專(zhuān)利名稱(chēng)：用于膀胱癌篩查的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及膀胱癌的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，更確切的說(shuō)是利用酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)篩查膀胱腫瘤。該技術(shù)是利用酸性磷酸酶化學(xué)染色法對(duì)液基制片法制片的細(xì)胞樣本進(jìn)行處理，利用該特異性染色使異常細(xì)胞胞漿內(nèi)形成鮮明的紅色沉淀，使異常細(xì)胞帶有明顯標(biāo)記的技術(shù)。
背景技術(shù)：
膀胱癌是我國(guó)最常見(jiàn)的泌尿系腫瘤，大約90%的膀胱癌為膀胱尿路上皮癌。膀胱癌的復(fù)發(fā)率很高，60% 70%的患者可能復(fù)發(fā)，11%復(fù)發(fā)的患者可進(jìn)展為浸潤(rùn)性腫瘤。目前對(duì)于膀胱癌診斷及隨訪(fǎng)主要依賴(lài)于膀胱鏡檢查和尿細(xì)胞學(xué)檢查。前者為診斷膀胱癌的金標(biāo)準(zhǔn)，但為侵入性的檢查，患者依從性差，價(jià)格比較昂貴，不宜作為常規(guī)檢查；后者雖然特異度高且無(wú)創(chuàng)，但對(duì)低度表淺性的腫瘤敏感性低，容易產(chǎn)生假陰性的結(jié)果。因此，尋找敏感度及特異度高的膀胱癌腫瘤標(biāo)志物作為膀胱癌的早期診斷、監(jiān)測(cè)以及預(yù)后評(píng)估受到越來(lái)越多的關(guān)注。尿細(xì)胞學(xué)的取樣方法主要有自然留尿和膀胱灌洗兩種，通常取中段尿或膀胱灌洗液的中間部分作為細(xì)胞學(xué)標(biāo)本來(lái)源。Badalamen等指出膀胱灌洗標(biāo)本細(xì)胞學(xué)檢查的靈敏度為61%，而自然留尿的靈敏度為41% ；反復(fù)留尿三次靈敏度為60%，仍低于單次膀胱灌洗細(xì)胞學(xué)檢查。尿細(xì)胞學(xué)制片分析方法主要有傳統(tǒng)涂片和新近開(kāi)展的液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)，傳統(tǒng)涂片讀片時(shí)易被紅細(xì)胞干擾，而液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)可以去除干擾診斷的雜質(zhì)制成背景清晰的液基細(xì)胞片，更好地保存細(xì)胞學(xué)形態(tài)，使得觀察更為容易。液基細(xì)胞學(xué)包括液基薄層細(xì)胞學(xué)技術(shù)和液基沉降細(xì)胞學(xué)技術(shù)，前者是將采集的脫落細(xì)胞轉(zhuǎn)移至含有保存液的特制小瓶中，通過(guò)過(guò)濾膜過(guò)濾將細(xì)胞和雜質(zhì)分離，最終在玻片上制成直徑為20mm的細(xì)胞薄層，固定后行巴氏染色，一次只能處理一份標(biāo)本。后者是將脫落細(xì)胞和保存液通過(guò)比重液離心后，以自然沉淀的方法將標(biāo)本中的可疑細(xì)胞與雜質(zhì)分離，最終在玻片上制成直徑為17-20mm的細(xì)胞薄層， 可同時(shí)處理多份標(biāo)本。酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)主要用于膀胱腫瘤的篩查。該技術(shù)是利用酸性磷酸酶化學(xué)染色法對(duì)液基制片法制片的細(xì)胞樣本進(jìn)行處理，利用該特異性染色使異常細(xì)胞胞漿內(nèi)形成鮮明的紅色沉淀，使異常細(xì)胞帶有明顯標(biāo)記的技術(shù)。該技術(shù)將酶組織化學(xué)染色用于臨床分子水平診斷，具有敏感性高，假陰性率低等特點(diǎn)。該技術(shù)的運(yùn)用能夠幫助醫(yī)生迅速找到異常細(xì)胞。酸性磷酸酶(Acid Phosphatase，ACP)是溶酶體的標(biāo)志酶之一，其活性反應(yīng)了細(xì)胞溶酶體的激活情況。在膀胱癌變細(xì)胞中，酸性磷酸酶表達(dá)豐富，而在正常細(xì)胞中則檢測(cè)不到其表達(dá)。酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)是利用異常的上皮細(xì)胞內(nèi)ACP活性增高的特點(diǎn)，通過(guò)檢測(cè)ACP 活性來(lái)甄別正常與病變細(xì)胞。目前通行的HE染色方法是液基薄層細(xì)胞制片法以及傳統(tǒng)涂片，上述方法單純依靠醫(yī)生根據(jù)細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞核形態(tài)給出檢查結(jié)果，工作量大，主觀性較強(qiáng)，假陰性率高。本發(fā)明在于提供一種利用酸性磷酸酶化學(xué)染色法對(duì)液基制片法制片的細(xì)胞樣本進(jìn)行處理篩查膀胱癌的方法，該技術(shù)的運(yùn)用能夠大大增加觀察的可視性，提高診斷的準(zhǔn)確性。并且操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，靈敏度高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以酸性磷酸酶催化的特異性反應(yīng)所生成產(chǎn)物與偶氮付品紅偶聯(lián)生成的紅色沉淀為標(biāo)記，從分子生物學(xué)層次鑒定異常細(xì)胞，保證了診斷的準(zhǔn)確性和靈敏度。同時(shí)夠助醫(yī)生迅速找到病變細(xì)胞，醫(yī)生在診斷時(shí)只需針對(duì)染色陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行核型分析，減少醫(yī)生工作量。結(jié)合液基細(xì)胞制片技術(shù)和常規(guī)核染色，不僅最大程度上保留了細(xì)胞形態(tài)，也使異常細(xì)胞同時(shí)具有胞漿紅染和核增大、核深染的特點(diǎn)，使細(xì)胞核質(zhì)比例異常的形態(tài)更加清晰， 使細(xì)胞信息最大化，更易于判讀。酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)利用在異常膀胱移行上皮中具有高活性的磷酸酶為特異性的標(biāo)志物而開(kāi)發(fā)，其核心原理是利用萘酚鹽作為酸性磷酸酶的底物，利用偶氮化合物與硝酸鹽作用形成的重氮鹽作為偶聯(lián)物在異常細(xì)胞內(nèi)形成紅色沉淀。最近的細(xì)胞分子實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果提示，腫瘤細(xì)胞中P53相對(duì)于正常細(xì)胞顯著減少或表現(xiàn)為失去正常功能的突變，這樣解除P53對(duì)細(xì)胞自噬降解系統(tǒng)的抑制，從而增強(qiáng)該系統(tǒng)的活性。由此可見(jiàn)，腫瘤細(xì)胞可能可以通過(guò)溶酶體的活性來(lái)顯示。酸性磷酸酶是溶酶體的標(biāo)志酶之一，可以通過(guò)檢測(cè)酸性磷酸酶的活性來(lái)反映溶酶體酶的激活情況。與我們推測(cè)一致的是，正常的移行上皮細(xì)胞中酸性磷酸酶為陰性，而異常上皮細(xì)胞酸性磷酸酶為陽(yáng)性。而且，現(xiàn)在，也沒(méi)有涉及在尿樣中癌細(xì)胞酸性磷酸酶高表達(dá)檢測(cè)的相關(guān)研究，更沒(méi)有將尿樣中酸性磷酸酶高表達(dá)與膀胱癌相聯(lián)系的研究。本發(fā)明研究表明，只有泌尿系腫瘤(尤其是膀胱癌)才會(huì)在尿樣中檢測(cè)到異常移行上皮細(xì)胞中酸性磷酸酶的高表達(dá)，即尿樣中該酶的高表達(dá)對(duì)膀胱癌是特異的。酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)是據(jù)酸性磷酸酶在異常上皮細(xì)胞特異性高表達(dá)的特點(diǎn)開(kāi)發(fā)研究的膀胱異常細(xì)胞篩查技術(shù)。臨床研究表明，與傳統(tǒng)的HE染色方法相比，該技術(shù)具有快速和高敏感的特點(diǎn)，為膀胱異常移行上皮細(xì)胞的診斷與普查提供了一個(gè)方便可靠的方法。本發(fā)明涉及一種膀胱癌的檢測(cè)試劑盒及其應(yīng)用，所述試劑盒包括酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑、酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和沉降緩沖液。染色試劑包括由固定液、染色液、鹽酸品紅、亞硝酸鈉、醋酸鈉溶液、蘇木素復(fù)染液及濾紙組成。更優(yōu)選由(1)固定液10%福爾馬林；(2)酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色液2-30. 5g/l萘酚AS-BI磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺(即萘酚AS-BI磷酸鹽的二甲基甲酰胺溶液)；(3)鹽酸品紅1-10%鹽酸品紅；(4)亞硝酸鈉0. 1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸鈉溶液1. 5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)蘇木素復(fù)染液；(7)濾紙組成。
本發(fā)明的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液有防腐、除去雜質(zhì)、溶解紅細(xì)胞的功能，使用其配合本發(fā)明的沉降緩沖液進(jìn)行所述制片、染色的效果要優(yōu)于傳統(tǒng)保存液和沉降緩沖液。本發(fā)明所述保存液組成如下所示(1)45% 甲醇(2) 0. 2-0. 5mM EDTA(3) 0. ImM NaCl(4) 0. IM 醋酸緩沖液，pH 4-6(5)dd H2O本發(fā)明的沉降緩沖液同樣優(yōu)于傳統(tǒng)緩沖液，其制片、染色后得到的圖像更加清晰， 便于觀察。本發(fā)明的沉降緩沖液有以下兩種配方配方a 0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方b IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA，0. 9% (m/v)NaCl。本發(fā)明還涉及所述酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑在制備用于篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途。本發(fā)明還涉及所述酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑和保存液在制備用于篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途。另外，本發(fā)明還涉及所述酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑、保存液和沉降緩沖液在制備用于篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途。


圖1 酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)傳統(tǒng)方法制片結(jié)果照片O00X)，染紅的細(xì)胞為膀胱異常細(xì)胞，病理證實(shí)為上皮內(nèi)瘤變，即病變的早期。圖中\(zhòng)指示紅細(xì)胞，而^>指示異常細(xì)胞團(tuán)。圖2 酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)傳統(tǒng)方法制片結(jié)果照片，其中左圖為為200X ；右圖為 400X ；圖中藍(lán)色盤(pán)狀小顆粒為紅細(xì)胞。圖中\(zhòng)指示正常尿路上皮細(xì)胞，&指示異常細(xì)胞。圖3 液基細(xì)胞沉降制片染色結(jié)果左上圖為200X。左下圖為左上圖中異常細(xì)胞放大圖，可見(jiàn)胞質(zhì)紅染，提示ACP高表達(dá)；右上圖為左上圖中正常的上皮細(xì)胞放大圖，無(wú)胞質(zhì)染紅；右下圖為左上圖中鏡片切面樣核的異常細(xì)胞的放大圖，同樣可以見(jiàn)到胞質(zhì)紅染。圖4 陽(yáng)性對(duì)照膀胱癌細(xì)胞株BIU-87 (購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢)酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色G00X)。可見(jiàn)視野內(nèi)癌細(xì)胞均有不同程度的紅染，且紅染隨核異型性程度增高而加深。圖5 將膀胱癌細(xì)胞株BIU-87分別在本發(fā)明所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和傳統(tǒng)保存液中保存7日后的染色結(jié)果。其中，圖5A為BIU-87在保存液中保存一周后，在配方a 的沉降緩沖液中自然沉降制片，酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色結(jié)果GOOx)；圖5B為BIU-87在本發(fā)明保存液中保存一周后，在配方b所述沉降緩沖液中自然沉降制片，酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色結(jié)果GOOx)；圖5C為BIU-87在傳統(tǒng)保存液中保存一周后，在配套的緩沖液中自然沉降制片，酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色結(jié)果GOOx)。具體實(shí)施例
實(shí)施例1
一、酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑盒成分
1)固定液10%福爾馬林；
2)酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸鹽溶于:
3)鹽酸品紅1-10%鹽酸品紅；
4)亞硝酸鈉0.1-0. 5M NaNO2 ；
5)醋酸鈉溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；
6)蘇木素復(fù)染液；
7)濾紙
二、保存液成分
1)45%甲醇；
2)0. 2-0. 5mM EDTA ；
3)0.ImM NaCl ；
4)0.IM醋酸緩沖液，pH 4-6 ；
.甲基甲酰胺(5)dd H2O。三、沉降緩沖液成分配方a 0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方b IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA，0. 9% (m/v)NaCl.三、取樣及操作A.常規(guī)制片依常規(guī)留取清晨清潔中段尿15mL，4000rpm離心5min，傾去液體。采用傳統(tǒng)常規(guī)方法制片細(xì)胞取出后置于兩張載玻片之間，稍加壓力反向拉開(kāi)，即成兩張厚薄均勻的涂片。 15mL尿樣可制2-4張涂片。待細(xì)胞干燥后用10%福爾馬林固定(試劑A) lmin，之后按照染色步驟染色。B.液基自然沉降法制片依常規(guī)留取清晨中段尿15mL，4000rpm離心5min，傾去液體。用保存液重懸細(xì)胞， 在保存液中細(xì)胞可以保存一至四周。制片時(shí)將保存液離心，傾去液體，用沉降緩沖液重懸細(xì)胞。自然沉降方法制片，10%福爾馬林固定(試劑A) lmin。專(zhuān)用保存液有防腐、除去雜質(zhì)、 溶解紅細(xì)胞的功能。同時(shí)，以膀胱癌細(xì)胞株BIU-87 (購(gòu)自中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，武漢)酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色作為陽(yáng)性對(duì)照。三、染色步驟1.將固定后的涂片用水充分洗凈2.將涂片放入酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色液中置于25_37°C染色20-30分鐘3.用水充分洗凈
4.將涂片放入蘇木素復(fù)染液5分鐘，流水沖洗5分鐘6.封片，鏡檢四、染色結(jié)果圖1和圖2為酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)傳統(tǒng)方法制片結(jié)果照片；圖3和圖4為液基細(xì)胞沉降制片染色結(jié)果。由上述圖1-3中可以看到，異常上皮細(xì)胞胞質(zhì)均被染紅，而正常細(xì)胞無(wú)著色現(xiàn)象；而且液基細(xì)胞沉降制片染色結(jié)果優(yōu)于傳統(tǒng)方法制片，且結(jié)果更為明顯，更加易于觀察。同時(shí)，在陽(yáng)性對(duì)照膀胱癌細(xì)胞株BIU-87酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色中可見(jiàn)視野內(nèi)癌細(xì)胞均有不同程度的紅染，且紅染隨核異型性程度增高而加深。實(shí)施例2選取臨床上已經(jīng)被鑒定為膀胱癌、肝癌、肺癌、大腸癌、胃癌、宮頸癌患者及健康人各3例，按照實(shí)施例1的方法取尿樣，并進(jìn)行酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色。結(jié)果顯示，3例膀胱癌患者均出現(xiàn)了圖1-3中的胞質(zhì)染紅，而在其余癌癥患者尿樣及健康人尿樣中均無(wú)胞質(zhì)染紅出現(xiàn)。上述試驗(yàn)結(jié)果表明，在尿樣中檢測(cè)到酸性磷酸酶的高表達(dá)對(duì)膀胱癌是具有較高特異性的，本申請(qǐng)的方法和試劑盒能夠用于篩查診斷或輔助篩查診斷膀胱癌患者。實(shí)施例3酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和沉降緩沖液的效果試驗(yàn)將膀胱癌細(xì)胞株BIU-87分別在本申請(qǐng)所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和已有某保存液(購(gòu)自廈門(mén)邁威生物科技有限公司)中保存7日后，配合沉降緩沖液進(jìn)行制片和染色， 得到的結(jié)果如附圖5所示，在本發(fā)明的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和沉降緩沖液中進(jìn)行的制片和染色效果(圖5A、5B)效果明顯好于對(duì)照組細(xì)胞保存液和沉降緩沖液(廈門(mén)邁威生物科技有限公司，圖5C)。其具體比較結(jié)果如下表所示(“ + ”多表示效果更優(yōu))
權(quán)利要求
1.一種用于篩查診斷或輔助篩查診斷膀胱癌的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒由酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑、酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和沉降緩沖液組成。
2.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于所述染色試劑由固定液、染色液、鹽酸品紅、 亞硝酸鈉、醋酸鈉溶液、蘇木素復(fù)染液及濾紙組成。
3.權(quán)利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑的具體組成如下所示(1)固定液10%福爾馬林；(2)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺；(3)鹽酸品紅1-10%鹽酸品紅；(4)亞硝酸鈉0.1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸鈉溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)蘇木素復(fù)染液；(7)濾紙。
4.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液的具體組成如下所示(1)45%甲醇；(2)0. 2-0. 5mM EDTA ；(3)0.ImM NaCl ；(4)0.IM醋酸緩沖液，pH 4-6 ；(5)ddH20。
5.權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述的沉降緩沖液有配方a和配方b兩種， 其具體組成分別為配方 a :0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方 b: IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA,0. 9% (m/v) NaCl
6.酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑在制備篩查診斷或輔助篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途，其特征在于，所述染色試劑由固定液、染色液、鹽酸品紅、亞硝酸鈉、醋酸鈉溶液、蘇木素復(fù)染液及濾紙組成。
7.權(quán)利要求6所述的用途，其特征在于，所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑的具體組成如下所示(1)固定液10%福爾馬林；(2)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺；(3)鹽酸品紅1-10%鹽酸品紅；(4)亞硝酸鈉0.1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸鈉溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)蘇木素復(fù)染液；(7)濾紙。
8.一種酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液，其特征在于，所述保存液的具體組成如下所示(1)45%甲醇；(2)0. 2-0. 5mM EDTA ；(3)0.ImM NaCl ；(4)0.IM醋酸緩沖液，pH 4-6 ；(5)ddH20。
9.權(quán)利要求8所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液在制備篩查診斷或輔助篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途。
10.一種沉降緩沖液，其特征在于，所述沉降緩沖液的組成如配方a或配方b所示配方 a :0. 5XPBS, pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA ；配方 b =IOmM Tris-HCl pH = 7. 0-7. 4，2_5mM EDTA,0. 9% (m/v) NaCl
11.權(quán)利要求10的沉降緩沖液在制備篩查診斷或輔助篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途。
12.酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑、權(quán)利要求8所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和權(quán)利要求 11所述的沉降緩沖液在制備用于篩查診斷或輔助篩查診斷膀胱癌患者的試劑盒中的用途， 其特征在于，所述酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑由固定液、染色液、鹽酸品紅、亞硝酸鈉、醋酸鈉溶液、蘇木素復(fù)染液及濾紙組成。
13.權(quán)利要求12所述的用途，其特征在于，所述的酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑的具體組成如下所示(1)固定液10%福爾馬林；(2)染色液2-30.5g/l萘酚AS-BI磷酸鹽溶于二甲基甲酰胺；(3)鹽酸品紅1-10%鹽酸品紅；(4)亞硝酸鈉0·1-0. 5M NaNO2 ；(5)醋酸鈉溶液1.5-4. 5M，pH 4. 5-5. 9 ；(6)蘇木素復(fù)染液；(7)濾紙。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)技術(shù)篩查膀胱腫瘤，該技術(shù)是利用酸性磷酸酶化學(xué)染色法對(duì)液基制片法制片的細(xì)胞樣本進(jìn)行處理，利用該特異性染色使異常細(xì)胞胞漿內(nèi)形成鮮明的紅色沉淀，使異常細(xì)胞帶有明顯標(biāo)記的技術(shù)。本發(fā)明提供用于上述檢測(cè)的試劑盒，試劑盒主要由酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)染色試劑、酶標(biāo)液基細(xì)胞學(xué)保存液和沉降緩沖液組成，能夠提供良好的檢測(cè)特異性和良好的染色效果。
文檔編號(hào)C12Q1/04GK102260731SQ20111017804
公開(kāi)日2011年11月30日 申請(qǐng)日期2011年6月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月28日
發(fā)明者李俊, 沈玉先, 王陽(yáng), 田添 申請(qǐng)人:合肥安旸生物醫(yī)藥有限公司