專利名稱：細(xì)胞周期s期報告基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)和基因工程領(lǐng)域，具體地講，涉及一個報告基因。
背景技術(shù)：
報告基因是一種編碼某種易于檢測的蛋白質(zhì)或酶的基因，把報告基因的編碼序列與其他目的基因融合，在調(diào)控序列控制下進(jìn)行表達(dá)，通過報告基因的表達(dá)產(chǎn)物可標(biāo)定目的基因的表達(dá)狀況。報告基因技術(shù)因具有高靈敏度、檢測方便等特點，被廣泛應(yīng)用于啟動子分析、監(jiān)控轉(zhuǎn)基因及其表達(dá)、細(xì)胞的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與藥物的篩選等多種細(xì)胞事件。隨著技術(shù)和檢測方法的進(jìn)步，熒光素酶以其能夠?qū)⒓?xì)胞內(nèi)基因的活性可視化和對細(xì)胞的無毒性而越來越成為主流，并且熒光素酶報告基因技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于體外監(jiān)測細(xì)胞生長和增殖。細(xì)胞的正常生長、分裂，必須依次經(jīng)過準(zhǔn)備階段的間期和有絲分裂期，細(xì)胞周期的正常運行，受到特異的細(xì)胞周期素和細(xì)胞周期依賴性蛋白激酶的精確調(diào)控，同時，還伴隨著多種特異性分子的合成和降解?；诖?，將熒光素酶報告基因與某一細(xì)胞周期特異性分子基因融合，便可通過觀察熒光素酶報告基因反映特異性分子的表達(dá)情況，進(jìn)而間接地了解細(xì)胞周期的變化及增殖情況。S 期激酶相關(guān)蛋白 2 (S-phase kinase associated protein 2，SKP2)是人類 F-box蛋白家族中的一員。研究發(fā)現(xiàn)，SKP2主要參與Gl期與S期的調(diào)控，是細(xì)胞進(jìn)入S期的必須蛋白。SKP2在Gl-S期之間出現(xiàn)，于S-G2期升高，到M期時則因上皮-鈣粘連素 (⑶Hl)介導(dǎo)的泛素化而迅速下降。因此，SKP2的表達(dá)變化可準(zhǔn)確地反映出細(xì)胞周期由Gl 期向S期轉(zhuǎn)變的過程，將熒光素酶與SKP2融合，便可構(gòu)建出反映細(xì)胞周期S期的報告基因。根據(jù)以前的研究，細(xì)胞周期的分析主要基于兩種生物學(xué)技術(shù)，一種是5溴脫氧尿嘧啶核苷(5-Bromodeoxyuriding，BrdU)摻入法，其主原理是5-BrdU可在S期代替胸腺嘧啶(T)滲入正在復(fù)制的DNA分子。另一種是應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞周期分析，其原理是利用各期的DNA含量的不同。但兩種方法都只能在細(xì)胞水平觀測細(xì)胞周期的變化，而無法實現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞周期監(jiān)測。近年來，通過體內(nèi)細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)而實現(xiàn)體內(nèi)細(xì)胞周期監(jiān)測的方法不斷涌現(xiàn)，如溴脫氧尿苷和放射性核素等標(biāo)記細(xì)胞和分子，但這些技術(shù)卻存在細(xì)胞毒性作用， 而且隨著細(xì)胞不斷分裂，標(biāo)記信號逐漸消失。細(xì)胞周期報告基因則因其對細(xì)胞無毒性，可進(jìn)行體內(nèi)細(xì)胞周期監(jiān)測而很好地克服了以往細(xì)胞周期分析技術(shù)的不足。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是設(shè)計一種新的報告基因，用于檢測細(xì)胞周期的變化。本發(fā)明的另一個目的是提供上述報告基因為抗腫瘤藥物療效的評價提供一種新的檢測方法。本發(fā)明的另一個目的是提供上述報告基因在分子生物學(xué)方面的研究應(yīng)用。本發(fā)明的另一個目的是提供上述報告基因在轉(zhuǎn)基因動物中的應(yīng)用。本發(fā)明是采用PCR的方法從基因組中擴(kuò)增出SKP2基因并對它進(jìn)行分析，然后克隆到PCDNA3. 1 ( + )-luc2質(zhì)粒上，并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，提取質(zhì)粒，并對它進(jìn)行酶切和測序分析，再將鑒定正確的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中進(jìn)行各項功能分析。SKP2和細(xì)胞周期依賴的基因調(diào)控之間密切相關(guān)，在正常細(xì)胞增殖調(diào)控中起重要作用?，F(xiàn)已有許多細(xì)胞周期相關(guān)分子被證實經(jīng)由SKP2依賴泛素蛋白酶體降解，包括如E2F， cyclinDl, cyclinE, cyclinA, cyclinB, CDC25B, p21wafl, p27kipl, p53。其中最重要的是 p27，p27kipl是重要的細(xì)胞周期負(fù)性調(diào)控因子，細(xì)胞由靜止?fàn)顟B(tài)進(jìn)入增殖狀態(tài)需p2^dpl 的降解，cyclinE-⑶K2復(fù)合物的激酶活性使p2^dpl的187位蘇氨酸110磷酸化，SKP2 特異性作用于磷酸化的P2^dpl，使其通過泛素蛋白酶體途徑降解，從而解除p2^dpl對 cyclin-CDK的抑制作用，使細(xì)胞順利通過細(xì)胞周期G S轉(zhuǎn)變的檢測點，細(xì)胞周期得以正常進(jìn)行。同時SKP2的表達(dá)水平受CDHl的泛素化調(diào)節(jié)，在M期迅速被CDHl介導(dǎo)的泛素化降解。本發(fā)明所提供的DNA序列，如圖1所示，代表的是報告基因SKP2-luc2的序列。其序列從907至3864共四58個bp，具有報告細(xì)胞是否處于S期的能力。232到819是啟動子(CMV)J956到四58是終止密碼子。本發(fā)明的有益效果本發(fā)明以報告基因的表達(dá)來觀測細(xì)胞周期的變化的策略有如下幾個優(yōu)點1、可體內(nèi)監(jiān)測細(xì)胞周期的變化，克服了流式等技術(shù)只能在細(xì)胞水平的觀察細(xì)胞周期的缺點，為動物實驗提供了一個強(qiáng)有力的工具。2、可早期監(jiān)測疾病的增殖情況，能達(dá)到對藥物療效進(jìn)行早期評價，縮減藥物的研發(fā)時間和減少研發(fā)費用?？朔藗鹘y(tǒng)影像學(xué)只能從解剖水平對疾病描述的局限，及核素標(biāo)記存在的細(xì)胞毒性的局限。


圖 1 為 PCDNA3. 1 ( + ) -SKP2-1UC2 構(gòu)建圖； 圖 2 為 pCDNA3. 1 ( + ) -SKP2-luc2 酶切結(jié)果； 圖3為細(xì)胞周期同步化后結(jié)果A、流式結(jié)果，B、熒光素酶的活性結(jié)果； 圖4為chdl-siRNA干擾后實驗結(jié)果A、westernbl0t結(jié)果，B、熒光素酶活性結(jié)果； 圖5為蛋白酶體抑制劑MG132、ALLN作用后實驗結(jié)果=Aiesternblot結(jié)果，B、熒光素酶活性結(jié)果。
具體實施例方式1質(zhì)粒的構(gòu)建
1.1引物設(shè)計
根據(jù)引物設(shè)計及質(zhì)粒設(shè)計要求分別加入NheI及Hind III酶切位點。Sense:
5’ -GCGCGCTAGCGCCACCATGCACAGGAAGCACCTCCA-3’ Anti-Sense
5 ’ -GCGCAAGCTTGACAACTGGGCTTTTGCAGTGT-3’ 1.2擴(kuò)增目的基因片段
1.2. 1在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌PCR-EP管中 IOXBuffer buffer 5 μ 1 dNTPmix(2 Mm) 4 μ 1
4引物 1 (10 Rn) 2 μ 1
引物 2 (10 Rn) 2 μ 1
DNA 模板(pCDNA3 myc-SKP2)1 μ 1
加 ddH20 至50 μ 1
1.2. 2調(diào)整好反應(yīng)程序。置于PCR儀上，PCR反應(yīng)參數(shù)為94°C 25秒，58°C 30秒， 720C 60 S,循環(huán)30次。最后72°C，保溫7 min。1. 2. 3取PCR產(chǎn)物用于電泳檢測 1.3連接
步驟①將質(zhì)粒PCDNA3. 1 (+)-luc2 (先用Hind III和NheI內(nèi)切酶處理)與插入DNA片段混合制備成體積為10 μ 1的DNA溶液，載體DNA和插入DNA的比例為0. 03 pmol 0. 3 pmol ；②向上述DNA溶液中加入等體積10 μ 1的連接酶，充分混勻；③16°C反應(yīng)30分鐘。2重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和鑒定
2.1 轉(zhuǎn)化
步驟①從-80°C冰箱中取一支感受態(tài)細(xì)胞懸液融解(從大連寶生物公司購買)；②、加入上述DNA產(chǎn)物2 μ 1，輕輕搖勻，冰上放置30 min ；③42°C水浴中熱擊90秒；④冰上冷擊卻5 min ；⑤取上述菌涂布于含Amp的篩選平板上，正面向上放置半小時，待菌液完全被培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)皿，37°C培養(yǎng)16 h;⑥挑選10單個的白色菌落分別放在5 ml含Amp的 LB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)。2.2質(zhì)粒提取
材料質(zhì)粒小提試劑盒(天根公司，目錄號DP103-03)，上述過夜培養(yǎng)的菌液步驟①柱平衡步驟向吸附柱CP3中加入500 μ 1的平衡液BL，12，000 rpm離心1 分鐘，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱重新放回收集管中；②取1-5 ml過夜培養(yǎng)的菌液， 加入離心管中，使用常規(guī)臺式離心機(jī)，12，000 rpm離心1分鐘，吸除上清；③向留有菌體沉淀的離心管中加入250 μ 溶液Ρ1，使用移液器或渦旋振蕩器徹底懸浮細(xì)菌沉淀；④向離心管中加入250 μ 溶液Ρ2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)6 — 8次使菌體充分裂解；⑤向離心管中加入；350 μ 1溶液Ρ3，立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)6-8次，充分混勻，12,000 rpm Cl3,400Xg )離心10分鐘，此時在離心管底部形成沉淀；⑥將上一步收集的上清液用移液器轉(zhuǎn)移到吸附柱CP3中，12，000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中；⑦向吸附柱CP3中加入500 μ 1去蛋白液PD，12,000 rpm離心30 - 60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3重新放回；⑧向吸附柱CP3中加入600 μ 漂洗液PW， 12，OOOrpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CP3放入收集管中；⑨向吸附柱 CP3中加入600 μ 1漂洗液PW，12，000 rpm離心30-60秒，倒掉收集管中的廢液；⑩將吸附柱CP3放入收集管中，12，000 rpm離心2分鐘，目的是將吸附柱中殘余的漂洗液去除；
Θ將吸附柱CP3置于一個干凈的離心管中，向吸附膜的中間部位滴加50-100 μ 洗脫緩
沖液ΕΒ，室溫放置2分鐘，12，000 rpm離心1分鐘將質(zhì)粒溶液收集到離心管中。2. 3 酶切
材料上述提取質(zhì)粒，內(nèi)切酶Hind III (寶生物公司)，內(nèi)切酶NheI (寶生物公司) 步驟分四組第一組20 μ 1體系中3 μ 1 DNA, 2 μ 1 10XBuffer, 15 μ 1無菌水，第二組 20 μ 1 體系中 3 μ 1 DNA, 2 μ 1 10XBuffer,l μ 1 Hind III內(nèi)切酶，14 μ 1 無菌水， 第三組 20 μ 1 體系中 3 μ 1 DNA，2 μ 1 10XBuffer,l μ 內(nèi)切酶 Nhel，14 μ 1 無菌水， 第四組 20 μ 1 體系中 3 μ 1 DNA，2 μ 1 10XBuffer,l μ 1 Hind III內(nèi)切酶，1 μ 1 內(nèi)切酶 Nhel,13 μ 1無菌水。輕輕混勻后在37° C環(huán)境下酶切2 h。結(jié)果見圖2。2. 4將上述酶切正確的質(zhì)粒菌種送公司測序。3 建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 pCDNA3. 1 ( + )SKP2_luc2 和 pCDNA3. 1 ( + )_luc2 的細(xì)胞株及鑒定 3.1轉(zhuǎn)染
材料HeLa 細(xì)胞，U20S 細(xì)胞，pCDNA3. l( + )SKP2_luc2 質(zhì)粒，Lipofectamine 2000,6418, pCDNA3. 1 ( + )-luc2 質(zhì)粒。步聚①取六孔板的培養(yǎng)皿，分別加入一定量的3X105HeLa細(xì)胞和U20S細(xì)胞 37° C培養(yǎng)，至70%左右匯合；②根據(jù)Lipofectamine2000的說明書加8. 0 μ g pCDNA3. 1 ( + )SKP2-luc2 質(zhì)粒 DNA 和 pCDNA3. 1 ( + )_luc2 質(zhì)粒 DNA 及 20 μ 1 的 Lipofectamine2000 進(jìn)行轉(zhuǎn)染；③轉(zhuǎn)染48 h后加將細(xì)胞轉(zhuǎn)到100 mm的培養(yǎng)皿中進(jìn)行培養(yǎng)；④加G418(1000 μ g/ ml)進(jìn)行篩選，每二天換一次液，篩選時間為2周后擴(kuò)大培養(yǎng)。這種轉(zhuǎn)染好的細(xì)胞分別命名為 HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 細(xì)胞，HeLa pCDNA3. 1 ( + ) luc2 細(xì)胞，U20SpCDNA3. 1 ( + ) SKP2-luc2 細(xì)胞，U20S pCDNA3. 1 ( + ) luc2 細(xì)胞。3. 2 鑒定
步聚取六孔板的培養(yǎng)分別加入適量上述的HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2細(xì)胞、HeLa PCDNA3. 1 ( + )luc2細(xì)胞、HeLa細(xì)胞，培養(yǎng)到子數(shù)生長期，用RLB裂解液裂解(Promega公司) 細(xì)胞提取蛋白。利用BCA (試劑盒購買自碧云天公司)法檢測蛋白濃度，蛋白分兩部分，一份用來檢測熒光素酶活性，一份用來做westernblot檢測蛋白。4檢測報告基因的功能 4.1細(xì)胞周期同步化
材料=HeLa pCDNA3. 1 ( + )SKP2_luc2 細(xì)胞，胸苷(Thymidine)，羥基脲(hydroxylurea) 步驟①取60mm的培養(yǎng)皿6 (分別命名為1-6號)個第個里加適量的HeLa ρ⑶NA3. 1 ( + )SKP2-luc2細(xì)胞，將細(xì)胞培養(yǎng)至指數(shù)生長期的早期(密度大概50%左右);②往(1-5號， 6號用來做對照)加入含2. 5 mmol / L Thymidine (sigma公司)的培養(yǎng)基用于腫瘤細(xì)胞的同步化培養(yǎng)，作用M h ；③棄掉含Thymidine培養(yǎng)基，用PBS液洗2次，再換上新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)溫浴10 h;④加入1 mmol / L hydroxylurea (sigma公司)進(jìn)行第2次阻斷，作用 14 h;⑤再棄含hydroxylurea培養(yǎng)基，PBS液洗2_3次后換上普通培養(yǎng)基，進(jìn)行第一次取樣。細(xì)胞一分為二，一部分細(xì)胞用于流式，一部分用于蛋白樣品的提??；⑥以后每3 h取一次樣。4. 1. 1 流式分析
步驟①將上述用于做流式的細(xì)胞用PBS洗二遍；②用70%的冰浴酒精過夜固定；③離心離去乙醇，PBS清洗一次；④每管細(xì)胞樣品中加入0. 5 ml碘化丙啶染色液(碧云天公司)， 緩慢并充分重懸細(xì)胞沉淀，37°C避光溫浴30分。V、上機(jī)。結(jié)果見圖3. A04. 1.2熒光素酶活性的檢測
步聚①、BCA法測蛋白濃度；②、利用發(fā)光儀(lumat LB 9507，BERTHO⑶公司)檢測熒光素酶活性。結(jié)果見圖3. B。
4.2 CDHl-siRNA 干擾實驗
材料HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 細(xì)胞禾Π HeLa pCDNA3. 1 ( + ) luc2 細(xì)胞， Lipofectamine2000, CDHl-siRNA 及 NC-siRNA (序列如下)。步驟①用DEPC水處理相關(guān)實驗用品；②取60 mm的培養(yǎng)皿6個，每孔分別加入適量的 HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 細(xì)胞和 HeLa pCDNA3. 1 ( + )luc2 細(xì)胞；③根據(jù) Lipofectamine2000anvitrogen 公司)的說明書加 200 pmol siRNA 及 10 μ 1 的 LipofectamindOOO進(jìn)行轉(zhuǎn)染。④48 h用RLB裂解液裂解細(xì)胞。⑤BCA測蛋白濃度，蛋白樣品分兩部分，一部分用做熒光素酶活性檢測，一部分用做westernblot實驗。結(jié)果見圖4， SKP2通過⑶Hl介導(dǎo)的泛素化降解，RNA干擾cdhl后，SKP2和SKP2-LUC2的表達(dá)均升高。Scramble siRNA:
Sense5' -UUCUCCGAAC⑶⑶CAC⑶TT-3‘
Anti-Sense 5' -AC⑶GACACGUUCGGAGAATT-3‘ CDHl siRNA:
Sense5' -UGAGAA⑶CUCCCA⑶CAGTT-3‘
Anti-Sense 5' -CUGACUGGGAGACUUCUCATT-3‘ 4.3 蛋白酶體抵制實驗
材料MG132 (碧云天公司)，ALLN (sigma 公司)，HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 細(xì)胞和 HeLa pCDNA3. 1 ( + ) luc2 細(xì)胞。步驟①取60 mm培養(yǎng)皿六個，第個分別加適量的HeLa pCDNA3. 1 ( + ) SKP2_luc2 細(xì)胞及HeLa pCDNA3. 1 ( + )luc2。②等細(xì)胞大約80%匯合時分別等體積的DMS0、MG132 (25 ymol/L),ALLN (50 μ mol/L)。③5 h后用RLB裂解液提取蛋白，檢測蛋白濃度，蛋白樣品一分為二一份用于熒光素酶活性的檢測，一份用于westernblot分析。結(jié)果見圖5，SKP2經(jīng)蛋白酶體途徑降解，抑制蛋白酶體活性后，SKP2和SKP2-LUC2的表達(dá)均升高。
權(quán)利要求
1.一種細(xì)胞周期S期報告基因，其核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。
2.含有權(quán)利要求1所述核苷酸序列的重組質(zhì)粒。
3.如權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒，其特征在于所述重組質(zhì)粒為 pCDNA3. l(+)-skp2-luc2。
4.權(quán)利要求1所述報告基因在制備用于觀察細(xì)胞周期變化藥物或制備抗腫瘤診斷藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了細(xì)胞周期S期報告基因及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了采用報告基因來檢測細(xì)胞周期變化的方法。用pCDNA3.1(+)-luc2的質(zhì)粒和S期激酶相關(guān)蛋白2(skp2)的cDNA構(gòu)建新的質(zhì)粒，將構(gòu)建的新質(zhì)粒用來轉(zhuǎn)染細(xì)胞，對所獲得的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示skp2-luc2報告基因在S期特異性的高表達(dá)。本發(fā)明可用于體內(nèi)監(jiān)測細(xì)胞周期的變化，克服了流式等技術(shù)只能在細(xì)胞水平觀察細(xì)胞周期的缺點，為動物實驗提供了一個強(qiáng)有力的工具。并且，利用本發(fā)明可對藥物療效進(jìn)行早期評價，縮減藥物的研發(fā)時間和減少研發(fā)費用，克服了傳統(tǒng)影像學(xué)只能從解剖水平對疾病描述的局限，及核素標(biāo)記存在的細(xì)胞毒性的局限。
文檔編號C12N15/63GK102181439SQ201110075260
公開日2011年9月14日 申請日期2011年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2011年3月28日
發(fā)明者張國君, 趙瑞君, 陳志鴻 申請人:汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院