斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白e基因序列及其制備方法和用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E的基因序列及其制備方法和用途，旨在提供一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列及其制備方法，該序列用于檢測腫瘤是否擴散或者作為靶位點設(shè)計治療腫瘤的藥物或者通過其在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中的作用進而用來探究斑節(jié)對蝦人工催熟的方法；其核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；制備方法通過提取斑節(jié)對蝦總RNA，來進行cDNA第一鏈的合成，再以合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增技術(shù)對目的基因的5ˊ和3ˊ末端進行PCR擴增；然后對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因進行測定，最后確定斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因分布和表達測定；屬于分子生物學中基因克隆領(lǐng)域。
【專利說明】斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列及其制備方法和用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種細胞周期蛋白E基因序列，具體地說，是涉及一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列，本發(fā)明還涉及該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，屬于分子生物學中基因克隆領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]細胞周期蛋白E是細胞周期調(diào)控過程中一個非常重要的蛋白，主要在細胞Gl期與CDK7結(jié)合并起作用，周期蛋白E屬于Gl期的正調(diào)節(jié)因子，主要對Gl期到S期的過渡進行調(diào)控，與同作為G1/S轉(zhuǎn)換點功能調(diào)控的因子CyclinD、抑癌基因視網(wǎng)膜神經(jīng)膠質(zhì)細胞瘤蛋白(retinob lastoma protein, Rb)、轉(zhuǎn)錄因子 E2F、抑癌基因 p53、KIP 家族、CDK2、4、5 等相互作用共同決定細胞周期的正常進行。周期蛋白E在進入S期后便立即被泛素化降解。
[0003]目前發(fā)現(xiàn)的Cyclin家族成員可分為10大類:A~J，包括亞型共15種，其中周期蛋白E是參與細胞周期G1/S期轉(zhuǎn)換的重要正性調(diào)節(jié)因子且在人的研究中最為廣泛，大多集中于周期蛋白E對腫瘤治療方面。近些年來，各國對腫瘤的研究逐漸集中在細胞周期調(diào)控方面，而周期蛋白E與CDK2結(jié)合后的復(fù)合物在周期調(diào)控方面起著舉足輕重的作用，特別是其涉及的Gl期磷酸化作用，更是當前的研究熱點。
[0004]隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，目前周期蛋白E基因在很多物種中相繼被克隆出來，如 Homo sapiens:人(AAM54043.1) ；Danio rerio:斑馬魚(NP_001002075.1) ；Megachilerotundata:切葉蜂(XP_003700054.1) ；Carassius auratus:鯽魚(BAA85846.1)等，但在對蝦中研究較少。
[0005]目前斑節(jié)對蝦的養(yǎng)殖過程存在雌性對蝦性腺發(fā)育不同步，且人工催熟效果差的問題，而細胞周期調(diào)控的研究對探討卵巢發(fā)育機理即雌蝦性成熟問題具有相當重要的意義，所以，期望通過對周期蛋白E的研究為發(fā)現(xiàn)新的催熟方法提供一定的理論支持。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]針對上述問題，本發(fā)明以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)，設(shè)計PCR擴增引物，并通過RACE技術(shù)克隆得到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的全表達序列，有利于探究斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育相關(guān)機理，并為發(fā)現(xiàn)新的催熟方法提供一定的理論支持。
[0007]為解決前一技術(shù)問題，本發(fā)明提供的第一個技術(shù)方案是這樣的:該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0008]本發(fā)明提供的后一技術(shù)方案是這樣的:該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，依次包括下述方法:
[0009]I)總RNA的提取
[0010]取健康的斑節(jié)對蝦三尾解剖，取出性腺并進行混合，將性腺混合液于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對 蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存；
[0011]2)cDNA第一鏈的合成[0012]將步驟I)中的斑節(jié)對奸性腺總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物混合,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈；
[0013]3)斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的PCR擴增、克隆
[0014]以步驟I)中合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增法對目的基因的5 z和:T末端進行PCR擴增；
[0015]其中:
[0016]在:T RACE中，利用降落PCR方法，依次接頭引物和cyCE-Fl、CyCE-F2進行PCR擴增；
[0017]在5 ' RACE中，首先利用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA為模板，以cycE-Rl和oligo-dG為引物進行一次PCR，所得PCR產(chǎn)物取用cycE_R2和oligo-dG進行二次PCR擴增；
[0018]4)對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的測定
[0019]所得到的PCR產(chǎn)物在分離檢測后，再將PCR產(chǎn)物純化，克隆到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5CI感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序；
[0020]5)斑節(jié)對奸細胞周期蛋白E的分布和表達
[0021]a)提取斑節(jié)對奸不同組織的RNA,按照PremeScriptTM RT reagent Kit操作手冊進行反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；將不同組織樣品cDNA稀釋作為模板，采用SYBR Green I染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析；
[0022]b)依照 TaKaRa SYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit 試劑盒說明書進行 PCR 反應(yīng)，再采用相對Λ CT法分析Pmcyclin E基因在各樣品中的相對表達量；
[0023]c)分別提取實驗室保存的經(jīng)過MIH處理及眼柄切除手術(shù)的卵巢RNA，然后按照上述a)所示方法進行反轉(zhuǎn)錄及熒光定量。
[0024]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄引物反轉(zhuǎn)錄引物的序列為:5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16〈3。
[0025]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
[0026]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的接頭引物的序列為:5>GGCCACGCGTCGACTAGTAC〈3。
[0027]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟2)所述的反應(yīng)條件:42°C 60min,70°C 15min。
[0028] 進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟3)所述的
[0029]cycE-Fl:5>ACGCCAACCTGACTACCT<3 ；
[0030]cycE-F2: 5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3 ；
[0031]cycE-Rl: 5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3 ；
[0032]cycE-R2:5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC〈3。
[0033]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟3)所述的3 z RACE 中反應(yīng)條件:94°C,5min ；94°C,45s ；60°C,30s ；72°C,45s ；35cycles ；72°C, IOmin0
[0034]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟3)所述的在 5 z RACE 中反應(yīng)條件:94°C,5min ；94°C,45s ；61°C,30s ；72°C,45s ；35cycles ；72°C,IOmin0
[0035]進一步的，上述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，步驟b)中PCR反應(yīng)使用引物為:
[0036]cyclinE-FFl:5>AAAACCGATGAGAAGACT<3 ；
[0037]cyclinE-FF2: 5>TCCTACAGAAGACACCCT<3 ；
[0038]RTEF-F: 5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3 ；
[0039]RTEF-R:5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT〈3。
[0040]該斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列用于檢測腫瘤是否擴散或者作為設(shè)計治療腫瘤藥物的靶位點或者調(diào)節(jié)斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程。
[0041]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明提供的技術(shù)方案具有如下優(yōu)點:
[0042]本發(fā)明的是以實驗室高通量測序獲得的EST序列為基礎(chǔ)設(shè)計的PCR擴增引物，并通過RACE技術(shù)克隆到斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的全表達序列；此外通過斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因設(shè)計熒光定量PCR引物，對周期蛋白E基因在斑節(jié)對蝦不同組織中分布情況及在經(jīng)過MIH注射 或眼柄切除手術(shù)的卵巢組織中的分布情況進行研究分析。不僅為研究斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E在卵巢發(fā)育中的作用奠定基礎(chǔ)，而且可以為斑節(jié)對蝦養(yǎng)殖過程中所出現(xiàn)的性腺發(fā)育參差不齊的情況從分子層面提供理論基礎(chǔ)，并且在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育過程中起重要作用，有利于人工催熟斑節(jié)對蝦，節(jié)約培養(yǎng)成本。
[0043]細胞周期蛋白E作為細胞周期調(diào)控中一個重要的蛋白，在細胞分裂、細胞周期調(diào)控、腫瘤發(fā)生等方面起重要作用，可以作為腫瘤是否擴散的重要檢測指標，可以作為靶位點來設(shè)計治療腫瘤的藥物。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0044]圖1是斑節(jié)對蝦周期蛋白E基因mRNA組織表達模式；
[0045]垂直線表示平均值土標準誤差(重復(fù)樣品數(shù)=4)，不同的字母表示存在顯著性差異(Ρ〈0.05)。
[0046]圖2是細胞cyclin E分別在經(jīng)過MIH注射、眼柄切除的斑節(jié)對蝦卵巢中的表達情況；垂直線表示平均值土標準誤差(重重復(fù)樣品數(shù)=3)。
【具體實施方式】
[0047]為了更好的理解、實施本發(fā)明的權(quán)利要求，下面結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明的權(quán)利要求做進一步的詳細說明，但本發(fā)明并不限于下述實施例，而是以權(quán)利要求為限。
[0048]1、總RNA的提取
[0049]試驗所用的雌雄斑節(jié)對蝦(鮮重200g左右)均取自于海南三亞，室內(nèi)水族箱內(nèi)暫養(yǎng)三天，水溫控制在24~25°C之間。取所需性腺組織約50mg用剪刀剪碎加入1ml的Trizol (美國invitrogen公司)進行勻衆(zhòng),按Trizol試劑盒使用手冊提取斑節(jié)對奸總RNA并用DEPC水懸浮，電泳觀察所提取RNA的完整性，并置于_80°C保存。
[0050]總RNA具體提取步驟:
[0051](I)加 200 μ L 預(yù)冷氯仿，渦旋振蕩 Imin 混勻，靜置 5min, 12000g，4，V 15min。
[0052](2)取三分之一上清溶液，加入等體積的預(yù)冷的異丙醇，顛倒混勻，冰上放置lOmin，12000g，4， °C IOmin0
[0053](3)倒掉上清，加lmL75%乙醇重懸沉淀，7500g，4°C離心5min。
[0054](4)重復(fù)步驟3 一次,并用槍頭吸出上清，干燥5~IOmin
[0055](5)加 40 μ LddH20 溶解沉淀
[0056](6) RNA的電泳檢測:將電泳槽、梳齒等置于3% H202過夜浸泡，配置1.5%的瓊脂糖凝膠(用0.5 X TBE溶液配制)，取5 μ L總RNA加I μ L上樣緩沖液，進行30min電泳檢測，對提取的RNA質(zhì)量進行測定。
[0057]2、cDNA第一鏈的合成
[0058]取步驟I中斑節(jié)對蝦性腺總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物(5>GGCCACGCGACTAGTAC(T) 16<3)(10pmol/L)混合在反轉(zhuǎn)錄酶(M-MLV, Promega, USA)的作用下合成cDNA —鏈。
[0059]cDNA的反轉(zhuǎn)錄實驗按照相關(guān)試劑盒(PrimeScript IIlst Strand cDNASynthesis Kit(TaKaRa))操作方法進行,具體如下:
【權(quán)利要求】
1.一種斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
2.制備權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的方法，其特征在于，依次包括下述方法: 1)總RNA的提取 取健康的斑節(jié)對蝦三尾進行解剖并取出性腺進行混合，將性腺混合液于Trizol中勻漿，提取斑節(jié)對蝦總RNA并用DEPC水懸浮，保存； 2)cDNA第一鏈的合成 將步驟I)中的斑節(jié)對奸性腺總RNA與反轉(zhuǎn)錄引物混合,在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成cDNA第一鏈； 3)斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的PCR擴增、克隆 以步驟I)中合成的第一鏈cDNA作為模板，利用cDNA末端快速擴增法對目的基因的5 ^和:T末端進行PCR擴增； 其中: 在3 ' RACE中，利用降落PCR方法，用接頭引物和cycE-Fl、cycE-F2依次進行PCR擴增；
在5 , RACE中，首先利用末端轉(zhuǎn)移酶在cDNA末端加上polyC尾巴后，以加尾的cDNA為模板，以cycE-Rl和oligo-dG為引物進行一次PCR，所得PCR產(chǎn)物取用cycE_R2和oligo-dG進行二次PCR擴增； 4)對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的測定 所得到的PCR產(chǎn)物在分離檢測后，再將PCR產(chǎn)物純化，連接到pMD-18T載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆，測序； 5)斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因的表達分布研究 a)提取斑節(jié)對奸不同組織的RNA,按照PremeScriptTMRT reagent Kit操作手冊反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板；將不同組織樣品的cDNA進行稀釋并作為后續(xù)實驗?zāi)０?，采用SYBR GreenI染料法，在Eppendorf熒光定量PCR儀上進行擴增和數(shù)據(jù)分析； b)依照TaKaRaSYBR? PrimeScriptTM RTPCR Kit試劑盒說明書進行PCR反應(yīng)，再采用相對ACT法對斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因在各個樣品中的相對表達量進行分析； c)分別提取實驗室保存的經(jīng)過MIH處理及眼柄切除手術(shù)的卵巢RNA，然后按照上述a)所示方法進行反轉(zhuǎn)錄及突光定量。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄引物的序列為:5>GGCCACGCGACTAGTAC(T)16〈3。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反轉(zhuǎn)錄酶為M-MLV。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟2)所述的反應(yīng)條件:42°C 60min，70°C 15min。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟 3)所述的 cycE-Fl:5>ACGCCAACCTGACTACCT<3 ；
cycE-F2:5>CTACAGACTACATAGACCGCTAC<3 ；
cycE-Rl:5>CTGGTGGACTCGGGTGTTGG<3 ；cycE-R2:5>CTGAATTTGTGCCATGTTTC〈3。
7.根據(jù)權(quán)利要 求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟 3)所述的 3 ' RACE 中反應(yīng)條件:94°C，5min ;94°C，45s ；60°C,30s ;72°C，45s ；35cycles ;72°C,IOmin0
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟 3)所述的在 5 ' RACE 中反應(yīng)條件:94°C，5min ;94°C，45s ；61°C,30s ;72°C，45s ；35cycles ；72°C,IOmin0
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列的制備方法，其特征在于，步驟b)中PCR反應(yīng)使用引物:
cyclinE-FFl:5>AAAACCGATGAGAAGACT<3 ；
cyclinE-FF2: 5>TCCTACAGAAGACACCCT<3 ；
RTEF-F:5>AAGCCAGGTATGGTTGTCAACTTT<3 ；
RTEF-R:5>CGTGGTGCATCTCCACAGACT<3。
10.權(quán)利要求1所述的斑節(jié)對蝦細胞周期蛋白E基因序列用于檢測腫瘤是否擴散或者作為設(shè)計治療腫瘤藥物的靶位點或者在斑節(jié)對蝦卵巢發(fā)育的過程中其重要的調(diào)節(jié)作用。
【文檔編號】C12N15/12GK103966230SQ201410214001
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月20日
【發(fā)明者】趙超, 邱麗華, 江世貴, 周發(fā)林, 傅明駿 申請人:中國水產(chǎn)科學研究院南海水產(chǎn)研究所