專(zhuān)利名稱(chēng)：具有OsMS2基因的載體的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的基因及其編碼的應(yīng)用，具體是一種具有 0sMS2基因的載體的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在植物花粉的發(fā)育過(guò)程中，花粉壁起著非常重要的作用。它對(duì)于花粉粒的正常發(fā)育、花粉粒對(duì)外界的耐受力都是非常必須的。此外，花粉外壁還可以保護(hù)花粉免受外界環(huán)境和病菌侵害，并在花粉從花藥移向柱頭的過(guò)程中起到了重要的作用?；ǚ弁獗谥饕删酆系逆咦踊ǚ鬯貥?gòu)成。孢子花粉素已經(jīng)被證實(shí)是含有聚合苯酚和脂肪酸衍生物的復(fù)合物，這些聚合物含有芳香族或共軛的側(cè)鏈，它們?cè)谑诜酆突ǚ勖劝l(fā)過(guò)程中細(xì)胞間的識(shí)別中起著重要的作用。外壁表面也顯示著高度修飾的模式，并因物種而異。在花粉外壁的縫隙中填充著一些粘性油脂以及類(lèi)似于蛋白的物質(zhì)，統(tǒng)稱(chēng)為含油層。它的主要成分為脂肪酸和長(zhǎng)鏈脂肪酸衍生物，如酯和油脂的不穩(wěn)定復(fù)合物以及各種蛋白。在水稻花粉壁的發(fā)育過(guò)程中，四分體晚期已開(kāi)始了小孢子外壁的發(fā)育。當(dāng)小孢子從四分體分離出來(lái)時(shí)其外壁并不明顯，但是出現(xiàn)了壁物質(zhì)的沉積。到了小孢子早期才形成了細(xì)帶狀的初生壁，這時(shí)的初生壁在光學(xué)顯微鏡下尚無(wú)法分辨，但在原有四分孢子沉積的壁物質(zhì)的基礎(chǔ)上，聚集形成了一電子致密的細(xì)帶狀結(jié)構(gòu)，其表面附著了一些黑色顆粒。發(fā)育到小孢子中期，則形成了光學(xué)顯微鏡下可見(jiàn)的外壁結(jié)構(gòu)，小孢子外壁物質(zhì)快速沉積，在質(zhì)膜外側(cè)形成了三條寬窄不等的電子致密帶，最內(nèi)側(cè)的較粗，中間的略細(xì)，最外側(cè)的致密帶上規(guī)則地分布了一些黑色小體，顯然是由早期的黑色顆粒形成的。小孢子壁繼續(xù)發(fā)育，中間的電子致密帶變細(xì)，兩邊的帶明顯加寬，結(jié)果花粉外壁分化出覆蓋層、柱狀層和基層。至此，外壁基本形成，即由兩邊較寬的電子致密帶(覆蓋層，基層)和中間的透明帶(柱狀層)組成。 小孢子發(fā)育晚期，小孢子的外壁沒(méi)有出現(xiàn)明顯的形態(tài)變化，但壁物質(zhì)沉積更加致密。二胞花粉早期，花粉外壁的覆蓋層、柱狀層、基層、外壁內(nèi)層和花粉內(nèi)壁，由表及里，層次分明。花粉外壁已完全形成。目前已報(bào)道的花粉壁不正常的突變體中，擬南芥cer6/p0pl。不能形成正常的含油層。cerl突變體含油層呈現(xiàn)出粒狀表面，與野生型相比，含油層中的脂滴數(shù)量多但個(gè)體小。擬南芥dexl突變體在小孢子從四分體釋放的過(guò)程中發(fā)生了異常，形成不正常的小孢子壁結(jié)構(gòu)。擬南芥flpl (faceless pollen-1)突變體，在小孢子外壁和含油層中都有缺陷，因此對(duì)醋解實(shí)驗(yàn)敏感。水稻wdal (Wax-deficient antherl)突變體，在花藥壁和花粉壁的蠟質(zhì)積累上存在缺陷，經(jīng)證明WDAl基因的編碼產(chǎn)物參與了長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成。擬南芥中的 MS2(MALE STERILITY 2)基因所編碼的產(chǎn)物與小孢子的形成有關(guān)。ms2突變體的花粉發(fā)育過(guò)程中的首次異常，發(fā)生在小孢子從四分體中釋放的階段。MS2基因在野生型花藥的絨氈層
3中表達(dá)，與花粉外壁物質(zhì)的形成有關(guān)，ms2突變體所產(chǎn)生的花粉粒含有非常薄的花粉外壁， 它對(duì)醋解實(shí)驗(yàn)很敏感。此外，有關(guān)分析表明MS2基因編碼的產(chǎn)物與一種加州希蒙得木蛋白 FAR和小麥中的TAA基因編碼的蛋白具有一定的相似性，它們都作為一種脂肪?；€原酶， 參與到脂肪醇的合成代謝過(guò)程中，而脂肪醇是形成花粉外壁所必須的代謝產(chǎn)物。0sMS2基因與擬南芥中MS2基因的氨基酸序列具有很高的相似性，為49. 9%。與小麥中TAA基因、Jojoba的FAR基因也有很高的相似性，分別為32.3^,30.9 ^并且其同源部分主要集中在兩個(gè)保守功能域，即NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和雄性不育結(jié)構(gòu)域。但是對(duì)那些 0sMS2基因的同源基因的研究?jī)H限于表型、生理及遺傳定位等方面。經(jīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)，尚未發(fā)現(xiàn)有關(guān)水稻0sMS2基因及其編碼的蛋白的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有0sMS2基因的載體的應(yīng)用；本發(fā)明的蛋白在控制水稻花粉發(fā)育方面具有明顯的作用，可用于產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來(lái)生產(chǎn)雜交種子，開(kāi)展輪回選擇和創(chuàng)造基因庫(kù)；也可利用本發(fā)明蛋白的編碼序列體外合成重組0sMS2蛋白來(lái)行使脂肪?；€原酶的功能，將脂肪酸還原成脂肪醇。本發(fā)明是通過(guò)以下的技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的，第一方面，本發(fā)明涉及一種水稻0sMS2基因，其堿基序列如SEQ ID NO 1所示。第二方面，本發(fā)明涉及一種水稻0sMS2基因編碼的蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。第三方面，本發(fā)明涉及一種質(zhì)粒，該質(zhì)粒包含SEQ ID NO 1所示的基因。第四方面，本發(fā)明涉及一種植物表達(dá)載體，該載體包含SEQ ID NO :1所示的基因。第五方面，本發(fā)明涉及一種宿主細(xì)胞，該宿主細(xì)胞包含SEQ ID NO :1所示的基因。所述宿主細(xì)胞為大腸桿菌。所述宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌。第六方面，本發(fā)明涉及一種制備水稻雄性不育株的方法，其特征在于，包括如下步驟步驟一，將包含SEQ ID NO 1所示的基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入水稻細(xì)胞；步驟二，培育轉(zhuǎn)化的水稻細(xì)胞，得到水稻雄性不育株。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果本發(fā)明的蛋白在控制水稻花粉發(fā)育方面具有明顯的作用，可用于產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來(lái)生產(chǎn)雜交種子，開(kāi)展輪回選擇和創(chuàng)造基因庫(kù)；也可利用本發(fā)明蛋白的編碼序列體外合成重組0sMS2蛋白來(lái)行使脂肪?；€原酶的功能，將脂肪酸還原成脂肪醇。


圖l0sms2突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察圖；圖20sMS2基因座位定位示意圖；圖30sMS2基因序列示意圖；圖4野生型與0sms2突變體掃描電鏡和醋解實(shí)驗(yàn)的觀察圖50sMS2互補(bǔ)質(zhì)粒pCAMBIA 1301_0sMS2的構(gòu)建示意圖；圖6碘染顯示轉(zhuǎn)基因苗互補(bǔ)成功的結(jié)果圖；圖70sMS2全長(zhǎng)在pET30a載體中蛋白表達(dá)結(jié)果圖；圖8氣象色譜檢測(cè)結(jié)果圖。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如 Sambrook 等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New York Co Id Spring Harbor Laboratory Press， 1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。在本實(shí)施例中，“分離的”、“純化的” DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來(lái)，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開(kāi)，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其的蛋白質(zhì)分開(kāi)。在本實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“水稻脂肪酰基還原酶蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有脂肪?；€原酶活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO. 1中第1-1827位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO. 1序列的編碼框第1-1827位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ IDN0. 1中第1-1827位核苷酸序列同源性低至約70%的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO. 1所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-1827位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO. 1中從核苷酸第1-1827位的核苷酸序列的同源性至少70%，較佳地至少80 %，更佳地至少90 %，最佳地至少95 %的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的水稻脂肪?；€原酶0sMS2蛋白相同功能的蛋白的SEQ ID N0. 2中開(kāi)放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)， 更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。在本實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“水稻脂肪酰基還原酶蛋白(或多肽)”指具有脂肪?；€原酶蛋白活性的SEQ ID N0. 2序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然參與水稻花粉發(fā)育蛋白相關(guān)相同功能的、SEQ ID N0. 2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10 個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括水稻脂肪酰基還原酶蛋白的活性片段和活性衍生物。本實(shí)施例的水稻脂肪?；€原酶蛋白的變異形式包括同源序列、保守性變異體、 等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)緊條件下能與水稻脂肪酰基還原酶蛋白相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用水稻脂肪?；€原酶蛋白相關(guān)多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。在本實(shí)施例中，“水稻脂肪?；€原酶蛋白保守性變異多肽”指與SEQ ID NO. 2的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。本發(fā)明還包括水稻脂肪酰基還原酶蛋白或多肽的類(lèi)似物。這些類(lèi)似物與天然水稻脂肪酰基還原酶多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過(guò)各種技術(shù)得到，如通過(guò)輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過(guò)定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類(lèi)似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸) 的類(lèi)似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的類(lèi)似物。應(yīng)理解，本實(shí)施例的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過(guò)將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。在本實(shí)施例中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。 在生產(chǎn)本實(shí)施例的水稻脂肪?；€原酶多肽時(shí)，可以將水稻脂肪酰基還原酶蛋白編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成水稻脂肪?；€原酶蛋白表達(dá)載體。如本實(shí)施例所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA ；如果啟動(dòng)子調(diào)控序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。在本實(shí)施例中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、 水稻細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。還可用Northern印跡法技術(shù)分析水稻脂肪酰基還原酶基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析水稻脂肪酰基還原酶的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。此外，本實(shí)施例還提供了一種可用作探針的核酸分子，該分子通常具有水稻脂肪?；€原酶的核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼水稻脂肪?；€原酶蛋白相關(guān)的核酸分子。此外，根據(jù)本實(shí)施例的水稻脂肪?；€原酶基因的核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選水稻脂肪?；€原酶相關(guān)同源基因或同源蛋白。本實(shí)施例的水稻脂肪?；€原酶相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR 擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本實(shí)施例所公開(kāi)的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開(kāi)放閱讀框序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，并用水稻的DNA、市售的DNA/cDNA庫(kù)或按
6本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的DNA/cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼
接在一起。一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來(lái)大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過(guò)常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。此外，還可通過(guò)化學(xué)合成將突變弓I入本實(shí)施例蛋白序列中。除了用重組法產(chǎn)生之外，本實(shí)施例蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過(guò)直接合成肽而加以生產(chǎn)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行?？梢苑謩e化學(xué)合成本實(shí)施例蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。本實(shí)施例是利用Y射線對(duì)粳稻9522品系進(jìn)行處理，種植后在F2代挑選花藥發(fā)育異常的突變體，挑選分離比為3 1的隱性單基因突變體為研究對(duì)象。獲得一新的水稻隱性雄性不育突變體0sms2。通過(guò)遺傳定位方法，首先將突變基因座位定位在水稻3號(hào)染色體上的標(biāo)記0S301、0S302附近，并進(jìn)一步確定于0S302、SJ302之間。進(jìn)一步精細(xì)定位， 在0S302和SJ302之間發(fā)展了 7對(duì)有多態(tài)性InDel分子標(biāo)記，最終將0sMS2基因定位在 SJ622和CL7-4之間。通過(guò)對(duì)網(wǎng)上(http://www.tigr.org)的序列分析，SJ622和CL7-4兩標(biāo)記之間物理距離大約為35kb0在這一范圍內(nèi)NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih. gov)和 tigr(http://www. tigr. org)都預(yù)測(cè)分析有13個(gè)基因，其中有一個(gè)編碼類(lèi)似MS2蛋白的基因。通過(guò)對(duì)這些基因進(jìn)行反復(fù)測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)突變體中0sMS2基因所在的第八個(gè)外顯子上有一堿基C的缺失。該基因共有九個(gè)外顯子，編碼608個(gè)氨基酸，在其編碼區(qū)內(nèi)有兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。一個(gè)是 NAD binding 4 domain，另一個(gè)是 Male sterility domain，它們?cè)谒净òl(fā)育過(guò)程中都起到了非常重要的作用。0sMS2的突變是由于基因第八個(gè)外顯子中的一個(gè)堿基發(fā)生缺失而造成的，該堿基位于兩個(gè)功能域之間，缺失后導(dǎo)致翻譯提前終止，雖然對(duì) NAD-binding-4功能域不造成影響，但是嚴(yán)重阻礙了 Male sterility功能域的功能行使， 同時(shí)這個(gè)單堿基的缺失也使翻譯提前終止，最終不能產(chǎn)生有功能的蛋白，所以0sMS2基因的突變?cè)斐闪酥参锏男坌圆挥?。本?shí)施例中的0sMS2基因與擬南芥中MS2基因的氨基酸系列具有很高的相似性，為49. 9%。與小麥中TAA基因、Jojoba的FAR基因也有很高的相似性，分別為32. 3%, 30. 9%。并且其同源部分主要集中在兩個(gè)保守功能域，即NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域和雄性不育結(jié)構(gòu)域。本研究發(fā)現(xiàn)的0sMS2基因是新發(fā)現(xiàn)的水稻中的脂肪酰基還原酶的基因，并將其命名為 0sMS2 (Oryza sativa L Male Sterile2)。通過(guò)對(duì)雄性不育突變體0sms2花器官發(fā)育各時(shí)期進(jìn)行組織切片、掃描電鏡、生理生化分析觀察，發(fā)現(xiàn)該基因的突變會(huì)導(dǎo)致水稻花粉外壁不能正常發(fā)育(圖4)，從而造成雄性不育(圖1)；生理生化分析表明突變體內(nèi)不能形成正常的花粉，當(dāng)將0sMS2基因轉(zhuǎn)入突變體時(shí)可以恢復(fù)突變體的表型(見(jiàn)圖6，圖6中，A.野生型B.突變體C. T1代轉(zhuǎn)基因苗)。 另外，體外重組表達(dá)的0sMS2蛋白具有將脂肪酸轉(zhuǎn)變成脂肪醇這種脂肪?；€原酶的功能 (圖8)，這說(shuō)明該基因確實(shí)控制了水稻花粉外壁脂肪醇的生物合成過(guò)程。本實(shí)施例在控制水稻花粉發(fā)育方面具有明顯的作用，可以產(chǎn)生新的水稻雄性不育系，用來(lái)生產(chǎn)雜交種子，開(kāi)展輪回選擇和創(chuàng)造基因庫(kù)，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上具有十分重要的應(yīng)用。 另外，也可以將0sMS2蛋白應(yīng)用于脂肪醇的合成或脂肪酸還原成脂肪醇這一工業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域。
實(shí)施例1osms2突變體植株的獲得和形態(tài)學(xué)的觀察該突變體是用6tlCo Y射線誘變粳稻9522種子，處理劑量為^OGy。對(duì)誘變的F2代中一雄性不育突變體三代回交，獲得隱性單基因調(diào)控的穩(wěn)定遺傳的突變體0sms2。所有植物材料種植于上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院試驗(yàn)基地。osms2突變體與粳稻9522回交，F(xiàn)1代全部為可育，自交F2代中出現(xiàn)分離，其中正常植株為153，突變株為49，正常植株與突變植株比例接近3 l(x2 = 0.006，x°_°5 = 3.84)，表明該雄性不育突變體表型由一個(gè)隱性單核基因突變?cè)斐?。?duì)osms2突變體植株的形態(tài)學(xué)觀察，如圖1，A，B，C，D，E，左側(cè)為野生型;A，B，C，D， E，右側(cè)為突變體。0sms2突變體表現(xiàn)為完全的雄性不育，其在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期沒(méi)有明顯的表型缺陷，發(fā)育后期雄性不育突變體整株形態(tài)與野生型粳稻9522相比，0sms2突變體穗小無(wú)結(jié)實(shí)， 整株形態(tài)直立(圖1A)。至生殖生長(zhǎng)期，除花藥以外，其他花器官的發(fā)育與野生型相比，亦沒(méi)有明顯的差異(圖1B，C，D)。0sms2突變體的花藥為白色，而相對(duì)應(yīng)的野生型粳稻9522花藥為黃色，并且突變體花藥比野生型小(圖1E)。實(shí)施例20sMS2基因的定位和克隆(1)定位群體。將0sms2突變體與秈稻品系廣陸矮4號(hào)雜交，自交獲得&代，選擇其中為雄性不育植株為定位群體。(2)水稻DNA提取。采用改進(jìn)的CTAB法。簡(jiǎn)單步驟如下取葉片0. 1_0. 2克(約半片)放到小研缽中，加入適量的液氮，立刻研磨至粉狀，裝入2ml離心管，加入700ul 100°C 預(yù)熱的1. 5xCTAB溶液于離心管中，小心混勻后放入56°C水浴，20分鐘后取出離心管，加入等體積氯仿/異戊醇，猛烈混勻，離心(13000rpm) 10分鐘，取上清于新管中，加入900ul無(wú)水乙醇混勻后_20°C放半小時(shí)以上。將析出的DNA離心，HOOOrpm(10分鐘)。去掉上清， 將沉淀用lml70%乙醇清洗一次，離心干燥，溶于200ul 1/10TE或水中，4°C冰箱保存。(3) InDel分子標(biāo)記分析。InDel分子標(biāo)記設(shè)計(jì)是根據(jù)比較粳稻日本晴秈稻9311 兩品系的已公布的核苷酸序列，對(duì)差異的部分設(shè)計(jì)引物，驗(yàn)證2個(gè)親本粳稻9522和廣陸矮 4號(hào)之間的多態(tài)性，PCR擴(kuò)增程序?yàn)?IOul體系中，Iul模板，Iul 10pmol/ul Primerl, Iul 10pmol/ul Primer2, Iul IOXBuffer (Mg2+), Iul 2mM dNTP,0. Iul Taq，3. 9ul 水。通過(guò) 6% 的PAGE膠電泳，銀染方法檢測(cè)。(4)群體分離分析(bulked segregant analysis)初定位方法。用132對(duì)標(biāo)記進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)3號(hào)染色體上的標(biāo)記0S301、0S302與0sMS2基因座位有明顯的連鎖關(guān)系。 選取該染色體上附近引物SJ301、SJ302，在194個(gè)F2代分離群體中進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)都與0sMS2有連鎖關(guān)系，并且最終確定在0S302和5302(圖幻之間。精細(xì)定位是圖位克隆的關(guān)鍵步驟之一，為進(jìn)一步定位0sMS2位點(diǎn)，擴(kuò)大F2代群體到7500株，從中得到用于定位突變體M20株。在0S302和SJ302之間發(fā)展了 7個(gè)InDel標(biāo)記(表1)，最終將0sMS2位點(diǎn)定位在SJ622和CL7-4之間。通過(guò)在網(wǎng)上(http://www.tigr.org)下載的粳稻日本晴第 3號(hào)染色體拼接的序列分析，SJ622和CL7-4兩標(biāo)記之間物理距離大約為351Λ (圖2)。
(5) 0sMS2 基因的克隆。在這一范圍:35Kb 內(nèi) NCBI (http //www. ncbi. nlm. nih. gov) 和tigr (http://www. tigr. org)都預(yù)測(cè)分析有13個(gè)基因，在這些基因中有一個(gè)編碼類(lèi)似MS2蛋白的基因，對(duì)這些基因進(jìn)行了反復(fù)測(cè)序，發(fā)現(xiàn)突變體中0sMS2基因所在的第八個(gè)外顯子上有一堿基C的缺失(圖幻。這個(gè)單堿基的缺失造成移碼，并使翻譯提前終止，最終不能產(chǎn)生有功能的蛋白。表IInDel分子標(biāo)記及其核酸序列
權(quán)利要求
1.一種具有0SMS2基因的載體的應(yīng)用，該載體為蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、宿主細(xì)胞或多肽，其中 所述蛋白質(zhì)為(a)由SEQID NO :2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)在(a)中的氨基酸序列經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酸羥基化酶活性的由(a)衍生的蛋白質(zhì)；所述質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞包含如SEQ ID NO 1所示的基因； 所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示；其特征在于，所述應(yīng)用是指用于調(diào)控水稻花藥表皮層和花粉外壁脂肪醇成份合成并由該基因功能的缺失特異性導(dǎo)致水稻的雄性不育。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征是，通過(guò)突變0sMS2基因獲得水稻雄性不育材料。
3.一種具有0sMS2基因的多肽的應(yīng)用，該多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示，其特征在于，利用其脂肪?；€原酶的功能，合成脂肪醇或?qū)⒅舅徇€原成脂肪醇，實(shí)現(xiàn)花粉外壁和花藥外壁的正常發(fā)育。
4.一種恢復(fù)0sMS2基因缺失導(dǎo)致的水稻的雄性不育的方法，其特征在于，通過(guò)將PCR擴(kuò)增得到的含有0sMS2基因組序列片段轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，并侵染幼穗愈傷，繼代兩周后轉(zhuǎn)入分化培養(yǎng)基，待有轉(zhuǎn)基因苗出現(xiàn)后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)基得以實(shí)現(xiàn)；所述的PCR擴(kuò)增中采用的引物序列為0sMS2_F aaaaaaagaattctgacatggcatcaacctgaaca 和0sMS2-R aaaaaaactcgagttgcagttcgaaccagctcctag
全文摘要
一種基因工程技術(shù)領(lǐng)域的具有OsMS2基因的載體的應(yīng)用，該載體為蛋白質(zhì)、質(zhì)粒、宿主細(xì)胞或多肽，所述蛋白質(zhì)為由SEQ ID NO2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)，或經(jīng)過(guò)取代、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且具有脂肪酸羥基化酶活性的衍生的蛋白質(zhì)；所述質(zhì)?；蛩拗骷?xì)胞包含如SEQ ID NO1所示的基因；所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示；所述應(yīng)用是指用于調(diào)控水稻花藥表皮層和花粉外壁脂肪醇成份合成并由該基因功能的缺失特異性導(dǎo)致水稻的雄性不育。
文檔編號(hào)C12N15/84GK102242112SQ20111010288
公開(kāi)日2011年11月16日 申請(qǐng)日期2009年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年11月5日
發(fā)明者張大兵, 梁婉琪, 石晶, 袁政, 譚何新 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)