專利名稱：一種用外源質(zhì)粒消除革蘭氏陰性菌代謝質(zhì)粒的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物遺傳學(xué)相關(guān)領(lǐng)域，更具體是涉及一種用外源質(zhì)粒消除革蘭氏陰 性菌代謝質(zhì)粒的方法，它適用于革蘭氏陰性菌代謝質(zhì)粒的消除。
背景技術(shù)：
質(zhì)粒是染色體外具有獨(dú)立復(fù)制能力的對細(xì)菌生存非必需的小型共價(jià)閉合環(huán)狀雙 鏈DNA分子。自然存在的質(zhì)粒大小從Ikb到IOOOkb不等，在單個(gè)細(xì)胞中的拷貝數(shù)從一個(gè)到 幾百個(gè)不等。質(zhì)?？截悢?shù)在恒定的條件下是質(zhì)粒的固有屬性，是由質(zhì)粒編碼的決定起始復(fù) 制頻率的蛋白質(zhì)控制的。根據(jù)質(zhì)粒所編碼的功能和賦予宿主的表型效應(yīng)，可將其分為各種 不同的類型
1.致育因子(Fertility factor, F 因子)
又稱F質(zhì)粒，其大小約lOOkb，這是最早發(fā)現(xiàn)的一種與大腸桿菌的有性生殖現(xiàn)象(接合 作用)有關(guān)的質(zhì)粒。攜帶F質(zhì)粒的菌株稱為F+菌株(相當(dāng)于雄性)，無F質(zhì)粒的菌株稱為F — 菌株(相當(dāng)于雌性)。F質(zhì)粒在大腸桿菌的接合作用中起主要作用。2.抗性因子(Resistance factor, R 因子)
這是另一類普遍而重要的質(zhì)粒，主要包括抗藥性和抗金屬兩大類，簡稱R質(zhì)粒。3. Col 質(zhì)粒
因這類質(zhì)粒首先發(fā)現(xiàn)與大腸桿菌中而得名，該質(zhì)粒含有編碼大腸菌素的基因，大腸菌 素是一種細(xì)菌蛋白，只殺死近緣且不含Col質(zhì)粒的菌株，而宿主不受其產(chǎn)生的細(xì)菌素的影 響。4. _個(gè)生Mf立(Virulence plasmid)
越來越多的證據(jù)表明，許多致病菌的致病性是由其所攜帶的質(zhì)粒引起的，這些質(zhì)粒具 有編碼毒素的基因，例如產(chǎn)毒素大腸桿菌是引起人類和動(dòng)物腹瀉的主要病原菌之一，其中 許多菌株含有為一種或多種腸毒素編碼的質(zhì)粒。5.代謝質(zhì)粒(Metabolic plasmid)
這類質(zhì)粒上攜帶有能降解某些基質(zhì)的酶的基因，含有這類質(zhì)粒的細(xì)菌，特別是假單胞 菌，能將復(fù)雜的化合物降解成能被其作為碳源和能源利用的簡單形式。尤其是對一些有毒 化合物，如芳香族化合物，農(nóng)藥的降解，在環(huán)境保護(hù)方面具有重要的意義。6.隱秘質(zhì)粒(Cryptic plasmid)
以上所討論的質(zhì)粒類型均具有某種可檢測的遺傳表型，但隱秘質(zhì)粒不顯示任何表型 效應(yīng)，它們的存在只有通過物理的方法，例如用凝膠電泳檢測細(xì)胞抽提液等方法才能發(fā)現(xiàn)。 它們存在的生物學(xué)意義，目前幾乎不了解。研究帶有質(zhì)粒的菌株時(shí)，人們總是希望得到相應(yīng)的質(zhì)粒消除菌。質(zhì)粒消除常指細(xì) 菌攜帶的質(zhì)粒從宿主中消除，其所編碼的性狀同時(shí)消失的現(xiàn)象。完全消除質(zhì)粒的細(xì)菌與質(zhì) 粒存在的原始菌株比較，可以觀察研究質(zhì)粒的遺傳學(xué)功能，完全消除質(zhì)粒的細(xì)菌還可以作 為基因工程菌，廣泛用于分子生物學(xué)研究。有的質(zhì)粒可以自發(fā)的以很高的頻率消除，但絕大部分質(zhì)粒都是非常穩(wěn)定的，需要采用某些質(zhì)粒消除劑或改變培養(yǎng)條件來提高質(zhì)粒消除率。消除質(zhì)粒的方法有化學(xué)處理法、物理處理法和高溫處理法。經(jīng)處理后質(zhì)粒復(fù)制或 分配受到抑制使子代細(xì)菌中的質(zhì)粒消除。常用的化學(xué)消除劑如丫啶橙、溴化乙啶、十二烷 基硫酸鈉SDS等，高溫處理法常用37°C、43°C兩種溫度進(jìn)行交替?zhèn)鞔Ｔ趯?shí)際應(yīng)用中，往 往根據(jù)前人的經(jīng)驗(yàn)選擇消除方法。菌體的特征、所含質(zhì)粒分子量大小、消除劑濃度、作用 時(shí)間和溫度都與消除率有關(guān)。嵌合染料(如丫啶橙、溴化乙啶等)適用于消除大腸桿菌中 的質(zhì)粒，十二烷基硫酸鈉對具有纖毛的細(xì)菌作用效果較好，胸腺嘧啶限量法僅適用于其營 養(yǎng)缺陷型菌株的質(zhì)粒消除。采用絲裂霉素(mitorcin，mitomycin C, MMC)消除假單胞菌 iPseudomonas)及相近屬菌株的質(zhì)粒是一個(gè)比較有效的方法。絲裂霉素的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有乙 撐亞胺及氨甲酰酯基團(tuán)，具有烷化作用，能與DNA雙鏈交叉聯(lián)結(jié)，抑制DNA復(fù)制，也能使部 分 DNA 斷裂。Prakash 等通過 mitomycin CPseudomonas cepacia strain RKJ200 一 個(gè)50kb質(zhì)粒，效率為3%，然后通過生長實(shí)驗(yàn)和色譜分析，證明質(zhì)粒消除菌的細(xì)胞破碎液對 對硝基酚降解生化途徑中的中間產(chǎn)物都沒有活性，細(xì)胞也不能以此幾個(gè)中間產(chǎn)物為底物生 長。通過將質(zhì)粒結(jié)合轉(zhuǎn)移到假單胞菌PaW340 (.P. putida PaW340)后受體菌獲得了同供體 菌一樣的降解特性。從而證明整個(gè)對硝基酚的降解途徑編碼在質(zhì)粒上。在許多能夠降解異 源物質(zhì)微生物中，編碼代謝途徑的基因簇定位在質(zhì)粒上，通過質(zhì)粒消除實(shí)驗(yàn)定位代謝基因， 有利于研究降解基因的整個(gè)操縱子的組成，功能，進(jìn)化和代謝途徑的調(diào)控。質(zhì)粒的不相容性是指在無選擇壓力的條件下，親緣關(guān)系密切的不同質(zhì)?；蛲徊?相容群的質(zhì)粒不能穩(wěn)定共存于同一宿主細(xì)胞，在細(xì)胞增殖過程中將有一種被排斥的現(xiàn)象。 質(zhì)粒不相容性最初是在20世紀(jì)60年代研究F質(zhì)粒時(shí)被描述到的，在70年代由Datta和 Hedges正式提出質(zhì)粒的不相容性的定義。質(zhì)粒的不相容性有可能是相稱的(symmetric)， 指的是兩個(gè)質(zhì)粒都相等的丟失概率，也可能是矢量的(vectorial)，是指一個(gè)質(zhì)粒有更高的 或者必然的丟失頻率。目前，主要有30組大腸桿菌中的不相容組和7組葡萄球菌中的不相 容組被分類。名為《DNA Insertion elements, Plasmid, and Episomes》的書中詳細(xì)列 出了質(zhì)粒根據(jù)不相容組的分類表。目前已有多個(gè)代謝質(zhì)粒的全基因組序列測定完成(如表 1-1)，發(fā)現(xiàn)代謝質(zhì)粒多屬于IncP不相容組。這些代謝質(zhì)粒的大小在50-500kb左右，而且多 為低拷貝。代謝質(zhì)粒往往是廣宿主的，即能夠在多種微生物中存在。這也是它在污染物的 生物降解中越來越受到重視的原因。表1-1降解質(zhì)粒IncP不相容組中的完全測序的質(zhì)粒
Tablel-I Characteristics of IncP catabolic plasmids with complete sequence determinedo
權(quán)利要求
一種用外源質(zhì)粒消除革蘭氏陰性菌代謝質(zhì)粒的方法，其步驟是A 制備電轉(zhuǎn)法感受態(tài)細(xì)胞 (1)從LB平板中挑取含代謝質(zhì)粒的革蘭氏陰性菌，例如潘多拉菌MCB032菌株(Pandoraea sp. MCB032)單菌落，接種到含有5 ml LB中30℃振蕩培養(yǎng)15 17 h； (2)次日，以1% vol/vol 的接種量轉(zhuǎn)接到50 ml LB中，于28 32℃劇烈振蕩培養(yǎng)2 3 h至600nm波長處的吸光值OD600達(dá)0.4 0.6； (3)在無菌條件下，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到無菌、用冰預(yù)冷的離心管中，在冰上放置10 min；(4)于4℃以3500×g離心10min，以回收細(xì)胞，倒出培養(yǎng)液，將管倒置以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡；(5)用10 ml預(yù)冷的Milli Q水重懸每份細(xì)胞沉淀，冰浴30 min；(6)于4℃以3500×g離心10 min，以回收細(xì)胞，倒出液體，將管倒置以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡；(7)用10ml 10%vol/vol甘油/水重懸每份細(xì)胞沉淀，放置于冰浴上30 min；(8)于4℃以3500×g離心10 min，以回收細(xì)胞，倒出液體，將管倒置以使最后的痕量培養(yǎng)液流盡；(9)重復(fù)步驟7、步驟8各一次；(10)用2 ml冰預(yù)冷的10%vol/vol甘油/水重懸每份細(xì)胞沉淀，用新鮮制備的感受態(tài)細(xì)胞直接做轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞凍存于10％ vol/vol甘油/水中 80℃?zhèn)溆?；B、 轉(zhuǎn)化(a)，分別將2μl 外源質(zhì)粒pRK415 或pVLT31 ，DNA濃度10ng 50 ng /μl加入50μl感受態(tài)細(xì)胞，混勻后轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中，電轉(zhuǎn)儀的參數(shù)設(shè)置為2.5 KV，電脈沖一次；(b)每管加1 ml LB培養(yǎng)基，然后將管轉(zhuǎn)移到搖床上，溫育1h；(c)將體積50 200l已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移到含相應(yīng)抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上；(d)將平板置于室溫直至液體被吸收；(e)倒置平板，于30℃培養(yǎng)，2天后出現(xiàn)菌落，挑選單菌落，提取質(zhì)粒，凝膠電泳檢測質(zhì)粒； 所述的革蘭氏陰性菌包括假單胞菌屬、伯克霍爾德菌屬或潘多拉菌屬；所述的外源質(zhì)粒包括屬IncP 1不相容組的革蘭氏陰性菌廣泛宿主質(zhì)?；?qū)買ncP 4不相容組的革蘭氏陰性菌廣泛宿主質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用外源質(zhì)粒消除革蘭氏陰性菌代謝質(zhì)粒的方法，步驟是A、制備電轉(zhuǎn)法感受態(tài)細(xì)胞(1)挑取單菌落，接種到LB中振蕩培養(yǎng)；(2)接種量轉(zhuǎn)接到LB中培養(yǎng)；(3)在無菌條件下，將細(xì)菌轉(zhuǎn)移到無菌、放置；(4)離心，回收細(xì)胞；(5)用預(yù)冷的水重懸細(xì)胞沉淀，冰?。?6)離心，回收細(xì)胞；(7)用甘油重懸細(xì)胞沉淀，放置冰浴上；(8)離心，回收細(xì)胞；(9)將細(xì)胞凍存于甘油中備用；B、轉(zhuǎn)化(a)，將外源質(zhì)粒加入感受態(tài)細(xì)胞，轉(zhuǎn)移到電轉(zhuǎn)杯中；(b)將管轉(zhuǎn)移到搖床上，溫育；(c)將感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)移含抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上；(d)將平板置于室溫；(e)倒置平板，提取質(zhì)粒，凝膠電泳檢測質(zhì)粒。方法簡單，快速，效率高，準(zhǔn)確性高。
文檔編號C12N15/63GK101974551SQ20101050244
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2010年10月11日
發(fā)明者劉虹, 周寧一, 孟芳會(huì), 王淑君 申請人:中國科學(xué)院武漢病毒研究所