專利名稱：一種2-酮基-l-古龍酸的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種2-酮基-L-古龍酸的制備方法。
背景技術(shù)：
目前國內(nèi)生產(chǎn)古龍酸多采用二步發(fā)酵法，二步發(fā)酵法通常采用混合菌系進(jìn)行發(fā)酵，這種混合菌系最為常用的兩種菌一種是氧化葡萄糖酸桿菌(俗稱小菌)，另一種是巨大芽孢桿菌(俗稱大菌)，其中小菌為產(chǎn)酸菌，胞內(nèi)分泌L-山梨糖脫氫酶可以將山梨糖轉(zhuǎn)化成2-酮基-L-古龍酸，但是單獨(dú)培養(yǎng)生長緩慢，產(chǎn)酸能力低；大菌不能產(chǎn)酸，但是它可以作為小菌的伴生菌，在發(fā)酵中起輔助作用，促進(jìn)小菌的生長和產(chǎn)酸。研究證實(shí)，大菌胞內(nèi)液和胞外液菌均可以促進(jìn)小菌生長，縮短小菌生長的延遲期。目前國內(nèi)古龍酸生產(chǎn)過程中，多采用流加碳酸鈉來控制調(diào)節(jié)pH，該反應(yīng)的產(chǎn)物是可溶的古龍酸鈉，在反應(yīng)后期，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，古龍酸鈉的濃度逐漸升高，容易對發(fā)酵反應(yīng)形成產(chǎn)物抑制，從而降低反應(yīng)產(chǎn)率。為了解決上述問題，本發(fā)明提出在古龍酸生產(chǎn)過程中采用一種新的pH調(diào)節(jié)劑， 一方面可以避免高濃度產(chǎn)物抑制產(chǎn)酸，利于發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)程，使發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)酸濃度能夠提高 8-10%，另一方面可降低工藝難度，提高設(shè)備利用率。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種2-酮基-L-古龍酸的制備方法。根據(jù)上述生產(chǎn)方法的不足，本發(fā)明采用氫氧化鈣替代碳酸鈉調(diào)節(jié)發(fā)酵過程中的pH 值，由于其反應(yīng)產(chǎn)物為難溶的古龍酸鈣，降低了高濃度產(chǎn)物對反應(yīng)速度和進(jìn)程的抑制，利于產(chǎn)酸。本發(fā)明的技術(shù)方案為在發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制PH值；所述氫氧化鈣可選擇液體或固體，優(yōu)選質(zhì)量濃度為20-50%的懸浮液；更優(yōu)選質(zhì)量濃度為30%的懸浮液。為進(jìn)一步提高生產(chǎn)效率，本發(fā)明人進(jìn)行了大量的研究，優(yōu)化了發(fā)酵過程參數(shù)，要求在發(fā)酵過程中將PH值控制為6. 7-7. 0 ；控制初始山梨糖濃度為20-25mg/ml，并在發(fā)酵過程中流加山梨糖，使發(fā)酵液中的山梨糖濃度控制在20-2aiig/ml。優(yōu)選地，所述pH值為6. 7-6. 8。其中，流加山梨糖可采用山梨糖糖液，其濃度可采用各種常用的濃度，優(yōu)選的，所述山梨糖糖液的濃度為200mg/L。另外，還通過控制反應(yīng)溫度控制反應(yīng)進(jìn)程，優(yōu)選的，控制反應(yīng)起始溫度為^rc，中后期(即M-38小時(shí)之后)將溫度升至30-31°C。采用上述參數(shù)，發(fā)酵周期為44-48小時(shí)。發(fā)酵過程可采用生產(chǎn)2-酮基-L-古龍酸常用的發(fā)酵液，如采用下述成分的營養(yǎng)液作為發(fā)酵液玉米漿110g/L，磷酸二氫鉀5g/L，硫酸鎂2g/L，尿素10g/L。有益效果本發(fā)明在制備2-酮基-L-古龍酸的過程中，采用流加氫氧化鈣來替代碳酸鈉控制PH值，產(chǎn)物為難溶的古龍酸鈣，降低了高濃度產(chǎn)物抑制，利于產(chǎn)酸。此發(fā)明方法在生產(chǎn)中成功運(yùn)用于大生產(chǎn)。發(fā)酵終點(diǎn)產(chǎn)酸濃度提高8-10%，達(dá)到105-110mg/ml，糖酸轉(zhuǎn)化率提高2-4 %，達(dá)到94-96 % ；此外，流加氫氧化鈣對后提取有利，提高了設(shè)備利用率，大大降低了能耗和物耗。
具體實(shí)施例方式以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。如無特別指明，本發(fā)明采用的發(fā)酵液為下述成分的營養(yǎng)液玉米漿110g/L，磷酸二氫鉀5g/L，硫酸鎂2g/L，尿素10g/L，并添加適量的山梨糖(濃度控制在20 25mg/ ml)構(gòu)成；采用本領(lǐng)域常用的氧化葡萄糖酸桿菌(小菌)(購自菌種保藏中心，保藏號 CGMCC1. 110)和巨大芽孢桿菌(大菌)(購自菌種保藏中心，保藏號CMCC(B)6310 制備菌液。菌液制備過程凍存管--搖瓶活化24h-大小菌分別分離(280C培養(yǎng)小菌2天，大菌2-3天)一選菌落飽滿，邊緣整齊，偏大的小菌單菌落挑一滿環(huán)涂布試管培養(yǎng)一天)一搭上大菌，選菌落飽滿，邊緣整齊，大小適中的大菌單菌落在已搭過小菌的試管上培養(yǎng)2 天)-用無菌水將試管上的菌苔洗下接種子瓶，240r/min,培養(yǎng)Mh)。對照例140m3發(fā)酵罐中初始裝液量為30m3，控制初始山梨糖濃度為25mg/ml，接種量為 30% (大菌和小菌混合種子液)，當(dāng)殘?zhí)墙抵?0mg/ml時(shí)，開始流加山梨糖糖液，糖液的濃度為200mg/L，流加過程控制糖含量為20-2aiig/ml ；同時(shí)，發(fā)酵過程中流加碳酸鈉溶液控制pH 在 6. 7-6. 8。 發(fā)酵過程中，起始溫度為四V，30小時(shí)，溫度升至30°C，36小時(shí)時(shí)，溫度升至31 °C。發(fā)酵周期為46小時(shí)，發(fā)酵終體積為100m3。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中古龍酸含量為90mg/ ml，摩爾轉(zhuǎn)化率為91%。實(shí)施例1140m3發(fā)酵罐中初始裝液量為30m3，控制初始山梨糖濃度為25mg/ml，接種量為 30% (大菌和小菌混合種子液)，當(dāng)殘?zhí)墙抵?0mg/ml時(shí)，開始流加山梨糖糖液，糖液的濃度為200mg/L，流加過程控制糖含量為20-2aiig/ml ；同時(shí)，發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制pH 在 6. 7-6. 8。發(fā)酵過程中，起始溫度為四V，30小時(shí)，溫度升至30°C，36小時(shí)時(shí)，溫度升至31 °C。發(fā)酵周期為44小時(shí)，發(fā)酵終體積為100m3。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中古龍酸含量為 105. lmg/ml，摩爾轉(zhuǎn)化率為94. 5%0實(shí)施例2140m3發(fā)酵罐中初始裝液量為35m3，控制初始山梨糖濃度為25mg/ml，接種量為 30% (大菌和小菌混合種子液)，殘?zhí)墙抵?0mg/ml時(shí)，開始流山梨糖糖液，糖液的濃度為 200mg/L，流加過程控制山梨糖含量為20-2aiig/ml ；發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制pH在 6. 8-7. O0發(fā)酵過程中，起始溫度為^°C，24小時(shí)溫度升至30°C，30小時(shí)溫度升至31 °C。
發(fā)酵周期為46小時(shí)，發(fā)酵終體積為106m3。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中古龍酸含量為106mg/ ml，摩爾轉(zhuǎn)化率為94. 79%。實(shí)施例3140m3發(fā)酵罐中初始裝液量為35m3，初始山梨糖濃度為23mg/ml，接種量為30% (大菌和小菌混合種子液)，殘?zhí)墙抵?0mg/ml時(shí)，開始流加山梨糖糖液，糖液的濃度為 200mg/L，流加過程控制山梨糖糖含量為20-2aiig/ml ；發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制pH在 6. 7-6. 8。發(fā)酵起始溫度為，30小時(shí)溫度升至30°C，36小時(shí)溫度升至31 °C，發(fā)酵周期為 48小時(shí)，發(fā)酵終體積為108m3。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中古龍酸含量為107mg/ml，摩爾轉(zhuǎn)化率為95. 4%。實(shí)施例4140m3發(fā)酵罐中初始裝液量為35m3，初始山梨糖糖濃度為25mg/ml，接種量為 30% (大菌和小菌混合種子液)，殘?zhí)墙抵?0mg/ml時(shí)，開始流加山梨糖糖液，糖液的濃度為200mg/L，流加過程控制糖含量為20-2aiig/ml ；發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制pH在 6. 7-7. 0 ；30小時(shí)后控制在6. 8-7. 0。發(fā)酵過程中，起始溫度為，30小時(shí)溫度升至30°C，36小時(shí)溫度升至31 °C，發(fā)酵周期為48小時(shí)，發(fā)酵終體積為110m3。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中古龍酸含量為110mg/ml，摩爾轉(zhuǎn)化率為96. 01%。實(shí)施例5140m3發(fā)酵罐中初始裝液量為35m3，初始山梨糖糖濃度為23mg/ml，接種量為 30 % (大菌和小菌混合種子液)，殘?zhí)墙抵?2mg/ml時(shí)，開始流加山梨糖糖液，糖液的濃度為200mg/L，流加過程控制糖含量為20-2aiig/ml ；發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制pH在 6. 7-7. 0，32小時(shí)后控制在6. 8-7. O。發(fā)酵過程中，起始溫度為，33小時(shí)溫度升至30°C，38小時(shí)溫度升至31°C，發(fā)酵周期為49小時(shí)，發(fā)酵終體積為110m3。經(jīng)檢測，發(fā)酵液中古龍酸含量為106mg/ml，摩爾轉(zhuǎn)化率為95. 46%。
權(quán)利要求
1.一種2-酮基-L-古龍酸的制備方法，其特征在于，發(fā)酵過程中流加氫氧化鈣控制PH值。
2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵過程中，控制初始山梨糖濃度為 20-25mg/ml。
3.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵過程中流加山梨糖，發(fā)酵液中山梨糖濃度控制在20-2ang/ml。
4.如權(quán)利要求1-3任一所述的制備方法，其特征在于，發(fā)酵過程中控制起始溫度為 29°C, 24-38小時(shí)后將溫度升至30-31°C。
5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述pH值為6.7-7. 0。
6.如權(quán)利要求1或5所述的制備方法，其特征在于，所述pH值為6.7-6. 8。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種2-酮基-L-古龍酸的制備方法。本發(fā)明采用氫氧化鈣替代碳酸鈉來控制發(fā)酵過程中的pH值，一方面可以避免高濃度產(chǎn)物抑制產(chǎn)酸，利于發(fā)酵反應(yīng)進(jìn)程，使發(fā)酵終點(diǎn)古龍酸的含量達(dá)105-110mg/ml，糖酸轉(zhuǎn)化率為94-96％，提高產(chǎn)酸濃度8-10％；另一方面可降低工藝難度，操作簡單，后提取容易，提高了設(shè)備利用率。
文檔編號C12R1/01GK102242178SQ201110169689
公開日2011年11月16日 申請日期2011年6月21日 優(yōu)先權(quán)日2011年6月21日
發(fā)明者李海燕, 李維理, 李榮杰, 穆曉玲, 符秀迪 申請人:安徽豐原發(fā)酵技術(shù)工程研究有限公司