專(zhuān)利名稱：：一種阿魏酸酯酶a突變體及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于基因工程和酶工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種阿魏酸酯酶A突變體及其用途。
背景技術(shù)：
：阿魏酸酯酶(EC3.1.1.73)是能水解存在于植物細(xì)胞壁中的羥基肉桂酸類(lèi)化合物、阿拉伯木聚糖與某些膠質(zhì)之間的酯鍵，是半纖維素完全降解所需的關(guān)鍵酶之一。其中來(lái)源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A是目前研究最多的阿魏酸酯酶之一，人們對(duì)其在底物作用范圍，內(nèi)源表達(dá)調(diào)控以及在畢赤酵母和大腸桿菌中表達(dá)方面作了大量研究。阿魏酸酯酶A在生物能源、飼料、造紙、保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)具有較大應(yīng)用潛力。在酶的工業(yè)應(yīng)用中，熱穩(wěn)定性是一個(gè)重要的參數(shù)。高穩(wěn)定性的酶高溫下反應(yīng)可以提高反應(yīng)速率和反應(yīng)物的溶解量，減少酶投入量等，從而降低成本(L.Viikari,etal.ThermostableEnzymesinLignocelluloseHydrolysis.AdvBiochemEngBiotechnol108(2007)121-145)。蛋白質(zhì)定向進(jìn)化技術(shù)是體外改良蛋白質(zhì)性質(zhì)的重要手段，過(guò)去十年間人們成功地利用該技術(shù)改造了上百種蛋白質(zhì)的性質(zhì)(J.D.Bloom,F.H.Arnold.InthelightofdirectedevolutionPathwaysofadaptiveproteinevolution.PNAS106(2009)9995-10000)。同時(shí)，理性設(shè)計(jì)手段也廣泛應(yīng)用于酶的改造中(VincentG.H.Eiisink，etal.Rationalengineeringofenzymestability.JBiotech113(2004)105—120)。目前生產(chǎn)上應(yīng)用的阿魏酸酯酶主要來(lái)源于黑曲霉的阿魏酸酯酶A，但是其熱穩(wěn)定性仍然不理想。應(yīng)用現(xiàn)有技術(shù)，進(jìn)一步改造阿魏酸酯酶A，提高其熱穩(wěn)定性，將推動(dòng)該酶在相關(guān)領(lǐng)域的更廣泛應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明利用易錯(cuò)PCR技術(shù)對(duì)來(lái)源于黑曲霉(Aspergillusniger)的阿魏酸酯酶A進(jìn)行分子改良，從而獲得熱穩(wěn)定性提高的阿魏酸酯酶A突變酶。為了達(dá)到以上目的，在前期已獲得的母本基礎(chǔ)上，經(jīng)一輪易錯(cuò)PCR對(duì)母本基因隨機(jī)突變，建立突變文庫(kù)，通過(guò)高通量篩選體系篩選出12個(gè)耐熱性提高的阿魏酸酯酶A突變體位點(diǎn)，并通過(guò)全序列合成方法將這12個(gè)突變位點(diǎn)整合到一條編碼序列上，獲得組合突變體(命名為CV-FAEA)，其熱穩(wěn)定性得到很大提高。本發(fā)明通過(guò)如下方式來(lái)實(shí)現(xiàn)隨機(jī)突變文庫(kù)的構(gòu)建和篩選我們已報(bào)道了黑曲霉(Aspergi1IusnigerCIB423.1)中克隆的編碼260個(gè)氨基酸殘基的阿魏酸酯酶A編碼序列(EMBLaccessionnumber:FJ430154)，并利用PoPMuSiC在線工具對(duì)其進(jìn)行計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)獲得了耐熱性提高了的阿魏酸酯酶A，暫命名為FAEA-D93G/S187F(見(jiàn)SEQIDNO.1)，該突變體作為下述基因操作的母本(S.-B.Zhang,andΖ._L.Wu,IdentificationofaminoacidresiduesresponsibleforincreasedthermostabilityofferuloylesteraseAfromAspergillusnigerusingthePoPMuSiCalgorithm.Bioresour.Technol.102(2011)2093-2096)。采取易錯(cuò)PCR方法對(duì)編碼母本FAEA-D93G/S187F的基因進(jìn)行隨機(jī)突變，以pPIC9K載體構(gòu)建高效突變庫(kù)，再將含有突變基因的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入畢赤酵母(PichiapastorisKM71)中，挑取突變子單克隆以及母本對(duì)照菌株于96孔板中培養(yǎng)并誘導(dǎo)阿魏酸酯酶A表達(dá)。將酶表達(dá)后的菌液離心，取部分上清液以2-氯對(duì)硝基苯酚為底物，反應(yīng)適當(dāng)時(shí)間測(cè)定酶活。同時(shí)，另取相同體積的上清液熱處理一定時(shí)間，以相同的方法測(cè)定殘余酶活性。然后，將殘余活性高于對(duì)照的菌株轉(zhuǎn)接到新的96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行重復(fù)篩選。培養(yǎng)耐熱性提高的突變酶重組菌，提取其基因組，并用PCR技術(shù)獲得其相應(yīng)的突變阿魏酸酯酶A的基因，送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。詳細(xì)方案見(jiàn)實(shí)施例2。經(jīng)上述隨機(jī)突變庫(kù)構(gòu)建和篩選，獲得了12個(gè)由單個(gè)氨基酸殘基的突變引起耐熱性有不同程度提高的阿魏酸酯酶A突變體，分別將其命名為Z1、Z2、Z3、Z4、Z5、Z6、Z7、Z8、Z9、Z10、Z11、Z12，序列信息見(jiàn)SEQIDNO.3-N0.13，其特征如下Zl該酶的第177位的谷氨酰胺突變?yōu)榻z氨酸；DNA序列由CAG變?yōu)镃AT。Z2該酶的第63位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔籇NA序列由ACC變?yōu)锳TC。Z3該酶的第140位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸；DNA序列由GCA突變?yōu)锳CA。Z4該酶的第235位由半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸；DNA序列由TGT突變?yōu)锳GT。Z5該酶的第57位由蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；DNA序列由ACC突變?yōu)锳TC。Z6該酶的第178位由纈氨酸突變?yōu)楸彼?；DNA序列由GTC突變?yōu)镚CC。Z7該酶的第14位由亮氨酸突變?yōu)楸奖彼?；DNA序列由TTA突變?yōu)門(mén)TC。Z8該酶的第163位由絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸；DNA序列由AGC突變?yōu)锳CC。Z9該酶的第37位由賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼幔籇NA序列由AAA突變?yōu)棣ˇ肠?。ZlO該酶的第121位由谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸；DNA序列由CAG突變?yōu)镃AC。Zll該酶的第185位由谷氨酰胺突變?yōu)榫彼幔籇NA序列由CAG突變?yōu)镃GG。Ζ12該酶的第35位由蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?；DNA序列由ACT突變?yōu)锳TT。12個(gè)位點(diǎn)的整合通過(guò)全序列基因合成整合以上12個(gè)突變位點(diǎn)，將合成的基因片段連入pGAPZαA載體并在畢赤酵母(PichiapastorisKM71)中表達(dá)(組合突變體阿魏酸酯酶A，命名為CV-FAEA，氨基酸序列見(jiàn)SEQIDNO.14)。母本和CV-FAEA純化后做耐熱性比較發(fā)現(xiàn)，與母本相比，整合了12個(gè)突變位點(diǎn)的突變體CV-FAEA的熱耐受性有了極大提高。如母本在55°C處理15分鐘時(shí)，其酶活性就喪失了一半，而CV-FAEA在55°C下處理4000分鐘后仍保持90%以上的酶活性。需要指出的是，C235S突變位點(diǎn)(Z4)在50-90°C溫度下處理一個(gè)小時(shí)能保持50%以上殘余活力，其對(duì)組合突變體CV-FAEA耐熱性提高有很大貢獻(xiàn)。阿魏酸酯酶A突變體耐熱性的顯著提高顯示了該酶在生物能源、飼料、造紙、保健食品、醫(yī)藥等行業(yè)潛在的應(yīng)用價(jià)值。圖1為母本阿魏酸酯酶A和組合突變體CV-FAEA的耐熱性比較。其中，··為母本阿魏酸酯酶A的酶活變化曲線；為組合突變型阿魏酸酯酶A的酶活變化曲線。T為溫度，Y為殘余酶活力。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，需要指出的是，本實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明，而非對(duì)本發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1易錯(cuò)PCR(error-pronePCR)方法構(gòu)建阿魏酸酯酶文庫(kù)利用GeneMorphIIRandomMutagenesiskit對(duì)阿魏酸酯酶基因(見(jiàn)SEQIDNO.1)進(jìn)行隨機(jī)突變。所用弓丨物為:faeA~F:5，-taggaggtgaattcgcctccacgcaaggcatctc-3，faeA-R:5，-taggaggtgcggccgcttaccaagtacaagctccgctcg-3，反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，61°C退火Imin和72°C延伸lmin，共25個(gè)循環(huán)，電泳后回收基因片段。將回收片段用NotI和EcoRI雙酶切，與經(jīng)過(guò)相同酶切的pGAPZαA載體(含有博萊霉素抗性基因)進(jìn)行連接反應(yīng)。雙酶切消化后的PGAPZαA載體和目的基因片段的摩爾量比13混合后，加入600個(gè)單位的T4連接酶，16°C連接過(guò)夜。然后將連接產(chǎn)物用酚/氯仿抽提兩次，離心，濃縮連接產(chǎn)物并用ddH20溶解后，電擊法轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，得到約5XIO4個(gè)克隆的一級(jí)突變庫(kù)。收集一級(jí)突變庫(kù)平板上的菌落培養(yǎng)2-3小時(shí)后提取質(zhì)粒，用NotI和EcoRI雙酶切回收的目的片段，與經(jīng)過(guò)相同酶切的PPIC9K載體(含有氨芐青霉素抗性基因)進(jìn)行連接反應(yīng)，連接產(chǎn)物濃縮、轉(zhuǎn)化等操作均和一級(jí)突變庫(kù)構(gòu)建方法一致。最后得到約5XIO4個(gè)克隆的二級(jí)突變庫(kù)。實(shí)施例2阿魏酸酯酶突變體庫(kù)的篩選將實(shí)施例1中二級(jí)突變庫(kù)克隆收集后提取質(zhì)粒并經(jīng)PmeI內(nèi)切酶線性化后，電擊轉(zhuǎn)化畢赤酵母(PichiapastorisKM71)感受態(tài)細(xì)胞并涂布MD平板(1.34%YNB，4X1(Γ5%生物素，2%葡萄糖)。培養(yǎng)2天后，挑取單克隆于96孔板，每孔含有150μ1BMGY培養(yǎng)基(含有l(wèi)OOmM、pH值6.0的磷酸鉀緩沖液，2%胰蛋白胨，酵母提取物，甘油，4x10_5%生物素)，30°C，280rpm，震蕩培養(yǎng)2天。用96孔板復(fù)制器復(fù)制各單克隆于MD固體培養(yǎng)基平板，30°C培養(yǎng)2天后存放于4°C冰箱中。離心96孔板培養(yǎng)物后移出上清液，并加入150μ1BMMY(培養(yǎng)基成分中除了用0.5%甲醇代替甘油外，其他成分和BMGY相同)，然后于30°C，280rpm搖床中震蕩培養(yǎng)36小時(shí)，誘導(dǎo)阿魏酸酯酶表達(dá)。離心，用排槍輕輕吸出96孔板各孔中的上清液，按相應(yīng)位置分別加入20μ1上清液于兩塊96孔板中。一塊裝有20μ1上清液的96孔板加入180μ1反應(yīng)液(0.85倍體積的含2.5%TritonX-100的100mM、pH6.4的磷酸鈉緩沖液和0.05倍體積的含有20mM2-氯對(duì)硝基苯酚底物的二甲基亞砜溶液混合而成)，40°C反應(yīng)15min。另一塊裝有20μ1上清液的96板置于63°C烘箱，30min處理后迅速放置在4°C快速降溫。如上述反應(yīng)以測(cè)定突變體殘余活性。殘余活性比母本殘余活性高的菌株挑到新的96孔培養(yǎng)板中進(jìn)行重復(fù)篩選。篩選到27個(gè)突變體，殘余活性是母本對(duì)照的2-5倍不等(見(jiàn)表1)。培養(yǎng)這些突變酶重組菌，提取其基因組，并用PCR技術(shù)獲得其相應(yīng)的突變阿魏酸酯酶基因，送上海英駿生物技術(shù)公司測(cè)序。對(duì)27個(gè)耐熱性提高的阿魏酸酯酶A突變體編碼序列測(cè)序結(jié)果分析后，確定突變酶熱穩(wěn)定的提高是由12個(gè)氨基酸突變引起的。12個(gè)單點(diǎn)突變體分別命名為Z1、Z2、Z3、Α、Ζ5、Ζ6、Ζ7、Ζ8、Ζ9、Ζ10、Zll、Ζ12，其具體特征見(jiàn)本說(shuō)明書(shū)
發(fā)明內(nèi)容部分。實(shí)施例3阿魏酸酯酶突變位點(diǎn)的整合將以上獲得的12個(gè)突變位點(diǎn)整合到一條核苷酸編碼序列上并由上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成全序列。為了方便后續(xù)蛋白純化，將合成的全序列用NotI和EcoRI雙酶切回收目的片段，連入經(jīng)過(guò)相同酶切的PGAPZaA載體(含有博萊霉素抗性基因)中(連接方法如實(shí)施例1)。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)并提取重組質(zhì)粒。將質(zhì)粒用BspHI內(nèi)切酶線性化后，轉(zhuǎn)化畢赤酵母(PichiapastorisKM71)感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有100yg/ml的博萊霉素的YPDS培養(yǎng)基(含有2%胰蛋白胨，1%酵母提取物，2%葡萄糖，IM山梨醇)中，30°C培養(yǎng)3天。挑取單克隆于YPD培養(yǎng)基(除不含有IM山梨醇外，培養(yǎng)基成分與YPDS培養(yǎng)基相同)中培養(yǎng)2天以表達(dá)該組合突變體酶。實(shí)施例4母本和12個(gè)單點(diǎn)突變的阿魏酸酯酶A粗酶液的熱穩(wěn)定測(cè)定將表達(dá)母本和12個(gè)單點(diǎn)突變的阿魏酸酯酶A的單克隆分別挑到25ml的BMGY培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩天后離心棄上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸菌體。0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)兩天后，取培養(yǎng)物上清于55°C溫度下分別測(cè)定母本和除Z4突變酶外的其他10個(gè)單點(diǎn)突變的阿魏酸酯酶A突變體的半失活時(shí)間(t1/2)；而Z4突變酶于90°C溫度下處理并測(cè)定其半失活時(shí)間(t1/2)。培養(yǎng)方法和酶活測(cè)定方法如實(shí)施例2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表1。表1母本阿魏酸酯酶A以及單點(diǎn)突變體t1/2測(cè)定權(quán)利要求1.一種阿魏酸酯酶A突變體，其特征在于以SEQIDNO.2所示的阿魏酸酯酶A氨基酸序列為基礎(chǔ)，經(jīng)突變后具有以下突變位點(diǎn)的氨基酸序列將其第14位的亮氨酸突變?yōu)楸奖彼峄?和第35位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第37位的賴氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第57位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第63位的蘇氨酸突變?yōu)楫惲涟彼峄?和第121位的谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸或/和第140位的丙氨酸突變?yōu)樘K氨酸或/和第163位的絲氨酸突變?yōu)樘K氨酸或/和第177位的谷氨酰胺突變?yōu)榻M氨酸或/和第178位的纈氨酸突變?yōu)楸彼峄?和第185位的谷氨酰胺突變?yōu)榫彼峄?和第235位的半胱氨酸突變?yōu)榻z氨酸。2.將權(quán)利要求書(shū)1所述的阿魏酸酯酶A突變體的基因連入PPIC9K或pGAPZαA載體，并在宿主菌PichiapastorisKM71中表達(dá)，獲得突變體酶蛋白。3.權(quán)利要求1所述的阿魏酸酯酶A突變體在半纖維素降解中的用途。全文摘要本發(fā)明屬于基因工程和酶工程
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體涉及一種阿魏酸酯酶A突變體及其用途。本發(fā)明利用易錯(cuò)PCR對(duì)阿魏酸酯酶A母本基因隨機(jī)突變，構(gòu)建隨機(jī)突變文庫(kù)，通過(guò)高通量篩選體系篩選出12個(gè)耐熱性提高的阿魏酸酯酶A突變體位點(diǎn)，并通過(guò)全序列合成方法將這12個(gè)突變位點(diǎn)整合到一條編碼序列上，獲得組合突變體。該組合突變體比母本的熱穩(wěn)定性有極大提高，顯示出在生物能源、飼料、造紙、保健食品，醫(yī)藥等工業(yè)中潛在的應(yīng)用價(jià)值。文檔編號(hào)C12N15/81GK102220299SQ20111010202公開(kāi)日2011年10月19日申請(qǐng)日期2011年4月22日優(yōu)先權(quán)日2011年4月22日發(fā)明者劉艷,吳中柳,張帥兵,裴小瓊申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院成都生物研究所