI) 以及轉(zhuǎn)錄中止信號sv40 (上游為NotI，下游為HindIII)依次連接至pSLfall80fa載體上， 形成pslllSOpserlspRedsv^]；在此基礎(chǔ)之上，將增強(qiáng)子hr3通過NcoI連接至I^serlsp上游，形成 pslll80[hr3Pserlsp/fei/sv40]；隨后利用 AscI 分別將 psl 1180 [PserlspRedsv40]， psl 1180 [hr3PserlspRedsv40]載體中的表達(dá)框切下，連接至經(jīng)同樣酶切后的轉(zhuǎn)基因骨架載體 PBac [3xp3-EGFPaf]之上，形成 pBac [3xp3_EGFP, PserlspRedsv40]基礎(chǔ)絲膠 1 表達(dá)載體(圖 5A)，和含增強(qiáng)子 hr3 的 pBac[3xp3_EGFP, hr3PserlspRedsv40]轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體(圖5B)。另外，將啟動子I^serl (上游為Sail，下游為BamHI)、轉(zhuǎn)錄激活因子(上游為BamHI，下游為NotI)以及轉(zhuǎn)錄中止信號sv40 (上游為NotI，下游為 HindiII)依次連接至pSLfal 180fa載體之上，形成psl 1180 [Pserlieisv40]，隨后利用 AscI將pS11180[I^erlie7SV40]中的表達(dá)框切下，連接至經(jīng)同樣酶切后的轉(zhuǎn)基因骨架載體 pBac [3xp3-Redaf]之上，形成 pBac [3xp3_Red，Pserlie7sv40](圖 5C)，該轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體以眼、神經(jīng)特異啟動子3xp3驅(qū)動的紅色熒光蛋白基因Red作為篩選。5轉(zhuǎn)基因家蠶的制備
本發(fā)明利用pHA4PIG(馬三垣等.，家蠶轉(zhuǎn)基因技術(shù)中若干因素對轉(zhuǎn)基因效率的影響.2009)作為輔助質(zhì)粒產(chǎn)生轉(zhuǎn)座酶，利用QIAGEN Plasimd Mini Kit (Qiagen)質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取 pBac [3xp3-EGFP, PserlspRedsv40]，pBac [3xp3_EGFP, hr3PserlspRedsv40 ]，以及pBac[3xp3-Red，Pserlielsv40]質(zhì)粒分別與pHA4PIG質(zhì)粒按1 1摩爾比混合后， 參照(家蠶滯育品種的轉(zhuǎn)基因方法，申請?zhí)?00910103397.6)中所述的方法進(jìn)行顯微注射。 主要步驟為將混合后的質(zhì)粒注射已解除滯育的大造早期胚胎(產(chǎn)卵后2 5 h)，隨后用無毒膠水對注射孔進(jìn)行封口，經(jīng)35%的甲醛蒸汽消毒5分鐘后，置于25°C，相對濕度85%的環(huán)境中孵化，孵化的幼蟲(G0代)采用人工飼料飼育，至成蟲后進(jìn)行自交或回交制種，獲得的 Gl代蠶卵(第7天)在宏觀體視熒光顯微鏡(Olypus MVX10,日本)下檢測，綠色熒光觀察采用波長為460 490nm的激發(fā)光，篩選出在眼睛或神經(jīng)特異激發(fā)綠色熒光和紅色熒光的轉(zhuǎn)基因陽性蛾圈，分別命名為SRSV，hSRSV和Siel，顯微注射與轉(zhuǎn)基因篩選的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(表 1)。
1權(quán)利要求
1.增強(qiáng)子Hr3，其特征在于由如SEQID NO: 1所示的核苷酸序列組成。
2.增強(qiáng)子Hr3的制備方法，其特征在于以BmNPV基因組作為模板，設(shè)計(jì)上游引物 5’ catgccatggaaaaagaagccgtgccca 3’，下游引物5’ catgccatggcagcgtcgtgaaaagagg 3’，利用PCR擴(kuò)增，得增強(qiáng)子hr3。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的增強(qiáng)子Hr3的制備方法，其特征在于，擴(kuò)增條件為94°C預(yù)變性4分鐘，94°C變性30秒，退火30秒，72 °C延伸45秒，共30個循環(huán)；最后72 °C延伸 10分鐘。
4.含有權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)子Hr3的啟動子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的啟動子，其特征在于將所述增強(qiáng)子Hr3通過NcoI限制性內(nèi)切酶連接于如SEQ ID N0:2所述的啟動子的上游，得含有增強(qiáng)子Hr3的啟動子；或?qū)⑺鲈鰪?qiáng)子Hr3通過NcoI限制性內(nèi)切酶連接于如SEQ ID NO: 3所述的啟動子的上游，得含有增強(qiáng)子Hr3的啟動子。
6.含有權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)子Hr3或含有權(quán)利要求4所述的啟動子的重組載體。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述重組載體的終止子如SEQID NO:4, SEQ ID N0:5或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體具體為pBac[3xp3EGFP -hr3PserlspRedsv40]，其中，含增強(qiáng)子Hr3、啟動子I^serlsp、紅色熒光蛋白基因Red和終止子SV40的表達(dá)框通過ASCI連接于轉(zhuǎn)座子pBac[3Xp3EGFPaf]轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體上。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組載體，其特征在于所述含有增強(qiáng)子 Hr3 的重組載體具體為 pBac[3xp3EGFP-hr3PserlspRedSerlPA]，具體為將 pBac[3xp3EGFP-hr3PserlspRedsv40]中終止子 sv40 被如 SEQ ID NO:6 所示的 krlPA 置換。
10.權(quán)利要求1所述的增強(qiáng)子Hr3在家蠶中制備重組外源蛋白的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及增強(qiáng)子Hr3，由如SEQIDNO:1所示的核苷酸序列組成，其可用于在家蠶中制備重組外源蛋白；本發(fā)明還涉及含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體，所述增強(qiáng)子Hr3通過其NcoI酶切位點(diǎn)與不含增強(qiáng)子的載體的啟動子上游的NcoI酶切位點(diǎn)連接，共同組成含有增強(qiáng)子Hr3的重組載體；本發(fā)明在細(xì)胞水平鑒定一類增強(qiáng)子hr3、轉(zhuǎn)錄激活因子IE1、非翻譯區(qū)序列5’UTR和3’UTR等增強(qiáng)基因表達(dá)的功能元件，在此基礎(chǔ)上將最佳的元件整合建立高效、穩(wěn)定的絲膠I(Sericin1)表達(dá)系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)基因家蠶中部絲腺高效表達(dá)重組外源蛋白。
文檔編號C12N15/10GK102492692SQ201110423280
公開日2012年6月13日 申請日期2011年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月16日
發(fā)明者向仲懷, 夏慶友, 徐漢福, 王峰, 趙萍, 馬三垣 申請人:西南大學(xué)