專利名稱：產(chǎn)生l-氨基酸的細(xì)菌和產(chǎn)生l-氨基酸的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在棒狀桿菌型細(xì)菌發(fā)酵期間，通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成 途徑產(chǎn)生L-氨基酸的方法，所述L-氨基酸具體為L(zhǎng)-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯 氨酸、L-纈氨酸、L-丙氨酸和L-賴氨酸。
背景技術(shù)：
L-氨基酸如L-谷氨酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的， 且通常以利用棒狀桿菌型細(xì)菌的發(fā)酵方法以工業(yè)規(guī)模產(chǎn)生，棒狀桿菌型細(xì)菌包括具有產(chǎn) 生L-氨基酸的能力的短桿菌屬(Brevibacterium)和棒桿菌屬(Corynebacterium)。為 了改進(jìn)棒狀桿菌型細(xì)菌的L-氨基酸生產(chǎn)力，已使用從自然界分離的菌株或其人工突變體 (JP07-121228B, JP07-121228B，JP06-237779A，Adv Biochem Eng Biotechnol. 2003 ；79 59-112. J Biotechnol. 2003Sep 4 ；104(1-3) :155-72.和 W095/34672)。
當(dāng)需氧細(xì)菌(aerobic bacteria)，特別是棒狀桿菌型細(xì)菌，在限氧 (oxygen-limited)條件下培養(yǎng)時(shí)，除目標(biāo)物質(zhì)(target substance)以外的有機(jī)酸如乳酸 和乙酸作為副產(chǎn)物過量積累。這種積累抑制細(xì)菌的生長(zhǎng)，并大大地降低發(fā)酵過程中細(xì)菌的 生產(chǎn)力。此外，中和這些有機(jī)酸的過量的反荷離子(counterion)是必需的，這增加了生產(chǎn) 成本。因此，希望創(chuàng)造出在培養(yǎng)過程中產(chǎn)生更少乙酸的菌株，如催化乙酸產(chǎn)生的酶的活性被 減少或消除的菌株。
使用催化乙酸產(chǎn)生的酶的活性被減少或消除的菌株的發(fā)酵方法實(shí)例包括， 使用乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(Pta)和乳酸脫氫酶(Idh)活性缺陷的大腸桿菌(Escherichia coli)來產(chǎn)生L-氨基酸(W099/06532)，利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷的腸細(xì)菌科 (Enterobacteriaceae family)來產(chǎn)生L-氨基酸，和利用丙酮酸氧化酶(poxB)活性缺陷 的腸桿菌科可來產(chǎn)生 D-泛酸(D-panthotheic acid) (W002/36797)。
已將乙酸激酶(ack)和乙酰磷酸轉(zhuǎn)移酶(pta)報(bào)導(dǎo)為參與棒狀桿菌型細(xì)菌中乙酸 的同化作用(assimilation)的酶(Microbiology, 1999 Feb ； 145(Pt2) :503-13)。同樣，已 報(bào)導(dǎo)了棒狀桿菌型細(xì)菌，其中產(chǎn)生乙酸的酶丙酮酸氧化酶(poxB)被破壞(EP1096013A)。
乙酰輔酶A水解酶是一種從乙酰輔酶A和水產(chǎn)生乙酸的酶(3. 1. 2. 1)，且已公開了 預(yù)測(cè)編碼谷氨酸棒桿菌的乙酰輔酶A水解酶的核苷酸序列(EP1108790A)。但是，還沒有關(guān) 于該基因?qū)嶋H克隆和表達(dá)分析的報(bào)導(dǎo)；因此該基因的實(shí)際(actual)功能也還未確認(rèn)。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供棒狀桿菌型細(xì)菌，所述棒狀桿菌型細(xì)菌具有改進(jìn)的、通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力，并提供使用這種細(xì)菌有效地 產(chǎn)生上述L-氨基酸的方法。
本發(fā)明的發(fā)明者進(jìn)行了廣泛的研究以完成上述目的。結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)通過減少棒 狀桿菌型細(xì)菌中乙酰輔酶A水解酶的活性，提高了產(chǎn)生L-氨基酸，尤其是L-谷氨酸、L-纈 氨酸和L-丙氨酸的能力，并因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明的一個(gè)目的是提供具有產(chǎn)生L-氨基酸能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述 棒狀桿菌型細(xì)菌被修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少，而且其中所述L-氨基酸是通過使 用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中通過在染色體的乙 酰輔酶A水解酶基因的編碼區(qū)或表達(dá)調(diào)控區(qū)弓I入突變來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中是通過破壞染色體 乙酰輔酶A水解酶基因來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水 解酶選自下組
(A)包含SEQ ID NO 24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和
(B)包含SEQ ID NO : 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中在所述蛋白質(zhì)中取代、缺 失、插入或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，且其中所述蛋白質(zhì)具有乙酰輔酶A水解酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水 解酶基因選自下組
(a)包含SEQ ID NO 23的核苷酸1037到2542的基因；禾口
(b)DNA，其能夠在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO 23的核苷酸1037至2542的多核 苷酸或由所述多核苷酸制備的探針雜交，并編碼了具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì) 菌被進(jìn)一步地修飾，以提高谷氨酸脫氫酶活性。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是 一種或多種選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨 酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生L-氨基酸的方法，包括
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述的棒狀桿菌型細(xì)菌；和
從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸，其中所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的 生物合成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供如上所述的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種 選自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨 酸和L-賴氨酸。
本發(fā)明還涉及如下方面
1.具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì)菌被修 飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少，并且其中所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物 的生物合成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
2.根據(jù)項(xiàng)1的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中通過將突變引入染色體乙酰輔酶A水解酶基因的編碼區(qū)或表達(dá)調(diào)控區(qū)來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
3.根據(jù)項(xiàng)1的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中通過破壞染色體乙酰輔酶A水解酶基因來減 少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
4.根據(jù)項(xiàng)1至3中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶選自下 組
(A)包含SEQ ID NO 24所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和
(B)包含SEQ ID NO : 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中在所述蛋白質(zhì)中取代、缺 失、插入、或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，并且其中所述蛋白質(zhì)具有乙酰輔酶A水解酶的活 性。
5.根據(jù)項(xiàng)1至3中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶基因選 自下組
(a)包含SEQ ID NO 23的核苷酸1037至2542的基因；和
(b)DNA，其能夠在嚴(yán)緊條件下與包含SEQ ID NO 23的核苷酸1037至2542的多核 苷酸或由所述多核苷酸制備的探針雜交，并編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白。
6.根據(jù)項(xiàng)1至5中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述棒狀桿菌型細(xì)菌被進(jìn)一步 修飾以提高谷氨酸脫氫酶活性。
7.根據(jù)項(xiàng)1至6中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌，其中所述L-氨基酸是一種或多種選 自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨 酸。
8.產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括
在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)項(xiàng)1至7中任一項(xiàng)的棒狀桿菌型細(xì)菌；和
從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸，且其中所述L-氨基酸是一種或多種經(jīng)由丙酮酸為中 間物產(chǎn)生的L-氨基酸。
9.根據(jù)項(xiàng)8的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的氨基酸L_谷氨 酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
附圖簡(jiǎn)述


圖1顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS3的方法。
圖2顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS4的方法。
圖3顯示了構(gòu)建質(zhì)粒PBS5T的方法。
圖4顯示了構(gòu)建質(zhì)粒ρ Δ ldh56-l的方法。
圖5顯示了構(gòu)建質(zhì)粒pBS4S: Aach的方法。
優(yōu)選實(shí)施方案描述
以下將對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)地描述。
<1>具有通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力的棒 狀桿菌型細(xì)菌
在本發(fā)明中，棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括常規(guī)的棒狀桿菌型細(xì)菌，也包括曾經(jīng)被 歸入短桿菌屬，但現(xiàn)在被歸入棒桿菌屬的細(xì)菌(Int. J. Syst.Bacteriol.，41，255 (1991))， 以及與棒桿菌屬細(xì)菌非常接近的(close)短桿菌屬細(xì)菌。這些棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括 如下
口譽(yù)乙酉先乙酸棒桿菌(Corynebacterium acetoacidophilum)
醋谷棒桿菌(Corynebacterium acetoglutamicum)
g醇棒桿菌(Corynebacterium alkanolyticum)
美棒Iflif (Corynebacterium callunae)
谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)
百合花棒桿菌(Corynebacterium lilium)
棲糖蜜棒桿菌(Corynebacterium melassecola)
嗜熱 產(chǎn)氨棒 桿菌(Corynebacterium thermoaminogenes) (Corynebacteriumefficiens)
力士棒桿菌(Corynebacterium herculis)
二歧短Iflif (Brevibacterium divaricatum)
黃色短桿菌(Brevibacterium flavum)
Brevibacterium immariophilum
乳發(fā)酵短桿菌(Brevibacterium lactofermentum)(谷氨酸棒桿菌)
玫瑰色短桿菌(Brevibacterium roseum)
角軍H短桿菌(Brevibacterium saccharoIyticum)
生硫短桿菌(Brevibacterium thiogenitalis)
產(chǎn)M短桿菌(Brevibacterium ammoniagenes)
白色短桿菌(Brevibacterium album)
賭狀短桿菌(Brevibacterium cerinum)
嗜氨微桿菌(Microbacterium ammoniaphilum)
棒狀桿菌型細(xì)菌的具體實(shí)例如下
嗜乙酰乙酸棒桿菌ATCC13870
醋谷棒桿菌ATCC15806
烷醇棒桿菌ATCC21511
美棒桿菌ATCC15991
谷氨酸棒桿菌ATCC13020，ATCC13032, ATCC13060，ATCC13869
百合花棒桿菌ATCCl599O
棲糖蜜棒桿菌ATCC17965
嗜熱產(chǎn)氨棒桿菌AJ12340(FERM BP-1539)
力士棒桿菌ATCCl3868
二歧短桿菌 ATCC14020
黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067, AJ12418 (FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC14068
乳發(fā)酵短桿菌(谷氨酸棒桿菌)ATCC13869
玫瑰色短桿菌ATCCl3825
解糖短桿菌ATCC14066
生硫短桿菌ATCC19240
產(chǎn)氨短桿菌ATCC6871，ATCC6872
白色短桿菌ATCC15111
賭狀短桿菌ATCC15112
嗜氨微桿菌ATCC153M
這些菌株可從美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，地址P.O. Box 1549, Manassas, VA 20108，United States ofAmerica)獲得。即，給予每個(gè)菌株唯一的登記號(hào)，該登記 號(hào)列于ATCC的目錄中?？梢岳眠@個(gè)登記號(hào)定購(gòu)菌株。根據(jù)布達(dá)佩斯條約(Budapest Treaty)的規(guī)定，口耆熱產(chǎn)氛棒桿菌(Corynebacteriumthermoaminogenes)AJ12340 菌株 于1987年03月13日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute of Bioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology,Ministry of International Trade and Industry(巨前為，獨(dú)立 亍政法人產(chǎn) 業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary, NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology),地址Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japan),^ia^ 登錄號(hào)FERM BP-1539。根據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定，將黃色短桿菌(Brevibacterium flavum) AJ12418菌株于1988年12月M日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究 所，并給予登錄號(hào)FERM BP-2205。
“通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的L-氨基酸”優(yōu)選指具有衍生 自丙酮酸的碳骨架的L-氨基酸。這類L-氨基酸的實(shí)例包括L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨 酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。如本文所用的，“通過使用丙酮酸作為 中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力”，指在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì) 菌時(shí)，導(dǎo)致在培養(yǎng)基中積累一種或多種上述L-氨基酸的能力。
產(chǎn)生L-氨基酸的能力可以是棒狀桿菌型細(xì)菌的野生型菌株的原始能力，或是通 過培育被賦予的能力。此外，產(chǎn)生L-氨基酸的能力可以通過修飾被賦予，所述修飾導(dǎo)致乙 酰輔酶A水解酶活性的減少，如后文所述。
為了賦予產(chǎn)生L-氨基酸的能力，可以使用培育棒狀桿菌型細(xì)菌所用的常規(guī)方法， 例如創(chuàng)造代謝調(diào)節(jié)突變菌株，或創(chuàng)造目標(biāo)物質(zhì)的生物合成酶的活性增強(qiáng)的重組菌株(見 "Amino Acid Fermentation，，，Center for AcademicPublications Japan Co. , Ltd. , 1st ed. Published on May 30，1986，p. 77to 100)。在這些方法中，可以單獨(dú)或組合使用引入代 謝調(diào)節(jié)突變和增強(qiáng)目標(biāo)物質(zhì)生物合成酶的方法。此外，可以引入兩個(gè)或兩個(gè)以上的突變，且 可以增強(qiáng)兩個(gè)或兩個(gè)以上的酶活性。
賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的實(shí)例是增強(qiáng)編碼L-谷氨酸生物合成酶的基因的表 達(dá)。涉及L-谷氨酸生物合成的酶的實(shí)例包括谷氨酸脫氫酶、谷氨酰胺合成酶、谷氨酸合成 酶、異檸檬酸脫氫酶、烏頭酸水合酶、檸檬酸合酶、磷酸烯醇丙酮酸羧酶、丙酮酸羧化酶、丙 酮酸脫氫酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸合酶、烯醇化酶、磷酸甘油酸變位酶、磷酸甘油酸 激酶、甘油醛-3-磷酸脫氫酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、果糖二磷酸醛縮酶、果糖磷酸激酶和葡糖 磷酸異構(gòu)酶。
增強(qiáng)這些基因的表達(dá)可以通過以下方法完成，將含有所述基因的DNA插入適 當(dāng)?shù)馁|(zhì)粒，該質(zhì)粒能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主復(fù)制，然后用所得質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞； 或通過同源重組、接合(conjugation)、轉(zhuǎn)座(transposition)等將所述基因整合到染色體上(EP0756007B，EP0332488A EP0771879A)；或在所述基因的啟動(dòng)子區(qū)域引入突變 (TO/0018935)，或以強(qiáng)啟動(dòng)子取代。
當(dāng)上述基因通過質(zhì)粒引入或整合到染色體上時(shí)，用于表達(dá)這些基因的啟動(dòng)子可以 是任何啟動(dòng)子，只要該啟動(dòng)子能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中起作用。這類啟動(dòng)子的實(shí)例包括 Iac啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、trc啟動(dòng)子、PS2啟動(dòng)子和pL啟動(dòng)子。也可以使用每個(gè)基因的天 然(native)啟動(dòng)子。
通過修飾以使檸檬酸合成酶基因、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因，和/或谷氨 酸脫氫酶基因表達(dá)增強(qiáng)的微生物的實(shí)例包括，在JP2001-333769A (EP1078989A)、 JP2000-106869A(EP955368A)、JP2000-189169A (EP952221A)禾口 JP2001-333769A (EP1078989A)中所公開的微生物。
賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的修飾也包括減少或消除酶的活性，所述的酶催化除 L-谷氨酸之外的化合物的合成，和從L-谷氨酸生物合成途徑分支。這類酶的實(shí)例包括異 檸檬酸裂合酶、α -酮戊二酸脫氫酶、磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶、乙酸激酶、乙酰羥酸合酶、乙酰乳酸合 酶(acetolactate synthase)、甲酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(formate acetyltransferase),乳酸脫氧 酶和谷氨酸脫羧酶。
為了減少或消除上述酶的活性，可以在染色體上這些酶的基因處，引入導(dǎo)致酶活 性減少或喪失的突變或缺失。這可以通過以下方法實(shí)現(xiàn)，例如，破壞染色體上編碼這些酶的 基因，或修飾所述基因的表達(dá)控制序列如啟動(dòng)子和/或aiine Dargarno (SD)序列。另外， 可以通過引入導(dǎo)致氨基酸取代的錯(cuò)義突變、產(chǎn)生終止密碼子的無義突變、或在編碼區(qū)添加 或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸的移碼突變；或通過缺失該基因的一部分來減少或消除這些酶的 活性(Journalof Biological Chemistry 272 :8611-8617 (1997))。此外，可以通過如下方 法減少或消除這些酶的活性構(gòu)建編碼突變酶的基因，所述基因的編碼區(qū)缺失，并通過同源 重組用所得基因取代染色體基因。α-酮戊二酸脫氫酶活性被減少的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí) 例包括在JP7-834672A和JP06-237779中公開的菌株。
此外，賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力的方法實(shí)例包括修飾菌株以增強(qiáng)編碼yggB基 因的基因表達(dá)，或修飾菌株以在YggB中引入突變的方法(NCgl 1221 ；NP_600492. Reports small-conductance. . . [gi :19552490])(美國(guó)專利申請(qǐng) No. 60/715131)。
也可以通過下方法賦予產(chǎn)生L-谷氨酸的能力篩選對(duì)有機(jī)酸類似物、呼吸抑制 劑、或超氧化物產(chǎn)生物具有抗性的菌株，或篩選對(duì)細(xì)胞壁合成的抑制劑具有敏感性的菌 株。這類方法的實(shí)例包括賦予對(duì)苯并吡喃酮(benzopirone)或萘醌(naphtoquinone)的 抗性(JP56-1889A)，賦予對(duì)單氟乙酸(monof luoroaceticacid)的抗性(JP 50-113209A)， 賦予對(duì)腺嘌呤和胸腺嘧啶的抗性(JP57-065198)，賦予對(duì)H0QN0的抗性(JP56-140895A)， 賦予對(duì)α-酮丙二酸(α-ketomalonic acid)的抗性(JP57-2689A)，賦予對(duì)胍的抗性 (JP56-35981A)，賦予對(duì)道諾霉素(daunomicin)的抗性(JP58-158192A)，以及賦予對(duì)青霉 素的敏感性(JP04-88994A)。
這類細(xì)菌的具體實(shí)例包括下列菌株
黃色短桿菌AJ3949 (FERM BP-2632 JP 50-113209A)
谷氨酸棒桿菌AJ116 (FERMP-5736;JP57-065198A)
黃色短桿菌AJl 1355 (FERM P-5007 JP56-1889A)
谷氨酸棒桿菌AJl 1355 (FERM P-5020 JP56-1889A)
黃色短桿菌AJl 1217 (FERM P-4318 JP57-2689A)
谷氨酸棒桿菌AJl 1218 (FERM P-4319 JP57-2689A)
黃色短桿菌AJl 1564 (FERM P-5472 ； JP56-140895A)
黃色短桿菌AJl 1439 (FERM P-5136 JP56-35981A)
谷氨酸棒桿菌H7684 (FERM BP-3004 ； JP04-88994A)
乳發(fā)酵短桿菌AJll似6 (FERM P5123 ； JP56-048890A)
谷氨酸棒桿菌AJl 1440 (FERM P5137 ； JP56-048890A)
乳發(fā)酵短桿菌AJl 1796 (FERM P6402 JP58-158192A)
賦予產(chǎn)生L-纈氨酸的能力的方法實(shí)例包括修飾菌株以增強(qiáng)編碼L-纈氨酸生物 合成酶的基因的表達(dá)的方法。L-纈氨酸生物合成酶的實(shí)例包括由ilvBNC操縱子編碼的酶， 即，由ilvBN編碼的乙酰羥酸合成酶和由ilvC編碼的異構(gòu)還原酶(isomero-reductase) (W000/50624)。ilvBNC操縱子受到L-纈氨酸、L-異亮氨酸和L-亮氨酸的任何組合的轉(zhuǎn)錄 阻抑(transcriptional r印ression)，所以最好進(jìn)行釋放稀釋(rel ease attenuation)，VX 避免作為產(chǎn)物的L-纈氨酸的轉(zhuǎn)錄阻抑。
可以通過減少或消除至少一種酶的活性將產(chǎn)生L-纈氨酸的能力賦予棒狀桿菌型 細(xì)菌，所述酶催化減少L-纈氨酸的產(chǎn)生量的反應(yīng)。例如，可以通過減少催化異亮氨酸合成 的蘇氨酸脫水酶的活性，或通過減少催化D-泛酸(D-panthothenate)合成的酶的活性賦予 產(chǎn)生L-纈氨酸的能力(W000/50624)。
也可以通過將對(duì)氨基酸類似物等的抗性賦予棒狀桿菌型細(xì)菌來賦予產(chǎn)生L-纈氨 酸的能力。
例如，可以使用對(duì)于L-異亮氨酸和L-甲硫氨酸是營(yíng)養(yǎng)缺陷的，并對(duì)D-核糖、 嘌呤核糖核苷或嘧啶核糖核苷有抗性的產(chǎn)生L-纈氨酸的突變菌株(FERM P-1841，F(xiàn)ERM P-四，JP-B-53-025034)，對(duì)聚酮化合物有抗性的產(chǎn)生L-纈氨酸的突變菌株(FERM P-1763， FERM P-1764 ； JP-B006-065314)，對(duì)L-纈氨酸有抗性，且對(duì)丙酮酸類似物如β _氟丙酮酸 (β -fluoropyruvic acid)敏感的產(chǎn)生 L-纈氨酸的突變菌株(FERM BP-3006, BP-3007, Patent 300692 。
具有產(chǎn)生L-丙氨酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括H+-腺苷三磷酸酶 (H+-ATPase)活性缺陷的棒狀桿菌型細(xì)菌(Appl Microbiol Biotechnol. 2001Nov ；57 (4) 534-40)，以及擴(kuò)增的具有(amplified with)編碼天冬氨酸β _脫羧酶結(jié)構(gòu)基因的棒狀桿 菌型細(xì)菌(JP-A-7-163383)。
可以通過修飾棒狀桿菌型細(xì)菌以增強(qiáng)編碼L-精氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)來 賦予產(chǎn)生L-精氨酸的能力。L-精氨酸生物合成酶的實(shí)例包括N-乙酰谷氨酰磷酸還原酶 (argC)、鳥氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶(argj)、N_乙酰谷氨酸激酶(argB)、乙酰鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶(argD)、 鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶(argF)、精氨琥珀酸合成酶(argG)、精氨琥珀酸裂合酶(argH)和 氨甲酰磷酸合成酶。這些精氨酸生物合成基因存在于Arg操縱子(argCJBDFRGH)上，且 受到由argR編碼的精氨酸抑制劑(repressor)的調(diào)控(J Bacteriol. 2002Dec ； 184 (23) 6602-14)。因此，精氨酸抑制劑的破壞導(dǎo)致Arg操縱子表達(dá)的增加，因此增強(qiáng)產(chǎn)生L-精氨 酸的酶的活性(US2002-0045223)。
賦予產(chǎn)生L-精氨酸的能力的另一種方法是，例如通過賦予對(duì)氨基酸類似物的抗 性。棒狀桿菌型細(xì)菌的實(shí)例包括對(duì)2-噻唑丙氨酸(2-thiazolealanine)有抗性，并且對(duì)于 L-組氨酸、L-脯氨酸、L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-甲硫氨酸或L-色氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷的棒狀 桿菌型細(xì)菌(JP-A-54-044096)；對(duì)酮丙二酸、氟丙二酸(fluoromalonic acid)或單氟乙酸 有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(JP-A-57-18989)；對(duì)精氨醇(argininol)有抗性的棒狀桿菌型 細(xì)菌(JP-B-62-024075)；對(duì)χ-胍有抗性的棒狀桿菌型細(xì)菌(χ是脂肪酸或脂肪鏈衍生物) (JP-A-2-186995)；和對(duì)精氨酸氧肟酸(arginine hydroxamate)和6-氮尿嘧啶有抗性的棒 狀桿菌型細(xì)菌(JP-A-57-150381)。
賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力的方法實(shí)例是通過修飾棒狀桿菌型細(xì)菌來增強(qiáng)編碼 L-谷氨酰胺生物合成酶的基因的表達(dá)。L-谷氨酰胺生物合成酶的實(shí)例包括谷氨酰胺合成 酶和谷氨酸脫氫酶(US2003-0003550)。
也可以通過減少或消除催化反應(yīng)的酶的活性來賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力，所 述反應(yīng)從L-谷氨酰胺生物合成途徑分支、且產(chǎn)生其它化合物。例如，可以通過減少谷氨酰 胺酶的活性來賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力(US2004-0152175)。
也可以通過賦予對(duì)L-氨基酸類似物的抗性來賦予產(chǎn)生L-谷氨酰胺的能力。這 些方法的實(shí)例包括，賦予對(duì)于6-重氮-5-氧-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-norleucine) 的抗性的方法(JP-A-3-232497)，賦予對(duì)于嘌呤類似物和/或甲硫氨酸亞砜(methionine sulfoxide)的抗性的方法(JP-A-61-2(^694)，賦予對(duì)于α -酮丙二酸的抗性的方法 (JP-A-56-151495)，以及賦予對(duì)于含谷氨酸的肽的抗性的方法(JP-2-186994)。
產(chǎn)生L-谷氨酰胺的棒狀桿菌型細(xì)菌的具體實(shí)例包括以下菌株
黃色短桿菌AJl 1573 (FERM P-5492，JP56-161495A)
黃色短桿菌AJl 1576 (FERM ΒΡ-10381，JP56-161495A)
黃色短桿菌AJ12212(FERM P-8123，JP61-202694A)
黃色短桿菌AJ12418(FERM BP-2205，JP02-186994A)
黃色短桿菌DH18 (FERM P-11116，JP03-232497A)
棲糖蜜棒桿菌DH;344 (FERM P-11117, JP3-232497A)
谷氨酸棒桿菌AJl 1574 (FERM P-5493，JP56-151495A)
賦予產(chǎn)生L-脯氨酸的能力的方法實(shí)例包括修飾棒狀桿菌型細(xì)菌以增強(qiáng)編碼L-脯 氨酸生物合成酶的基因的表達(dá)的方法。L-脯氨酸生物合成酶的實(shí)例包括谷氨酸激酶、 Y -谷氨酰磷酸還原酶(Y -glutamyl phosphate reductase)和脯氨酸_5_羧化物還原酶 (pyroline-5-carboxylate reductase)(J Bacteriol. 1996Aug ； 178 (15) :4412-9.)。
也可以通過減少或消除催化反應(yīng)的酶的活性賦予產(chǎn)生L-脯氨酸的能力，所述反 應(yīng)從L-脯氨酸生物合成途徑分支、并產(chǎn)生其它化合物。例如，可以通過減少鳥氨酸轉(zhuǎn)氨酶 (ornithine-aminotransferase)的活性來賦予產(chǎn)生 L-脯氨酸的能力(J Bacteriol. 1996 Aug ；178(15) :4412-9.)。
同時(shí)，因?yàn)長(zhǎng)-精氨酸、L-谷氨酰胺和L-脯氨酸含有L-谷氨酸作為碳骨架，所以 可以通過擴(kuò)增編碼酶的基因賦予產(chǎn)生這些氨基酸的能力，所述酶在上述產(chǎn)生L-谷氨酸的 細(xì)菌中，催化導(dǎo)致從L-谷氨酸產(chǎn)生上述每種L-氨基酸的反應(yīng)。
此外，由于L-丙氨酸是通過L-天冬氨酸的β -脫羧合成的，所以可以通過修飾產(chǎn)生L-天冬氨酸的細(xì)菌以使乙酰輔酶A水解酶活性減少來獲得產(chǎn)生L-丙氨酸的細(xì)菌。
通過育種賦予或增強(qiáng)L-賴氨酸生產(chǎn)力可以通過弓I入一個(gè)或多個(gè)下列的突變來進(jìn) 行。這樣的人工突變體如下所示對(duì)于S-(2_氨乙基)_半胱氨酸(在下文中稱為“AEC”) 具有抗性的突變體；生長(zhǎng)需要氨基酸例如L-高絲氨酸的突變體(參見日本專利公布號(hào) 4828078和566499)；對(duì)于AEC具有抗性且需要氨基酸例如L-亮氨酸、L-高絲氨酸、L-脯 氨酸、L-絲氨酸、L-精氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸等的突變體(參見美國(guó)專利3，708，395 和3,825,47 ；對(duì)于DL-氨基己內(nèi)酰胺、氨基月桂基內(nèi)酰胺(aminolauryllactam)、天冬氨 酸類似物、磺胺類藥、醌型化合物和N-月桂基亮氨酸(N-lauroylleucine)具有抗性的產(chǎn)生 L-賴氨酸的突變體，和對(duì)于草酰乙酸脫羧酶或呼吸系統(tǒng)酶抑制劑具有抗性的產(chǎn)生L-賴氨 酸的突變體(參見日本專利 Laid-Open編號(hào) 5053588，5031093，52102498, 539394，5386089， 559783，559759，5632995和5639778，日本專利公布號(hào)5343591和531833)；需要肌醇或乙 酸的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體(見日本專利Laid-Open編號(hào)559784和568692)；對(duì)于氟丙 酮酸或?qū)?4°C或更高的溫度敏感的生產(chǎn)L-賴氨酸的突變體(見日本專利LaidOpen編號(hào) 5386090)；對(duì)于乙二醇具有抗性的短桿菌和棒桿菌的產(chǎn)生L-賴氨酸的突變體(見美國(guó)專利 4，411，997)。
賦予產(chǎn)生L-賴氨酸的能力的方法實(shí)例是增強(qiáng)編碼L-賴氨酸生物合成酶的基因 的表達(dá)。參與了 L-賴氨酸生物合成的酶的實(shí)例包括，但不限于二氨基庚二酸途徑酶，如 二氫吡啶二羧酸合酶(dihydrodipicolinate synthase)基因(dapA)、天冬氨酸激酶基 因(IysC)、二氫吡啶二羧酸還原酶(dihydrodipicolinatedreductase)基因(dapB)、二 氨基庚二酸脫羧酶基因(IysA)、二氨基庚二酸脫氫酶基因(ddh)(上述所有；國(guó)際公布號(hào) 96/40934)、磷酸烯醇丙酮酸羧酶基因(ppc)(日本專利申請(qǐng)Laid-Open編號(hào)60-87788)、 天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶基因(aspC)(日本專利公布號(hào)6-1020 )、二氨基庚二酸差向異構(gòu)酶基因 (dapF)(日本專利申請(qǐng)Laid-Open編號(hào)2003-135066)和天冬氨酸半醛脫氫酶(aspartate semialdehydedehydrogenease)基因(asd)(國(guó)際公布號(hào)(KV6I723)；和氨基己二酸途徑酶， 如同型烏頭酸水合酶(homoaconitate hydratase)基因(日本專利申請(qǐng)Laid-Open編號(hào) 2000-157276)。
此外，本發(fā)明的細(xì)菌可具有減少的催化反應(yīng)的酶的活性，或者可使所述酶具有缺 陷，所述反應(yīng)通過從L-賴氨酸生物合成途徑分支，生成除L-賴氨酸之外的產(chǎn)物。催化反 應(yīng)的酶包括高絲氨酸脫氫酶和賴氨酸脫羧酶，所述反應(yīng)通過從L-賴氨酸生物合成途徑分 支生成除L-賴氨酸之外的產(chǎn)物。這些酶的活性減少的菌株在W095/23864和W096/178930 中有所描述。
<2>減少乙酰輔酶A水解酶活性的修飾
如上所述本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力，所述L-氨基酸是 通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的，且經(jīng)過修飾以使乙酰輔酶A水解酶 (EC 3. 1. 2. 1)活性減少。
本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌可以通過以下方法獲得，修飾上述的具有通過使用丙酮 酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生L-氨基酸的能力的棒狀桿菌型細(xì)菌，以使乙酰輔酶A水 解酶活性減少。培育本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，賦予細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸的能力，或修飾 細(xì)菌以使乙酰輔酶A水解酶活性減少，可以以任何順序進(jìn)行。
“乙酰輔酶A水解酶(ACH)活性”指催化從乙酰輔酶A和水產(chǎn)生乙酸的活性。“修 飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少”的含義是乙酰輔酶A水解酶活性低于未修飾的菌株， 包括野生型棒狀桿菌型細(xì)菌。與未修飾的菌株相比，每單位細(xì)胞重量的ACH活性優(yōu)選減少 到50%或以下，更優(yōu)選30%或以下，還更優(yōu)選10%或以下。在此，作為對(duì)照的野生型棒狀桿 菌型細(xì)菌包括，例如，乳發(fā)酵短桿菌2256菌株(ATCC 13869)或谷氨酸棒桿菌ATCC 13032 ； (被用作對(duì)照的)未修飾的菌株包括乳發(fā)酵短桿菌Aldh菌株。乙酰輔酶A水解酶活性可以 根據(jù) Gergely，J.等的方法測(cè)量(Gergely，J.，Hele，P. & Ramkrishnan, C. V. (1952) J. Biol. Chem. 198p323-334)。“減少”包括活性完全消失的情況。優(yōu)選的是，本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì) 菌具有的乙酰輔酶A水解酶活性比野生型或未修飾的菌株低，且引起的L-氨基酸積累比野 生型或未修飾的菌株高。
ACH的實(shí)例包括含有SEQ ID NO : 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，和包含SEQ ID NO: M所示氨基酸序列，其中在一個(gè)或多個(gè)位置取代、缺失、插入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，但 保留了 ACH活性的蛋白質(zhì)。盡管此處所指的“幾個(gè)”氨基酸殘基的數(shù)量可能依據(jù)蛋白質(zhì)氨 基酸殘基的三維結(jié)構(gòu)中的位置或種類而不同，但可以優(yōu)選為2到20個(gè)，更優(yōu)選2到10個(gè)， 特別優(yōu)選2到5個(gè)。在保留ACH活性的同時(shí)，ACH基因編碼的蛋白質(zhì)與SEQ ID N0J4所示 氨基酸序列的同源性優(yōu)選不低于80%，更優(yōu)選不低于90%，還更優(yōu)選不低于95%，特別優(yōu) 選不低于97%。這些ACH同源物中的氨基酸取代優(yōu)選為保守取代，包括以ser或thr取代 ala,以 gin、his Iys ￠(^ arg,以 glu、gin、lys> his asp ￠(^ asn,以 asn> glu gin ￠(^ asp,以 ser ala ￠(^ cys,以 asn> glu、lys、his、asp arg ￠(^ gin,以 gly、asn> gin、lys 或 asp 取代 glu,以 pro 取代 gly,以 asn、lys、gin、arg 或 tyr 取代 his,以 leu、 met、val 或 phe 取代 ile,以 ile、met、val 或 phe 取代 leu,以 asn、glu、gin、his 或 arg 取 代 lys,以 ile、leu、val 或 phe 取代 met,以 trp、tyr、met、ile 或 leu 取代 phe,以 thr 或 ala ￠(^ ser,以 ser ala ￠(^ thr,以 phe tyr ￠(^ trp,以 his、phe trp ￠(^ tyr 和以met、ile或Ieu取代val。
“修飾以使乙酰輔酶A水解酶活性減少”包括每個(gè)細(xì)胞中乙酰輔酶A水解酶分子數(shù) 量減少的情況，和每分子輔酶A水解酶活性減少的情況。具體地說，這些修飾可以通過以下 方法完成，例如，破壞染色體上編碼乙酰輔酶A水解酶的基因，或修飾表達(dá)調(diào)控序列，如啟 動(dòng)子和/或Siine-Dalgarno (SD)序列。染色體上的乙酰輔酶A水解酶基因包括，例如，包 含SEQ ID NO 23的核苷酸1037到2542的DNA。此外，乙酰輔酶A水解酶基因包括，例如， 通過使用引物SEQ ID 7和8用PCR方法可獲得的DNA。另外，染色體上的乙酰輔酶A水解 酶基因可以是在嚴(yán)緊條件下能夠與SEQ ID No. 23的核苷酸1037到2542或可由所述核苷 酸制備的探針雜交的DNA，只要其編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋白質(zhì)。“嚴(yán)緊條件” 指這樣的條件，在該條件下，形成所謂的特異性雜交，而不形成所謂的非特異性的雜交。盡 管難以用數(shù)值清晰地說明這些條件，但這些條件的實(shí)例包括，在60°C，并在對(duì)應(yīng)于1 X SSC, 0. 1% SDS，優(yōu)選0. 1XSSC,0. 1% SDS的鹽濃度，進(jìn)行一次，優(yōu)選兩次或三次洗滌。
可以通過合成基于谷氨酸棒桿菌的核苷酸序列(例如，SEQ ID No. 23, NCgl2480 of Gen Bank 登錄號(hào) NC_003450 (NC_003450 的 27四376 到 2730884 的互補(bǔ)鏈))的合 成寡核苷酸，并使用谷氨酸棒桿菌的染色體DNA作為模板進(jìn)行PCR來克隆乙酰輔酶A 水解酶基因(在下文中稱為“ach基因”)。另外，源自棒狀桿菌型細(xì)菌如乳發(fā)酵短桿菌的另一個(gè)核苷酸序列也是可用的?？梢杂砂魻顥U菌型細(xì)菌作為DNA供體，通過例如 Saito 禾口 Miura 的方法(H. Saitoand K. Miura, Biochem. Biophys. Acta,72,619(1963), "BiotechnologyExperiments Handbook",ed. By The Society for Biotechnology Japan, p. 97 to 98，Baifukan, 1992)制備染色體 DNA。
由此制備的ach基因或其部分可用于破壞染色體ach基因。另外，用于破壞染色 體ach基因的ach基因也可以是具有足夠同源性以導(dǎo)致與目標(biāo)棒狀桿菌型細(xì)菌染色體上的 ach基因同源重組的基因(例如，具有SEQ ID NO 23的核苷酸1037到2542的基因)。這 里，足夠引起同源重組的同源性優(yōu)選80%或以上，更優(yōu)選90%或以上，還更優(yōu)選95%或以 上，特別優(yōu)選97%或以上。此外，在嚴(yán)緊條件下可以與上述基因雜交的DNA也可以被用于基 因破壞。
可通過如下方法破壞ach基因，例如，制備“缺失型ach基因”，其中ach基因的部 分序列缺失，以至于不產(chǎn)生功能正常的乙酰輔酶A水解酶，用含有此缺失型ach基因的DNA 轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌，以導(dǎo)致缺失型ach基因和染色體上ach基因之間的重組。這種利用 同源重組進(jìn)行基因置換的基因破壞已經(jīng)被建立，并包括使用線性DNA的方法，或使用含溫 度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒的方法(美國(guó)專利6，303，383或JP-A-05-007491)。利用同源重 組進(jìn)行基因置換的基因破壞也可以通過使用在棒狀桿菌型細(xì)菌中無法復(fù)制的質(zhì)粒來進(jìn)行。 優(yōu)選使用在棒狀桿菌型細(xì)菌中無法復(fù)制，但在埃希氏菌屬細(xì)菌^scherichiabacteria)中 能夠復(fù)制的質(zhì)粒。這種質(zhì)粒的實(shí)例包括PHSG299 (Takara Bio)和pHSG399 (Takara Bio)。
可以用缺失型ach基因，例如，通過使用sacBGchafer，A. et al.，Gene 145(1994)69-73)的同源重組來替換染色體ach基因。sacB基因編碼果聚糖蔗糖酶，且用 于有效地選擇菌株，在所述菌株中染色體目標(biāo)基因被突變基因所取代，并將載體部分從染 色體中消除(cured)。
首先，可以通過以下方法制備重組質(zhì)粒在具有溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)的質(zhì)粒中，插 入缺失型(突變體)ach基因、sacB基因和選擇標(biāo)記，如氯霉素抗性基因。將所得質(zhì)粒引入 棒狀桿菌型細(xì)菌的宿主菌株。當(dāng)果聚糖蔗糖酶在棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，由蔗糖 轉(zhuǎn)化產(chǎn)生的果聚糖對(duì)于細(xì)菌是致死的，因此該細(xì)菌無法在含有蔗糖的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。所以， 通過在含有蔗糖的平板中培養(yǎng)，可選擇菌株，所述菌株中在質(zhì)粒的突變體ach基因和染色 體ach基因之間發(fā)生取代，并由此將質(zhì)粒的其他部分從細(xì)胞中消除。
sacB基因的實(shí)例包括下列
枯草芽孢桿菌(Bacillussubillus) :sacB GenBank 登錄號(hào) X02730 (SEQ IDNO 19)
解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliqufaciens) :sacB GenBank 登錄號(hào) X52988
運(yùn)動(dòng)發(fā)酵單胞菌(Zymomonasmobilis) :sacB GenBank 登錄號(hào) L33402
嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacilus stearothermophilus) :surB GenBank 登錄號(hào) U34874
Lactobacillus sanfranciscensis :frfA GenBankAJ508391
Acetobacter xvlinus :lsxA GenBank 登錄號(hào) AB034152
Gluconacetobacter diazotrophicus :lsdA GenBank 登錄號(hào) L41732
可以通過常規(guī)方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化。例如，可以使用以氯化鈣處理受體細(xì)胞從而增加DNA通透性的方法，其已被報(bào)導(dǎo)用于大腸桿菌(Mandel, M. and Higa, Α.，J. Mol. Biol.，53， 159(1970))，以及使用由生長(zhǎng)細(xì)胞制備的感受態(tài)細(xì)胞以引入DNA的方法，其以被報(bào)導(dǎo)用于 枯草芽孢桿菌(Duncan，C. H.，Wilson, G. A. andYoung, F. Ε.，Gene, 1，153(1977))。除了這 些方法之外，可以使用將重組DNA引入到原生質(zhì)體-樣或原生質(zhì)球-樣(protoplast-or spheroplast-like)受體細(xì)胞中的方法，其已被報(bào)導(dǎo)可用于枯草芽孢桿菌、放線菌類 (actinomytetes)禾口酵母(Chang, S. and Choen, S. N. , Molec. Gen. Genet. , 168, 111 (1979)； Bibb, Μ. J. ， Ward, J. M. and Hopwood, 0. A. ， Nature,274,398 (1978) ；Hinnen, . A. Hicks, J. B. and Fink, G. R.，Proc. Natl. Sci. USA, 75,1929(1978))。此外，棒狀桿菌型細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 還可以通過電脈沖法進(jìn)行(Sugimoto et al.，JP2-207791A)。
用于棒狀桿菌型細(xì)菌的溫度敏感性質(zhì)粒的實(shí)例包括p48K和pSH(T2 (EP1038966)、 pHSC4(法國(guó)專利Laid-open公布號(hào)洸67875，1992和JP5-7491A)、pBS5T等等。在棒狀桿 菌型細(xì)菌中，這些質(zhì)粒可以在至少為25V的溫度自主復(fù)制，但不能在37°C的溫度自主復(fù) 制。含有PHSC4的大腸桿菌(Escherichia coli)AJ12571菌株依據(jù)布達(dá)佩斯條約的規(guī)定 于1990年10月11日保藏在通商產(chǎn)業(yè)省工業(yè)技術(shù)院生命工學(xué)工業(yè)技術(shù)研究所(National Institute ofBioscience and Human Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry)(巨前為獨(dú)立 亍政法人產(chǎn) 業(yè)技術(shù)綜合研究所特許微生物保藏中心(International Patent Organism Depositary, NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology),其地址 為 Tsukuba Central 6,1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-5466, Japan)，并給予保藏號(hào) FERM BP-3524。
在溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)不起作用的溫度(例如25°C )培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的菌株，以獲得已 弓I入所述質(zhì)粒的菌株。然后，在高溫下培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體以消除溫度敏感性質(zhì)粒，并涂布在含抗生 素藥物如卡那霉素的平板培養(yǎng)基上。雖然消除了所述質(zhì)粒的菌株不能在含這種抗生素藥物 的平板上生長(zhǎng)，但其中染色體ach基因用突變的ach基因取代的少數(shù)菌株能夠生長(zhǎng)并作為 菌落出現(xiàn)。
在這種將含突變ach基因的重組DNA整合到染色體DNA的菌株中，重組DNA導(dǎo)致 了與原來存在于染色體上的ach基因的重組，并將染色體ach基因與突變ach基因的融合 基因插入到染色體，以使重組DNA的其它部分(載體區(qū)段、溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性 標(biāo)記)存在于融合基因之間。然后，為了在染色體DNA上只留下突變的ach基因，將一個(gè)拷 貝的ach基因連同載體區(qū)段(包括溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)和藥物抗性標(biāo)記)從染色體DNA消 除。在這種情況下，正常ach基因被留在染色體DNA上，并將突變的ach基因從染色體DNA 中消除，或者相反，將突變的ach基因留在染色體DNA上，并將正常的ach基因從染色體DNA 中消除。然后，可以通過使用PCR、Southern雜交等選擇在染色體上只留下突變ach基因的 菌株。
減少乙酰輔酶A水解酶活性也可以通過修飾表達(dá)調(diào)控序列，如啟動(dòng)子、 Shine-Dalgarno(SD)序列、操縱子、終止子或衰減子(attenuator)來實(shí)現(xiàn)。染色體上的表 達(dá)調(diào)控序列可以通過基因分析軟件如Genetix，通過用于表達(dá)分析的載體如啟動(dòng)子搜索載 體(promoter-searching vector)，以及通過已知的信息，如Genbank數(shù)據(jù)庫鑒定。例如，減 少乙酰輔酶A水解酶活性的突變實(shí)例包括，修飾乙酰輔酶A水解酶基因的啟動(dòng)子區(qū)以使其效力減少的突變，和破壞乙酰輔酶A水解酶基因啟動(dòng)子區(qū)共有序列的突變。可以通過使用 不能在宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制的溫度敏感性質(zhì)?；蜃詺⑤d體(suicide vector)來引入這些 突變。
減少乙酰輔酶A水解酶活性也可以通過以下方法完成在染色體上乙酰輔酶A水 解酶基因的編碼區(qū)引入氨基酸取代(錯(cuò)義突變)；引入終止密碼子(無義突變)；通過添 加或缺失一個(gè)或兩個(gè)核苷酸引入移碼突變；或缺失基因的一部分(Journal of Biologial Chemistry 272 :8611-8617(1997))。
減少乙酰輔酶A水解酶活性的實(shí)例還包括如下方法用紫外線照射或用在常規(guī)突 變處理中使用的致突變?cè)?mutagen)如N-甲基-N’-硝基-N-亞硝基胍(NTG)和亞硝酸處 理棒狀桿菌型細(xì)菌，以選擇乙酰輔酶A水解活性減少的菌株(“Amino Acid Fermentation", Center for Academic Publications Japan Co. , Ltd. , 1st ed. Published on May 30, 1986，p.77 至 100)。
同時(shí)，本發(fā)明中優(yōu)選使用被進(jìn)一步修飾以使谷氨酸脫氫酶(以下稱為“GDH”)活性 增強(qiáng)的菌株。
為使具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力、且經(jīng)修飾以減少ACH活性的棒狀桿菌型細(xì)菌中的 GDH活性得到擴(kuò)增，將編碼GDH的基因片段連接到可在棒狀桿菌型細(xì)菌中起作用的載體，優(yōu) 選連接到多拷貝型載體上以制備重組DNA，再用得到的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌。由于轉(zhuǎn)化 體細(xì)胞中編碼GDH的基因拷貝數(shù)增加，GDH活性得到擴(kuò)增。
編碼GDH的基因可以源自棒狀桿菌型細(xì)菌或可源自其他生物體如大腸桿菌。
已經(jīng)鑒定了編碼棒狀桿菌型細(xì)菌的⑶H的基因(gdh基因)的核苷酸序列(例 如，SEQ ID NO 25 =Molecular Microbiology (1992)6 (3),317-3261999, NC_003450 的 2194739. . 2196082的互補(bǔ)鏈)，所以gdh基因可以使用基于所述核苷酸序列設(shè)計(jì)的引物 和棒狀桿菌型細(xì)菌的染色體DNA作為模板通過PCR獲得(PCR 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng);White， Τ. J. et al. ；Trends Genet. 5，185 (1989))。編碼其他微生物的GDH的基因也可以以相同方 式獲得。
<3>使用本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌產(chǎn)生L-氨基酸
可通過在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上所述得到的棒狀桿菌型細(xì)菌以產(chǎn)生所述L-氨基酸， 并導(dǎo)致所述L-氨基酸的積累，和從培養(yǎng)基中收集所述L-氨基酸，從而有效地產(chǎn)生使用丙酮 酸作為中間物產(chǎn)生的L-氨基酸。
為了使用本發(fā)明的棒狀桿菌型細(xì)菌產(chǎn)生這些L-氨基酸，可以通過常規(guī)方法用普 通培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，所述普通培養(yǎng)基含有碳源、氮源、無機(jī)鹽和(如果需要的話，)痕量的有 機(jī)營(yíng)養(yǎng)物，如氨基酸和維生素?？梢允褂煤铣膳囵B(yǎng)基或天然培養(yǎng)基。培養(yǎng)基中使用的碳源 和氮源可以是任何種類的，只要它們能夠被本發(fā)明中菌株所利用。
碳源的實(shí)例包括糖類，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、麥芽糖、甘露糖、半乳糖、淀粉 水解物和糖蜜。此外，有機(jī)酸類如檸檬酸和蘋果酸，和醇類如乙醇，可以單獨(dú)使用或與其他 碳源組合使用。
氮源的實(shí)例包括氨，銨鹽如硫酸銨、碳酸銨、氯化銨、磷酸銨和乙酸銨，以及硝酸Τττ . ο
可以痕量存在的有機(jī)營(yíng)養(yǎng)物的實(shí)例包括氨基酸、維生素、脂肪酸和核酸，并可以使用含有這些營(yíng)養(yǎng)物的蛋白胨(peptone)、酪蛋白氨基酸、酵母提取物和大豆蛋白水解物。在 使用其生長(zhǎng)需要氨基酸等的營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變菌株的情況下，優(yōu)選補(bǔ)充所需的營(yíng)養(yǎng)物。
無機(jī)鹽的實(shí)例包括磷酸鹽、鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽和錳鹽。
在需氧條件下在20到45°C的發(fā)酵溫度、同時(shí)將pH調(diào)整為5到9進(jìn)行培養(yǎng)。如果 培養(yǎng)過程中PH降低，可以在培養(yǎng)基中加入碳酸鈣或堿，如氨氣來中和。大約10到120小時(shí) 的培養(yǎng)導(dǎo)致可觀量的L-氨基酸的積累。
培養(yǎng)完成后，通過公知的回收方法從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸。例如，將細(xì)胞從培 養(yǎng)液中去除后，通過濃縮和結(jié)晶來收集L-氨基酸。實(shí)施例
在下文中，通過下列非限制性實(shí)施例更加具體地解釋本發(fā)明。
實(shí)施例1
<1>構(gòu)建攜帶sacB基因的破壞載體
(A)構(gòu)建 pBS3
使用枯草芽孢桿菌的染色體DNA作為模板，和SEQ ID NOS :1和2的寡核苷酸作為 引物，通過PCR獲得了 sacB基因(SEQ ID NO :19)。使用LA taq(由TaKaRa制造)如下進(jìn) 行PCR 在94°C貯熱(heat retention) 5分鐘的一個(gè)循環(huán)；和94°C變性30秒、49°C退火30 秒和72°C延伸2分鐘的25個(gè)循環(huán)。用常規(guī)方法純化所得PCR產(chǎn)物，然后用BglII和BamHI 消化并平端化。將所述片段插入到已用Avail消化且平端化的pHSG^9中。所得DNA用于 轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109 (由TAKARABIO INC.制造)的感受態(tài)細(xì)胞。然后，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞 涂布到含25 μ g/ml卡那霉素(以下縮寫為"Km")的LB瓊脂培養(yǎng)基上，溫育一夜。此后， 分離單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì) 粒命名為pBS3。圖1顯示了構(gòu)建pBS3的方法。
(B)構(gòu)建 pBS4S
使用不引起氨基酸取代的交換(cr0SS-0Ver)PCR通過核苷酸取代來修飾pBS3上 卡那霉素抗性基因中的SmaI識(shí)別位點(diǎn)，從而使pBS3不被內(nèi)切酶(endnuclease) SmaI切斷。 首先，使用PBS3作為模板和SEQ ID NOS :3和4的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR，以由此獲得 卡那霉素抗性基因的N末端片段。另一方面，為了獲得卡那霉素抗性基因的C末端片段，使 用pBS3作為模板和SEQ ID NOS :5和6的合成DNA作為引物進(jìn)行PCR。使用PyrobestDNA 聚合酶(由TAKARA BIO INC.制造)如下進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)PCR產(chǎn)物在98°C貯熱5分 鐘的一個(gè)循環(huán)；以及98°C變性10秒、57°C退火30秒、72°C延伸1分鐘的25個(gè)循環(huán)。SEQ ID NOS 4和5彼此部分互補(bǔ)，且不包含SmaI識(shí)別位點(diǎn)。然后，為了獲得不含SmaI識(shí)別位 點(diǎn)的突變卡那霉素抗性基因的全長(zhǎng)片段，將上述N末端和C末端基因產(chǎn)物以基本上等摩爾 量混合在一起。使用所述基因產(chǎn)物作為模板和SEQ ID NOS :3和6的合成DNA作為引物進(jìn) 行PCR，以獲得SmaI位點(diǎn)修飾的卡那霉素抗性基因片段。使用Pyrobest DNA聚合酶(由 TAKARA BIO INC.制造)如下進(jìn)行PCR以獲得目標(biāo)PCR產(chǎn)物在98°C貯熱5分鐘的一個(gè)循 環(huán)；以及98°C變性10秒、57°C退火30秒、72°C延伸1. 5分鐘的25個(gè)循環(huán)。
用常規(guī)方法純化PCR產(chǎn)物，然后用BanII消化，然后插入到pBS3的上述BanII識(shí) 別位點(diǎn)中。將所得質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(可由Takara Bio得到)。即，將轉(zhuǎn)化的細(xì)菌細(xì)胞涂布到含有25 μ g/ml卡那霉素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，并溫育一夜。此 后，選擇出現(xiàn)的菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中分離質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入 物的質(zhì)粒命名為PBS4S。圖2顯示了構(gòu)建pBS4S的方法。
(C)構(gòu)建 pBS5T
通過利用BamHI和SmaI消化棒狀桿菌型細(xì)菌中的溫度敏感性復(fù)制起點(diǎn)和平端化， 將其從PHSC4 (JP-A-5-7491)中切除，并插入pBS4S的平端化的NdeI位點(diǎn)。使用所得DNA轉(zhuǎn) 化大腸桿菌JM109的感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有25 μ g/ml Km 的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后培養(yǎng)過夜。然后，分離單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取 質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為pBS5T。圖3顯示了構(gòu)建pBS5T的方 法。
實(shí)施例2
<構(gòu)建Idh-破壞的菌株>
(A)克隆破壞乳酸脫氫酶基因的片段
使用基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032菌株(SEQ ID NO :21 =GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) NC_003450)的乳酸脫氫酶基因(以下縮寫為“l(fā)dh基因”)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的合成DNA 通過交換PCR得到含有源自缺失了 ORF的乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的Idh基因的基因片段。 具體來說，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS :7和8的合 成DNA作為引物通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR，以獲得Idh基因的N末端片段。另一方面，為了獲 得Idh基因的C末端片段，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS :9和10的合成DNA作為引物，通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。SEQ IDNOS :8和9彼此互補(bǔ)，且 被設(shè)計(jì)以導(dǎo)致Idh基因的ORF全部序列的缺失。
然后，為了獲得缺失內(nèi)部序列的Idh基因片段，將Idh的N末端和C末端基因產(chǎn)物 以基本上等摩爾量混合，且使用所述混合物作為模板和SEQ IDNOS 11和12的合成DNA作 為引物，通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。在以常規(guī)方式純化PCR產(chǎn)物之后，用Mil消化PCR產(chǎn)物。 其后，將該P(yáng)CR產(chǎn)物插入上述pBS4S的Mil位點(diǎn)。用所得DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞 (由 TAKARABIO INC.制造)，并涂布到含有 100 μ M IPTG、40 μ g/ml X-Gal 和 25ug/ml Km 的LB瓊脂培養(yǎng)基上，然后過夜培養(yǎng)。其后分離單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì) 粒，并將具有目的PCR產(chǎn)物的插入物的質(zhì)粒命名為ρΔ ldh56-l。圖4顯示了所述質(zhì)粒的構(gòu) 建方法。
(B)制備Idh-破壞的菌株
由于上述(A)中所制備的ρ Δ ldh56_l不含有使其能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌中自主 復(fù)制的區(qū)域，當(dāng)以此質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，通過同源重組將所述質(zhì)粒整合入染色體 的轉(zhuǎn)化體菌株所出現(xiàn)的頻率極低。因此，使用含有高濃度P Δ ldh56-l質(zhì)粒的溶液通過電脈 沖法轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌2256菌株，然后涂布到含有25 μ g/ml卡那霉素的CM-Dex瓊脂培養(yǎng) 基(5g/L 葡萄糖、10g/L 聚胨、10g/L 酵母提取物、lg/L KH2PO4、0. 4g/L MgSO4 ·7Η20、0· 01g/L FeSO4 · 7Η20、0· Olg/L MnSO4 · 7H20、3g/L 尿素和 1. 2g/L 大豆水解物，禾口 pH 7. 5 (KOH))上， 在31. 5°C培養(yǎng)約30小時(shí)。出現(xiàn)在此培養(yǎng)基上的菌落是這樣的菌株，其中在質(zhì)粒的Idh基因 片段和乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體上的Idh基因之間發(fā)生了同源重組，并將卡那霉 素抗性基因和源自質(zhì)粒的McB基因插入該染色體。17
然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中，于31. 5°C將這些第一次重組體 (first recombinant)培養(yǎng)一夜。在適當(dāng)?shù)南♂尯?，將重組體涂布到含蔗糖10%的Dex-SlO 瓊脂培養(yǎng)基(10g/L 蔗糖、10g/L 聚胨、10g/L 酵母提取物、lg/L KH2PO4、0. 4g/L MgSO4 ·7Η20、 0. 01g/L FeSO4 · 7Η20、0· 01g/LMnS04 · 4H20、3g/L 尿素、1. 2g/L 大豆水解物和 10 μ g/L 生物 素，和pH 7. 5 (KOH))上并在31. 5°C培養(yǎng)約30小時(shí)。結(jié)果，獲得約50個(gè)菌株，其中通過二次 重組消除sacB基因，且成為蔗糖非敏感性的。
由此獲得的菌株包括染色體Idh基因被源自ρ Δ ldh56-l的突變型取代的菌株，以 及保留了染色體野生型Idh基因的菌株。通過將在Dex-SlO瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的細(xì)胞 進(jìn)行直接PCR(direct PCR)，容易地檢查Idh基因是突變型還是野生型。使用PCR擴(kuò)增的引 物(SEQ ID NOS 7和10)分析Idh基因，選擇其PCR產(chǎn)物小于野生型Idh基因的菌株作為 Idh破壞的菌株，并被命名為2256 Δ (Idh)菌株，所述野生型Idh基因是使用野生型2256菌 株的染色體DNA作為模板擴(kuò)增的。所得菌株被用作親本菌株用于制備下述ach基因破壞的 菌株。
當(dāng)發(fā)酵在厭氧條件下進(jìn)行時(shí)，積累相當(dāng)大量的乳酸作為副產(chǎn)品，所以乳酸脫氫酶 活性缺乏是優(yōu)選的(JP 11-206385 J Mol Microbio Biotechnol. 2004 ；7 (4) :182-96.) 然而，L-谷氨酸通常在乳酸脫氫酶不起作用的有氧條件下產(chǎn)生，并且無需在乙酰輔酶A水 解酶基因破壞的菌株中破壞Idh基因而用于產(chǎn)生L-谷氨酸。
實(shí)施例3
<構(gòu)建乙酰輔酶A水解酶破壞的菌株>
(A)克隆用于破壞乙酰輔酶A水解酶基因的片段
使用基于谷氨酸棒桿菌ATCC13032(SEQ ID NO :23 =GenBank數(shù)據(jù)庫登錄號(hào) NC_003450)乙酰輔酶A水解酶基因(以下該基因縮寫為“ach”)的核苷酸序列設(shè)計(jì)的合成 DNA，通過交換PCR獲得含有ach基因的基因片段，所述ach基因源自缺失ORF的乳發(fā)酵短 桿菌2256菌株。具體來說，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS 13和14的合成DNA作為引物通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR，以獲得ach基因的C末端片段。 另一方面，為了獲得N末端片段，使用乳發(fā)酵短桿菌2256菌株的染色體DNA作為模板和SEQ ID NOS 15和16的合成DNA作為引物通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。SEQID NOS 14和15彼此部 分互補(bǔ)。利用KOD-pIus (由Τ0Υ0Β0 Co.，LTD.制造)進(jìn)行PCR反應(yīng)。在進(jìn)行了 94°C貯熱2 分鐘的一個(gè)循環(huán)之后，將如下步驟重復(fù)30個(gè)循環(huán)在94°C變性10秒、55°C退火30秒、68°C 延伸50秒。然后，為了獲得缺失內(nèi)部序列的ach基因片段，將ach基因的N末端片段和C末 端片段以基本上等摩爾量混合在一起。使用所述混合產(chǎn)物作為模板和SEQ ID N0S:17和18 的合成DNA作為引物通過常規(guī)方法進(jìn)行PCR。用K0D-plus(由Τ0Υ0Β0 Co.，LTD.制造)進(jìn) 行PCR反應(yīng)。進(jìn)行了在94°C保持(retention) 2分鐘的一個(gè)循環(huán)之后，將如下步驟重復(fù)30 個(gè)循環(huán)94°C變性10秒、55°C退火30秒、68°C延伸90秒。在通過常規(guī)方式純化擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物之后，用)(bal消化PCR產(chǎn)物，并將其插入到上述實(shí)施例1⑶中所構(gòu)建的PBS4S的)(baI 位點(diǎn)中。用所得DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM 109的感受態(tài)細(xì)胞(由TAKARA BIO INC.制造)，并 涂布到含有100 μ M IPTG,40y g/ml X-Gal和25 μ g/ml Km的LB瓊脂培養(yǎng)基中，然后培養(yǎng) 一夜。此后，分離白色單菌落作為轉(zhuǎn)化體。從所得轉(zhuǎn)化體中提取質(zhì)粒，并將具有目的PCR產(chǎn) 物的插入物的質(zhì)粒命名為PBS4S: Aach0圖5顯示了構(gòu)建pBS4S: Aach的方法。
(B)制備ach破壞的菌株
由于上述(A)中所制備的pBS4S: Aach不含使其能夠在棒狀桿菌型細(xì)菌的細(xì)胞 中自主復(fù)制的區(qū)域，當(dāng)以該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棒狀桿菌型細(xì)菌時(shí)，通過同源重組將所述質(zhì)粒并入其 染色體的菌株作為轉(zhuǎn)化體出現(xiàn)的頻率極低。因此，使用含有高濃度？8345::八&(^質(zhì)粒的溶 液通過電脈沖法轉(zhuǎn)化乳發(fā)酵短桿菌2256 Δ (Idh)菌株，并涂布到含有25 μ g/ml卡那霉素的 CM-Dex瓊脂培養(yǎng)基上，在31. 5°C培養(yǎng)約30小時(shí)。出現(xiàn)在此培養(yǎng)基上的菌株是這樣的菌株， 其中在質(zhì)粒的缺失型(deletion-type) ach基因片段和乳發(fā)酵短桿菌2256 Δ (Idh)菌株的 染色體上的ach基因之間發(fā)生了同源重組，并將卡那霉素抗性基因和源自質(zhì)粒的McB基因 插入染色體中。
然后，在不含卡那霉素的CM-Dex液體培養(yǎng)基中，于31. 5°C將這些第一次重組體 培養(yǎng)一夜。在適當(dāng)?shù)南♂尯螅瑢⒅亟M體涂布到含蔗糖10%的Dex-SlO瓊脂培養(yǎng)基上，并在 31. 5°C培養(yǎng)約30小時(shí)。結(jié)果，獲得約50個(gè)菌株，其中通過二次重組從染色體消除sacB基 因，且成為蔗糖非敏感性的。
由此獲得的菌株包括染色體ach基因被源自pBS4S: Δ ach的突變型取代的菌株， 以及保留了染色體野生型ach基因的菌株。通過將在Dex-SlO瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)獲得的細(xì) 胞進(jìn)行直接PCR，容易地確定ach基因是突變型還是野生型。使用引物(SEQ ID N0S:13和 16)分析ach基因后，對(duì)于野生型ach基因擴(kuò)增2. 9kb的DNA片段和對(duì)于突變型ach基因擴(kuò) 增1. 4kb的DNA片段。作為通過上述方法分析蔗糖非敏感性菌株的結(jié)果，選擇出只含有突 變型ach基因的菌株，并將從2256 Δ (Idh)獲得的ach破壞的菌株命名為2256 Δ (ldh,ach) 菌株。
實(shí)施例4
<利用ach破壞的菌株產(chǎn)生L-谷氨酸>
(1)評(píng)價(jià)ach破壞的菌株的產(chǎn)生L-谷氨酸的能力
如下在S型釜(S-type jar)中培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌2256 Δ (Idh)菌株和 2256 Δ (ldh,ach)菌株用于產(chǎn)生L-谷氨酸。將各一環(huán)(loop)在CMDex瓊脂平板上培養(yǎng)的 2256 Δ (Idh)菌株和2256 Δ (ldh,ach)菌株接種到300ml的種子培養(yǎng)基(seed medium)(每 IL 純化水(purified water)中 60g 葡萄糖、1. 54g H3PO4U. 45g Κ0Η、0· 9g MgSO4 · 7H20、 0. Olg FeSO4 · 7Η20、670μ g VBl · HCl、40y g 生物素、1. 54g 大豆水解物、0. 28g DL-甲硫氨 酸和0. Iml AZ-20R(用氨水調(diào)節(jié)至pH 7. 2))，以Ι/lvvm通氣培養(yǎng)直到殘?zhí)潜煌耆?，?時(shí)控制PH為7. 2 (NH3),溫度為31. 5°C，且PL > 0。
將30ml培養(yǎng)液接種到270ml主培養(yǎng)基(main culture medium)(每IL純化水中 80g 葡萄糖、3. 46g KH2PO4Ug MgSO4 ·7Η20、0· Olg FeSO4 ·7Η20、0· Olg MnSO4 ·4_5Η20、230 μ g VBl ·Ηα、0. 35g大豆水解物、和0. anl AZ-20R(用氨調(diào)節(jié)至pH 7.3))中，在1/lvvm通氣條 件下培養(yǎng)，同時(shí)控制溫度為31. 5°C，pH為7. 3，且PL > 0。在殘?zhí)潜煌耆闹?，加?0 至80ml料液(feedsolution)，培養(yǎng)液由每IL純化水500g葡萄糖和0. 2ml AZ-20R組成，并 繼續(xù)培養(yǎng)到殘?zhí)峭耆幌摹?br> 結(jié)束培養(yǎng)之后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯螅贐iotech Analyzer AS210(由 Asahi Kasei Corporation制造)中分析培養(yǎng)液中所積累的L-谷氨酸(Glu)的量。表1 顯示了結(jié)果。
表1通過ach缺陷型菌株產(chǎn)生L-谷氨酸
菌林OD620nm糖類消耗GluGlu產(chǎn)率a-KG(χ 101)(g)(g/L)(%)(g/L)2256Δ(勵(lì))0.72060.187.851.82.662256NJdh’ ach)0.62963.693.653.98.45
與2256 Δ (Idh)菌株(親本菌株)相比，2256 Δ (ldh，ach)菌株在產(chǎn)率上顯示約 2%的改進(jìn)。此外，作為L(zhǎng)-谷氨酸前體的α-酮戊二酸(Ci-KG)的積累量改進(jìn)了約三倍。此 結(jié)果顯示，減少或消除ACH活性在L-谷氨酸的產(chǎn)生中是有效的。
實(shí)施例5
<通過ach缺陷型菌株產(chǎn)生L-丙氨酸和L-纈氨酸>
(1)評(píng)價(jià)ach缺陷型菌株的培養(yǎng)
如下在S型釜中培養(yǎng)乳發(fā)酵短桿菌2256 Δ (Idh)菌株和2256 Δ (ldh, ach)菌株用 于產(chǎn)生L-丙氨酸和L-纈氨酸。將各一環(huán)在CMDex瓊脂平板上培養(yǎng)的2256 Δ (ldh)菌株和 2256 Δ (ldh, ach)菌株，接種到300ml種子培養(yǎng)基(每IL純化水60g葡萄糖、1. 54g H3PO4, 1. 45g K0H、0.9g MgSO4 ·7Η20、0· OlgFeSO4 ·7Η20、670 μ g VBl · HC1、40 μ g 生物素、1. 54g 大 豆水解物、0. 28g DL-甲硫氨酸和0. Iml AZ_20R(用氨水調(diào)節(jié)至pH 7.2))中，并以1/lvvm 通氣培養(yǎng)直到殘?zhí)峭耆?，同時(shí)用氨控制PH為7. 2，溫度為31. 5°C，且PL > 0。
將30ml培養(yǎng)液接種到270ml主培養(yǎng)基(每IL純化水80g葡萄糖、3. 46g KH2PO4, Ig MgSO4 · 7Η20、0· Olg FeSO4 · 7Η20、0· Olg MnSO4 · 4_5Η20、230 μ g VBl · HC1、0. 35g 大豆水 解物和O.aiil AZ-20R(用氨調(diào)節(jié)至pH 7.3))中，并在1/lvvm通氣條件下培養(yǎng)，同時(shí)控制溫 度為31. 5°C，pH為7. 3，且PL > 0。在殘?zhí)潜煌耆闹?，加?0至80ml料液，所述料 液由每IL純化水500g葡萄糖和0. 2ml AZ-20R組成，并繼續(xù)培養(yǎng)直到殘?zhí)潜煌耆摹?br> 完全培養(yǎng)之后，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯?，用Amino Acid AnalyZerL8500 (由 Hitachi, Ltd.制造)分析培養(yǎng)液中所積累的L-丙氨酸(Ala)和L-纈氨酸(Val)的量。表 2顯示了結(jié)果。
表2 通過ach缺陷型菌株產(chǎn)生Ala和Vla
菌林OD620nmAla (g/L)Via (g/L)(χ 101)2256Δ(腦)0.7201.1490.0522256A(ldh, ach)0.6292.5330.214
2256 Δ (ldh, ach)顯示L-丙氨酸積累量的約2. 2倍的改進(jìn)，和L-纈氨酸積累量 的約四倍的改進(jìn)。此結(jié)果顯示，減少或消除ACH活性在L-纈氨酸和L-丙氨酸的產(chǎn)生中是 有效的。
工業(yè)適用性
根據(jù)本發(fā)明，改進(jìn)了 L-氨基酸的發(fā)酵產(chǎn)量(fermentation yield)，所述L-氨基酸 是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的。
權(quán)利要求
1.具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力的谷氨酸棒桿菌，其中所述谷氨酸棒桿菌被修飾使得乙 酰輔酶A水解酶活性減少，并且其中所述L-氨基酸是通過使用丙酮酸作為中間物的生物合 成途徑產(chǎn)生的一種或多種L-氨基酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的谷氨酸棒桿菌，其中通過將突變引入染色體乙酰輔酶A水解酶基 因的編碼區(qū)或表達(dá)調(diào)控區(qū)來減少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的谷氨酸棒桿菌，其中通過破壞染色體乙酰輔酶A水解酶基因來減 少所述乙酰輔酶A水解酶活性。
4.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的谷氨酸棒桿菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶選自下組(A)包含SEQID NO 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)；和(B)包含SEQID NO : 所示氨基酸序列的蛋白質(zhì)，其中在所述蛋白質(zhì)中取代、缺失、插 入、或添加了一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，并且其中所述蛋白質(zhì)具有乙酰輔酶A水解酶的活性。
5.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的谷氨酸棒桿菌，其中所述乙酰輔酶A水解酶基因選 自下組(a)包含SEQID NO 23的核苷酸1037至2542的基因；和(b)DNA，其能夠在包括在0.1XSSC、0. 1% SDS在60°C洗滌的嚴(yán)緊條件下，與包含SEQ ID NO 23的核苷酸1037至2542的多核苷酸雜交，并編碼具有乙酰輔酶A水解酶活性的蛋 白質(zhì)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的谷氨酸棒桿菌，其中所述谷氨酸棒桿菌被進(jìn)一步修 飾以提高谷氨酸脫氫酶活性。
7.根據(jù)權(quán)利要求1至3中任一項(xiàng)的谷氨酸棒桿菌，其中所述L-氨基酸是一種或多種選 自下組的L-氨基酸L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸和L-纈氨 酸。
8.產(chǎn)生L-氨基酸的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1至7中任一項(xiàng)的谷氨酸棒桿菌；和從培養(yǎng)基中收集L-氨基酸，且其中所述L-氨基酸是一種或多種經(jīng)由丙酮酸為中間物 產(chǎn)生的L-氨基酸。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的方法，其中所述L-氨基酸是一種或多種選自下組的氨基酸L-谷 氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及產(chǎn)生L-氨基酸的細(xì)菌和產(chǎn)生L-氨基酸的方法，更具體地，本發(fā)明描述了具有產(chǎn)生L-氨基酸的能力且被修飾使得乙酰輔酶A水解酶活性減少的棒狀桿菌型細(xì)菌。該細(xì)菌被用于產(chǎn)生通過使用丙酮酸作為中間物的生物合成途徑產(chǎn)生的L-氨基酸，如L-谷氨酸、L-精氨酸、L-谷氨酰胺、L-脯氨酸、L-丙氨酸、L-纈氨酸和L-賴氨酸。
文檔編號(hào)C12P13/06GK102031238SQ201010505090
公開日2011年4月27日 申請(qǐng)日期2005年11月25日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月25日
發(fā)明者中村純, 児島宏之, 福井啟太 申請(qǐng)人:味之素株式會(huì)社