專利名稱：抗藍(lán)藻重組抗體多肽及其基因與制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及環(huán)保生物技術(shù)，特別是一種抗藍(lán)藻重組抗體多肽及其基因與制備方法。
背景技術(shù)：
水體過度營養(yǎng)化造成的藍(lán)藻增生、水體污染是目前威脅世界范圍水環(huán)境的最大危害，給人類造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，給地球生物圈造成無法修復(fù)的危害。隨著我國經(jīng)濟(jì)發(fā)展造成的加速工業(yè)化和城鎮(zhèn)化，生態(tài)環(huán)境污染和惡化日益加劇，水環(huán)境生態(tài)防治已成為我們必需面對和解決的重大問題?，F(xiàn)用抗菌藥物對藍(lán)藻基本無效；藍(lán)藻屬細(xì)菌域第X門-藍(lán)細(xì)菌門的一類原核細(xì)胞，目前能夠控制藍(lán)藻的只有重金屬類化學(xué)制劑，如硫酸銅等。而在實(shí)際應(yīng)用中，由于效果有 限，往往不惜超劑量多次重復(fù)用藥，造成的結(jié)果是在殺傷藍(lán)藻的同時(shí)也將水體中其他有益藻類、水生植物和生物破壞殆盡，給環(huán)境造成了無法逆轉(zhuǎn)的永久性破壞。同時(shí)重金屬類化學(xué)制劑在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的殘留量越來越大，因此人類急需開發(fā)高效且使用安全的抗藍(lán)藻藥物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供一種新型的重組抗藍(lán)藻多肽的基因、重組質(zhì)粒、多肽；此種多肽能特異的殺滅藍(lán)藻細(xì)胞而不會(huì)傷害其他藻類細(xì)胞、植物和動(dòng)物。本發(fā)明的再一目的是提供上述重組抗藍(lán)藻多肽的制備方法。雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為CGMCC No. 4783。上述雜交瘤分泌的單克隆抗體。具有藍(lán)藻識別結(jié)合能力的模擬抗體多肽，是上述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，或根據(jù)上述單克隆抗體的抗原結(jié)合片段上的功能區(qū)域設(shè)計(jì)而得的小分子多肽。所述模擬抗體多肽其氨基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。編碼上述模擬抗體多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示?？顾{(lán)藻重組抗體多肽，由上述具有藍(lán)藻識別結(jié)合能力的模擬抗體多肽可操作地線性連接在大腸菌素多肽的羧基端構(gòu)成，所述大腸菌素選自大腸菌素El, la, lb, A, B或N。所述抗藍(lán)藻重組抗體多肽，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 7所示。編碼上述抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因。所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示。含有編碼上述抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因的重組表達(dá)載體。上述抗藍(lán)藻重組多肽的制備方法，其步驟如下將編碼抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因?qū)氲酱竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，然后分離大腸桿菌表達(dá)的多肽。上述抗藍(lán)藻重組抗體多肽在治理水體過度營養(yǎng)化中的應(yīng)用。
本發(fā)明提供一種抗藍(lán)藻重組抗體多肽，由大腸菌素多肽和抗藍(lán)藻細(xì)胞表面抗原的抗體模擬物多肽組合而成。在該多肽分子中，抗藍(lán)藻細(xì)胞表面抗原的抗體模擬物用于識別并結(jié)合藍(lán)藻使分子中的大腸菌素攻擊藍(lán)藻。由于抗體模擬物為識別藍(lán)藻表面抗原的抗體模擬物，因此本發(fā)明的多肽具有專門攻擊藍(lán)藻細(xì)胞而不損害其它水體生物，因而不會(huì)污染水源，用于水體藍(lán)藻污染的治理非常環(huán)保和安全。本發(fā)明的抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基于CGMCCNo. 4783雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段(Fab)的輕鏈和重鏈的氨基酸序列及核苷酸序列設(shè)計(jì)出的具有藍(lán)藻識別結(jié)合能力的抗體模擬物，如單鏈抗體、抗體小分子模擬物等本領(lǐng)域已經(jīng)熟知的抗體模擬物。在本發(fā)明中，設(shè)計(jì)的抗體模擬物只需要具有抗原識別能力即可實(shí)現(xiàn)發(fā)明目的，因?yàn)榭贵w模擬物的任務(wù)只是引導(dǎo)重組多肽分子到達(dá)目標(biāo)生物細(xì)胞表面，然后由重組多肽中的大腸菌素在目標(biāo)細(xì)胞膜上制造離子通道從而是目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)溶物泄露而死。因此，基于上述單克隆抗體設(shè)計(jì)的抗體模擬物，只要能起到識別目標(biāo)抗原的目的，這些抗體模擬物與大腸菌素連接而成的重組多肽都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式中，抗體模擬物為抗藍(lán)藻原生質(zhì)體表面抗原的單克隆抗體(由CGMCC No. 4783的雜交瘤細(xì)胞分泌)的幾個(gè)結(jié)構(gòu)域VfDRl、VHFR2和Vl⑶R3按 VHCDRl-VHFR2-VfDR3結(jié)構(gòu)連接而成的28肽抗體模擬物。室內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證明，該抗體模擬物構(gòu)成的抗藍(lán)藻多肽可以在水介質(zhì)中自由游動(dòng)，具有自動(dòng)尋找藍(lán)藻細(xì)胞表面抗原的生物學(xué)活性。28肽抗體模擬物構(gòu)成具有易于克隆和表達(dá)且具有與原始抗體相同的識別活性的優(yōu)點(diǎn)，可以引導(dǎo)重組多肽中的大腸菌素到達(dá)藍(lán)藻細(xì)胞膜上形成離子通道來殺傷這些藍(lán)藻細(xì)胞，該重組多肽具有現(xiàn)用治理水污染藥物(如硫酸銅等)所無法比擬的、具有生態(tài)-環(huán)境安全性。本發(fā)明中，構(gòu)建重組抗藍(lán)藻多肽的大腸菌素可選自能形成離子通道的大腸菌素El, la, lb, A，B或N，在本發(fā)明的實(shí)施例驗(yàn)證了大腸菌素Ia與抗藍(lán)藻抗體模擬物構(gòu)建的重組多肽，但但發(fā)明利用的是這些大腸菌素在細(xì)菌胞膜上形成離子通道來殺死細(xì)菌的這一共性，因此，按照本發(fā)明的構(gòu)思，這些大腸菌素與抗藍(lán)藻的抗體模擬物多肽線性連接構(gòu)成的重組多肽都能夠?qū)崿F(xiàn)本發(fā)明的目的-即提供能夠殺死藍(lán)藻的重組多肽。本發(fā)明還提供了包含重組多肽的基因的重組質(zhì)粒的制備方法，是將編碼抗體模擬物的核苷酸序列經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)插入大腸菌素的羧基端形成本發(fā)明的重組質(zhì)粒。以選用大腸菌素Ia為例，將編碼抗體模擬物的核苷酸序列插入Ia基因的第626位氨基酸后(羧基端)而形成本發(fā)明的重組質(zhì)粒。構(gòu)建重組質(zhì)粒的原始商用質(zhì)粒pSELECT-1來自于Promega公司，其中裝載了大腸菌素Ia和相應(yīng)的Immunity蛋白基因，針對抗體模擬物基因設(shè)計(jì)了數(shù)對引物，其序列見實(shí)施例I。利用雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)，按照Strategene公司試劑盒操作獲得重組質(zhì)粒,例如pCHCcyanoMAl。本發(fā)明的又一方面，提供本發(fā)明所述抗藍(lán)藻多肽的制備方法，將編碼抗體模擬物的基因可操作地與大腸菌素基因連接獲得編碼重組抗藍(lán)藻多肽基因的重組質(zhì)粒，將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入大腸桿菌工程菌中而獲得可產(chǎn)生重組抗藍(lán)藻多肽的工程菌細(xì)胞。用離子交換柱分離純化即獲得本發(fā)明所述的抗藍(lán)藻多肽。本發(fā)明所述抗藍(lán)藻多肽可用于治理水污染。可以通過將本發(fā)明中的多肽添加可接受的載體或賦形劑或可選的其它成分而制成適于環(huán)境使用的藥物組合物。其機(jī)理是多肽中可與藍(lán)藻細(xì)胞表面抗原識別的抗體模擬物誘導(dǎo)大腸菌素到達(dá)藍(lán)藻細(xì)胞膜附近，然后大腸菌素離子通道結(jié)構(gòu)域的疏水區(qū)段插入藍(lán)藻細(xì)胞膜中，進(jìn)而大腸菌素離子通道結(jié)構(gòu)域在藍(lán)藻細(xì)胞膜上形成離子通道，使藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)容物泄漏而致藍(lán)藻細(xì)胞死亡，從而達(dá)到殺死藍(lán)藻細(xì)胞的目的。本發(fā)明所述的抗藍(lán)藻多肽相較于傳統(tǒng)抗藍(lán)藻藥物的優(yōu)點(diǎn)在于，其具有特異的靶向性，因而在治理過程中不會(huì)攻擊其他藻類、植物和動(dòng)物細(xì)胞，其毒性和不良反應(yīng)遠(yuǎn)低于傳統(tǒng)抗藍(lán)藻藥物。再由于它是 在藍(lán)藻細(xì)胞膜上直接形成離子通道來殺傷藍(lán)藻細(xì)胞，因此在抗藍(lán)藻多肽-離子通道造成泄漏而致藍(lán)藻細(xì)胞死亡的這一較短時(shí)限內(nèi)，藍(lán)藻細(xì)胞較難利用突變基因-蛋白表達(dá)方式來修復(fù)抗藍(lán)藻多肽-離子通道在藍(lán)藻細(xì)胞膜上造成的幾何缺損，所以藍(lán)藻細(xì)胞對本發(fā)明的抗藍(lán)藻多肽產(chǎn)生耐藥性的概率較低。這預(yù)示本發(fā)明所述抗藍(lán)藻多肽具有良好的應(yīng)用前景。雜交瘤保藏信息保藏號CGMCCNo. 4783雜交瘤名稱抗藍(lán)藻細(xì)胞表面抗原的單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞保藏日期2011年4月20日保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏單位地址北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號。


圖I.是含有抗體模擬物和大腸菌素Ia基因的重組質(zhì)粒pCHCcyanoMAl的結(jié)構(gòu)示意圖。圖2.為抗藍(lán)藻多肽結(jié)構(gòu)示意圖。圖3.是含有部分基因顛倒N-C順序的抗體模擬物基因和大腸菌素Ia基因的重組質(zhì)粒pCHCcyanoMA2的結(jié)構(gòu)示意圖。圖4.為本發(fā)明抗藍(lán)藻多肽對生長于液體培養(yǎng)基中銅綠微囊藻的抑制試驗(yàn)結(jié)果。圖中A，空白對照液，B，氨芐青霉素50ii g/ml，C，廣譜信息菌素(Ph-NM) 50 y g/ml，D，抗藍(lán)藻多肽(l)50iig/ml，E，抗藍(lán)藻多肽(2)50iig/ml。圖5.為本發(fā)明抗藍(lán)藻多肽(I)對生長于液體培養(yǎng)基中銅綠微囊藻的抑制試驗(yàn)結(jié)果。圖中A，處理48小時(shí)后，B，處理72小時(shí)后，C，處理96小時(shí)后。圖中每一列從左至右共6個(gè)燒瓶，依次為1，對照，2，0. Iii g/ml抗藍(lán)藻多肽(1)，3，0. 5iig/ml抗藍(lán)藻多肽(1)，4,1 u g/ml抗藍(lán)藻多肽(I), 5, 5 ii g/ml抗藍(lán)藻多肽(I), 6,10 y g/ml抗藍(lán)藻多肽⑴。圖6.為本發(fā)明抗藍(lán)藻多肽⑴對生長于液體培養(yǎng)基中柵藻的抑制試驗(yàn)結(jié)果。處理10日后，圖中每一列從左至右共6個(gè)燒瓶，依次為1，對照，2，Iii g/ml抗藍(lán)藻多肽(I), 3, 5 ii g/ml抗藍(lán)藻多肽⑴，4,10 ii g/ml抗藍(lán)藻多肽(I), 5,15 y g/ml抗藍(lán)藻多肽
(I),6, 20 u g/ml抗藍(lán)藻多肽⑴。圖7.為本發(fā)明抗藍(lán)藻多肽⑴對生長于液體培養(yǎng)基中銅綠微囊藻、柵藻的抑制試驗(yàn)結(jié)果。上圖為銅綠微囊藻的結(jié)果，下圖為柵藻的試驗(yàn)結(jié)果。圖8.為本發(fā)明抗藍(lán)藻多肽對生長于液體培養(yǎng)基中銅綠微囊藻、魚腥藻、小球藻、柵藻的抑制試驗(yàn)結(jié)果。圖中左側(cè)燒瓶為對照，右側(cè)燒瓶為35 U g/ml抗藍(lán)藻多肽(I)。A，銅綠微囊藻，B，魚腥藻，C，小球藻，D，柵藻。圖9.為本發(fā)明抗藍(lán)藻多肽對藍(lán)藻污染的自然水體抑制試驗(yàn)結(jié)果。圖中A,空白對照,B,抗藍(lán)藻多肽(I) I V- g/ml, C,抗藍(lán)藻多肽(I) 5 U g/ml, D,抗藍(lán)藻多肽(I) 10 u g/ml, E,硫酸銅 0. 7 u g/mlo圖10.為圖9抑制試驗(yàn)的部分測試結(jié)果。A，水體中光密度變化，B，水體中葉綠素a變化，C，水體中pH變化，D，水體中優(yōu)勢
藻類種群變化。D-1,對照組,D-2,1 ii g/ml抗藍(lán)藻多肽⑴處理組,D_3,0. 7 ii g/ml硫酸銅處理組。圖11.為圖9中抗藍(lán)藻多肽對藍(lán)藻污染的自然水體抑制試驗(yàn)的顯微鏡觀察結(jié)果 (放大400倍)。分別為對照、抗藍(lán)藻多肽(I) I U g/ml和硫酸銅0. 7 U g/ml處理水體中藻類(魚腥藻)在A，第一日，B，第二日，C，第三日，D，第四日，E，第五日的變化。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例I表達(dá)抗藍(lán)藻多肽的質(zhì)粒的構(gòu)建和重組抗藍(lán)藻多肽的制備材料雜交瘤細(xì)胞CGMCC No. 4783。步驟I.抗體模擬物的核苷酸序列及氨基酸序列的獲得收集雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體，采用常規(guī)方法對單克隆抗體進(jìn)行測序獲得抗原結(jié)合片段Fab重鏈和輕鏈序列后，根據(jù)抗原互補(bǔ)決定區(qū)的氨基酸序列設(shè)計(jì)得到抗體模擬物氨基酸序列，如SEQ ID NO. 3所示，編碼該抗體模擬物的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。步驟2.原始質(zhì)粒為裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECT_l質(zhì)粒(購自Promega公司，上述基因由本實(shí)驗(yàn)室裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)(QuickChange Kit, Strategene公司)將編碼抗藍(lán)藻的抗體模擬物的基因(序列表中SEQ ID N0.2所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia基因的1626位點(diǎn)后，得到重組質(zhì)粒pCHCcyanoMAl (如圖I所示)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入E. coli B834(DE3)工程菌里表達(dá)制備多肽，獲得序列表如SEQ ID NO. 7所述的抗藍(lán)藻多肽，在后續(xù)的實(shí)施例中稱為“抗藍(lán)藻多肽(I) ”，其分子量約70，000。突變程序按Strategene QuickChange Site-Directed MutagenesisKit(catalog#200518)藥箱手冊進(jìn)行I、準(zhǔn)備點(diǎn)突變反應(yīng)物5ul IOx buffer2ul (IOng)野生型大腸菌素Ia質(zhì)粒Iul (125ng)設(shè)計(jì)的5’ -3’寡聚核苷酸引物Iul (125ng)設(shè)計(jì)的3’ -5’寡聚核苷酸引物Iul dNTP雙蒸水50ulIul pfu(除質(zhì)粒，引物和雙蒸水外，均為藥箱所備試劑)2、進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增條件變性95°C，35秒，退火53°C，70秒，延伸68°C，17分共20個(gè)循環(huán)；3、加入Dpnl內(nèi)切酶Iul消化母體DNA鏈后(37°C，I小時(shí))，取Iul反應(yīng)物與HMS174感受態(tài)細(xì)胞50ul冰孵30分鐘，行熱沖擊42V，45秒，再置入冰中2分鐘；4、加入NZY培基0. 5ml后220rpm，37°C搖菌I小時(shí)后，取50_100ul反應(yīng)物鋪板(LB培基加1%瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素，37 °C過夜)；5、18小時(shí)后挑菌,循Qiagene,Gibco等公司的各種商用提取質(zhì)粒藥箱提取質(zhì)粒均可，測序確定突變成功；6、將質(zhì)粒50ng與制備的E. coli B834(DE3)工程菌感受態(tài)細(xì)胞50ul冰孵30分，42°C，30秒熱沖擊，取50-100ul反應(yīng)物加入SOC培基0. 5ml，220rpm，37°C搖菌I小時(shí)后鋪板(LB培基加1%瓊脂加50ug/ml氨芐青霉素)37°C孵育，12-16小時(shí)后挑取菌落； 7、大量增菌，8-16升LB培基，250rpm，37°C，6-8小時(shí)；離心沉淀菌體，4°C，6000g,20 分鐘，取 4°C，50mM Borate, 2mM EDTA, pH 9. 0) 50_80ml 懸浮菌體，加入 0. 2M PMSF 250微升后行超聲破碎(4°C，400W, 2分鐘)，高速離心沉淀破碎菌體(4°C，75000g, I. 5小時(shí))，取上清經(jīng)硫酸鏈霉素沉淀DNA，裝入分子量15，000的透析袋于4°C，50mMBorate, 2mM EDTA,pH 9. 0緩沖液10升透析過夜后，將上清上樣于CM柱(Amersham Biosciences),經(jīng)50mMBorate,0. 3M NaCl,2mM EDTA, pH 9. 0緩沖液，4°C )洗脫后即可得到重組抗藍(lán)藻多肽(I)(請見圖2)。下面列出為制備pCHCcyanoMAl質(zhì)粒的抗體模擬物基因所設(shè)計(jì)的具體雙鏈寡聚核苷酸序列pCHCcyanoMAl1、5， -3，gcg aat aag ttc tgg ggt att TCT TAT TGG ATG CAG TGG GTT AAG CAAtaa ataaaa tataag aca ggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta TTG CTT AAC CCA CTG CAT CCA ATA AGA aat acccca gaa cttatt cgc2、5， -3’tat tgg atg cag tgg gtt aag caa AGA CCG GGG CAA GGG CTG GAG TGG ATT GGCtaa ata aaa tataag acaggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta GCC MT CCA CTC CAG CCC TTG CCC CGG TCT ttgctt aaccca ctg cat cca ata3、5， -3’ggg caa ggg ctg gag tgg att ggc CAG CAG TAT YGG TCT ACG CCC CCG TGG ACGtaa ata aaa tataag acaggc3， -5，gcc tgt ctt ata ttt tat tta CGT CCA CGG GGG CGT AGA CCA ATA CTG CTG gccaat ccactc cag ccc ttg ccc實(shí)施例2表達(dá)抗藍(lán)藻多肽的對照質(zhì)粒的構(gòu)建和對照重組抗藍(lán)藻多肽的制備
原始質(zhì)粒為裝載了大腸菌素Ia和Immunity蛋白基因的pSELECT_l質(zhì)粒(購自Promega公司，上述基因由本實(shí)驗(yàn)室裝載)，經(jīng)雙鏈寡聚核苷酸點(diǎn)突變技術(shù)(QuickChange Kit, Strategene公司)將編碼抗藍(lán)藻的抗體模擬物的基因(序列表中SEQ ID N0.4所述核苷酸序列)插入到大腸菌素Ia基因的1626位點(diǎn)后，得到重組質(zhì)粒pCHCcyanoMA2(如圖3所示)，重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入E. coli B834(DE3)工程菌里表達(dá)制備多肽，獲得序列表如SEQ ID NO. 9所述的抗藍(lán)藻多肽，在后續(xù)的實(shí)施例中稱為“抗藍(lán)藻多肽(2)”，其分子量約70，000。制備PCHCcyanoMA2質(zhì)粒的模擬物基因的雙鏈寡聚核苷酸序列按實(shí)施例I的方法設(shè)計(jì)。其制備方法同實(shí)施例2。實(shí)施例3抗藍(lán)藻多肽對銅綠微囊藻的抑制試驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)(I)
步驟I.準(zhǔn)備試驗(yàn)藻藍(lán)藻為購自中國科學(xué)院水生生物研究所的FACHB-978銅綠微囊藻(Microcustis aeruginosa)。試驗(yàn)藻的培養(yǎng)方法將藻種接種到裝有250ml BGll培養(yǎng)基的500ml容積錐形瓶中，置于光照培養(yǎng)箱中。接種初始藻細(xì)胞密度為5 X IO4個(gè)/mL，錐形瓶用透氣膜封蓋，以防污染。培養(yǎng)溫度為25°C，光照強(qiáng)度為(2500±10% )Lux ;光暗比為12h/12h。為減少因光照不均勻可能造成的影響，每隔2 3h搖動(dòng)并更換各實(shí)驗(yàn)組錐型瓶的位置I次。自接種的第5天起，每隔24h取樣、測定I次。待藻細(xì)胞數(shù)密度達(dá)到IO6個(gè)/mL數(shù)量級左右時(shí)，即可開始下一步試驗(yàn)。步驟2.在五個(gè)試管A、B、C、D、E中分別加入制備好的藍(lán)藻液lml，然后加入抑制劑A空白對照液，B氨芐青霉素50 u g/ml，C廣譜信息菌素(申請?zhí)枮?00910092128. 4中公開的Ph-AMl) 50 V- g/ml, D抗藍(lán)藻多肽(I) 50 u g/ml, E抗藍(lán)藻多肽(2) 50 u g/ml后,五個(gè)試管置于孵箱中低速振蕩培養(yǎng)12小時(shí)后，都加入吖啶橙(按50nM加入)和碘化丙啶(按600nM加入)孵化30分鐘，吸取數(shù)微升置于載玻片上，熒光顯微鏡(Nikon90i，DM505和DM565濾光鏡片)觀察活藍(lán)藻染色情況。結(jié)果如圖4所示。結(jié)果顯示只有抗藍(lán)藻多肽(I)殺傷了培養(yǎng)的銅綠微囊藻。而抗藍(lán)藻多肽(2)、氨芐青霉素、Ph-NM對所培養(yǎng)的銅綠微囊藻均無作用。試驗(yàn)(2)步驟I同試驗(yàn)(I)步驟I。步驟2.直接在6個(gè)接種了試驗(yàn)藻的500ml的錐形瓶中按濃度梯度加入抗藍(lán)藻多肽。銅綠微囊藻加入抗藍(lán)藻多肽的劑量為0、0. l、0.5、l、5、10ug/ml，每日觀察對藍(lán)藻的生長抑制情況。結(jié)果如圖5所示。由于各處理組所用的抗藍(lán)藻多肽(I)濃度不一樣，錐形瓶中銅綠微囊藻液由綠色變成淺黃色之時(shí)間快慢與多肽的濃度成正比，然在72小時(shí)內(nèi)，肉眼可觀察到各處理組均可有效殺滅所試之銅綠微囊藻。上述結(jié)果證明，抗藍(lán)藻多肽⑴具有靶向殺傷藍(lán)藻的效力，而抗藍(lán)藻多肽2幾乎無效。試驗(yàn)(3)材料購自中科院水生生物研究所的FACHB-417斜生柵藻(Scenedesmusobliqnus)采用試驗(yàn)(I)中步驟I的方法培養(yǎng)試驗(yàn)藻。步驟2.直接在6個(gè)接種了試驗(yàn)藻的500ml的錐形瓶中按濃度梯度加入抗藍(lán)藻多肽(I)，劑量分別為:0、l、5、10、15、20ug/ml。每日觀察對柵藻的生長抑制情況。結(jié)果如圖6所示。雖然加入的抗藍(lán)藻多肽(I)劑量相對銅綠微囊藻處理組大了 10倍，肉眼在試驗(yàn)期間(190小時(shí))未觀察到抗藍(lán)藻多肽⑴表現(xiàn)出任何對所試柵藻的殺傷作用。結(jié)果如圖6所示。雖然加入的抗藍(lán)藻多肽(I)劑量相對銅綠微囊藻處理組大了 10倍，肉眼在試驗(yàn)期間(190小時(shí))未觀察到抗藍(lán)藻多肽⑴表現(xiàn)出任何對所試柵藻的殺傷作
用。 試驗(yàn)(4)以上試驗(yàn)(I) (3)每瓶取0. ImL培養(yǎng)液，置于血球計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)。圖7所示的藻細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示與對照相比較，I U g/ml抗藍(lán)藻多肽(I)在72小時(shí)內(nèi)即可殺滅所試之銅綠微囊藻。而I U g/ml抗藍(lán)藻多肽(I)對所試之柵藻幾乎無任何作用。實(shí)施例4.抗藍(lán)藻多肽對抗銅綠微囊藻、魚腥藻、小球藻、柵藻的液體培養(yǎng)基試驗(yàn)所試藻類為購自中科院水生所的銅綠微囊藻、魚腥藻、小球藻和柵藻。藻類培養(yǎng)和加入處理劑之方法同實(shí)施例3的試驗(yàn)(I)的步驟I。取藻細(xì)胞數(shù)密度達(dá)到IO6個(gè)/mL數(shù)量級的培養(yǎng)藻液40ml分裝于300ml錐形瓶中，各加入A :加入等量的空白對照液，B :加入抗藍(lán)藻多肽(I) 35 y g/ml，繼續(xù)培養(yǎng)4日，觀察其生長情況。結(jié)果如圖8所示。24小時(shí)后，銅綠微囊藻和魚腥藻藻液顏色開始變淺，至第4日藻液已變清亮。而小球藻和柵藻藻液顏色和濁度均無變化。該結(jié)果顯示抗藍(lán)藻多肽I抑制了所試銅綠微囊藻、魚腥藻的生長，卻不能抑制小球藻、柵藻的生長。上述結(jié)果證明，抗藍(lán)藻多肽(I)具有靶向殺傷藍(lán)藻的效力。實(shí)施例5抗藍(lán)藻多肽對自然水體中藍(lán)藻的殺滅試驗(yàn)自然水體采自被藍(lán)藻嚴(yán)重污染的蘇州陽澄湖沼蝦養(yǎng)殖池，25-35升分裝于60x40x30厘米塑料養(yǎng)殖盆中，每隔20分鐘氣泵送氣10分鐘；加熱器自動(dòng)調(diào)溫至27°C，光照強(qiáng)度為(2500 ± 10 %) Iux ;光暗比為12h/12h，每日采樣檢測養(yǎng)殖水體pH、650nm光吸收值、葉綠素a吸收值(請見圖9)。將采樣液置于可見分光光度計(jì)中測定650nm光吸收值(請見圖10)。利用熱乙醇-反復(fù)凍融-分光光度法測定葉綠素a含量(請見圖10)。用分光光度計(jì)于665、700nm下測其吸光度，計(jì)算葉綠素a的濃度。其公式為[Chla] = [12. 12(D66
4-D750)-l. 58(D647-D750)-0. 08(D630-D750)]VE/VS d。對照組水體中的pH、650nm光吸收值、葉綠素a吸收值在試驗(yàn)期間一直居高不下，而抗藍(lán)藻多肽(I)組和硫酸銅組水體的pH、650nm光吸收值、葉綠素a吸收值自第二日起即顯著下降。每日采樣30ml水樣用福爾馬林固定后，離心濃縮10倍，取0. ImL置于血球計(jì)數(shù)板中，在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù)(請見圖11)。鏡檢中可見在第一日，對照組、抗藍(lán)藻多肽(I)組和硫酸銅組水體中可見大量生長茂盛的魚腥藻；而自第二日起，抗藍(lán)藻多肽(I)組和硫酸銅組水體中的魚腥藻大量減少、碎裂；至第五日抗藍(lán)藻多肽(I)組和硫酸銅組水體中已找不到魚腥藻，而對照組水體中仍見大量魚腥藻生長。顯微鏡檢觀察藻類形態(tài)變化，同時(shí)對各種藻類計(jì)數(shù)以確定養(yǎng)殖水體中浮游植物優(yōu)勢種群的動(dòng)態(tài)變化(請見圖10)。在對照組水體中，魚腥藻和銅綠微囊藻始終為優(yōu)勢藻種；在抗藍(lán)藻多肽(I)組水體中，魚腥藻和銅綠微囊藻逐漸減少，小球藻變成為優(yōu)勢藻種；在硫酸銅組水體中，魚腥藻和銅綠微囊藻逐漸減少，而另一種藍(lán)藻，顫藻變成為優(yōu)勢藻種。表I抗藍(lán)藻多肽處理之浮游植物細(xì)胞計(jì)數(shù)及形態(tài)變化(個(gè)/升)
權(quán)利要求
1.雜交瘤細(xì)胞，其保藏號為=CGMCCNo. 4783。
2.權(quán)利要求I所述的雜交瘤分泌的單克隆抗體。
3.具有藍(lán)藻識別結(jié)合能力的模擬抗體多肽，是權(quán)利要求2所述的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段，或根據(jù)所述抗原結(jié)合片段上的功能區(qū)域設(shè)計(jì)然后人工表達(dá)分離而得的小分子多肽。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的模擬抗體多肽，其氨基酸序列如SEQID NO. 3所示。
5.編碼權(quán)利要求3或4的模擬抗體多肽的基因。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因，核苷酸序列如SEQID NO. 2所示。
7.抗藍(lán)藻重組抗體多肽，由權(quán)利要求3或4所述的具有藍(lán)藻識別結(jié)合能力的模擬抗體 多肽可操作地線性連接在大腸菌素多肽的羧基端構(gòu)成，所述大腸菌素選自大腸菌素El，Ia，Ib，A，B 或 N。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗藍(lán)藻重組抗體多肽，其氨基酸序列如SEQID NO. 7所示。
9.編碼抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的編碼抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因，核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
11.含有編碼抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因的重組表達(dá)載體。
12.權(quán)利要求7或8所述的抗藍(lán)藻重組多肽的制備方法，其步驟如下將編碼抗藍(lán)藻重組抗體多肽的基因?qū)氲酱竽c桿菌表達(dá)系統(tǒng)中，培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌，然后分離大腸桿菌表達(dá)的多肽。
13.權(quán)利要求7或8所述的抗藍(lán)藻重組抗體多肽在治理水體過度營養(yǎng)化中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明“抗藍(lán)藻重組抗體多肽及其基因與制備方法”，屬于環(huán)保生物技術(shù)。抗藍(lán)藻重組抗體多肽，由抗藍(lán)藻的抗體模擬物多肽可操作地線性連接在大腸菌素多肽的羧基端構(gòu)成，所述抗藍(lán)藻的抗體模擬物多肽是基于CGMCC No.4783雜交瘤細(xì)胞所分泌的單克隆抗體的抗原結(jié)合片段設(shè)計(jì)的具有藍(lán)藻識別結(jié)合能力的多肽。本發(fā)明的新型抗藍(lán)藻多肽相較于現(xiàn)用治理水污染藥物的優(yōu)點(diǎn)在于，其直接在藍(lán)藻細(xì)胞膜上形成離子通道來殺傷藍(lán)藻，因此殺傷效率強(qiáng)于現(xiàn)用治理水污染藥物數(shù)十倍；由于該多肽對藍(lán)藻(原核細(xì)胞)是靶向性殺傷，不會(huì)殺傷其他有益的真核細(xì)胞藻類；該多肽本身又可被蛋白酶、胃酸等降解；因此它具有現(xiàn)用治理水污染藥物(如硫酸銅等)無法比擬的生態(tài)和環(huán)境安全性。
文檔編號C12R1/91GK102747041SQ20111015522
公開日2012年10月24日 申請日期2011年6月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年4月21日
發(fā)明者丘小慶 申請人:畿晉慶三聯(lián)(北京)生物技術(shù)有限公司