專利名稱：轉(zhuǎn)芽孢桿菌源α-淀粉酶基因重組乳酸桿菌及制品和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因重組技術(shù)，特別是一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源α -淀粉酶基因重組乳酸桿菌及制品和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
眾所周知，動物的生長是依賴于營養(yǎng)豐富的飼料，而動物的生長速度的快慢是取決于動物對飼料的消化利用率，而飼料的消化利用率又取決于其消化道內(nèi)的消化酶的多少，因為飼料中的營養(yǎng)物質(zhì)大多都是以高分子形式存在的，所以必須有相應(yīng)的酶將其降解后方能被腸道吸收利用，因此腸道消化酶的多少對于動物的生長、料肉比和經(jīng)濟效益至關(guān)重要。目前，很多消化酶如淀粉酶、纖維素酶、蛋白酶等已被開發(fā)，在飼料中也有廣泛的應(yīng)用。而在飼料成分中，淀粉是其中最主要的營養(yǎng)物質(zhì)之一，所以淀粉在腸道中的分解率在很大程度上影響著動物的生長速度。因此研究淀粉酶以適當(dāng)?shù)男问綉?yīng)用于動物生產(chǎn)具有重要的實踐意義。淀粉酶是α -淀粉酶、β -淀粉酶及葡糖淀粉酶的總稱，由于淀粉酶在工業(yè)、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)上應(yīng)用廣泛，因此，在酶家族中它是非常重要的一種酶。淀粉酶的來源很廣泛，可以來自于植物、動物以及微生物。大部分的α-淀粉酶存在于微生物中，α-淀粉酶是胞外酶，可以隨機的切斷線狀直鏈淀粉鏈中連接相鄰的兩個葡萄糖單位的1，4-α_糖苷鍵。 β -淀粉酶主要來源于植物，但也有少部分微生物產(chǎn)生，它是在外面起作用的酶，可以分解直鏈淀粉、支鏈淀粉以及糖原分子的非還原性末端鏈，它可以水解交替的糖苷鍵，產(chǎn)生麥芽糖。葡糖淀粉酶可以水解單個的葡萄糖。α-淀粉酶已經(jīng)從多種細(xì)菌、真菌和酵母中分離獲得。由于細(xì)菌淀粉酶具有多種優(yōu)良的特性，因此，細(xì)菌淀粉酶應(yīng)用比較多，其中曲霉和桿菌， 特別是淀粉液化芽孢桿菌已用于工業(yè)化生產(chǎn)。在動物養(yǎng)殖業(yè)中，從某種程度上，淀粉酶主要被用作消化助劑，補充面粉的糖化活性，改善一些動物飼料的可消化性。淀粉酶存在于單胃動物的消化道內(nèi)，由動物的消化道自身分泌。但是幼禽幼畜消化機能尚未發(fā)育健全，淀粉酶分泌量往往不足，而且動物年老時消化酶分泌能力降低，另外動物在受到應(yīng)激或疾病感染后引起消化酶分泌紊亂(McTigue MA et al. The alkaline amylase of the alkalophilic Bacillus sp. IMD 370. Enzyme and Microbial Technology, 1995，20 (17): 45 47)。由于消化酶的分泌不足，大量的飼糧無法被順利的消化吸收，較多的飼糧進(jìn)入后腸發(fā)生腐敗分解，引起大腸桿菌等有害菌群增殖，產(chǎn)生多量的胺類毒性物質(zhì)，對腸壁組織造成損傷，使腸道蠕動加快和分泌增加， 造成腹瀉。在這些情況下，在其日糧中添加外源淀粉酶，不但能補充體內(nèi)內(nèi)源酶的不足，而且能激活內(nèi)源酶的分泌，增強動物對飼料養(yǎng)分的消化吸收能力，明顯提高飼料利用率，同時無毒、無副作用、無殘留(Yasuji Minoa et al. Developments in the use of Bacillus species for Industrial production. Canadian Journal of Microbiology, 2004， 23(2): 1-17)。20世紀(jì)90年代初，我國開始淀粉酶制劑的研究與應(yīng)用，在短短十幾年的時間里，淀粉酶已被逐步應(yīng)用到畜、禽、水產(chǎn)動物等各個養(yǎng)殖領(lǐng)域，具有顯著增強消化功能、提高飼料利用率、促進(jìn)生長、提高動物的生產(chǎn)性能等功效(劉慶華等，添加淀粉酶與復(fù)合酶對蛋種雞生產(chǎn)性能及養(yǎng)分利用率的影響.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2010，8: 23-25)。但是自然分離的菌株往往α -淀粉酶酶活不是很高，很難直接用于工業(yè)化生產(chǎn)或作為添加劑使用，所以一般要對野生型菌株進(jìn)行改造，如通過誘變育種、構(gòu)建基因工程菌和基因突變，使α-淀粉酶能夠在特定的宿主菌中表達(dá)，而且產(chǎn)酶量也大大提高。隨著分子生物學(xué)和基因工程技術(shù)的不斷完善，通過基因工程技術(shù)改造菌株已成為一種廣泛應(yīng)用的手段。目前，世界上一些大的酶制劑公司生產(chǎn)酶制劑的菌種50%是基因工程菌。最大的酶制劑生產(chǎn)商丹麥諾維信公司，生產(chǎn)酶制劑的菌種80%是基因工程菌。在國內(nèi)，很多企業(yè)還處于傳統(tǒng)誘變菌種生產(chǎn)酶制劑的落后狀態(tài)。Richardson等利用高通量篩選方法從構(gòu)建的a_淀粉酶基因文庫中篩選到3株耐酸(低pH值4. 5)耐高溫(105°C )的不依賴Ca2+高性能菌株，又利用基因重組技術(shù)、鑒定與優(yōu)化評價構(gòu)建了一個穩(wěn)定、高產(chǎn)、耐酸、耐高溫的重組酶蛋白。劉逸寒等(劉逸寒等.耐酸性高溫淀粉酶突變基因在大腸桿菌中的表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究.食品與發(fā)酵工業(yè)，2007，33 O) :36-41)將去信號肽的耐酸性高溫a_淀粉酶突變基因克隆到大腸桿菌表達(dá)載體pET-30a上并實現(xiàn)高效表達(dá)，表達(dá)量達(dá)到141 mg / L，重組酶比活達(dá)到354. 6U / mg蛋白。王磊等(王磊等.耐高溫淀粉酶基因在枯草桿菌染色體上的整合、擴增及表達(dá)的研究.工業(yè)微生物，1998,^(1):7-1 進(jìn)行了耐高溫a_淀粉酶基因在枯草桿菌染色體上的整合、擴增及表達(dá)的研究。通過構(gòu)建一套整合載體，將來自嗜熱脂肪芽胞桿菌的耐高溫a-淀粉酶基因以及質(zhì)粒pC194上的一段Cm抗性基因隨機整合至枯草桿菌1A289染色體上，通過提高整合菌的抗氯霉素能力和反復(fù)進(jìn)行整合，提高耐高溫淀粉酶基因在染色體上的拷貝數(shù)，最終a-淀粉酶基因在染色體上的拷貝數(shù)由整合初的1個增至 7個以上，在無選擇壓力情況下，產(chǎn)酶220U / mL。乳酸桿菌是近年發(fā)展起來的一種最具發(fā)展?jié)摿Φ募?xì)菌表達(dá)系統(tǒng)，因為乳酸桿菌具有太多的優(yōu)點(1)乳酸桿菌在人類已經(jīng)有上千年的應(yīng)用歷史，是唯一一個沒有致病性的菌種，是一種公認(rèn)的具有GRAS(Generally Regarded As Safe)有益微生物。(2)乳酸桿菌菌體本身就對機體有益生作用，其分泌多種物質(zhì)更是機體必不可少的，若再在其載體上克隆入外源目的基因，這樣就可集菌體、自泌物質(zhì)和外源蛋白于一體；C3)若選擇非抗性標(biāo)記，則該表達(dá)系統(tǒng)中的菌體、選擇性標(biāo)記、誘導(dǎo)物均為食品級，為生產(chǎn)綠色安全的食品提供了可會邑(Maria J G et al. Integrative food-grade expression system based on the lactose regulon of lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology, 2000,66(11): 4822^4828) ； (4)它在人和動物體內(nèi)占絕對優(yōu)勢，以它為表達(dá)系統(tǒng)作為口服益生菌，較其它菌株更易達(dá)到較高的表達(dá)量(Sch印pier L, Vogel Μ, Zuercher A W, et al. Recombinant Lactobacillus johnsonii as a mucosal vaccine delivery vehicle. Vaccine. 2002 20 (23-24) : 2913-2920) ; (5)乳酸桿菌不具有內(nèi)在免疫原性; (6)乳酸桿菌對機體粘膜有極強的粘附作用，因此構(gòu)建的乳酸桿菌基因工程菌就可在粘膜處不斷繁殖，持續(xù)向機體釋放目的蛋白。因此乳酸桿菌表達(dá)系統(tǒng)近年來得到了較快的發(fā)展，如使乳酸桿菌攜帶賴氨酸、蛋氨酸等基因，通過直接飼喂乳酸桿菌可減少向飼料中添加相應(yīng)的物質(zhì)，從而可降低飼料成本。Hashiba等(Hashiba H et al. Establishment of a host-vector system in Lactobacillus helveticus with β -galactosedase activityas a selection marker. Biosci Biotechnol Biochem, 1992，50:190 194)將Bacillus. Licheniformis的α -淀粉酶結(jié)構(gòu)基因插入pBGlO的紅霉素抗性基因啟動子區(qū)下游，在 L. helveticus SBT2195 巾Pouwels · (Kaniitiffli K et al. Isolation
and characterization of acidocin A and cloning of the bacteriocin gene from Lactobacillus acidophilus. Appl Environ Microbiol, 1995, 61:1061 1067)也成功地構(gòu)建了攜帶乳酸桿菌L-1 dh基因強啟動子和Lactoamy 1 οvorus淀粉酶基因的調(diào)節(jié)啟動子的表達(dá)和分泌載體。另外如胰島素酶、蛋白酶、葡聚糖酶、脂酶和細(xì)菌素等外源基因都已在乳酸桿菌中得到了表達(dá)。另外一個重要的用途就是作為抗原呈遞載體，從而實現(xiàn)疫苗的□月艮免疫。Zegers 等(Zegers N D et al. Expression of the protective antigen of bacillus antracis by Lactobacillus Casei: towards the development of an oral vaccine against anthrax. J Appl Microbiol, 1999，87:309 314)禾口 Maassen 等(Maassen C B M et al. Instruments for oral disease-intervention strategies: recombinant Lactobacillus Casei expressing tetanus toxin fragment C for vaccination or myelin proteins for oral tolerance induction in multiple sclerosis. Vaccine, 1999, 17(25) : 2117 2128)利用乳酸桿菌作為疫苗載體，攜帶表達(dá)外源抗原，通過粘膜免疫動物，可誘發(fā)抗感染免疫。Pouwels等(Pouwels P H et al. Lactic acid bacteria as antigen delivery vehicles for oral immunization purposes. Int J food Microbiol, 1998,41 ) :155 167)則構(gòu)建了乳桿菌的一系列表達(dá)載體，用于表達(dá)破傷風(fēng)毒素C片段、幽門螺桿菌脲酶A和B亞單位等抗原。他還用pLPCR2載體表達(dá)兩個并列重復(fù)口蹄疫病毒和大腸桿菌β-半糖苷酶基因的融合蛋白，在干酪乳桿菌中融合蛋白的表達(dá)大約為細(xì)胞總蛋白的0. 1%。實驗發(fā)現(xiàn)，外源抗原基因表達(dá)于細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞表面，均能誘發(fā)針對該抗原的全身和局部粘膜免疫反應(yīng)；通過口服、鼻粘膜或腹腔注射等途徑接種，也均可引起有效的免疫應(yīng)答。更有意義的是，法國和巴西已于2000年聯(lián)手開展在乳酸桿菌中表達(dá)rotavirus的抗原基因，然后用重組的乳酸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)酸奶，來預(yù)防兒童輪狀病毒性腹瀉。近年來國內(nèi)也相繼開展了這方面的工作，何召慶等(何召慶，秦澤榮，徐鑌蕊， 等.降鈣素基因在乳酸桿菌中的克隆.中國獸藥雜志，2002，36 (6) :20-22)將鮭降鈣素基因克隆并表達(dá)在乳酸桿菌質(zhì)粒pW425t中，然后轉(zhuǎn)化到ThyA基因缺陷的乳酸桿菌中表達(dá)。王春鳳等(王春鳳等.柔嫩艾美爾球蟲S07基因在乳酸桿菌中的表達(dá).自然科學(xué)進(jìn)展.王春鳳等.飼喂轉(zhuǎn)球蟲基因功能乳酸桿菌后對雛雞體重的影響.畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2002，33(6) 591-593)在質(zhì)粒pW425t中成功地表達(dá)了雞球蟲S07基因，將該重組的乳酸桿菌給剛出殼的雛雞飼喂，一周后攻球蟲卵囊5 X 105個/只，通過測定試驗雛雞的體重未發(fā)生變化，表明了基因工程乳酸桿菌的有效性。這些結(jié)果都證明重組乳酸桿菌是一種良好的口服載體，無論是讓其攜帶促生長的酶蛋白還是抗原蛋白都能在體內(nèi)顯示其具有誘人的應(yīng)用前景。
本發(fā)明是利用PCR技術(shù)從淀粉液化芽孢桿菌基因組中擴增出淀粉酶amy基因和從短小乳桿菌基因組中擴增出信號肽sp基因，構(gòu)建了含有sp基因和_y基因的重組表達(dá)質(zhì)粒pllac-sp-amy，通過電轉(zhuǎn)化整合到了乳酸桿菌的基因組上，并實現(xiàn)了穩(wěn)定表達(dá)，從而獲得了能夠分泌表達(dá)淀粉酶的重組乳酸桿菌。該重組乳酸桿菌可以應(yīng)用于飼料中富含淀粉的動物生產(chǎn)中，尤其是對初生仔豬和雛雞，對于提高生長速度、降低料肉比、增加經(jīng)濟效益等具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a_淀粉酶基因重組乳酸桿菌，以及該重組乳酸桿菌的制品及應(yīng)用。通過提供一種能夠分泌表達(dá)淀粉酶的基因工程乳酸桿菌，巧妙設(shè)計將乳酸桿菌的信號肽基因與芽孢桿菌的淀粉酶基因重組到乳酸桿菌的表達(dá)載體上，再電轉(zhuǎn)化整合到乳酸桿菌，研制成能特異表達(dá)淀粉酶的重組乳酸桿菌，作為益生菌活菌飼料添加劑用于動物的生產(chǎn)。為了實現(xiàn)解決上述技術(shù)問題的目的，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案
一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌，其特征是該轉(zhuǎn)芽孢桿菌源淀粉酶基因重組乳酸桿菌是將a-淀粉酶基因和信號肽基因連接后插入到乳酸桿菌表達(dá)載體 Pllac的多克隆位點，然后再將其整合到干酪乳桿菌L. CECT5276的核糖體結(jié)合位點中獲得的產(chǎn)品；所述的α —淀粉酶基因來源于GenBank上的登陸號為⑶591658的淀粉液化芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens, ATCC 23842)，所用于擴增的序列是 l_1545bp 位堿基；信號肽基因來源于在GenBank上的登陸號為Z14250的短小乳酸桿菌Z. brevisl. 2028, 所用于擴增的序列是260-349bp位的堿基。本發(fā)明的一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌，所述的α —淀粉酶的 DNA序列，其包含如下序列或經(jīng)修飾的序列，所述修飾不改變所編碼的氨基酸序列
ATGATTCAAAAACGAAAGCGGACAGTTTCGTTCAGACTTGTGCTTATGTGCACGCTCTTA60TTTGTCAGTTTGCCGATTACAAAAACATCAGCTGTAAATGGCACGCTGATGCAGTATTTT120GAATGGTATACGCCGAACGGCGGCCAGCATTGGAAACGATTGCAGAATGATGCGGAACAT180TTATCGGATATCGGAGTCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACCAAGGATTGAGCCAA240TCCGATCACGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAAAGGG300ACGGTCAGAACGAAATACGGCACAAAATCAGACCTTCAAGATGCGATCGGCTCACTGCAT360TCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGGTTTTGAATCATAAGGCTGGTGCTGATGCA420GCAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGCCAATAGAAATCAGGAAACTTCGGAG480GAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATTTTCGTTTTCCGCGCCGTGGAAACACGTACAGT540GATTTTAAATGGCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAATCCCGGAAGATC600AGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGGGAAGGAAAAGCGTGGGATTGGGAAGTATCAAGTGAA660AACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTACGACCACCCTGATGTCGTG720GTAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATGCGAATGAACTGTCATTAGACGGCTTCCGT780ATTGATGCCGCCAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGGTTCAGGCGGTCAGA840CAGGCGACGGGAAAAGAAATGTTTACGGTTGCGGAGTATTGGCAGAATAATGCCGGGAAA900CTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAATCAATCCGTGTTTGGTGTTCCGCTTCAT960TTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATATGAGGCGTTTGCTGGAC1020GGTACCGTTGTGTCCAGGCATCCGGAAAAGGCGGTTACATTTGTTGAAAATCATGACACA1080CAGCCGGGACAGTCATTGGAATCGACAGTCCAAACTTGGTTTAAACCGCTTGCATACGCC1140TTTATTTTGACAAGAGAATCCGGTTATCCTCAGGTGTTCTATGGGGATATGTACGGGACA1200AAGGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAGATAATATAGAGCCGATTTTAAAA1260GCGCGTAAGGAGTACGCATACGGGCCCCAGCACGATTATATTGAGCACCCGGATGTGATC1320GGATGGACGA GGGAAGGTGA CAGCTCCGCC GCCAAATCAG GTTTGGCCGC TTTAATCACG 1380 GACGGACCCG GCGGATCAAA GCGGATGTAT GCAGGCCTGA AAAATGCCGG CGAGACATGG 1440 TATGACATAA CGGGCAACCG TTCAGATACT GTAAAAATCG GATCTGACGG CTGGGGAGAC 1500 TTTCATGTAA ACGATGGGTC CGTCTCCATT TATGTTCAGA AATAA1545
乳酸桿菌(LactcAacillus brevis 1.2028)信號肽基因，序列如下 ATGCAATCAA GTTTAAAGAA ATCTCTTTAC TTGGGCCTTG CCGCATTGAG CTTTGCTGGT 60 GTTGCTGCCG TTTCAACGAC TGCTTCAGCT90
將α —淀粉酶基因和信號肽基因插入到乳酸桿菌的表達(dá)載體Pllac的NdeI和SmaI 位點，然后將其整合到干酪乳桿菌L. CECT5276中，得到轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌。進(jìn)一步的，所述的重組乳酸桿菌含有表達(dá)質(zhì)粒pllac-sp-amy，重組表達(dá)質(zhì)粒pilac-sp -amy含有乳酸桿菌復(fù)制子ori、核糖體結(jié)合位點RBS、操縱子Iac、 乳酸桿菌信號肽基因(signal peptide, sp)、淀粉酶基因(amylase，amy)、核糖體結(jié)合位點RBS和抗性篩選基因紅霉素Ery (erythromycin, Ery)基因，其表達(dá)式為-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-o利用本專利所述的轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a_淀粉酶基因重組乳酸桿菌，可以制備含上述轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌菌種發(fā)酵形成的液態(tài)、固態(tài)產(chǎn)品。所述轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a_淀粉酶基因重組乳酸桿菌可以在制備仔豬飼料中的得到應(yīng)用。重組乳酸桿菌可以作為一種口服飼料添加劑應(yīng)用于養(yǎng)豬業(yè)，可以補充豬尤其是仔豬腸道淀粉酶不足，具有促進(jìn)飼料的消化，提高料重比，增加經(jīng)濟效益的作用。此外，宿主菌乳酸桿菌是一種干酪乳桿菌，其本身對動物機體也有益生功能，因此本發(fā)明是提供了一種人工產(chǎn)淀粉酶益生基因工程乳酸桿菌，在仔豬生產(chǎn)中具有重要的應(yīng)用價值。本專利的一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a_淀粉酶基因重組乳酸桿菌的構(gòu)建方法，包括使用一種淀粉液化芽孢桿菌基因組和一種來自乳酸桿菌的信號肽，將淀粉液化芽孢桿菌基因和來自乳酸桿菌的信號肽基因插入到乳酸桿菌的表達(dá)載體Pllac的NdeI和SmaI位點，然后將其整合到干酪乳桿菌L. CECT5276中，得到轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌；其詳細(xì)的工藝如下
一、α 一淀粉酶基因引物獲得和淀粉液化芽孢桿菌基因組的提取，包括步驟1-4:
1、α一淀粉酶基因引物由中美泰和生物技術(shù)(北京)有限公司合成，引物序列如下 上游引物 P1 5，- GCTCTAGATATATGTTACAATTGAAGTGCA-3，(XbaI 位點為 “ TCTAGA”)； 下游引物 Ρ2: 5’ - AACCCGGGGTTTATTTTCCGCTTCT-3’(SmaI 位點為 “CCCGGG”)；
2、淀粉液化芽孢桿菌基因的提取
將活化的淀粉液化芽孢桿菌培養(yǎng)1 后，取3ml菌液，然后參照北京艾德萊生物科技有限公司的細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒(離心柱型)提取其基因組DNA，方法按使用說明書步驟進(jìn)行；
3、α一淀粉酶amy基因的PCR擴增
以步驟2提取的基因組DNA為模板，擴增淀粉液化芽孢桿菌的α —淀粉酶基因，反應(yīng)體系如下
表1 α —淀粉酶基因PCR擴增體系
權(quán)利要求
1.一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌，其特征是該轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌是將a-淀粉酶基因和信號肽基因連接后插入到乳酸桿菌表達(dá)載體 Pllac的多克隆位點，然后再將其整合到干酪乳桿菌L. CECT5276的核糖體結(jié)合位點中獲得的產(chǎn)品；所述的α —淀粉酶基因來源于GenBank上的登陸號為⑶591658的淀粉液化芽孢桿菌，所用于擴增的序列是l_1545bp位堿基；信號肽基因來源于在GenBank上的登陸號為 Z14250的短小乳酸桿菌Z. brevisl. 2028，所用于擴增的序列是^0_349bp位的堿基。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)芽孢桿菌源淀粉酶基因重組乳酸桿菌，其特征是所述的重組乳酸桿菌含有表達(dá)質(zhì)粒pilac-sp-amy，重組表達(dá)質(zhì)粒pilac-sp -amy含有乳酸桿菌復(fù)制子ori、核糖體結(jié)合位點RBS、操縱子lac、乳酸桿菌信號肽基因(signal peptide, sp)、淀粉酶基因(amylase，amy)、核糖體結(jié)合位點RBS和抗性篩選基因紅霉素 Ery (erythromycin, Ery)基因，其表達(dá)式為-ori-RBS-lac-sp-amy-RBS-Ery-o
3.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)芽孢桿菌源淀粉酶基因重組乳酸桿菌菌種發(fā)酵形成的液態(tài)、固態(tài)廣品。
4.權(quán)利要求1所述轉(zhuǎn)芽孢桿菌源淀粉酶基因重組乳酸桿菌在制備仔豬飼料中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明介紹了一種轉(zhuǎn)芽孢桿菌源a-淀粉酶基因重組乳酸桿菌及其制品及應(yīng)用，將a-淀粉酶基因和信號肽基因連接后插入到乳酸桿菌表達(dá)載體pIlac的多克隆位點，再將其整合到干酪乳桿菌L.CECT5276的核糖體結(jié)合位點中；α－淀粉酶基因為GU591658的淀粉液化芽孢桿菌，所用于擴增的序列是1-1545bp堿基；信號肽基因為Z14250的短小乳酸桿菌L.brevis1.2028，所用于擴增的序列是260-349bp堿基。該重組乳酸桿菌可以應(yīng)用于飼料中富含淀粉的動物生產(chǎn)中，尤其是對初生仔豬和雛雞，對于提高生長速度、降低料肉比、增加經(jīng)濟效益等具有重要的意義。
文檔編號C12R1/245GK102363762SQ20111028338
公開日2012年2月29日 申請日期2011年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2011年12月5日
發(fā)明者丁軻, 余祖華, 周變?nèi)A, 孔濤, 王國永, 白東英, 趙振升, 鐘社普 申請人:河南科技大學(xué)