專(zhuān)利名稱(chēng)：用于由長(zhǎng)心卡帕藻集成生產(chǎn)乙醇和海藻液的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及由長(zhǎng)心卡帕藻(Kapphycus alvarezii)生產(chǎn)乙醇和海藻液的集成方法。更具體地，本發(fā)明涉及用于由富含藻膠的紅色海藻長(zhǎng)心卡帕藻生產(chǎn)乙醇的方法。
背景技術(shù)：
由于乙醇在燃料市場(chǎng)中的高需求，現(xiàn)在乙醇是一種重要的產(chǎn)品。其市場(chǎng)由1975年的不到十億升到2006年的超過(guò)390億升，并且預(yù)計(jì)在2015年達(dá)到1000億升(Licht 2006)。 全球乙醇生產(chǎn)在2000-2005年間超過(guò)翻番，而起始于小得多的基礎(chǔ)的生物柴油的生產(chǎn)僅擴(kuò)張了四倍。相反，在同一時(shí)期，世界油生產(chǎn)僅增加7%。少于4%的乙醇由石油合成生產(chǎn)，而其余的通過(guò)由生物資源發(fā)酵生產(chǎn)?，F(xiàn)在，乙醇由兩大組生物資源生產(chǎn)糖物質(zhì)和淀粉材料。 在這兩種用于燃料乙醇生產(chǎn)的原料之間存在競(jìng)爭(zhēng)。在21世紀(jì)前十年開(kāi)始時(shí)，糖物質(zhì)是多于60%的燃料乙醇生產(chǎn)的原料，到2006年，其份額減少至47%，此時(shí)，谷物占產(chǎn)量的53% (Licht 2006,"World ethanol markets :The outlook to 2015 (世界乙醇市場(chǎng)2015 年展望)，，，Tunbridge Wells, Agra Europe special report (Agra 歐洲專(zhuān)題 艮告)，UK)。生物燃料的生產(chǎn)和使用已經(jīng)進(jìn)入全球增長(zhǎng)的新時(shí)代。現(xiàn)在使用的兩種主要的生物燃料是乙醇和生物柴油。乙醇易于摻加汽油，生物柴油摻加基于石油的柴油用于常規(guī)以柴油供燃料的機(jī)器。目前，乙醇占生物燃料總產(chǎn)量超過(guò)90%，生物柴油占剩余部分。乙醇具有如油市場(chǎng)一樣大的潛在的市場(chǎng)。其可以潛在地代替整個(gè)汽油燃料市場(chǎng)。在轉(zhuǎn)酯過(guò)程中，甲醇或乙醇還用于制備生物柴油。幾乎所有的燃料乙醇通過(guò)玉米糖和甘蔗廢物的發(fā)酵產(chǎn)生。世界上糖物質(zhì)和谷物的量是有限的，并且對(duì)于乙醇生產(chǎn)，它們是相對(duì)昂貴的原料。使用這些物質(zhì)的生物乙醇生產(chǎn)導(dǎo)致與人類(lèi)食品的競(jìng)爭(zhēng)，其可能在將來(lái)導(dǎo)致谷物和糖的價(jià)格上漲至較高的水平。基于乙醇的生物燃料通常來(lái)源于對(duì)玉米和大豆中存在的碳水化合物進(jìn)行發(fā)酵，這對(duì)于生產(chǎn)是廉價(jià)的。 然而，培育這些作物需要大面積的田地，這可能替代食物所需要的面積。由于農(nóng)業(yè)用地的有限可用性，所以重要的是，我們不能忽視海洋環(huán)境作為用于乙醇生產(chǎn)的生物質(zhì)來(lái)源的潛力。已知大型藻類(lèi)可以容易地培育，多產(chǎn)性生長(zhǎng)，并且匯集碳。另外，海藻的水產(chǎn)養(yǎng)殖減少對(duì)海洋的富營(yíng)養(yǎng)化(eutrophication)的貢獻(xiàn)，因此可以用來(lái)減輕污水排出物和工業(yè)來(lái)源的氮廢物(如來(lái)源于魚(yú)類(lèi)水產(chǎn)養(yǎng)殖的那些)的影響，這有助于生物多樣性的維持或提高。大型藻類(lèi)，更常見(jiàn)地稱(chēng)為“海藻”，是多樣組快速生長(zhǎng)的海洋植物，并且在潮間帶以及淺潮線下水域中以附著到巖石上的形式存在。這些植物是自養(yǎng)型的，利用來(lái)自太陽(yáng)的能量結(jié)合水與二氧化碳(CO2)來(lái)產(chǎn)生碳水化合物和最終的生物質(zhì)。在世界范圍內(nèi)，收獲這種生物質(zhì)作為食品來(lái)源以及用于藻膠生產(chǎn)的輸出材料。由于對(duì)海藻和基于海藻的產(chǎn)品的需求超過(guò)野生原料的供應(yīng)，在一些亞洲國(guó)家中，如中國(guó)、日本、菲律賓和韓國(guó)，商業(yè)性培育海藻。此外，需求的增長(zhǎng)開(kāi)始刺激對(duì)培育方法以及用于海藻資源的可持續(xù)性生產(chǎn)和利用的提取方法的研究和開(kāi)發(fā)。這些海藻可以在面積無(wú)限的海洋中以商業(yè)規(guī)模生長(zhǎng)，并且可以產(chǎn)生巨大的生物質(zhì)，而無(wú)需精確的農(nóng)業(yè)實(shí)踐。
這些海藻可以用于生物燃料生產(chǎn)，特別是用于生物乙醇生產(chǎn)，原因在于，由于下述原因，與生物柴油生產(chǎn)相比，它們更適于生物乙醇生產(chǎn)1. 一些海藻的碳水化合物含量非常高。2.與碳水化合物含量相比，海藻中的脂質(zhì)(油)含量較少，這使得它們較不適于生物柴油生產(chǎn)。3.對(duì)于乙醇生產(chǎn)，可以使用干/半干的或新鮮的海藻。它們不需要任何預(yù)先處理， 如干燥。4.生物柴油生產(chǎn)需要提取油，對(duì)此，材料需要干燥，這是要增加能量的。5.通過(guò)乙醇發(fā)酵產(chǎn)生的(X)2可以用作藻類(lèi)養(yǎng)殖原料。紅藻是具有高生長(zhǎng)速率的全球重要海藻。它們是多樣性起源的代表；更復(fù)雜的菌體由細(xì)絲組成?，F(xiàn)在，卡帕藻屬(Kappaphycus)和瓊枝藻屬(Betaphycus)紅藻是食品工業(yè)中使用的角叉菜聚糖的最重要的來(lái)源。江蘺屬(Gracilaria)、石花菜屬(Gelidium)、雞毛菜屬(Pterocladia)和其他紅藻用于制備廣泛用作微生物生長(zhǎng)培養(yǎng)基中的膠凝劑和用于生物技術(shù)應(yīng)用的瓊脂。這些藻細(xì)胞壁由長(zhǎng)鏈多糖(如具有廣泛商業(yè)用途的纖維素和瓊脂/ 角叉菜聚糖)組成。角叉菜聚糖是由卡帕藻屬和瓊枝藻屬的紅色海藻提取的直鏈硫酸化多糖家族。角叉菜聚糖由半乳糖和3，6_無(wú)水半乳糖單位的鈉、鉀、鎂和鈣硫酸酯組成?？色@得三種基本類(lèi)型的角叉菜聚糖，它們?cè)诹蛩峄サ臄?shù)目和位置方面不同。這些多糖是大的、高度柔性的分子，在存在單價(jià)和二價(jià)陽(yáng)離子的條件下，其圍繞彼此卷曲形成雙螺旋結(jié)構(gòu)。這給與它們?cè)谑覝叵滦纬啥喾N熱可逆性凝膠的能力。在不同的產(chǎn)膠藻(carrageenophyte)中，基于干重， 角叉菜聚糖含量在25-35%變化。角叉菜聚糖在食品和制藥工業(yè)中廣泛用作增稠劑、穩(wěn)定劑和膠凝劑。直至目前，印度的海藻工業(yè)單一性地依賴于收集天然原料。主要地，這集中在馬尾藻屬(Sargassum)(用于藻酸鹽和液態(tài)海藻肥料)、可食江蘺(Gracilaria edulis)(用于低級(jí)瓊脂)和凝花菜(Gelidiella acerosa)(用于中高等瓊脂)。所有這些在過(guò)去的五年里經(jīng)歷了急劇的變化。一方面，長(zhǎng)心卡帕藻適應(yīng)印度水域，并且由于十年之久的研究結(jié)果證明其培育是可行的(申請(qǐng)日為2005年2月22日的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US6858430)。該技術(shù)隨后由 CSMCRI許可，其本身又刺激了在泰米爾納德邦(Tamil Nadu)的培育行為，幫助小組和NGOs 從最終使用者那里買(mǎi)回保證(guarantee)。在過(guò)去的二十年里，在全世界，包括印度，成功地進(jìn)行了大規(guī)模的產(chǎn)膠藻培育，因此不缺乏產(chǎn)生角叉菜聚糖的海藻。鑒于海藻在鮮重基礎(chǔ)上包含大于90%的水分的事實(shí)，CSMCRI發(fā)明了一種不添加任何的水分液化新鮮海藻的獨(dú)特方法(美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，893，479)。通過(guò)這種簡(jiǎn)單的方法，可以以集成方式回收兩種產(chǎn)物， 一種是濃縮的富含角叉菜聚糖的殘?jiān)?，另一種是富含主要和微量植物養(yǎng)分的植物汁液(液態(tài)海藻肥料-LSF)。為了滿足農(nóng)業(yè)需要，需要大量的長(zhǎng)心卡帕藻生物質(zhì)，這可以通過(guò)在海濱和近海濱的培育獲得?；厥罩汉?，將產(chǎn)生大量富含角叉菜聚糖的殘余生物質(zhì)。當(dāng)滿足對(duì)于k-角叉菜聚糖的原料需求后，殘余的生物質(zhì)可以用于生物乙醇生產(chǎn)。因此，從海藻中回收多種產(chǎn)物使得培育在經(jīng)濟(jì)上更可行。良好的培育實(shí)踐可以證明卡帕藻屬是用于乙醇生產(chǎn)的較廉價(jià)的原料。從基于海藻的工業(yè)的大量擴(kuò)張同時(shí)聚焦可持續(xù)性的觀點(diǎn)看來(lái)，這些開(kāi)發(fā)是非常重要的。
通常針對(duì)使用食品作物的大規(guī)模燃料生產(chǎn)的主要批判在于這可能使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)背離食品作物，特別是在發(fā)展中國(guó)家中。事實(shí)在于能量作物計(jì)劃與食品作物競(jìng)爭(zhēng)對(duì)農(nóng)業(yè)用地、 水、肥料、專(zhuān)業(yè)勞動(dòng)力等的使用，這導(dǎo)致食品價(jià)格上漲。此外，培育用于生物燃料生產(chǎn)的作物對(duì)生物多樣性有影響。因此，急需鑒定一種克服所有這些局限的用于生物乙醇生產(chǎn)的替代資源。海洋藻類(lèi)/海藻是理想的選擇，原因在于它們生長(zhǎng)在海洋中，在海洋中有巨大的培育面積可用，并且由于高生長(zhǎng)速率，無(wú)需專(zhuān)門(mén)的農(nóng)業(yè)實(shí)踐即可產(chǎn)生巨大的生物質(zhì)，因此減輕對(duì)農(nóng)業(yè)用地的壓力。除了這些之外，它們富含碳水化合物，并且因此是生物乙醇生產(chǎn)的理想資源。
現(xiàn)有技術(shù)可以參考屬于 Eswaran 等的名稱(chēng)為"Integrated method for production of carrageenan and liquid fertilizer from fresh seaweeds (從新§羊海藻生產(chǎn)角叉菜聚糖和液態(tài)肥料的集成方法)”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)6，89，3479(2007)，他們已經(jīng)公開(kāi)了一種由長(zhǎng)心卡帕藻的新鮮生物質(zhì)獲得多種產(chǎn)物并且由此提高海藻的價(jià)值的集成方法。這些產(chǎn)物為 i).汁液，其為一種潛在的液態(tài)生物肥料，和ii).粒狀富含角叉菜聚糖的殘余材料。這種殘余材料是用于提取k-角叉菜聚糖的原料。該專(zhuān)利的缺點(diǎn)在于利用殘余材料僅用于一種產(chǎn)物，即k-角叉菜聚糖的制備。沒(méi)有提及利用富含角叉菜聚糖的粒狀殘余材料來(lái)生產(chǎn)乙醇?？梢詤⒖糓aleszka等在Enzyme and Microbial Tech.(酶和微生物技術(shù)) (1982)4(5) :349-352 中題目為"Ethanol production from D-galactose and glycerol by Pachysolen tannophilus (通過(guò)嗜單寧管囊酵母(Pachysolen tannophilus)由 D-半乳糖和甘油制備乙醇)，，的論文，他們描述了由先前認(rèn)為不發(fā)酵的糖類(lèi)如D-半乳糖和甘油生產(chǎn)乙醇。他們研究由單糖如D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖或D-木糖或甘油生產(chǎn)乙醇。他們報(bào)道嗜單寧管囊酵母將上文提及的所有主要植物單糖轉(zhuǎn)化成乙醇。他們還闡述該酵母菌具有將來(lái)源于藻類(lèi)的甘油發(fā)酵成乙醇的能力。該論文的缺點(diǎn)在于使用植物單糖作為乙醇生產(chǎn)的底物。沒(méi)有提及關(guān)于海洋藻類(lèi)或海洋藻類(lèi)多糖用于乙醇生產(chǎn)的應(yīng)用?？梢詤⒖紝儆?M Benjamin 名稱(chēng)為"Methods and compositions for producing metabolic products for algae (用于生產(chǎn)藻類(lèi)代謝產(chǎn)物的方法和組合物)”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào) 5270175(1993)，其公開(kāi)了轉(zhuǎn)化并且利用轉(zhuǎn)化的海洋大型藻類(lèi)細(xì)胞生產(chǎn)乙醇。他們選擇滸苔屬(Enteromorpha sp.)，依據(jù)是其快速生長(zhǎng)和在兩個(gè)月內(nèi)在生長(zhǎng)池中形成稠密墊的能力。 他們由滸苔屬制備原生質(zhì)體，并且通過(guò)插入在高表達(dá)啟動(dòng)子基因控制下的醇脫氫酶基因和 /或丙酮酸脫羧酶而修飾藻細(xì)胞。他們將產(chǎn)生醇的轉(zhuǎn)化體在200ml海水培養(yǎng)基中培養(yǎng)，并且在淺池中每2-3天將該培養(yǎng)物用海水充滿5-7次。他們報(bào)道藻細(xì)胞代謝途徑中至少一種酶的過(guò)量表達(dá)導(dǎo)致產(chǎn)生代謝產(chǎn)物。該專(zhuān)利的缺點(diǎn)在于a)使用淀粉是主要多糖的遺傳修飾的海藻，b)遺傳轉(zhuǎn)化是復(fù)雜的過(guò)程，并且需要持續(xù)監(jiān)測(cè)，c)由于植物的轉(zhuǎn)基因性質(zhì)，在其應(yīng)用前必須清楚調(diào)控規(guī)范。沒(méi)有提及關(guān)于使用長(zhǎng)心卡帕藻進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。此外，乙醇不是作為副產(chǎn)物生產(chǎn)?？梢詤⒖紝儆?Ueda 等名稱(chēng)為"Process for the production of ethanol from microalgae(由微藻生產(chǎn)乙醇的方法)”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US5578472 (1996)，其公開(kāi)由微藻生產(chǎn)乙醇的方法。他們培養(yǎng)能夠在細(xì)胞中積聚淀粉的萊茵衣藻(Chlamydomonasfeinhardtii) UTEX2247,收集藻細(xì)胞，濃縮包含生長(zhǎng)的藻細(xì)胞的藻培養(yǎng)液，從而獲得藻細(xì)胞汁液，并且將在汁液中的濃縮的藻細(xì)胞保持在暗處和厭氧氣氛中以在6. 0-9. 0的pH范圍以內(nèi)形成乙醇。他們將殘余汁液進(jìn)行甲烷發(fā)酵，燃燒其產(chǎn)生二氧化碳，二氧化碳用在微藻培養(yǎng)步驟中。缺點(diǎn)為a)使用微藻，b)在藻細(xì)胞中積聚的淀粉是用于乙醇生產(chǎn)的底物，c)發(fā)酵過(guò)程在黑暗條件下進(jìn)行。沒(méi)有提及使用大型微藻多糖(藻膠)作為乙醇生產(chǎn)的底物?？梢詤⒖糎irano 等在 Energy (能量)(1997)22 :137-142 中題目為 “C02fixation and ethanol production with microalgal photosynthesis and intracellular anaerobic fermentation (利用微藻光合作用和細(xì)胞內(nèi)厭氧發(fā)酵進(jìn)行CO2固定和乙醇生產(chǎn))”的論文，他們已經(jīng)檢驗(yàn)了微藻的乙醇生產(chǎn)力。在從海水中分離多于200株微藻藻株并且篩選它們的生長(zhǎng)速率、淀粉含量和乙醇生產(chǎn)力后，鑒定普通小球藻(Chlorella vulgaris) (IAM C-534)關(guān)于其淀粉含量(即37% )是最有希望的一種。他們從小球藻屬 (Chlorella)細(xì)胞中提取淀粉，將淀粉糖化，用酵母菌發(fā)酵，并且獲得65%的乙醇轉(zhuǎn)化。他們還檢驗(yàn)了另一種類(lèi)型的乙醇生產(chǎn)方法，即，在黑暗和厭氧條件下的細(xì)胞內(nèi)淀粉發(fā)酵。他們報(bào)道所有檢測(cè)的藻株表現(xiàn)出細(xì)胞內(nèi)淀粉降解和乙醇產(chǎn)生。最后，他們推論出細(xì)胞內(nèi)乙醇生產(chǎn)比常規(guī)乙醇發(fā)酵生產(chǎn)更簡(jiǎn)單和能量密集。該論文的缺點(diǎn)為a)使用微藻，b)使用提取的微藻成分淀粉作為底物，c)利用在黑暗和厭氧條件下的細(xì)胞內(nèi)淀粉發(fā)酵。沒(méi)有提及使用海藻或由海藻獲得的富含角叉菜聚糖的物質(zhì)作為乙醇生產(chǎn)的底物。參考Ueno 等在 J. of Fermentation and Bioengineering(發(fā)酵和生物工程雜 ；^ ) (1998)86(1) 38-43 ΦΙΙ g ^ "Ethanol production by Dark Fermentation in the Marine Green alga, Chlorococcum littorale (通過(guò)在海洋綠藻綠球藻(Chlorococcum littorale)中的黑暗發(fā)酵生產(chǎn)乙醇)”的論文，他們已經(jīng)研究了在海洋綠藻綠球藻 (Chlorococcum littorale)中的黑暗發(fā)酵，重點(diǎn)在于乙醇生產(chǎn)。他們報(bào)道在25°C在黑暗厭氧條件下在M小時(shí)內(nèi)消耗27%的細(xì)胞淀粉，通過(guò)其產(chǎn)生作為發(fā)酵產(chǎn)物的乙醇、乙酸、氫氣和二氧化碳。他們已經(jīng)在30°C獲得450微摩爾/g-干重的最大乙醇生產(chǎn)力。該論文的缺點(diǎn)在于a)利用具有作為碳水化合物的淀粉的微藻，c)發(fā)酵過(guò)程在黑暗厭氧條件下進(jìn)行生產(chǎn)乙醇。他們不使用微藻，特別是紅色海藻。也沒(méi)有提及利用酵母菌或細(xì)菌進(jìn)行發(fā)酵。Hirayama等在他們?cè)?Mudies in Surface Science and Catalysis (表面科學(xué)和催化研究)(1998) 114 :657-660 中的題目為 “Ethanol production from carbon dioxide by fermentative microalgae (通過(guò)發(fā)酵的微藻由二氧化碳生產(chǎn)乙醇)”的論文中已經(jīng)描述了從固定二氧化碳的可發(fā)酵微藻生產(chǎn)乙醇。他們篩選了多于200株來(lái)自于海水的微藻藻株，篩選其通過(guò)自發(fā)酵的CO2固定和乙醇生產(chǎn)。還檢測(cè)分離株的生長(zhǎng)速率、淀粉含量、和由胞內(nèi)淀粉到乙醇的轉(zhuǎn)化率。基于其較高的生長(zhǎng)速率(30g-干生物質(zhì)/m2.d)、淀粉含量(基于干重的30%)和在黑暗和厭氧條件下由淀粉到乙醇的較高的轉(zhuǎn)化率(50%)，他們選擇極好的藻株中的一種，衣藻屬物種(Chlamydomonas sp.) YA-SH-I。他們培育衣藻屬物種，收集并且允許自發(fā)酵。最后，他們從發(fā)酵液中提取乙醇。該論文的缺點(diǎn)在于a)使用具有較高淀粉含量的微藻，b)使用在黑暗條件下的自發(fā)酵方法。沒(méi)有提及利用除淀粉外還具有多糖的微藻，特別是紅色海藻，進(jìn)行乙醇生產(chǎn)并且沒(méi)有作為副產(chǎn)物產(chǎn)生乙醇?？梢詤⒖糞vein Jarle Horn于2000年投向挪威iTrondheim的挪威科技大學(xué)(Norwegian University of Science and Technology, NTNU)生物技術(shù)系的題目為"Bioenergy from brown seaweeds (來(lái)自褐色海藻的生物能量)”的Wi. D論文，其進(jìn)行關(guān)于使用北方海帶(Laminaria hyperborea)和泡葉藻(Ascophyllum nodosum)生產(chǎn)能量的研究。在該工作中，從北方海帶葉提取的海帶多糖和甘露醇用作乙醇生產(chǎn)的底物。他使用棕櫚發(fā)酵細(xì)菌(ZymcAacter palmae)從甘露醇生產(chǎn)乙醇，其不能利用海帶多糖。然而，酵母 Pichia angophorae能夠同時(shí)從這兩種底物生產(chǎn)乙醇。最后，他從褐色海藻生產(chǎn)了甲烷和乙醇。據(jù)此，如果收集成本低，從海藻生產(chǎn)能量將是經(jīng)濟(jì)的?？梢宰⒁獾剑瑏?lái)自藻酸鹽工業(yè)的廢物可以被認(rèn)為是用于能量生產(chǎn)的無(wú)成本原料。該工作的缺點(diǎn)在于使用褐色海藻。沒(méi)有提及使用紅藻作為乙醇來(lái)源，沒(méi)有作為副產(chǎn)物產(chǎn)生乙醇。可以參考Horn等在 J. of Industrial Microbiology and Biotechnology (工業(yè)微生物學(xué)和生物技術(shù)雜志)(2000)25 :249-2 中題目為“Ethanol production from seaweed extract (由海藻提取物的乙醇生產(chǎn))”的論文，他們已經(jīng)報(bào)道由褐色海藻提取物生產(chǎn)乙醇。 他們?cè)赑H 2. 060°C 1小時(shí)由培育的北方海帶的新鮮葉制備水性提取物。該提取物包含甘露醇和海帶多糖，產(chǎn)率為基于鮮重2%。使用四種微生物，一種細(xì)菌和三種酵母菌在批次和連續(xù)培養(yǎng)物中發(fā)酵。他們?cè)谂闻囵B(yǎng)物中獲得0.43g/g底物的乙醇產(chǎn)率。該論文的缺點(diǎn)在于a)損失(sacrificing)整個(gè)褐藻北方海帶的植株，和b)使用由甘露醇和海帶多糖組成的海藻提取物作為糖底物。他們沒(méi)有使用紅藻進(jìn)行乙醇生產(chǎn)。此外，沒(méi)有提及作為副產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇。Matsumoto Appl. Biochemistry and Biotechnology (j^MLftl 學(xué)和生物技術(shù))(2003) 105 :247-254 中題目為"Saccharification of marine microalgal biomass for bioethanol production using marine bacteria (使用海洋細(xì)菌HU海洋■ 藻生物質(zhì)進(jìn)行生物乙醇生產(chǎn))”的論文，他們報(bào)道使用海洋細(xì)菌糖化海洋微藻多糖的方法。 在分離的191株海洋細(xì)菌中，鑒定水蛹假交替單胞菌(I^eudoalterimonas undina)是在鹽水條件下糖化最有潛力的細(xì)菌培養(yǎng)物。使用綠色微藻NKG 12070，其具有最高的細(xì)胞內(nèi)碳水化合物(如淀粉)濃度。在將水蛹假交替單胞菌接種到藻細(xì)胞懸浮液中后，由于淀粉酶產(chǎn)生，觀察到還原糖濃度的增加。缺點(diǎn)在于a)使用淀粉是主要碳水化合物的微藻作為原料， b)他們利用酶過(guò)程進(jìn)行糖化。沒(méi)有提及使用海藻進(jìn)行乙醇生產(chǎn)?？梢詤⒖紝儆赪oods 等名稱(chēng)為 “Genetically modified cyanobacteria for the production of ethanol, the constructs and method thereof (用于生產(chǎn)乙酉享的遺傳修飾的藍(lán)藻，構(gòu)建體及其方法)”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US6699696(2004)，他們已經(jīng)公開(kāi)由遺傳修飾的藍(lán)藻(cyanobacteria)、特別是聚球藻屬(Synechococcus)生產(chǎn)乙醇的方法。他們將獲自運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonas mobilis)的編碼丙酮酸脫羧酶和醇脫氫酶的DNA片段構(gòu)建在 PL0I295質(zhì)粒中。這兩種酶是由糖酵解途徑產(chǎn)物丙酮酸產(chǎn)生乙醇所必需的。將收集的藍(lán)藻細(xì)胞通過(guò)結(jié)合所述構(gòu)建體進(jìn)行修飾，并且接種在含有氨芐青霉素的平板中，以選擇轉(zhuǎn)化的氨芐青霉素抗性藍(lán)藻細(xì)胞。這些修飾的聚球藻屬細(xì)胞能夠以至少1.7 μ mol乙醇/mg葉綠素/小時(shí)的可回收的量產(chǎn)生乙醇。該專(zhuān)利的缺點(diǎn)在于a)使用微藻，特別是需要精確的專(zhuān)業(yè)知識(shí)和連續(xù)監(jiān)測(cè)的遺傳修飾的聚球藻屬。沒(méi)有提及使用海藻進(jìn)行醇生產(chǎn)?？梢詤⒖紝儆?Bush 等名稱(chēng)為"Process for the production of ethanol from algae (從藻類(lèi)生產(chǎn)乙醇的方法)”的美國(guó)專(zhuān)利號(hào)US7135308 (2006)，他們已經(jīng)公開(kāi)了一種生產(chǎn)乙醇的方法，該方法通過(guò)從天然水域地點(diǎn)收集積聚淀粉的、形成細(xì)絲的或形成群落的藻類(lèi)來(lái)形成生物質(zhì)，起始細(xì)胞腐爛，發(fā)酵并且從發(fā)酵液分離乙醇。他們將藻類(lèi)生物質(zhì)保持在黑暗和厭氧條件下，以起始生物質(zhì)的腐爛，然后接種酵母菌，如釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)來(lái)形成發(fā)酵溶液，從該發(fā)酵溶液分離所產(chǎn)生的乙醇。該專(zhuān)利的缺點(diǎn)在于a)由于他們使用天然微藻繁殖物，因此使用的是混合的藻類(lèi)培養(yǎng)物，b)使用微藻成分淀粉作為底物。由于實(shí)驗(yàn)使用微藻繁殖物進(jìn)行，因而他們沒(méi)有使用純的微藻培養(yǎng)物。沒(méi)有提及下述a)在發(fā)酵前，淀粉水解成簡(jiǎn)單的糖，和b)使用微藻進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，并且乙醇不是作為另外的產(chǎn)物生產(chǎn)。可以參考Jessica 等(2008)發(fā)表在 Journal of Applied Phycology (應(yīng)用藻類(lèi)學(xué)雜志)(D0I 10. 1007/sl0811-008-9384-7)中的題目為"Fermentation study on Saccharina latissima for bioethanol production considering variable pretreatments (考慮到可變的預(yù)先處理，關(guān)于Saccharina latissima對(duì)于生物乙醇生產(chǎn)的發(fā)酵研究)”的論文，他們描述了藻類(lèi)的酶預(yù)處理對(duì)利用褐藻糖海帶(糖海帶(Laminaria saccharina))的生物乙醇生產(chǎn)的影響。昆布多糖和甘露醇是除海藻酸外從褐藻門(mén) (pheophyta)獲得的主要糖水化合物。所有三種碳水化合物的量隨季節(jié)和植物的生命周期變化。昆布多糖由具有少量β_1，6-連接的β-1，3-連接的葡萄糖殘基組成。該多糖在不同PH和溫度條件下容易用昆布多糖酶水解。然而，在23°CpH 6用酶處理樣品獲得最大乙醇產(chǎn)量(0.49%)。該論文的缺點(diǎn)在于a)損失整個(gè)海藻，b)由于pH調(diào)節(jié)在預(yù)處理過(guò)程中在水解產(chǎn)物中產(chǎn)生高鹽含量，這妨礙乙醇生產(chǎn)，c)乙醇不是作為另外的產(chǎn)物產(chǎn)生?？梢詤⒖?007年3 月東京海洋科技大學(xué) CTokyo University of Marine Sciences and Technology)三菱石if究所(Mitsubishi Research Institute)在 www, pinktentacle. com/2007/03/seaweed-as-biofuel的研究，該研究公布了由培育的海藻大規(guī)模生產(chǎn)生物乙醇的挑戰(zhàn)性提案的詳細(xì)內(nèi)容。據(jù)此，海藻長(zhǎng)期被討論作為典型地由作物如甘蔗和玉米制備的生物乙醇的一種潛在的來(lái)源，但是想法從未成為現(xiàn)實(shí)。據(jù)此，馬尾藻屬海藻由于其較高的生長(zhǎng)速率以大規(guī)模培育，然后將藻多糖如巖藻多糖和海藻酸酶糖化，隨后發(fā)酵產(chǎn)生乙醇。據(jù)此，除了產(chǎn)生乙醇之外，海藻還將通過(guò)減少海洋中存在的過(guò)量的營(yíng)養(yǎng)物而有助于清理日本海。該提案的缺點(diǎn)在于1.使用褐藻進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，2.損失整個(gè)海藻進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，3.用褐藻馬尾藻屬替代食品藻類(lèi)(如紫菜(nori)和裙帶菜(wakame))的培育，4.應(yīng)用相對(duì)較慢的酶糖化方法。他們沒(méi)有提及使用紅藻，沒(méi)有提及作為副產(chǎn)物生產(chǎn)乙醇。可以參考專(zhuān)業(yè)機(jī)械雜志(Theprofessional Journal engineer)在其于 2008 年 1 月 7 日發(fā)表在(http //www, ambathen. um. dk/da/menu/0m0s/Kl imaforandringer/DENMARK LOOKSTOTURNACOMMONSEAffEEDINTOBIOFUELhtm ？ ffBCMODE = Pre % 2CPresentationU 中的題目為"Denmark looks to turn a common seaweed into biofuel (丹麥希望將普通海藻轉(zhuǎn)化成生物燃料)”的論文，其提及資助評(píng)估由海萵苣(sea lettuce)(海藻)生產(chǎn)生物乙醇的潛力的項(xiàng)目。他提及，綠藻石莼(Ulva lactuca)具有生產(chǎn)生物乙醇的潛力。他指出奧爾古月斯大學(xué)(University of Aarhus)國(guó)家環(huán)境石if究所(National Environmental Research Institute)Michael Bo Rasmussen的觀察，其中他提及海萵苣作為由非食品生物質(zhì)資源而不是谷物作物(如玉米和玉蜀黍(maize))制備生物乙醇的豐富潛在資源?？梢詤⒖糎iroshi Yamazaki 在 2008 年 6 月 1 日在 http //bioenerRY. checkbiotech. org/news/2007-06-27/Japan experiments with new biofuels/ 的題目為"Japan experiments with new biofuels (日本使用新生物燃料的實(shí)驗(yàn))”的論文，其報(bào)道日本公司已經(jīng)開(kāi)始將生物乙醇燃料引入市場(chǎng)，以希望顯著減少(X)2的釋放。他還補(bǔ)充，國(guó)內(nèi)生物燃料生產(chǎn)，特別是由可食用的材料的生物燃料生產(chǎn)，似乎是遙遠(yuǎn)的目標(biāo)。然而，使用新材料(包括海藻和木屑)的有希望的實(shí)驗(yàn)正引起注意。近來(lái)，在 http://www. eurozone-invest. com/biofuel. html 上的文章描述使用海藻或藻類(lèi)來(lái)生產(chǎn)生物乙醇和生物柴油。據(jù)此，培育用于生物柴油生產(chǎn)的藻類(lèi)更難，原因在于它們需要特定的環(huán)境獲得高生產(chǎn)力，并且可能容易受不需要的物種的污染。另一方面，海藻和藻類(lèi)富含復(fù)合糖類(lèi)，如淀粉，其量高于存在的油。通過(guò)轉(zhuǎn)化和發(fā)酵，這種多糖轉(zhuǎn)化成乙醇?？梢詤⒖?Aizawa 等在 Oceans 2007 中題目為 ‘Seaweed Bioethanol Production in Japan-The Ocean Sunrise ftx) ject (日本的海藻生物乙醇生產(chǎn)-海洋朝陽(yáng)工程)”的論文，其闡述該工程目的在于通過(guò)利用日本專(zhuān)屬經(jīng)濟(jì)區(qū)(EEZ)和領(lǐng)海帶的447萬(wàn)km2 (世界第六大)的未使用面積來(lái)養(yǎng)殖和收集銅藻(Sargassum horneri)而生產(chǎn)海藻生物乙醇。他們還補(bǔ)充，通過(guò)海藻生物乙醇生產(chǎn)，該工程目的在于通過(guò)貢獻(xiàn)化石燃料的替代能源而防止全球變暖。該論文概述了由iTokyo Fisheries Promotion進(jìn)行的項(xiàng)目可行性研究的結(jié)果。該論文的缺點(diǎn)在于a)使用銅藻生產(chǎn)乙醇。他們沒(méi)有進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，沒(méi)有提及從紅藻細(xì)胞內(nèi)化合物提取半乳糖。2008 年 6 月 2 日在 http//www. prensa~latinaenRlish. com/article, asp ？ ID = % 7B6392ED95-9842-486E- YB4E5-676A4FA23D61 % 7D)&language = EN 上題目為 "seaweed biofuel developed(開(kāi)發(fā)的海藻生物燃料)”的最近的報(bào)道描述由海藻制備的生物燃料可能是由食品作物獲得的與食品價(jià)格上漲相關(guān)的乙醇的替代品。在該文章中， Bernard Stroazzo (Bio Fuel-System (生物燃料系統(tǒng))的總裁)闡述由海藻生產(chǎn)生物燃料是有希望的，產(chǎn)物既不影響環(huán)境也不會(huì)使人群食物供給處于危險(xiǎn)中。據(jù)此，與其他生物燃料相比，海藻具有非常有效的光合作用系統(tǒng)，回收100%的太陽(yáng)能。然而，最大問(wèn)題在于研究者鑒定適宜的海藻物種，從其可能產(chǎn)生大量的生物燃料。Ricardo Radulovich 在其 2008 年 6 月 10 日在 COSMOS 雜志(http //www, cosmosmagazine. com/node/2040)中題目為"Let ’ s use seaweed as fuel (讓我們使用海藻作為燃料)”的文章中提到海藻通常用作食品、肥料和動(dòng)物飼料，但是也可以用作主要燃料。他還指出使用海藻進(jìn)行生物燃料生產(chǎn)的優(yōu)點(diǎn)，如不需要土壤和水。私有公司Algenol致力于廣泛的研究和開(kāi)發(fā)，嘗試開(kāi)發(fā)工業(yè)規(guī)模的生產(chǎn)系統(tǒng)，以使用海水和大量的C02由荒蕪的田地上的藻類(lèi)制備乙醇。Algenol通過(guò)自然選擇、環(huán)境選擇和產(chǎn)生低成本和環(huán)境安全性生物燃料的分子生物學(xué)工具而使用藍(lán)藻(藍(lán)綠藻)。如同所有植物，藻類(lèi)利用光合作用將太陽(yáng)能轉(zhuǎn)化為以油、碳水化合物和蛋白形式儲(chǔ)備的化學(xué)能。 Algenol的專(zhuān)利技術(shù)從四種豐富的且實(shí)際上無(wú)限的可再生資源生產(chǎn)乙醇藻類(lèi)、陽(yáng)光、二氧化碳和海水。該過(guò)程的輸出是乙醇、氧氣、淡水和農(nóng)業(yè)肥料。Algenol的方法具有巨大的積極的能量平衡，并且不需要種植、收集、原料運(yùn)輸、基于化石燃料的肥料并且在生長(zhǎng)或乙醇生產(chǎn)過(guò)程中不釋放 C02 (http //ww. alRenolbiofuels. com/default, html)。該公司相信， 其基于海水的方法可以產(chǎn)生6，000加侖/英畝/年，與此相反，玉米和甘蔗分別產(chǎn)生約360 和890加侖/英畝。在該過(guò)程中，藻類(lèi)通過(guò)光合作用消耗陽(yáng)光和多于90%的系統(tǒng)CO2，其中糖類(lèi)被轉(zhuǎn)化成乙醇。乙醇被立即泵出并且蒸發(fā)到生物反應(yīng)器中，其每個(gè)夜晚被捕獲。該發(fā)明的缺點(diǎn)在于使用藍(lán)綠藻而不是海藻。也沒(méi)有提及作為副產(chǎn)品生產(chǎn)乙醇。KBS World Radio 于 2008 年6 月 17 日公布題目為 “Researchers produce bioethanol with seaweecK研究者用海藻生產(chǎn)生物乙醇)”的報(bào)道。據(jù)此，韓國(guó)海洋研究禾口開(kāi)發(fā)研究所(The Korean Ocean Research and Development Institute)聲稱(chēng)該研究所與Gangwon National University的研究者聯(lián)合使用在Jeju島海岸發(fā)現(xiàn)的一種類(lèi)型的海藻生產(chǎn)生物乙醇。該研究所計(jì)劃推動(dòng)并將研究進(jìn)行到底，以使該技術(shù)商業(yè)化。根據(jù) 2008 年 6 月 23 日在 http://dsc. discovery, com/news/2008/06/23/ ireland-seaweed-ethanol. html dated June 23 公布的報(bào)道，其弓丨用 Discovery News, "Seaweed power Ireland Taps new energy source (海藻能量愛(ài)爾蘭選擇新能源)，，， Galway愛(ài)爾蘭國(guó)立大學(xué)(National University of Ireland)愛(ài)爾蘭海藻中心(Irish Seaweed Center)主任乂?。。∶驥han (—位愛(ài)爾蘭科學(xué)家)描述愛(ài)爾蘭可能成為由海藻生產(chǎn)生物燃料的主要扮演者。據(jù)此，藻類(lèi)沒(méi)有陸地生物質(zhì)資源的負(fù)面形象，認(rèn)為其對(duì)較高的食品價(jià)格負(fù)責(zé)，影響水的使用并且破壞雨林。國(guó)際應(yīng)用藻類(lèi)學(xué)學(xué)會(huì)(International society for Applied Phycology)正檢驗(yàn)使用褐色海藻生產(chǎn)生物乙醇的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)方面。農(nóng)業(yè)綜合產(chǎn)業(yè)通訊記者Ray Ryan撰寫(xiě)了題目為“kaweed offers bright future for biofuel industry (海藻提供生物燃料工業(yè)的光明未來(lái))”的文章，于2008年6月M 曰發(fā)表在網(wǎng)站 http //www, examiner, ie/story/business/Rbo jqlcwo i/rss2/ 上。參考上述，他講述利用其豐富的、可持續(xù)的海藻資源，愛(ài)爾蘭準(zhǔn)備好成為下一代生物燃料生產(chǎn)中的重要扮演者。Seaweedireland. com 在 http //dezeewierwinkel. nl/bio-fuel. html 發(fā)表關(guān)于生物燃料、生物氣體、電和熱的文章，該文章講述海藻可以被小的微生物分解，從而產(chǎn)生不同類(lèi)型的醇。發(fā)明目的本發(fā)明的主要目標(biāo)是提供由長(zhǎng)心卡帕藻集成生產(chǎn)海藻液和乙醇的方法，所述方法克服上述缺點(diǎn)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供由紅色海藻生產(chǎn)作為副產(chǎn)物的生物乙醇的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是提供由紅色海藻、特別是由產(chǎn)膠藻類(lèi)生產(chǎn)生物乙醇的方法。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是由產(chǎn)膠藻類(lèi)、特別是長(zhǎng)心卡帕藻生產(chǎn)生物乙醇。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在壓榨和回收海藻液后從由新鮮長(zhǎng)心卡帕藻產(chǎn)生的富含角叉菜聚糖的顆粒生產(chǎn)生物乙醇。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是稀硫酸和升高的溫度用于海藻水解將海藻多糖轉(zhuǎn)化為單糖的應(yīng)用。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)向水解物中反復(fù)添加新鮮藻類(lèi)生物質(zhì)而將糖濃度增加至IOV0o 本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是使用固體氫氧化鈣來(lái)中和糖溶液中的硫酸。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)過(guò)濾或離心去除不溶性CaS04。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)電滲析(ED)去除糖溶液的可溶鹽。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在滅菌前用氮源如蛋白胨、酵母提取物或麻瘋樹(shù)屬團(tuán)塊(Jatropha cake)的蛋白水解物加富水解物。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是在滅菌的糖溶液中接種釀啤酒酵母，即，培養(yǎng)號(hào)為NCIM 3455 (ATCC 26602)的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是發(fā)酵糖溶液產(chǎn)生乙醇。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是通過(guò)蒸餾從發(fā)酵液中分離生物乙醇以及生物乙醇的濃縮。本發(fā)明的另一個(gè)目標(biāo)是使用乙醇蒸餾后的殘余物質(zhì)，連同中和過(guò)程中產(chǎn)生的 CaSO4和ED過(guò)程中包含K2SO4作為主要可溶鹽的淘汰物作為肥料。發(fā)明_既述因此，本發(fā)明提供用于由長(zhǎng)心卡帕藻生產(chǎn)乙醇和海藻液的集成方法，所述方法包括下述步驟(a)從海洋中收集培育的紅色海藻；(b)從新鮮卡帕藻屬提取汁液，以釋放出液態(tài)植物養(yǎng)分，留下富含角叉菜聚糖的殘余顆粒物質(zhì)；(c)洗滌所述殘余顆粒，以去除鹽和泥沙；(d)使用0.5-5 %范圍以內(nèi)的稀硫酸水解富含多糖的顆粒，并且在80-200°C范圍以內(nèi)將溶液加熱30-90分鐘，以獲得富含還原糖的水解物；(e)通過(guò)過(guò)濾或在5000-7000rpm范圍以內(nèi)離心15分鐘回收溶液；(f)通過(guò)向所述過(guò)濾的溶液中添加新鮮長(zhǎng)心卡帕藻顆粒而增加水解物中的糖濃度，并且重復(fù)步驟(d)和(e)，直到糖濃度在2-10%范圍以內(nèi)；(g)用堿如氫氧化鈣、氫氧化鈉、碳酸鈣和氫氧化鉀調(diào)節(jié)水解物的pH在4. 5-8. 0范圍以內(nèi)；(h)通過(guò)過(guò)濾或在5000-7000rpm范圍以內(nèi)離心15分鐘而分離不溶性鹽；(i)通過(guò)電滲析將水解物脫鹽，以去除可溶鹽；(j)用0.2-2.0%范圍以內(nèi)的氮源如蛋白胨、酵母提取物和麻瘋樹(shù)屬團(tuán)塊的蛋白水解物加富(enriching)所述水解物，然后將其在121°C滅菌15分鐘；(k)在所加富的水解物中接種培養(yǎng)物號(hào)為NCIM 3455 (ATCC沈602)的釀酒酵母， 并且在25-35°C溫育M-96小時(shí)范圍以內(nèi)的時(shí)間；(1)監(jiān)測(cè)乙醇生產(chǎn)；(m)通過(guò)蒸餾從發(fā)酵液中分離乙醇；(η)通過(guò)蒸餾濃縮乙醇。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，使用屬于紅藻門(mén)(Iihodophyta)種類(lèi)和卡帕藻屬的產(chǎn)角叉菜聚糖的大型藻類(lèi)進(jìn)行乙醇生產(chǎn)，其中除海藻液之外，乙醇作為來(lái)自富含角叉菜的顆粒的另外的產(chǎn)物產(chǎn)生。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，糖化步驟包括在升高的溫度下富含角叉菜聚糖的顆粒的酸水解，其中在80-200°C范圍以內(nèi)的溫度下通過(guò)0.5% -5.0%范圍以內(nèi)的稀硫酸處理30-90min范圍以內(nèi)的時(shí)間，多糖被部分水解成單糖，如半乳糖。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)在相同溶液中反復(fù)水解新鮮顆粒，最終水解物的還原糖濃度由2. 0%增加至10%。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，糖溶液保持在2 % -10 %范圍以內(nèi)。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，回收的糖溶液具有0. 6-1. 0范圍以內(nèi)的pH。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在中和步驟過(guò)程中產(chǎn)生的不溶性CaSO4通過(guò)在真空下過(guò)濾或以7000rpm離心15分鐘去除，而可溶鹽通過(guò)電滲析方法去除。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，水解物用濃度在0.2-2.0%范圍以內(nèi)的氮源如蛋白胨和酵母提取物或麻瘋樹(shù)屬團(tuán)塊的蛋白水解物加富。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，在高壓滅菌的水解物中接種標(biāo)準(zhǔn)釀啤酒酵母菌， 即培養(yǎng)物號(hào)為NCIM 3455 (ATCC 26602)的釀酒酵母的活性培養(yǎng)物。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將接種的海藻水解物在有氧和厭氧條件下在 25-35°C范圍以內(nèi)培養(yǎng)M-96小時(shí)范圍以內(nèi)的時(shí)間，以將糖發(fā)酵為乙醇。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)蒸餾從發(fā)酵液分離生物乙醇。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將蒸餾后殘余的發(fā)酵液連同在中和過(guò)程中產(chǎn)生的不溶性CaSO4和電滲析過(guò)程的淘汰物用作肥料。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，最終水解物包含作為單糖的半乳糖、部分水解的寡糖和未水解的角叉菜聚糖。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用氫氧化鈣將水解物的pH調(diào)節(jié)至4. 5-8. 0的范圍。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，沉淀的硫酸鈣通過(guò)過(guò)濾或離心去除。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使用電滲析法將水解物脫鹽，以去除可溶鹽。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將最終水解物用蛋白胨和酵母提取物或麻瘋樹(shù)屬團(tuán)塊的蛋白水解物加富，以提供使生物發(fā)酵的氮源。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，將培養(yǎng)物號(hào)為NCIM 3455(ATCC26602)的釀酒酵母接種在發(fā)酵液中，并且在30°C開(kāi)始在有氧條件下然后在厭氧條件下溫育M-96小時(shí)范圍以內(nèi)的時(shí)間。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，發(fā)酵過(guò)程中的乙醇生產(chǎn)通過(guò)GC-MS監(jiān)測(cè)。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，從發(fā)酵液濃縮并蒸餾乙醇。附圖簡(jiǎn)述

圖1電滲析過(guò)程的示意流程圖。發(fā)明詳述本發(fā)明的目的是生產(chǎn)生物乙醇，更具體地是提供一種通過(guò)發(fā)酵大型藻類(lèi)生物質(zhì)生產(chǎn)乙醇的方法。本發(fā)明涉及開(kāi)發(fā)通過(guò)利用紅藻藻膠作為原料使用紅藻生產(chǎn)生物乙醇的方法。在本發(fā)明中，首次從紅色海藻、特別是長(zhǎng)心卡帕藻中生產(chǎn)作為副產(chǎn)物的生物乙醇。紅色海藻是快速生長(zhǎng)的海洋植物，其包括可降解的多糖，主要是瓊脂或角叉菜聚糖。生物乙醇的方法通常包括糖化和發(fā)酵。糖化通常通過(guò)濃酸/稀酸水解和酶水解進(jìn)行，然后使用細(xì)菌或酵母菌發(fā)酵。糖化通過(guò)在80-200°C范圍以內(nèi)的溫度下使用 0. 5% -5. 0%范圍以內(nèi)的硫酸將藻類(lèi)生物質(zhì)進(jìn)行稀酸水解30-90分鐘范圍以內(nèi)的時(shí)間而進(jìn)行。由于角叉菜聚糖的高硫酸含量，這導(dǎo)致角叉菜聚糖轉(zhuǎn)化為半乳糖，同時(shí)產(chǎn)生可溶鹽。通過(guò)在類(lèi)似條件下在相同溶液中處理新鮮的生物質(zhì)而增加回收的水解物的還原糖濃度。重復(fù)該過(guò)程3-5次，從而獲得在2-10%范圍以內(nèi)的所需要的還原糖濃度，這使用Nelson法分光光度監(jiān)測(cè)。糖濃度的增加導(dǎo)致最終水解物中可溶鹽濃度的增加。使用氫氧化鈣將得到的濾出液的PH調(diào)節(jié)至4. 5-8.0的范圍以內(nèi)。在中和過(guò)程中產(chǎn)生的不溶性硫酸鈣沉淀通過(guò)過(guò)濾或在5000-7000rpm范圍以內(nèi)離心15分鐘去除，而可溶鹽通過(guò)電滲析方法去除。在該過(guò)程中，將電滲析堆 (electrodialysis stack)用本實(shí)驗(yàn)室制備的共聚物型的5膜對(duì)(cell pairs)的陽(yáng)離子和陰離子交換膜裝填。在膜堆(stack)中使用平行流。該膜堆的單一有效膜面積是80cm2。 海藻水解物通過(guò)ED膜堆的產(chǎn)物(稀釋物)區(qū)室循環(huán)。同時(shí)，水通過(guò)濃縮物區(qū)室循環(huán)。所有實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用適當(dāng)?shù)谋靡苑謩e為3. OL/h的產(chǎn)物和濃縮物流的循環(huán)流速進(jìn)行。硫酸鈉稀溶液通過(guò)在末端的兩個(gè)電極區(qū)室循環(huán)，以洗滌出電滲析產(chǎn)物。通過(guò)AC-DC整流器方式在兩個(gè)電極之間應(yīng)用電勢(shì)(7.5V)。稀釋物和濃縮物流二者的循環(huán)持續(xù)至所有溶解的鹽淘汰物達(dá)到初始量的約90-95%。以規(guī)律的區(qū)間流(intervals current)，記錄電壓和TDS。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，分析稀釋物和濃縮物流的檢測(cè)樣品的TDS、傳導(dǎo)率、pH、氯化物、硫酸鹽、硬度、鈉、鉀寸。電滲析過(guò)程后，將包含單糖、部分水解的寡糖或未水解的多糖的最終水解物用 0. 2-2.0%范圍以內(nèi)的氮源如蛋白胨、酵母提取物或麻瘋樹(shù)屬團(tuán)塊的蛋白水解物加富，高壓滅菌并且通過(guò)接種培養(yǎng)物號(hào)為NCIM 3455 (ATCC沈602)的釀酒酵母并將其在25_35°C培養(yǎng)對(duì)-96小時(shí)范圍以內(nèi)的時(shí)間，從而將其單糖轉(zhuǎn)化為乙醇。使用耦合GC-MS(QP 2010)的 GC-MS(Shimadzu GC :2010)通過(guò)頂部空間(A0C-5000)分析儀監(jiān)測(cè)乙醇生產(chǎn)，其中測(cè)量發(fā)酵溶液的還原糖，從而確定發(fā)酵效率。最后，通過(guò)蒸餾從發(fā)酵溶液分離所產(chǎn)生的乙醇，并且將殘留物質(zhì)用作肥料。通過(guò)蒸餾從發(fā)酵液中回收生物乙醇，盡管所回收的乙醇不是燃料級(jí)別的，但是可以通過(guò)如蒸餾、膜純化、化學(xué)干燥的方法、或各種方法的組合將其濃縮而轉(zhuǎn)化成燃料級(jí)別的。最后，本發(fā)明描述使用紅色海藻的半乳糖以副產(chǎn)物生產(chǎn)生物乙醇。本發(fā)明中采用的創(chuàng)造性步驟為i)開(kāi)發(fā)了一種從紅色海藻中生產(chǎn)海藻液和乙醇的集成方法， )作為副產(chǎn)物產(chǎn)生乙醇，iii)使用紅色海藻作為乙醇生產(chǎn)的原料，iv)使用紅色海藻富含角叉菜聚糖的原料的硫酸化多糖作為乙醇來(lái)源，ν)用硫酸水解富含角叉菜聚糖的原料，用以將多糖轉(zhuǎn)化為單糖，Vi)通過(guò)在相同的溶液中重復(fù)新鮮顆粒的水解而增加水解物的糖濃度，Vii)使用氫氧化鈣進(jìn)行中和，Viii)通過(guò)過(guò)濾或離心去除所產(chǎn)生的不溶性 CaSO4, ix)通過(guò)電滲析方法除去所述水解物的可溶鹽，ix)用氮源加富所述水解物，χ)用培養(yǎng)物號(hào)為NCIM 3455 (ATCC 26602)的釀酒酵母活性生長(zhǎng)的酵母菌培養(yǎng)物發(fā)酵液體，xi)通過(guò)蒸餾回收乙醇，和xii)使用包含硫酸鉀和硫酸鈉的電滲析的淘汰物連同在中和過(guò)程中產(chǎn)生的CaSO4和乙醇蒸餾后的殘留物質(zhì)作為肥料。
實(shí)施例下述實(shí)施例通過(guò)舉例說(shuō)明的方式提供，因此不應(yīng)該解釋為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1從新鮮的卡帕藻屬回收液體汁液后，洗滌殘留的顆粒并且干燥。將已知重量的干燥顆粒用稀硫酸在升高的溫度下指定時(shí)間而進(jìn)行糖化。分別通過(guò)苯酚-硫酸法和 Nelson' s法測(cè)量水解物中的全部的糖和還原糖。用于糖化的條件和在糖化過(guò)程中產(chǎn)生的糖詳見(jiàn)表1和2。表1
權(quán)利要求
1.用于由長(zhǎng)心卡帕藻(Kappaphycusalvarezii)集成生產(chǎn)乙醇和海藻液的方法，所述方法包括下述步驟(a)從海洋中收集培育的長(zhǎng)心卡帕藻；(b)從步驟(a)中得到的新鮮卡帕藻屬提取汁液，以釋放出液態(tài)植物養(yǎng)分，留下富含角叉菜聚糖的殘余顆粒物質(zhì)；(c)洗滌步驟(b)中得到的所述顆粒，以去除鹽和泥沙；(d)使用0.5-5%范圍以內(nèi)的稀硫酸水解步驟(c)中得到的富含角叉菜聚糖的顆粒，然后在80-200°C范圍以內(nèi)將溶液加熱30-90分鐘，以獲得富含還原糖的水解物；(e)通過(guò)過(guò)濾或在5000-7000rpm范圍以內(nèi)離心15分鐘回收步驟(d)中得到的溶液，從而得到水解物；(f)通過(guò)向所述過(guò)濾的溶液中添加新鮮長(zhǎng)心卡帕藻顆粒而增加步驟(e)中得到的水解物中的糖濃度，然后重復(fù)步驟(d)和(e)，直到糖濃度達(dá)到2-10%范圍以內(nèi)；(g)用堿如氫氧化鈣調(diào)節(jié)所述水解物的PH在4.5-8. 0范圍以內(nèi)，從而產(chǎn)生不溶性鹽 CaSO4 ；(h)通過(guò)過(guò)濾或在5000-7000rpm范圍以內(nèi)離心而分離步驟(g)中獲得的不溶性鹽，從而得到水解物；(i)通過(guò)電滲析將步驟(h)中得到的水解物脫鹽，以去除可溶鹽；(j)用0.2-2.0%范圍以內(nèi)的氮源加富步驟(i)中得到的所述水解物，然后在121°C滅菌15分鐘；(k)在步驟(j)中得到的水解物中接種酵母屬(Saccharomyces)的酵母菌培養(yǎng)物，并且將其在25-35°C范圍以內(nèi)溫育M-96小時(shí)范圍以內(nèi)的時(shí)間，從而獲得乙醇；(1)通過(guò)蒸餾從發(fā)酵液中分離步驟(k)中得到的乙醇；(m)通過(guò)蒸餾濃縮步驟(1)中得到的乙醇，從而獲得所需要的產(chǎn)物。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中使用屬于紅藻門(mén)(Iihodophyta)的綱和卡帕藻屬 (Kappaphycus)的產(chǎn)角叉菜聚糖的大型藻類(lèi)進(jìn)行乙醇生產(chǎn)和海藻液生產(chǎn)，乙醇作為來(lái)自富含角叉菜聚糖的顆粒的另外的產(chǎn)物產(chǎn)生。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中糖化步驟包括富含角叉菜聚糖的顆粒在升高的溫度下的酸水解，其中在80-200°C范圍以內(nèi)的溫度下通過(guò)0.5% -5.0%范圍以內(nèi)的稀硫酸處理 30-90min范圍以內(nèi)的時(shí)間，多糖被部分水解成單糖，如半乳糖。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)在相同溶液中反復(fù)水解新鮮顆粒，最終水解物的還原糖濃度由2.0%增加至10%。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中在中和過(guò)程中產(chǎn)生的不溶性CaSO4通過(guò)在真空下過(guò)濾或在5000-7000rpm范圍以內(nèi)離心15分鐘去除，而可溶鹽通過(guò)電滲析方法去除。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中所述水解物用濃度在0.2-2. 0%范圍以內(nèi)的氮源如蛋白胨和酵母提取物或麻瘋樹(shù)屬(Jatropha)團(tuán)塊的蛋白水解物加富。
7.權(quán)利要求1所述的方法，其中在高壓滅菌的水解物中接種標(biāo)準(zhǔn)釀啤酒酵母菌，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiea),的活性培養(yǎng)物。
8.權(quán)利要求1或7所述的方法，其中將所述接種的海藻水解物在有氧和厭氧條件下在 25-35°C范圍以內(nèi)溫育M-96小時(shí)范圍以內(nèi)的時(shí)間，以將糖發(fā)酵為乙醇。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中通過(guò)蒸餾從所述發(fā)酵液分離生物乙醇。
10.權(quán)利要求1所述的方法，其中將蒸餾后殘余的發(fā)酵液連同在中和過(guò)程中產(chǎn)生的不溶性CaSO4和電滲析過(guò)程的淘汰物用作肥料。
全文摘要
本發(fā)明涉及由新鮮紅色海藻長(zhǎng)心卡帕藻(Kappaphycus alvarezii)集成生產(chǎn)乙醇和海藻生物肥料的方法。具體地，本發(fā)明描述了由長(zhǎng)心卡帕藻生產(chǎn)作為副產(chǎn)物的乙醇的方法。該方法包括壓榨新鮮藻類(lèi)以釋放汁液(其為一種證明的生物肥料)，并且回收殘留的富含角叉藻聚糖的生物質(zhì)，將所述生物質(zhì)在升高的溫度下用稀酸水解，使用廉價(jià)的氫氧化鈣中和水解物，并且通過(guò)過(guò)濾或離心去除不溶的鹽，通過(guò)電滲析除去水解物的可溶鹽，用氮源加富，接種酵母菌并且將其發(fā)酵形成包含乙醇的發(fā)酵液，并且通過(guò)蒸餾由所述發(fā)酵液分離乙醇，并且將殘余的水解物、所產(chǎn)生的CaSO4和由電滲析得到的淘汰物用作肥料。
文檔編號(hào)C12P7/06GK102597251SQ201080050007
公開(kāi)日2012年7月18日 申請(qǐng)日期2010年7月30日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月7日
發(fā)明者G·格納塞卡蘭, K·埃斯瓦蘭, 卡爾帕納·哈雷什·莫迪, 哈沙德·拉曼白·布蘭巴特, 巴拉蒂本·古納凡特雷·沙阿, 巴林德納·薩那, 巴瓦納特·杰哈, 斯里庫(kù)馬蘭·坦姆皮, 普什皮托·庫(kù)馬·高希, 阿廷德拉·丁克雷·舒克拉 申請(qǐng)人:科學(xué)與工業(yè)研究委員會(huì)