一株類芽孢桿菌及其用于κ-卡拉膠酶的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一株類芽孢桿菌（Paenibacillussp.）fjfst-333，已于2013年12月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCCM2013707，以及用該菌株發(fā)酵制備κ-卡拉膠酶的方法。本發(fā)明以該菌株作為菌種，采用碳源、氮源、無機(jī)鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基，在優(yōu)化后的培養(yǎng)條件下，κ-卡拉膠酶的活力達(dá)到67U/ml。發(fā)酵液通過硫酸銨鹽析，離心收集沉淀，后進(jìn)行透析，取透析液過離子交換柱及凝膠柱，冷凍干燥即可獲得κ-卡拉膠酶干粉。
【專利說明】一株類芽孢桿菌及其用于K-卡拉膠酶的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物化工領(lǐng)域，涉及一株類芽孢桿菌及其用于K -卡拉膠酶的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]卡拉膠是由1，3-β-D-吡喃半乳糖和1，4-a-D-吡喃半乳糖作為基本骨架，交替連接而成的硫酸線性多糖，主要存在于紅藻綱中的麒麟菜屬、角叉菜屬、杉藻屬和沙菜屬等的細(xì)胞壁中。根據(jù)其二糖單元上所含的硫酸基團(tuán)的數(shù)量和內(nèi)醚環(huán)的有無，可將卡拉膠分為κ-、1-、Y-、λ-、ξ-、ω-和ν-卡拉膠等類型，工業(yè)生產(chǎn)和使用的主要為K-卡拉膠、1-卡拉膠和λ -卡拉膠3種。
[0003]卡拉膠是一種海藻硫酸半乳勻多糖，通過化學(xué)或生物手段降解和修飾后，獲得的半乳低聚糖硫酸醋及其衍生物具有多種生物活性如抗病毒、抗腫瘤、抗凝血等，對人體的細(xì)胞免疫和體液免疫功能也具有顯著的增強(qiáng)作用。研究顯示，卡拉膠及其低聚糖的生物學(xué)活性與分子量大小和硫酸根含量密切相關(guān)，一般認(rèn)為，多糖分子量在5000-60000范圍具有明顯的生物活性，因此經(jīng)降解后得到的卡拉膠低聚糖硫酸酷有可能成為新型海洋藥物的重要來源。
[0004]卡拉膠酶主要來源于假單胞菌Paenibacillus、卩遼纖維菌Cytophaga、弧菌K/fo-1o、別單胞菌等。目前利用卡拉膠制備半乳低聚糖硫酸醋的方法主要依賴于化學(xué)法。由于化學(xué)降解方法存在反應(yīng)條件不易控制、降解產(chǎn)率低、目的產(chǎn)物不易分離等無法克服的缺點(diǎn)，而酶解法可以最大程度地保護(hù)反應(yīng)底物的活性基團(tuán)不會在降解過程中受到破壞，從而為藥源開發(fā)奠定了良好的基礎(chǔ)。因此，通過從海藻物質(zhì)或海洋生物中篩選可以產(chǎn)生卡拉膠酶的細(xì)菌成為了國內(nèi)外的科技工作者的主要方向。
[0005]用微生物法獲得卡拉膠酶的研究已經(jīng)有30余年的研究歷史，但迄今為止，僅有為數(shù)不多的幾種微生物被發(fā)現(xiàn)具有生物法制備卡拉膠酶的功能，包Pseudomonascarrageenovora (MeLean M W Journal of Biotechnology, 1979) > Cytophaga sp.1k一 C783 (Sarwar G Journal of Biotechnology, 7987) > Delesseria sanguines(Potin P et.Biotechnology and BioengineeringPseudoalteromonascarrageenovora (Miehel G et.Journal of Fermentation and Bioengineering, 1999) >Pseudoalteromonas PorjDAjTae (劉光嘉et.海洋微生物多糖水解酶的基因克隆和高效表達(dá)，2012)等。因此篩選新的微生物菌種進(jìn)行酶解法降解卡拉膠成為研究者的新任務(wù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是提供一株能高效降解K -卡拉膠的菌株并用其制備K -卡拉膠酶的方法。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案:一株篩選自角叉菜的細(xì)菌，可用于生產(chǎn)K-卡拉膠降解酶，其命名為類芽孢桿菌如ci77m sp.) fjfst-333,已于2013年12月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCC NO: M 2013707，保藏地址為武漢大學(xué)。
[0008]微生物菌株的篩選及鑒定:
本發(fā)明從角叉菜進(jìn)行卡拉膠降解菌的篩選。將角叉菜剪碎用海水(3%海鹽配置)浸泡2d，取上清液加入富集培養(yǎng)基中5°C，160r/min搖床培養(yǎng)3d后，重復(fù)操作3次，取0.1ml富集培養(yǎng)也涂布初篩分離培養(yǎng)基28°C倒置培養(yǎng)48h，挑取周圍形成明顯透明圈和凹坑的菌落劃線初篩培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，挑取單菌落移接傳代培養(yǎng)基斜面，獲得卡拉膠降解菌純培養(yǎng)。純種接到發(fā)酵培養(yǎng)液種32°C，160r/min培養(yǎng)2d后檢測培養(yǎng)液中κ -卡拉膠酶的活力，最終篩選出目標(biāo)菌株Β-333對其進(jìn)行生理生化鑒定和16s rDNA序列分析，確定其為類芽孢桿菌{PaenibadIlus sp.),擬命名為類芽抱桿菌sp.) f jfst-333。
[0009]用所述的類芽孢桿菌sp.) f jfst-333生產(chǎn)K-卡拉膠酶的方法步驟如下: ①將類芽孢桿菌sp.) fjfst-333接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝30ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)24h后，取Iml培養(yǎng)液再次接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)56h，發(fā)酵液離心(5000r/min, IOmin)去除沉淀,取上清液；
②用250ml三角瓶裝20ml只含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% κ -卡拉膠底物的培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發(fā)酵酶液，于32°C反應(yīng)lh，得到含κ -卡拉膠酶的發(fā)酵液；
③將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過4°C，8000-10000g冷凍離心10-20min之后，取上清液；
④將上清液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%-80%的飽和硫酸銨，加入后繼續(xù)攪拌lh，放置冰箱沉降過夜，40C，8000-10000g離心20-40min取沉淀；
⑤沉淀置于蒸餾水中透析48h，冷凍干燥后得到粗酶粉，_20°C保存；
⑥粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI緩沖液溶解，濾紙過濾除去不溶性雜質(zhì)，經(jīng)陰離子交換色譜 Q-sepharose Fast Flow 分離，用含有 0.1~0.6mol/L NaCI 的 0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI緩沖液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，流速為1.2ml/min,于280nm檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)含量，分布收集洗脫液，4.5ml/管，測定峰位的酶活；
⑦將試管中有活性的部分合并進(jìn)行冷凍干燥，即成κ-卡拉膠酶半成品。
[0010]⑧將Sephcryl S-100 凝膠過濾層析柱(Φ 1.6cm*80cm)用緩沖液(0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl)平衡后，秤取κ -卡拉膠酶半成品0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱。用緩沖液(0.02mol/L, pH7.5的Tris-HCl)進(jìn)行洗脫，控制流速為0.lml/min。洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集，4ml/管，分別測定出峰部分試管的酶活，將有活力的部分合并，經(jīng)充分透析脫鹽后，超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得到κ -卡拉膠酶成品。
[0011]所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基:氯化鈉15g、K -卡拉膠2g、酵母膏l(xiāng)g、無機(jī)鹽母液100ml、水900ml、pH7.5，其中無機(jī)鹽母液=NaNO3 20g、MgS04.7H20 5g,K2HPO4 IOgXaCl2 lg、蒸餾水 IL0
[0012]步驟②所述培養(yǎng)基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
[0013]用該方法生產(chǎn)的κ -卡拉膠酶的檢測方法:
取步驟③得到含有κ -卡拉膠酶的發(fā)酵液上清液lmL，加入20mL的卡拉膠底物(其中含有0.5%卡拉膠)，置于32°C酶解lh，后加入1.0mLDNS,沸水浴5min。冷卻至室溫后，用蒸餾水補(bǔ)齊刻度，使用分光光度計在540nm下進(jìn)行檢測。IU定義為Imin產(chǎn)生Iug卡拉膠寡糖的值。
[0014]本發(fā)明的有益效果:
①新篩選出一株能高效生產(chǎn)κ-卡拉膠酶的菌株，分類命名為類芽孢桿菌{PaenibadIlus sp.) fjfst-333。
[0015]②本發(fā)明以該菌作為菌種，以常見碳源，氮源，無機(jī)鹽組成的發(fā)酵培養(yǎng)基，可以在48-60h內(nèi)達(dá)到最大酶產(chǎn)量，酶活為67U/ml。
【具體實(shí)施方式】
[0016]以下是說明本發(fā)明的具體實(shí)施例，但本發(fā)明并不限于此。
[0017]實(shí)施例1
以角叉菜做樣品進(jìn)行κ -卡拉膠降解菌的篩選。將角叉菜剪碎用海水(3%海鹽配置)浸泡2d，取上清液加入富集培養(yǎng)基中5°C，160r/min搖床培養(yǎng)3d后，重復(fù)操作3次，取0.1ml富集培養(yǎng)也涂布初篩分離培養(yǎng)基28°C倒置培養(yǎng)48h，挑取周圍形成明顯透明圈和凹坑的菌落劃線初篩培養(yǎng)基，培養(yǎng)48h后，挑取單菌落移接傳代培養(yǎng)基斜面，獲得κ -卡拉膠降解菌純培養(yǎng)。純種接到發(fā)酵培養(yǎng)液種32°C，160r/min培養(yǎng)2d后檢測培養(yǎng)液中κ -卡拉膠酶的活力，最終篩選出目標(biāo)菌株Β-333。
[0018]實(shí)施例2
經(jīng)形態(tài)學(xué)和生理生化特性研究，Β-333菌株的特征如下:
菌落形態(tài):菌落表面微隆起、呈乳黃色、粘連，邊緣整齊。
[0019]細(xì)胞形態(tài):此為革蘭氏染色陽性、陰性，形態(tài)為桿狀，鞭毛。
[0020]生理生化特征:為兼性厭氧菌，氧化酶反應(yīng)可變，V-P反應(yīng)(乙酰甲基甲醇產(chǎn)生)可變，V-P液的pH 4~6，不產(chǎn)硫化氫。
[0021 ] 對該菌株的16S rRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增與序列測定，發(fā)現(xiàn)其16S rRNA的基因部分片斷長度為1539bp，經(jīng)過NCBI和核糖體數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對，鑒定為類芽孢桿菌(.PaenibadIlus sp.),擬命名為類芽抱桿菌sp.) f jfst-333,菌株的 16SrRNA序列具體可見序列表。
[0022]實(shí)施例3
①將類芽孢桿菌sp.) fjfst-333接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝30ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)24h后，取Iml培養(yǎng)液再次接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)56h。發(fā)酵液離心(5000r/min, IOmin)去除沉淀,取上清液。所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基:氯化鈉15g、κ -卡拉膠2g、酵母膏l(xiāng)g、無機(jī)鹽母液100ml、水900ml、ρΗ7.5。
[0023]無機(jī)鹽母液=NaNO320g、MgSO4.7H20 5g、K2HPO4 10g、CaCl2 lg、蒸餾水 1L。
[0024]②用250ml三角瓶裝20ml只含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% κ -卡拉膠底物的培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發(fā)酵酶液。于32°C反應(yīng)lh，得到含κ-卡拉膠酶的發(fā)酵液并測其酶活。所述培養(yǎng)基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。 [0025]該實(shí)施例所得的瓊膠酶的活力為67U/mL。
[0026]實(shí)施例4
①.將類芽孢桿菌如ciJJmsp.) fjfst-333接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝30ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種菌落，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)24h后，取Iml培養(yǎng)液再次接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)56h，發(fā)酵液離心(5000r/min, IOmin)去除沉淀,取上清液。所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基:氯化鈉15g、κ -卡拉膠2g、酵母膏l(xiāng)g、無機(jī)鹽母液100ml、水900ml、ρΗ7.5。
[0027]無機(jī)鹽母液=NaNO320g、MgSO4.7H20 5g、K2HPO4 10g、CaCl2 lg、蒸餾水 1L。
[0028]②.用250ml三角瓶裝20ml只含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% κ -卡拉膠底物的培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發(fā)酵酶液，于32°C反應(yīng)lh，得到含κ -卡拉膠酶的發(fā)酵液，所述培養(yǎng)基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
[0029]③.將發(fā)酵培養(yǎng)基經(jīng)過4°C，8000_10000g冷凍離心10_20min之后，取上清液。
[0030]④.將上清液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%_80%的飽和硫酸銨，加入后繼續(xù)攪拌lh，放置冰箱沉降過夜，40C, 1000Og離心40min取沉淀；
⑤.沉淀置于蒸餾水中透析48h，冷凍干燥后得到粗酶粉，_20°C保存；
⑥.粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI緩沖液溶解，濾紙過濾除去不溶性雜質(zhì)，經(jīng)陰離子交換色譜 Q_sepharose Fast Flow 分離，用含有 0.1~0.6mol/L NaCI 的 0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI緩沖液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，流速為1.2ml/min,于280nm檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)含量，分布收集洗脫液，4.5ml/管，測定峰位的酶活；
⑦.將試管中有活性的部分合并進(jìn)行冷凍干燥，即成κ-卡拉膠酶半成品；
⑧.將Seph cryl S-100 凝膠過濾層析柱(Φ 1.6cm*80cm)用緩沖液(0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl)平衡后，秤取κ -卡拉膠酶半成品0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱。用緩沖液(0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl)進(jìn)行洗脫，控制流速為0.lml/min。洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集(4ml/管)，分別測定出峰部分試管的酶活，將有活力的部分合并，經(jīng)充分透析脫鹽后，超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得到κ -卡拉膠酶成品。
【權(quán)利要求】
1.一株類芽孢桿菌，其特征在于:所述菌株為類芽孢桿菌sp.)fjfst-333,已于2013年12月25日在中國典型培養(yǎng)物保藏中心登記保藏，其保藏號為CCTCC M 2013707。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一株類芽孢桿菌，其特征在于:所述類芽孢桿菌(.Paeni bad Ilus sp.) fjfst-333 的 16S rRNA 序列如 SEQ ID N0.1 所不。
3.一株如權(quán)利要求1所述的一株類芽孢桿菌的用途，其特征在于:用于制備K-卡拉膠酶。
4.一株如權(quán)利要求1所述的類芽孢桿菌用于制備K-卡拉膠酶的方法，其特征在于:包括如下步驟: ①.將類芽孢桿菌sp.)f jfst-333接種到產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，250ml三角瓶裝30ml產(chǎn)酶培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種菌落，320C、160r/min搖床培養(yǎng)24h后，取Iml培養(yǎng)液再次接種產(chǎn)酶培養(yǎng)基，32°C、160r/min搖床培養(yǎng)56h，發(fā)酵液5000r/min離心IOmin,去除沉淀,取上清液； ②.用250ml三角瓶裝20ml只含質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5% κ -卡拉膠底物的培養(yǎng)基，按常規(guī)方法滅菌、冷卻并接種Iml上清發(fā)酵酶液，于32°C反應(yīng)lh，得到含κ-卡拉膠酶的發(fā)酵液，所述培養(yǎng)基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml, ρΗ7.5 ； ③.將發(fā)酵培養(yǎng)基 經(jīng)過4°C，8000-10000g冷凍離心10-20min之后，取上清液； ④.將上清液加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為60%-80%的飽和硫酸銨，加入后繼續(xù)攪拌lh，放置冰箱沉降過夜,40C，8000-10000g 離心 20-40min 取沉淀； ⑤.沉淀置于蒸餾水中透析48h，冷凍干燥后得到粗酶粉，_20°C保存； ⑥.粗酶用0.02mo/L pH7.5的Tris-HCI緩沖液溶解，濾紙過濾除去不溶性雜質(zhì)，經(jīng)陰離子交換色譜 Q_sepharose Fast Flow 分離，用含有 0.1~0.6mol/L NaCI 的 0.05mol/LpH7.2的Tris-HCI緩沖液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，流速為1.2ml/min,于280nm檢測洗脫液中的蛋白質(zhì)含量，分布收集洗脫液，4.5ml/管，測定峰位的酶活； ⑦.將試管中有活性的部分合并進(jìn)行冷凍干燥，即成κ-卡拉膠酶半成品； ⑧.將S印hcrylS-100凝膠過濾層析柱用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液平衡后，秤取κ -卡拉膠酶半成品0.05g溶于4mL平衡緩沖液中，6000g低溫離心20min后取上清液上層析柱，用0.02mol/L,pH7.5的Tris-HCl緩沖液進(jìn)行洗脫，控制流速為0.lml/min,洗脫液經(jīng)紫外檢測并分部收集，4ml/管，分別測定出峰部分試管的酶活，將有活力的部分合并，經(jīng)充分透析脫鹽后，超濾膜濃縮，對濃縮液冷凍干燥，得到κ -卡拉膠酶成品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一株綠膿桿菌用于制備κ-卡拉膠酶的方法，其特征在于:所述產(chǎn)酶培養(yǎng)基:氯化鈉15g、κ -卡拉膠2g、酵母膏l(xiāng)g、無機(jī)鹽母液100ml、水900ml、ρΗ7.5，其中無機(jī)鹽母液=NaNO3 20g、MgSO4.7H20 5g、K2HPO4 10g、CaCl2 lg、蒸餾水 IL0
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一株綠膿桿菌用于制備κ-卡拉膠酶的方法，其特征在于:步驟②所述培養(yǎng)基:κ -卡拉膠5g，蒸餾水1000ml，pH7.5。
【文檔編號】C12N1/20GK103923853SQ201410093127
【公開日】2014年7月16日 申請日期:2014年3月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月14日
【發(fā)明者】張龍濤, 郭娟娟, 曾紹校, 鄭寶東, 張怡, 歐洋, 黃旭輝 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)