專利名稱：：活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明提供無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌。特別地，本發(fā)明提供在外膜內(nèi)實(shí)質(zhì)上缺乏脂多糖(LPS，內(nèi)毒素)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌"co7/))。本發(fā)明進(jìn)一步提供活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)生方法及其用途。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及研究和開發(fā)治療劑的纟且合物和方法。
背景技術(shù)：
：脂多糖(LPS,內(nèi)毒素)是革蘭氏陰性細(xì)菌的主要抗原。LPS是由抗原性、大小可變的、共價(jià)連接到脂質(zhì)A上的糖鏈組成的糖磷脂，保守的疏水區(qū)結(jié)構(gòu)上定義為N,O-酰基0-l，6-D-葡糖胺I,4'-二磷酸。LPS的毒性由脂質(zhì)A通過與哺乳動(dòng)物免疫系統(tǒng)的B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞相互作用來表達(dá)，該過程導(dǎo)致促炎性細(xì)胞因子的分泌，主要是TNF，它對(duì)于宿主可具有致命后果。脂質(zhì)A還"在體外，，活化人T淋巴細(xì)胞(Th-l)以及"在體內(nèi)"活化鼠CD4+和CD8+T細(xì)胞，這一特性讓宿主的免疫系統(tǒng)對(duì)LPS的大小可變糖鏈產(chǎn)生特異性的回憶型IgG抗體應(yīng)答。在這些基礎(chǔ)上，近來已經(jīng)將LPS認(rèn)作"體內(nèi)，，T細(xì)胞依賴型抗原。為了完全表達(dá)毒性，LPS必須通過若干單位的糖磷脂單體的關(guān)聯(lián)形成脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)來保持它的超分子結(jié)構(gòu)。該分子的這種構(gòu)象重排也是完全表達(dá)免疫原特性的基礎(chǔ)。膿毒癥和膿毒性休克是由細(xì)菌和由LPS引發(fā)的定義明確的臨床狀況，所述LPS是由導(dǎo)致上述病理的細(xì)菌制造的內(nèi)毒素。膿毒癥和膿毒性休克的臨床體征根據(jù)存在內(nèi)毒素的量以及病程經(jīng)歷時(shí)間而有所不同。感染的最早期臨床體征可以是發(fā)熱，輕度抑郁，和缺乏食欲。病程進(jìn)一步發(fā)展，患者將會(huì)呈現(xiàn)更加明顯的休克體征，包括心率提高，脈壓弱，脫水，齒齦變暗，腳耳發(fā)冷，低于正常體溫，呼吸速率加快，或腹瀉。一旦患者呈現(xiàn)內(nèi)毒素休克體征，應(yīng)當(dāng)認(rèn)為是緊急情況并應(yīng)當(dāng)立即聯(lián)系醫(yī)生。盡管正確使用了抗生素和其它治療措施，但由內(nèi)毒素相關(guān)的病癥帶來的死亡率仍然是顯著的問題。細(xì)菌的抗生素抗性，潛在疾病過程的嚴(yán)重性，支持性治療施用不足部分導(dǎo)致了常規(guī)治療的失敗。需要加深了解引發(fā)內(nèi)毒素相關(guān)病癥的革蘭氏陰性細(xì)菌。此外，還需要改進(jìn)對(duì)于內(nèi)毒素相關(guān)病癥的治療。發(fā)明概述本發(fā)明提供無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌。特別地，本發(fā)明提供在外膜內(nèi)實(shí)質(zhì)上缺乏脂多糖(LPS,內(nèi)毒素)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)。本發(fā)明進(jìn)一步提供活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)生方法及其用途。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及研究和開發(fā)治療劑的組合物和方法。本發(fā)明的實(shí)施方案提供釆用缺失LPS的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)的廣泛的方法和組合物。以下在發(fā)明概述、發(fā)明詳述和下面的實(shí)施例部分中描述了示例性實(shí)施方案。本發(fā)明并不限于這些示例性實(shí)施方案。所述缺失LPS的革蘭氏陰性細(xì)菌可以通過任何機(jī)制生成。本文描述了生成這種細(xì)菌的多種不同機(jī)制。例如，在一些實(shí)施方案中，將涉及KD0合成的基因進(jìn)行突變(例如，減少或消除功能性蛋白質(zhì)的表達(dá))。在一些實(shí)施方案中，將涉及KD0與脂質(zhì)IV,的關(guān)聯(lián)的基因進(jìn)行突變。在一些實(shí)施方案中，將涉及脂質(zhì)IV,合成的基因進(jìn)行突變。在一些實(shí)施方案中，將涉及LPS生產(chǎn)或呈現(xiàn)的其它基因進(jìn)行突變。本發(fā)明并不限于基因突變。在一些實(shí)施方案中，利用RNA干擾或其它技術(shù)改變表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過提供抑制劑(例如，合成的或天然的竟?fàn)幮曰蚍蔷範(fàn)幮耘潴w，抗體等)來改變蛋白質(zhì)功能。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)為影響LPS狀態(tài)所做的改變，對(duì)經(jīng)修飾的細(xì)菌進(jìn)一步提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其它修飾，或?qū)τ诰S持健康、生長(zhǎng)等有用的其它組分。本發(fā)明的實(shí)施方案并不限于這些機(jī)制，除非另外指定。本發(fā)明證明缺失LPS的細(xì)菌是可以存活的，可以通過多種途徑來制備，并且發(fā)現(xiàn)了在多種情形下的用途。LPS層對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜的形式和功能都是必需的。除了是革蘭氏陰性菌致病機(jī)理的主要介質(zhì)之外，至少由KD0廣脂質(zhì)A[2-酮3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)]組成的LPS(內(nèi)毒素)結(jié)構(gòu)長(zhǎng)期以來被認(rèn)為是大腸桿菌持續(xù)生長(zhǎng)所必需的最小結(jié)構(gòu)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供缺失KDO的活的革蘭氏陰性細(xì)菌菌林，盡管其特別制造了無內(nèi)毒素活性的LPS前體脂質(zhì)IVA，一種已知的人體內(nèi)LPS-誘導(dǎo)的膿毒癥的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供缺失D-阿拉伯糖5-磷酸異構(gòu)酶(API)表達(dá)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌包含突變，從而使得菌林實(shí)質(zhì)上不含KDO。在一些實(shí)施方案中，所述突變包括在一種或多種涉及KD0合成或修飾的基因中的一種或多種突變。在一些實(shí)施方案中，所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌包含這樣的突變，其中所述突變?cè)贚PS生物合成途徑中阻止KD02和脂質(zhì)IVA之間的關(guān)聯(lián)，從而使脂質(zhì)IVA單獨(dú)轉(zhuǎn)運(yùn)到外膜。在一些實(shí)施方案中，KDO合成基因中的一種或多種突變，或LPS生物合成途徑中的一種或多種突變，包括但不限于，在基因gutQ，kdsD(yrbH),kdsA,kdsB,waaA，msbA和yhjD，或任何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因中的突變。在一些實(shí)施方案中，所述菌林缺乏或?qū)嵸|(zhì)上缺乏KDO蛋白質(zhì)的合成。在一些實(shí)施方案中，活的革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜表達(dá)脂質(zhì)IVa。在一些實(shí)施方案中，所述革蘭氏陰性細(xì)菌是大腸桿菌。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供生產(chǎn)脂質(zhì)IVa的方法，包括從活的革蘭氏陰性細(xì)菌中提取脂質(zhì)IVa。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供治療內(nèi)毒素相關(guān)病癥的方法，包括向患有內(nèi)毒素相關(guān)病癥的受試者施用包含分離自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂質(zhì)IVa的組合物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供外膜疫苗或其它組合物用來誘導(dǎo)針對(duì)革蘭氏陰性細(xì)菌的免疫應(yīng)答，所述組合物包含本發(fā)明的活的革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜。這種組合物可以用來在研究、藥物篩選和治療情境中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含分離自革蘭氏陰性細(xì)菌的脂質(zhì)IVa的佐劑。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供活的革蘭氏陰性細(xì)菌，所述革蘭氏陰性細(xì)菌缺失gutQ,kdsD(yrbH),kdsA，kdsB,waaA，msbA，和/或yhjD中一種或多種基因的表達(dá)，或任何其它與外膜LPS呈遞有關(guān)聯(lián)的生物合成、加工或運(yùn)輸基因的表達(dá)。本發(fā)明的細(xì)菌，或其部分(例如，膜部分)可用于研究和治療應(yīng)用中。附圖簡(jiǎn)述圖1給出了從KPM22中提取的LPS樣品的表征。圖1A:來自透析后酚抽提物的LPS的內(nèi)核-脂質(zhì)A糖組成。GlcN-D-葡糖胺；KD0-2-酮3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸；L-^磁-D-甘露-庚糖-庚糖。圖1B:來自蛋白酶K處理的全細(xì)胞裂解物的LPS的SDS-PAGE分析。上面的圖是經(jīng)過銀染的，而中間和底部的圖是利用針對(duì)脂質(zhì)A的非糖基化1，4'-雙磷酸化P-1，6-連接的GlcN二糖主鏈的mABA6而顯色的免疫印跡。中間圖的膜用1°/。醋酸處理以便在免疫反應(yīng)前釋放脂質(zhì)A。泳道l-5是不同LPS化學(xué)型的腸沙門氏菌G^/邊o/2e7he/z"r/ca)血清變型參照菌林[1.3749(Ra);2.3750(Rb2);3.3748(Rb3);4.3769(Rdl),5.1102(Re)]，6.野生型BW30270,7.KPM22,8.KPM25，9.在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中具有A5P的KPM22,10.KPM31，11.KPM34,12.在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中具有A5P的KPM31,13.KPM40，14.KPM42,15.在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中具有A5P的KPM40，16.200ng化學(xué)合成的脂質(zhì)IVa(化合物406)。圖2給出了在KPM22中的LPS前體的表征。純化LPS樣品的負(fù)離子模式的電荷解巻積電噴射離子化傅立葉變換離子回旋(ESIFT-ICR)質(zhì)鐠。給出的質(zhì)量數(shù)指的是中性分子的單同位素質(zhì)量。圖2A:BW30270(插圖:糖形I的同位素分布；3915.71u)。圖2B:KPM22(插圖脂質(zhì)IVa的結(jié)構(gòu)；1404.86u)。圖2C:KPM25(插圖野生型LPS,描述了KDO「脂質(zhì)A(Re內(nèi)毒素)的化學(xué)結(jié)構(gòu)并通過箭頭表示庚糖附著點(diǎn)。紅色、藍(lán)色和綠色峰標(biāo)記分別對(duì)應(yīng)于糖形I，IV，和II的峰族(參見，例如，S.Miiller-Loennies，B.Lindner,H.Brade,/.扁/.C力復(fù)278,34090(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。各個(gè)結(jié)構(gòu)峰指配列在表9中。PE-磷脂酰乙醇胺；f磷酸；尸-^薩磷酸乙醇胺；LAtri，LAtetra，LApenU，IAexa-月旨質(zhì)A的跣化狀態(tài)。圖3代表野生型BW30270(a)和KPM22(b)的內(nèi)膜和外膜的蔗糖梯度分離。對(duì)級(jí)分測(cè)定總蛋白質(zhì)含量(X)，外膜磷脂酶A(OMPLA)(O)，和內(nèi)膜NADH氧化酶(A)。在還原性條件下進(jìn)行蛋白質(zhì)樣品的SDS-PAGE凝膠(12。/。)電泳。分子質(zhì)量蛋白質(zhì)標(biāo)記(kDa)列在每個(gè)膠的左側(cè)。箭頭指示OMP蛋白質(zhì)的位置(~35kDa)[Q2]。圖4給出KPM22的表征。野生型BW30270(圖A和B)和KPM22(圖C和D)的透射電子顯微鏡(TEM)照片。箭頭指示KPM22的OM表面處的外膜嚢泡(OMV)(圖C)。IM-內(nèi)膜，OM-外膜,PG-肽聚糖。標(biāo)尺條-50nm。圖5給出KPM22的表征。圖5A:估測(cè)莢膜異多糖酸產(chǎn)生，以pg曱基戊糖(L-巖藻糖)/mL/OD混懸細(xì)胞培養(yǎng)物表示。圖5B:利用mAb898抗體進(jìn)行的腸道細(xì)菌共同抗原(ECA)的免疫印跡分析。泳道1(BW30270)，泳道2(KPM22)，泳道3(KPM25)。圖6給出酚相抽提物的ESIFT-ICR質(zhì)譜。來自BlO0n0(A),KPM22(B)，和KPM25(C)的酚相的電荷解巻積負(fù)離子ESIFT-ICR質(zhì)譜。通過逐滴加入水來將LPS從粗制酚抽提物中沉淀。通過離心澄清后，將酚上清液透析并如上所述進(jìn)行處理。注意在此過程中脂質(zhì)IVa并未通過水從酚相中沉淀(B)。ECA。yc-環(huán)狀腸道細(xì)菌共同抗原(ECA)。圖7給出LPS制品的hTNFa細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力。用各種濃度的如上所述分離的LPS制品攻擊人單核細(xì)胞(MNC)。利用基于ELISA的測(cè)定來量化hTNFot釋放。一式兩份收集數(shù)據(jù)點(diǎn)。(陰影條塊-BW30270，空白條塊-KPM22，陰影線條塊-KPM25)。圖8顯示gutQ對(duì)于D-葡糖醇利用和LPS生物合成的作用。C4)BW30270(口),BW3O27O(A-0(〇),和BW30270(pT7-gutQ)(△)的二次生長(zhǎng)曲線。將在添加了1lug/mL石克胺和10mMD-葡萄糖的M9基本培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的過夜培養(yǎng)物稀釋至新鮮培養(yǎng)基中，所述新鮮培養(yǎng)基具有2mMD-葡萄糖和2mMD-葡糖醇作為雙重碳源。通過測(cè)定600nm的濁度來監(jiān)測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)。(歷銀染的蛋白酶K-處理的全細(xì)胞裂解物的曲辛(tricine)SDS-PAGELPS凝膠，所述細(xì)胞裂解物來自BW30270(WT)，BW30270(A^//^,和BW30270(Air^y^。在對(duì)數(shù)早期收獲等量的細(xì)菌細(xì)胞，所述細(xì)菌細(xì)胞生長(zhǎng)在有(+)或無(-)D-葡糖醇(10mM)的基本培養(yǎng)基(O.2%甘油)中，并如實(shí)驗(yàn)過程中所述進(jìn)行處理。圖9顯示AAPI菌林BW30270(A^/^Air^y幼中的生長(zhǎng)和LPS合成。(力在MOPS基本培養(yǎng)基中的大腸桿菌BW30270(A^/^A7^歷的生長(zhǎng)曲線，所述基本培養(yǎng)基具有硫胺(lug/mL)和甘油(0.1%)作為單一碳源。在培養(yǎng)基中補(bǔ)充糖磷酸和10|liMG6P(A),15jiMA5P(口)，或二者(〇)。(歷用A5P滴定LPS。將已經(jīng)停止分裂的生長(zhǎng)在MOPS基本培養(yǎng)基(O.2%甘油，5pMA5P，10pMG6P)中的靜止期培養(yǎng)物稀釋到新鮮培養(yǎng)基中并振蕩6小時(shí)，所述新鮮培養(yǎng)基包含GW(1(^M)和不同濃度的A5P(0.1，1,10,50,和100pM)。基于OD由相同數(shù)目的細(xì)胞制備LPS樣品并通過曲辛SDS-PAGE和銀染進(jìn)行分析。(O由野生型BW30270(泳道1和2)和BW30270(A^/^Ai^y")(泳道3和4)制備樣品的LPS曲辛SDS-PAGE和(幼^/^的定量RT-PCR分析。用10jiMG6P和5pMA5P預(yù)誘導(dǎo)BW30270(A^/^Airf/^),沉淀，重懸于新鮮MOPS基本培養(yǎng)基(O.2%甘油)中，所述基本培養(yǎng)基只有所示的AW和10mMD-葡糖醇，并在收獲進(jìn)行分析之前再振蕩4小時(shí)。S-O.l-lkbDNA分子量標(biāo)記；Con-基因組DNA為模板。圖10顯示大腸桿菌K-12MG1655的gW操縱子。利用Yamada和Saier的逆轉(zhuǎn)錄酶作圖來確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(參見，例如，Yamada,M.&Saier，M.H.，Jr.(1988)JMolBiol203，569-83;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，并通過箭頭表示。圖11顯示Kdo的生物合成和摻入LPS。涉及的酶是(1)D-阿拉伯糖5-磷酸異構(gòu)酶(KdsD/GutQ),(2)Kdo8P合酶(KdsA)，(3)Kdo8P磷酸酶(KdsC)，和(4)CMP-Kdo合成酶(KdsB)。在大腸桿菌中，隨后在逐步加入仲?；?6)月桂酸酯(LpxL)和(7)肉豆蔻酸酯(LpxM)之前通過(5)Kdo轉(zhuǎn)移酶(WaaA)將兩分子活化Kdo順序轉(zhuǎn)移到脂質(zhì)IVa上。定義為了有利于理解本發(fā)明，下面對(duì)多種術(shù)語進(jìn)行定義。本文所用的，術(shù)語"受試者"和"患者"指任何動(dòng)物，諸如哺乳動(dòng)物像狗、貓、鳥、家畜，優(yōu)選人。本文所用的，術(shù)語"LPS相關(guān)病癥"，"與內(nèi)毒素相關(guān)的病癥"，"內(nèi)毒素相關(guān)病癥"，"內(nèi)毒素-相關(guān)病癥"，"膿毒癥"，"膿毒癥相關(guān)病癥"，或類似的術(shù)語，描述了與LPS相關(guān)聯(lián)的任何病癥，例如與菌血癥或脂多糖導(dǎo)入血流中或胃腸外勦膜表面上(例如肺)相關(guān)聯(lián)的病癥。這些病癥包括，但不限于，內(nèi)毒素相關(guān)休克，內(nèi)毒素相關(guān)彌散性血管內(nèi)凝血，內(nèi)毒素相關(guān)貧血癥，內(nèi)毒素相關(guān)血小板減少癥，內(nèi)毒素相關(guān)成人呼吸窘迫綜合征，內(nèi)毒素相關(guān)腎衰竭，內(nèi)毒素相關(guān)肝病或肝炎，由于革蘭氏陰性菌感染導(dǎo)致的系統(tǒng)性免疫應(yīng)答綜合征(SIRS)，革蘭氏陰性菌新生兒膿毒癥，革蘭氏陰性菌腦膜炎，革蘭氏陰性菌肺炎，由于革蘭氏陰性菌感染導(dǎo)致的嗜中性白細(xì)胞減少癥和/或白細(xì)胞減少癥，血液動(dòng)力學(xué)休克和內(nèi)毒素相關(guān)熱病(pyresis)。術(shù)語，"活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌，，指包含實(shí)質(zhì)上不含LPS的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌菌林。本文可以互換使用的術(shù)語"細(xì)胞"和"宿主細(xì)胞"和"重組宿主細(xì)胞",指的是能夠或已經(jīng)轉(zhuǎn)化了載體，典型的是表達(dá)載體的細(xì)胞。本文所用的宿主細(xì)胞優(yōu)選是革蘭氏陰性細(xì)菌。要理解這些術(shù)語并不僅僅指特定受試者細(xì)胞，還指這種細(xì)胞的后代或潛在后代。由于突變或環(huán)境影響某些修飾可能在后代中發(fā)生，這種后代可能實(shí)際上與親本細(xì)胞并不完全相同，但仍然包括在本文所用的術(shù)語范圍內(nèi)。術(shù)語"培養(yǎng)基"是本領(lǐng)域所認(rèn)可的，通常指用來培養(yǎng)活的細(xì)胞的任何物質(zhì)或制品。所用的術(shù)語"源自"，例如，在源自革蘭氏陰性細(xì)菌菌林的脂質(zhì)IVa上下文中，指的是可以獲自所述細(xì)菌或蛋白質(zhì)的脂質(zhì)IVa，并且意欲包括蛋白質(zhì)的片段或部分。關(guān)于基因或基因表達(dá)，本文所用的術(shù)語"缺陷的"，意指基因并非野生型基因并且生物并不具有野生型基因型和/或野生型表型。缺陷的基因、基因型或表型可能是在該基因中突變的結(jié)果，或調(diào)控該基因的表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后)使其正常表達(dá)被破壞或壓制的基因的結(jié)果。"被破壞的基因表達(dá)"意欲包括完全抑制和低于野生型基因表達(dá)的基因表達(dá)下降(例如，如在滲漏突變中)兩種情況。術(shù)語"革蘭氏陰性細(xì)菌"是本領(lǐng)域所公認(rèn)的，一般指不保留革蘭氏染色的細(xì)菌(例如，結(jié)晶紫和碘之間的有色復(fù)合物的沉積)。在示例性革蘭氏染色中，首先通過加熱將細(xì)胞固定在載玻片上并用堿性染料(例如，結(jié)晶紫)染色，染料被所有細(xì)菌(即，革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性的)攝取。隨后用碘-KI混合物對(duì)載玻片進(jìn)行處理以固定菌抹，用丙酮或乙醇洗滌，最后用不同顏色的較淺染料(例如，番紅精)進(jìn)行復(fù)染。革蘭氏陽(yáng)性生物保留最初的紫色染色，而革蘭氏陰性生物被有機(jī)溶劑脫色，因此顯示復(fù)染色。示例性的革蘭氏陰性細(xì)菌和細(xì)胞系包括，但不限于，埃希氏菌屬(細(xì)Ae"'c力/aspp.)，志賀菌屬(脂ge"a柳.)，沙門氏菌屬(^邁謹(jǐn)7/aspp.),彎曲桿菌屬(C,y/c^a"er柳.)，奈瑟氏菌屬(jVe/sser/aspp.)，嗜血桿菌屬(細(xì)卿力""sspp.),氣單胞菌屬(Jer歸層spp.),弗朗西斯菌屬(spp.),耶爾森菌屬(fers/z7/aspp.)，克雷4白菌屬(i7e6s/e//aspp.),包特氏菌屬(臉d""/aspp.)，軍團(tuán)菌屬(Ze^7one//aspp.)，棒桿菌屬(Co，e6a"er/aspp.),檸檬酸桿菌屬(。'"Ma"erspp.),衣原體屬(C力/啤^spp.),布魯氏菌屬(5ryce"sspp.)，假單胞菌屬(戶se油/csspp.)，螺桿菌屬("e"cc^"erspp.)和弧菌屬(r/6r/0spp.)。本文所用的術(shù)語"突變體革蘭氏陰性細(xì)菌""LPS突變體革蘭氏陰性細(xì)菌"，"kdsD和gutQ突變體革蘭氏陰性細(xì)菌"，"API突變體革蘭氏陰性細(xì)菌"或類似的術(shù)語，包括本發(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌，其在例如gutQ，kdsD，kdsA，kdsB，waaA，msbA,yhjD基因或4壬4可其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因中的一種或多種中已經(jīng)突變一次或多次，由此產(chǎn)生實(shí)質(zhì)上缺乏LPS蛋白質(zhì)表達(dá)的外膜。"分子的免疫原性部分"指的是該分子中能夠在受試者中引發(fā)針對(duì)該分子的免疫反應(yīng)的部分。如對(duì)于LPS或脂質(zhì)IVa分子所用的術(shù)語"分離的"，指的是已經(jīng)與其它細(xì)菌組分分離(例如，部分或全部分離)特別是從外膜中分離的LPS或脂質(zhì)IVa。本文所用的，術(shù)語"部分"，當(dāng)參照序列(例如，蛋白質(zhì)的氨基酸序列，基因的核酸序列)使用時(shí)，表示任何量的所指序列(例如，氨基酸序列或核酸序列的0.001%,0.1%,1%,10%，30%，50%,75%，80%，85%，90%，95%，98%,99.999%)。本文所用的術(shù)語"調(diào)節(jié)"指的是上調(diào)(即，活化或刺激(例如，通過激動(dòng)或加強(qiáng)))和下調(diào)(即，抑制或壓制(例如，通過拮抗，下降或抑制))。術(shù)語"可誘導(dǎo)的/誘導(dǎo)型"特別指這樣的基因表達(dá)，其并非組成性的但其響應(yīng)刺激(例如，溫度，重金屬或其它培養(yǎng)基添加物)而發(fā)生。術(shù)語"非人動(dòng)物"包括可以在測(cè)試本發(fā)明中被處理或使用的任何動(dòng)物，包括哺乳動(dòng)物諸如非人靈長(zhǎng)類，嚙齒動(dòng)物，羊，狗，.牛，豬，雞，以及兩棲動(dòng)物，爬行動(dòng)物等。優(yōu)選的非人動(dòng)物選自靈長(zhǎng)科或嚙齒科(例如，大鼠和小鼠)。術(shù)語"核酸"指的是多核苷酸或寡核苷酸諸如脫氧核糖核酸(DNA)，和，當(dāng)合適時(shí)，核糖核酸(RM)。該術(shù)語還應(yīng)當(dāng)被理解為包括由核苷酸類似物制得的MA或DNA的類似物，作為等同物；以及可適用于所描述的實(shí)施方案，包括單鏈(有義或反義)和雙鏈多核苷酸。術(shù)語"可藥用的"意指一種在生物學(xué)或在其它方面沒有不良影響的物質(zhì)，即所述物質(zhì)可以與選定的化合物一起對(duì)個(gè)體施用，不會(huì)引發(fā)任何不希望的生物學(xué)效應(yīng)或以有害的方式與它所處的藥物組合物中的其它化合物相互作用。術(shù)語"致熱的"或"致熱原性"指的是當(dāng)施用給受試者時(shí)，化合物誘導(dǎo)發(fā)熱或發(fā)熱應(yīng)答的能力。這種發(fā)熱應(yīng)答一般由宿主促炎性細(xì)胞因子IL-1，IL-6和/或TNF-a所介導(dǎo)，其分泌由例如LPS所誘導(dǎo)。具有"減弱致熱原性"的物質(zhì)或"減弱致熱性衍生物"指的是具有比對(duì)應(yīng)物質(zhì)低的致熱活性的物質(zhì)，例如，相對(duì)于對(duì)應(yīng)物質(zhì)小于大約80%致熱原性，優(yōu)選小于大約70%致熱原性，更加優(yōu)選小于大約60%致熱原性，更加優(yōu)選小于大約50。致熱原性，更加優(yōu)選小于大約40%致熱原性，還要更加優(yōu)選小于大約30%致熱原性。換句話說，如本文所述或本領(lǐng)域7>知的任何測(cè)定法所測(cè)，具有減弱致熱原性的物質(zhì)比相應(yīng)物質(zhì)少至少大約20%，30°/。，歌50%，60%，或70%致熱原性。"實(shí)質(zhì)上減弱的致熱原性"或"實(shí)質(zhì)上減弱的致熱性衍生物"指的是這樣的物質(zhì)(例如，由活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌所產(chǎn)生的)，其已被改變從而使得它相對(duì)于野生型物質(zhì)具有少于20%的致熱原性，優(yōu)選相對(duì)于野生型物質(zhì)少于10%致熱原性，優(yōu)選少于1%致熱原性，優(yōu)選少于IOI致熱原性，優(yōu)選少于IOI致熱原性，優(yōu)選少于10l致熱原性，優(yōu)選少于1(T、致熱原性，優(yōu)選少于IOI致熱原性，最優(yōu)選少于101致熱原性。換句話說，如本文所述或本領(lǐng)域公知的任何測(cè)定法所測(cè)，具有實(shí)質(zhì)上減弱的致熱原性的物質(zhì)相對(duì)于相應(yīng)未改變物質(zhì)，致熱原性要少至少大約90%,99%,IO倍，大約10-2倍，大約10—3倍，至少大約10—4倍，至少大約1(T倍，至少大約10—6倍。本文所用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)染"意指核酸通過核酸介導(dǎo)的基因傳遞導(dǎo)入受體細(xì)胞中(例如，通過表達(dá)載體)。本文所用的"轉(zhuǎn)化"指這樣的過程，其中作為細(xì)胞攝取外源DNA或RNA的結(jié)果細(xì)胞的基因型改變。在例示性實(shí)施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞是表達(dá)kdsD和gutQ基因中一種或多種的突變體形式的細(xì)胞。經(jīng)轉(zhuǎn)化的細(xì)胞還可以是表達(dá)核酸的細(xì)胞，所述核酸干擾gutQ,kdsD,kdsA，kdsB，waaA，msbA,ynjD基因或任何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因的表達(dá)。本文所用的，術(shù)語"轉(zhuǎn)基因"意指已被導(dǎo)入細(xì)胞中的核酸(例如，突變體kdsD，gutQ,kdsA,kdsB，waaA，msbA,ynjD基因或4壬何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因，或其反義轉(zhuǎn)錄物)。轉(zhuǎn)基因可以是部分或完全異源的，即相對(duì)于它所導(dǎo)入的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物或細(xì)胞是外來的，或可以與它所導(dǎo)入的生物或細(xì)胞的內(nèi)源基因同源，但它被設(shè)計(jì)用于被插入或被插入動(dòng)物或細(xì)胞的基因組中，插入的方式改變了其所插入的細(xì)胞的基因組。轉(zhuǎn)基因還可以附加體的形式存在于細(xì)胞中。本文所用的術(shù)語"治療"受試者的狀況或疾病，意欲包括治愈，以及改善所述狀況或疾病的至少一種癥狀。術(shù)語"栽體"指能夠轉(zhuǎn)送其所連接的另一種核酸的核酸分子。能夠指導(dǎo)其所可操作連接的基因的表達(dá)的載體在本文中稱作"表達(dá)栽體"。本文所用的術(shù)語"表達(dá)系統(tǒng)"指在一定條件下的表達(dá)載體，所述條件使得mRNA可以進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和/或mRNA可以;陂翻譯成蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)RNA，或其它細(xì)胞組分。所述表達(dá)系統(tǒng)可以是體外表達(dá)系統(tǒng)，其可以商購(gòu)或容易根據(jù)本領(lǐng)域已知技術(shù)制作，或可以是體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)，諸如包含表達(dá)載體的真核或原核細(xì)胞。一般來說，在重組DAN技術(shù)中使用的表達(dá)載體通常是"質(zhì)粒，，的形式，其一般指以其載體形式不結(jié)合到染色體上的環(huán)形雙鏈DNA環(huán)。在本說明書中，"質(zhì)粒"和"載體"可以互換使用，因?yàn)橘|(zhì)粒是最常用形式的載體。不過，本發(fā)明意欲包括這類其它形式的表達(dá)載體，其發(fā)揮等同的功能并且是本領(lǐng)域公知的，或以后將成為本領(lǐng)域公知的(例如，粘粒，嗜菌粒和噬菌體載體)。發(fā)明詳述本發(fā)明提供無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌。特別地，本發(fā)明提供在外膜內(nèi)實(shí)質(zhì)上缺乏脂多糖(LPS，內(nèi)毒素)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)。本發(fā)明進(jìn)一步提供活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)生方法及其用途。本發(fā)明還提供誘導(dǎo)免疫應(yīng)答以及研究和開發(fā)治療劑的組合物和方法。革蘭氏陰性細(xì)菌在肽聚糖周圍具有不對(duì)稱的脂質(zhì)雙層-外膜(0M)。0M內(nèi)葉主要是由各種甘油磷脂組成，而外葉主要包含獨(dú)特的兩親性大分子-脂多糖(LPS)。在大腸桿菌和其它密切相關(guān)的腸道細(xì)菌中，有~106LPS分子/細(xì)胞覆蓋接近75%的整個(gè)細(xì)胞表面區(qū)域，占0M總重的~30%(參見，例如，S.M.Galloway，C.R.Raetz，J.Biol.Chem.265，6394(1990);L.Leive，Ann.N.Y.Acad.Sci.235，109(1974);H.Nikaido，EscherichiacoliandSalmonellatyphimurium:cellularandmolecularbiology,F.C.Neidhardt，Ed.(AmericanSocietyforMicrobiology,Washington,D.C.，1987)，vol.1,pp.29-47;在此將每篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。在細(xì)菌細(xì)胞和含水環(huán)境之間的界面處暴露的位置呈遞LPS作為主要的OM相關(guān)表面抗原。LPS涉及多種與宿主免疫應(yīng)答相關(guān)聯(lián)的病理和生理活性(參見，例如，A.Wiese，等人，Biol.Chem.380，767(1999);H,Heine,等人，Mol.Biotechnol.19,279(2001);在此將每篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。LPS是一種免疫刺激/炎性分子，公認(rèn)為革蘭氏陰性菌發(fā)病機(jī)理和全身炎癥的介質(zhì)，由此術(shù)語內(nèi)毒素經(jīng)?？膳cLPS互換使用。LPS層對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌的0M的形式和功能都是必需的。因而，除了在革蘭氏陰性菌發(fā)病機(jī)理中發(fā)揮關(guān)鍵作用之外，LPS還是細(xì)菌存活的關(guān)鍵決定因素。各種革蘭氏陰性細(xì)菌的LPS符合共同的結(jié)構(gòu)，概念性地分成三個(gè)區(qū)0M-埋植脂質(zhì)A,寡糖核心，然后是由腸桿菌科中的z"重復(fù)單位或某些細(xì)菌中的短分枝寡糖組成的0-特異性親水多糖鏈，所述細(xì)菌包括人翁膜病原體，如腦膜炎奈瑟氏菌(L/z7e"i/^i〃V/s)，'淋病態(tài)瑟氏菌(義goooiT力oeae)，^危感嗜血桿菌(〃ae邊o/7力/7i/si/7/7we/7么ae)，百曰咳桿菌(脅d"e"apert證/s)，和衣原體屬(C力/輝d/aspp)。在革蘭氏陰性細(xì)菌屬中脂質(zhì)A是最保守的LPS結(jié)構(gòu)域，是負(fù)責(zé)宿主內(nèi)生物學(xué)活性的結(jié)構(gòu)組分，代表LPS的內(nèi)毒素原理。在腸道細(xì)菌中，脂質(zhì)A由P-1，6-連接的D-葡糖胺二糖主鏈組成，其被四個(gè)0)-3-羥基-肉豆蔻酸以酯-(3，3，)或酰胺-(2，2')鍵所酰化。大腸桿菌野生型菌抹的成熟脂質(zhì)A分子一般包含兩個(gè)額外的?；?，主要是月桂酸酯和肉豆蔻酸酯，附于非還原性葡糖胺的W)-3-羥基肉豆蔻酰基基團(tuán)上以形成脂質(zhì)A的特征性酰氧基?；鶈挝?。寡糖核心將脂質(zhì)A連接到高變的多糖鏈上，進(jìn)一步分成內(nèi)部和外部寡糖核心區(qū)。盡管外部核心并不十分保守，糖組成和糖苷鍵都有所變化，但大部分革蘭氏陰性細(xì)菌都制成包含至少一個(gè)2-酮3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)分子的內(nèi)部核心。KD0是LPS的基本組分，它是在幾乎所有LPS結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)的保守殘基(參見，例如，0.Holst，TrendsGlycosci.Glycotechnol.14，87(2002);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。大腸桿菌生長(zhǎng)所需的最小LPS結(jié)構(gòu)是附于脂質(zhì)A上的兩個(gè)KD0殘基(KD0廠脂質(zhì)A或Re內(nèi)毒素)(參見，例如，C.R.Raetz，C.Whitfield，A匪.Rev.Biochem.71，635(2002);S.Gro麗，H.Brade,J.EndotoxinRes.7，3(2001);在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，著重強(qiáng)調(diào)KDO在維持細(xì)菌細(xì)胞的完整性和生存能力中的重要性。L-API由大腸桿菌K-12中的i^y"基因所編碼(參見，例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W,(2003)JBiolChem278，32771-7;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。LPS結(jié)構(gòu)內(nèi)KD0的遍在性質(zhì)已經(jīng)促進(jìn)對(duì)其生物合成的研究。該途徑由酶d-阿拉伯糖5-磷酸(A5P)異構(gòu)酶(API)所起始，所述酶將戊糖途徑中間產(chǎn)物D-核酮糖5-磷酸轉(zhuǎn)變成A5P。隨后，A5P與磷酸烯醇丙酮酸縮合形成Kdo8-磷酸(Kdo8P)(KdsA),水解成Kdo(KdsC)，在最后從CMP-Kdo轉(zhuǎn)移至受體脂質(zhì)IVA(WaaA)之前，活化成糖核苷酸CMP-KdoOCdsB)(圖11)。后面的?；D(zhuǎn)移酶LpxL和LpxM接下來分別將脂肪酸月桂酸和肉豆蔻酸轉(zhuǎn)移至Kdo2-脂質(zhì)IVA以形成六?；疜do-脂質(zhì)A的特征性酰氧基?；鶈挝弧Ｔ诖竽c桿菌K-12中，有兩種API基因U&"和gi/^入基于同源性研究，據(jù)推測(cè)其它API可能存在于大腸桿菌中。特別地，葡糖醇操縱子gutQ的最終開放閱讀框與kdsD(以前稱為yrbH)具有顯著的同源性(45%同一性)。G-API是g""^^!柳。操縱子的最后基因產(chǎn)物，所述操縱子包含七種集中(convergently)轉(zhuǎn)錄的基因(圖10)。如表1中所示，gutQ和kdsD共有類似的生化特性。表1.1&"和^/^的生化特性—特性^Dagut^a數(shù)據(jù)來自Yamada，M.，Yamada，Y.&Saier，M.H.，Jr.(1990)"^&《1，141-5;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文。b通過31PNMR測(cè)量的；由Haldane關(guān)系(Ru5P/A5P)計(jì)算。。見測(cè)試底物的實(shí)驗(yàn)過程。d通過高分辨率電感耦合等離子體質(zhì)鐠測(cè)定的Zn2+當(dāng)量/單體。6少于5%的活性殘留。f作為分離的酶，用l(VMEDTA。8通過電噴射離子化質(zhì)鐠測(cè)定的；由蛋白質(zhì)序列計(jì)算的。h通過凝膠過濾測(cè)定的。葡糖醇操縱子表達(dá)負(fù)責(zé)由環(huán)境中協(xié)同吸收和代謝D-葡糖醇的磷酸烯醇丙酮酸糖磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(PTS)(參見，例如，T.C.Meredith，R.W.Woodard,J.Biol.Chem.278,32771(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。該操縱子最初由Lengeler(參見，例如，C.Galanos,等人，Eur.J.Biochem.9，245(1969);S,Mtiller-Loennies，等人，J.Biol.Chem.278，34090(2003);在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)研究，隨后由Saier(參見，例如，K.A.Brozek,C.R，Raetz,J.Biol.Chem.265，15410(1990);H,Nikaido，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67，593(2003);在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)研究，已知由七種集中轉(zhuǎn)錄的基因^/"A^^i^組成。EII^復(fù)合物由guU(EIICl結(jié)構(gòu)域)，gutE(EIIBC2結(jié)構(gòu)域)，和gutB(EIIA結(jié)構(gòu)域)形成，并將D-葡糖醇作為D-葡糖醇6-磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)穿過內(nèi)膜到細(xì)胞中。隨后通過gutD(—種NADH依賴型脫氳酶)將D-葡糖醇6-磷酸進(jìn)一步代謝為糖酵解的中間產(chǎn)物D-果糖6-疋(A5P)^(Ru5P)KA5PtoRu5P)irc"(Ru5PtoA5P)4(calc.)b最適pH對(duì)A5P/Ru5P特異性Zn"/亞單位的當(dāng)量d10jaMZn2+的抑制eEDTA的活化f亞單位MW(calc.)g天然MWh0.61±0.06mM0.35±0.08mM157土4secf1255土16sec—10.47(0.35)1.(35104Da(35196Da)122土5kDa(四聚體)1.2±0.lmM0.64±0.08mM218±4sec_1242±llsec—10.47(0.48)33909Da(34031Da)133土4kDa(四聚體)是4:一是是11一是w是是磷酸。gW操縱子的表達(dá)由復(fù)雜的多組分調(diào)控系統(tǒng)緊密控制，除了cAMP-CAP(環(huán)磷酸腺苷-分解代謝產(chǎn)物激活蛋白)介導(dǎo)的調(diào)控之外，所述系統(tǒng)還由轉(zhuǎn)錄抑制劑(gutR)和轉(zhuǎn)錄激活劑(gutM)組成(參見，例如，C.J.Belunis，等人，J.Biol.Chem.270，27646(1995);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。不過，gutQ的功能仍然不了解(參見，例如，R.C.Goldman,W.E.Kohlbre畫r,LBacteriol.163,256(1985);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。在本發(fā)明實(shí)施方案的開發(fā)過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，構(gòu)建實(shí)質(zhì)上缺乏外膜LPS表達(dá)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌，盡管其特殊地產(chǎn)生無內(nèi)毒素活性的LPS前體脂質(zhì)IVa，一種人體中LPS誘導(dǎo)的膿毒癥的已知拮抗劑。本發(fā)明并不限于構(gòu)建實(shí)質(zhì)上缺乏外膜LPS表達(dá)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌的特定方法(例如，通過抑制API表達(dá)；通過突變gutQ和/或kdsD基因；通過抑制KD0表達(dá)；通過抑制KDO和脂質(zhì)1^之間的關(guān)聯(lián)；通過kdsA，和/或kdsB，和/或waaA和/或msbA和/或yhjD基因，或其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因的突變；通過抑制脂質(zhì)IVA表達(dá)；通過lpxM基因，或其它脂質(zhì)IVa的生物合成、加工或運(yùn)輸基因的突變)。本發(fā)明考慮任何類型革蘭氏陰性細(xì)菌菌林在構(gòu)建實(shí)質(zhì)上缺乏外膜LPS表達(dá)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌中的用途?？捎糜诒景l(fā)明的革蘭氏陰性細(xì)菌的實(shí)例包括，但不限于，埃希氏菌屬，志賀菌屬，沙門氏菌屬，彎曲桿菌屬，奈瑟氏菌屬，嗜血桿菌屬，氣單胞菌屬，弗朗西斯菌屬，耶爾森菌屬，克雷伯菌屬，包特氏菌屬，軍團(tuán)菌屬，棒桿菌屬，檸檬酸桿菌屬，衣原體屬，布魯氏菌屬，假單胞菌屬，螺桿菌屬和弧菌屬。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用大腸桿菌?？梢允褂玫陌ＯＪ暇鷮倬|的實(shí)例包括，但不限于，大腸桿菌菌林DH5a，HB101,HS-4，4608-58，1-184-68，53638-C-17，13-80，和6-81(參見，例如，Sambrook,等人，(Eds.)，1993:MolecularCloning,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.);Grant,等人，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA,87:4645;Sansonetti，等人，1982，Ann.Microbiol.(Inst.Pasteur)，132A:351)，產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌(Evans，等人，1975,Infect.I咖un.，12:656)，腸致病性大腸桿菌(Donnenberg，等人，1994，J.Infect.Dis，，169:831;在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)和腸出血性大腸桿菌(參見，例如，McKee和O'Brien,1995,Infect.Immiin.,63:2070)。本發(fā)明并不限于突變體革蘭氏陰性細(xì)菌菌林(例如，在kdsD和/或gutQ，kdsA,kdsB，waaA,msbA，ynjD基因，或其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因中具有突變的革蘭氏陰性細(xì)菌菌林)生長(zhǎng)的特定培養(yǎng)條件。為了示例性的目的，利用適于所生長(zhǎng)的細(xì)菌菌林的常規(guī)培養(yǎng)技術(shù)，可以將細(xì)菌生長(zhǎng)在任何適于細(xì)菌生長(zhǎng)的標(biāo)準(zhǔn)液體培養(yǎng)基中，如LB培養(yǎng)基(Difco，DetroitMich.),營(yíng)養(yǎng)肉湯(Difco)，胰蛋白酶大豆肉湯(Difco)，或M9基本肉湯(Difco)(Miller,1991,同上)?；蛘?，可以將細(xì)菌培養(yǎng)在固體培養(yǎng)基上，諸如L-瓊脂(Difco)，營(yíng)養(yǎng)球脂(Difco)，胰蛋白酶大豆瓊脂(Difco)，或M9基本瓊脂(Difco)。對(duì)于革蘭氏陰性細(xì)菌菌林，其中所述菌抹包含突變kdsD和/或gutQ，將外源D-阿拉伯糖5-磷酸源用于細(xì)菌生長(zhǎng)和存活(Meredith等人，2006,ACSChem.Biol.1:33-42;將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)。或者，在開發(fā)本發(fā)明一些實(shí)施方案過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，包含kdsD和/或gutQ突變的菌林中msbA基因的過表達(dá)是補(bǔ)充D-阿拉伯糖5-磷酸用于細(xì)菌生長(zhǎng)和存活的一種備選方案。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供具有在gutQ,kdsD(yrbH),kdsA，kdsB，waaA,msbA，和/或yhjD基因中的突變，或在任何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因中的突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，gutQ和kdsD基因的突變抑制細(xì)菌菌林內(nèi)的API表達(dá)，這會(huì)抑制KD0表達(dá)，繼而抑制外膜LPS表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在kdsA基因中具有突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在kdsB基因中具有突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在waaA基因中具有突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。在開發(fā)本發(fā)明實(shí)施方案過程中進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)顯示，kdsA,kdsB,和/或waaA的突變通過阻止KD0的產(chǎn)生或KD02和脂質(zhì)IVA之間的關(guān)聯(lián)來抑制LPS生物合成途徑，從而將單獨(dú)的脂質(zhì)IVA運(yùn)輸?shù)酵饽ぁ＜?xì)菌細(xì)胞存活并且不含LPS并且是無毒的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在gutQ,kdsD，kdsA，kdsB，和/或waaA基因中具有突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌，并且進(jìn)一步包含msbA基因中的突變。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供在gutQ,kdsD，kdsA，kdsB或waaA基因中具有突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌，并且進(jìn)一步包含yhjD基因中的突變。本發(fā)明考慮使用在革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)導(dǎo)入遺傳突變的任何技術(shù)。這些技術(shù)包括，但不限于，非特異性誘變，利用化學(xué)劑諸如N-曱基-N'-硝基N-亞硝基胍，吖啶橙，溴化乙錠，或非致命性暴露于紫外光線下(參見，例如，Miller(Ed.)，1991:AShortCourseinBaterialGenetics,ColdSpringHarborPress,ColdSpringHarbor,N.Y.;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。或者，可以利用TnlO誘變，噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，入噬菌體介導(dǎo)的等位基因交換，或接合轉(zhuǎn)移，或利用重組DNA技術(shù)的定點(diǎn)誘變來導(dǎo)入突變(參見，例如，Miller(Ed.)，1991，同上；Hone，等人，1987，J.Infect.Dis.,156:167;Noriega,等，1994，Infect.Immun.，62:5168;Hone，等人，1991,Vaccine,9:810;Chatfield，等人，1992,Vaccine,10:53;Pickard，等人，1994，Infect.Immun.，62:3984;Odegaard，等人，1997,J.Biol.Chem.,272:19688;Lee，等人，1995,J.Biol.Chem.，270:27151;Garrett，等人，1998,J.Biol.Chem.,273:12457;在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)?？梢允褂萌魏螌?dǎo)入突變的方法并且可以聯(lián)合一種或多種附加的突變來導(dǎo)入突變。例如，在一些實(shí)施方案中本發(fā)明提供具有一種以上突變?nèi)缭趃utQ，kdsD,kdsA,kdsB，waaA，msbA，yhjD基因中的突變，或在任何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因中的突變的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。在一些實(shí)施方案中，在革蘭氏陰性細(xì)菌內(nèi)的突變(例如，gutQ，kdsD(yrbH)，kdsA，kdsB，waaA,msbA，和/或yhjD基因的突變，或4壬何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因的突變)可組成性表達(dá)或在誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制下，所述誘導(dǎo)型啟動(dòng)子諸如，例如，溫度敏感型熱激家族的啟動(dòng)子，或厭氧誘導(dǎo)型nirB啟動(dòng)子(參見，例如，Harborne，等人，1992，Mol.Micro.，6:2805;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，或在阻遏型啟動(dòng)子控制下，諸如uapA(參見，例如，Gorfinkiel，等人，1993，LBiol.Chem.，268:23376;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)或gcv(參見，例如，Stauffer，等人，1994，J.Bact,176:6159;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。選擇合適的啟動(dòng)子將取決于宿主細(xì)菌菌林并且對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說將是顯而易見的。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供缺失API表達(dá)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)。本發(fā)明并不限于抑制API表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過抑制KDO蛋白質(zhì)表達(dá)來抑制API表達(dá)。本發(fā)明并不限于抑制KDO蛋白質(zhì)表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過例如，gutQ基因，kdsD基因，kdsA基因或kdsB基因的突變，或在任何其它KDO生物合成基因中的突變來抑制KDO蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供活的無毒的(例如，無內(nèi)毒素的)革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)。本發(fā)明并不限于提供活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過抑制外膜中LPS表達(dá)來提供活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌。本發(fā)明并不限于抑制外膜中LPS表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過抑制API蛋白質(zhì)表達(dá)來抑制LPS表達(dá)。本發(fā)明并不限于抑制API表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過抑制KDO蛋白質(zhì)表達(dá)來抑制API表達(dá)。本發(fā)明并不限于抑制KDO蛋白質(zhì)表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過例如，gutQ基因和kdsD基因的突變來抑制KDO蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，由于KDO蛋白質(zhì)不與脂質(zhì)IV,相關(guān)聯(lián)，外膜上的KDO蛋白質(zhì)表達(dá)不發(fā)生，從而只有脂質(zhì)IVa逸送到外膜。例如，gutQ,kdsD，kdsA,kdsB，waaA，msbA,和/或yhjD基因中的突變或任何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因的突變消除了KDO廣脂質(zhì)IVA復(fù)合物的形成或膜呈遞，導(dǎo)致，例如，只有脂質(zhì)IVA分子被運(yùn)送到外膜并且沒有隨后的LPS形成。在一些實(shí)施方案中，可以通過對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說已知的克隆方法來對(duì)活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌進(jìn)行遺傳工程改造(見Sambrook等人，MolecularCloning;ALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratoryPress;將其全部?jī)?nèi)容并入本文作為參考)以表達(dá)，產(chǎn)生和呈現(xiàn)非天然蛋白質(zhì)和肽，諸如，但不限于，來自其它細(xì)菌生物的LPS，獨(dú)特的脂質(zhì)衍生物，人蛋白質(zhì)或肽生產(chǎn)，非人蛋白質(zhì)或肽生產(chǎn)，疫苗生產(chǎn)，等等。這些產(chǎn)生的產(chǎn)物可用于多種應(yīng)用，包括但不限于，臨床治療和基礎(chǔ)研究努力。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供包含表達(dá)脂質(zhì)IVa的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)。本發(fā)明并不限于提供包含表達(dá)脂質(zhì)IVa的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過抑制API蛋白質(zhì)表達(dá)來得到包含表達(dá)脂質(zhì)IVa的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。本發(fā)明并不限于抑制API蛋白質(zhì)表達(dá)的特定方法。本發(fā)明并不限于抑制API表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過抑制KD0蛋白質(zhì)表達(dá)來抑制API表達(dá)。本發(fā)明并不限于抑制KD0蛋白質(zhì)表達(dá)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過例如，gutQ，kdsD，kdsA，kdsB,waaA,msbA，和/或yhjD基因的突變或4壬4可其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因的突變來抑制KD0蛋白質(zhì)表達(dá)。在一些實(shí)施方案中，通過抑制KD0和脂質(zhì)iva之間的關(guān)聯(lián)，從而只有脂質(zhì)IVa被逸送到外膜(例如，無KD0)，來得到無LPS的包含表達(dá)脂質(zhì)iva的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。本發(fā)明并不限于抑制KDO和脂質(zhì)iva之間關(guān)聯(lián)的特定方法。在一些實(shí)施方案中，通過例如，gutQ，kdsD，kdsA，kdsB,waaA，msbA和/或yhjD基因中的突變，或任何其它生物合成、加工或運(yùn)輸基因的任何突變來抑制KDO和脂質(zhì)iva之間的關(guān)聯(lián)。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離自活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)的脂質(zhì)IVa。脂質(zhì)IVa用于例如研究哺乳動(dòng)物膿毒性休克信號(hào)傳遞途徑，和作為L(zhǎng)PS型分子合成中的構(gòu)件。目前分離脂質(zhì)IVa的方法包括傳統(tǒng)的全有機(jī)合成，成熟LPS的降解，或由條件突變體純化，所述條件突變體產(chǎn)生包含所需脂質(zhì)IVa級(jí)分的異源LPS層。這些方法的缺點(diǎn)包括脂質(zhì)IVa產(chǎn)量低并且花費(fèi)勞動(dòng)多。從本發(fā)明的活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌中分離脂質(zhì)IVa代表了超越這些方法的顯著改進(jìn)，因?yàn)橥饽ご嬖谥|(zhì)IVa。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供分離自活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)外膜嚢泡。脂質(zhì)IVa是膿毒性休克信號(hào)傳遞途徑的拮抗劑，治療急性膿毒癥患者的一種可行方法是阻斷涉及LPS的信號(hào)傳遞途徑。在一些實(shí)施方案中，使用來自包含表達(dá)脂質(zhì)IVa的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌的分離的外膜嚢泡來治療或預(yù)防性阻止膿毒癥相關(guān)病癥。由本發(fā)明的活的無毒革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，AAPI菌抹)制備的外膜嚢泡包含脂質(zhì)IVa作為L(zhǎng)PS拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，將分離自活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)的外膜嚢泡用于改進(jìn)基于外膜嚢泡的疫苗的目的。經(jīng)常通過嚴(yán)苛化學(xué)處理去掉LPS來對(duì)基于OMV的疫苗進(jìn)行"解毒"。不過，去除方法對(duì)于OMV疫苗的蛋白質(zhì)組分具有有害作用，所述蛋白質(zhì)組分可以是抗體靶向的良好候選物，特別是來自其它革蘭氏陰性病原體的克隆的外膜蛋白質(zhì)。對(duì)于AAPI突變體菌林作為宿主，解毒不是必需的，因?yàn)槠涮峁┝祟~外的安全水平。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供革蘭氏陰性細(xì)菌，所述細(xì)菌包含具有脂質(zhì)IVa和LPS表達(dá)的外膜。將LPS的毒性與免疫刺激特性分離是開發(fā)基于LPS的佐劑或基于LPS的疫苗的主要挑戰(zhàn)。由于厶API菌林中的阻斷是在LPS途徑的早期，可以使用來自其它細(xì)胞的酶(其用磷酸基團(tuán)，乙醇胺，L-4-脫氧阿拉伯糖，不同的?；滈L(zhǎng)度等修飾LPS)和具有改變活性的突變酶來生成LPS分子陣列，其在細(xì)胞內(nèi)具有獨(dú)特的生物學(xué)活性。在大腸桿菌中進(jìn)行這種遺傳操作的許多方法已經(jīng)存在。另外，通過在生長(zhǎng)培養(yǎng)基中包含D-阿拉伯糖5-磷酸可以恢復(fù)成熟LPS合成，允許控制和優(yōu)化LPS衍生物與成熟LPS的量和比例。這種LPS"混合物"可以實(shí)現(xiàn)免疫刺激活性同時(shí)保留可接受的低水平的潛在毒性之間的所需平衡。在一些實(shí)施方案中，使用活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌作為宿主來生產(chǎn)無內(nèi)毒素的治療性分子。本發(fā)明并不限于特定的治療性分子。傳統(tǒng)上，在革蘭氏陰性細(xì)菌中生產(chǎn)治療性分子，不管它是用于疫苗的OM嚢泡，用作佐劑的LPS型分子(諸如單磷?；|(zhì)A(MPLA)),重組藥物蛋白質(zhì)，大分子，或用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞轉(zhuǎn)染/基因治療的DNA，受到來自細(xì)菌宿主的內(nèi)毒素存在的干擾。治療性分子污染內(nèi)毒素是一個(gè)問題，因?yàn)長(zhǎng)PS的免疫原性潛力已被充分證明。目前減少內(nèi)毒素污染的生產(chǎn)策略包括各種純化技術(shù)，諸如市場(chǎng)上出售用來純化無內(nèi)毒素的DM質(zhì)粒的試劑盒，隨后通過各種測(cè)定法來測(cè)量?jī)?nèi)毒素水平。由于AAPI菌株并不產(chǎn)生內(nèi)毒素，不需要這種純化步驟。由此，本發(fā)明的活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌菌林(例如，AAPI菌林)提供改進(jìn)的方法分離無內(nèi)毒素的治療性分子(例如，脂質(zhì)IVa)。例如，預(yù)期AAPI菌林是宿主，用來在無內(nèi)毒素的環(huán)境中利用充分研究的革蘭氏陰性細(xì)菌生產(chǎn)商業(yè)上重要的治療性分子。此外，包含gutQ，kdsD，kdsA，kdsB,waaA，msbA，yhjD基因中的突變，或任何其它生物合成，加工，或運(yùn)輸細(xì)菌基因中的突變的菌林可以作為宿主，用來在無內(nèi)毒素的環(huán)境中利用革蘭氏陰性細(xì)菌生產(chǎn)商業(yè)上重要的治療性分子。在一些實(shí)施方案中，活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌可以用來生產(chǎn)刺激免疫應(yīng)答的疫苗或其它組合物。例如，利用如本文所述的革蘭氏陰性細(xì)菌生產(chǎn)針對(duì)傷寒的弱毒疫苗。由于在疫苗制品中存在的內(nèi)毒素，目前的傷寒疫苗引發(fā)副作用?？紤]利用本文所述的活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌或其部分，其中在外膜上不呈現(xiàn)LPS(例如，內(nèi)毒素)，回避了由包含內(nèi)毒素的疫苗制品引發(fā)的副作用。本發(fā)明可以用于任何通常發(fā)現(xiàn)內(nèi)毒素污染的疫苗制品或其它組合物中。因?yàn)樗鼈兊腖PS缺陷表型，本發(fā)明的活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌還可用作活的減毒疫苗。由此，本發(fā)明可用于開發(fā)不含內(nèi)毒素污染的OM疫苗和其它組合物來誘導(dǎo)免疫應(yīng)答，其可以為了免疫和研究的目的施用給受試者。例如，可以利用如在US專利申請(qǐng)2005/0013831或US專利6，558，677中所述的方案制備減毒的或OM疫苗，在此將上述專利文本的全部?jī)?nèi)容作為參考并入本文。例如，這種疫苗可用于對(duì)受試者進(jìn)行免疫，所述受試者處于發(fā)生膿毒性休克的危險(xiǎn)(例如，由大腸桿菌)，諸如手術(shù)患者。另外，可以開發(fā)用于針對(duì)例如百日咳(例如，包特氏菌(Bordetellasp.))，布魯桿菌病或內(nèi)毒素休克(例如，布魯菌(》ruce/7asp.)),肺和呼吸系統(tǒng)感染(例如，假單胞菌屬(Pseudomonassp.)，嗜血桿菌(腸卿力/7i/5"sp.)，莫拉氏菌(船me"ssp.)),霍亂(例如，弧菌(P76"'osp.))，肺炎(例如，克雷伯氏菌U/由/e/7asp.)，嗜血桿菌(^seiZ7o;7力/7yisp.))，胃潰瘍(例如，螺桿菌(Ve//co&cfersp.))，腦膜炎(例如，奈瑟氏菌(vVe/"eWasp.)，嗜血桿菌(^3e邁一/7wssp.))，中耳炎(例如，嗜血桿菌(&^o;7A//i/ssp.)，莫拉氏菌(#orajre//asp.))，痢疾和腹竭(例如，志賀菌(M/ge77asp.)，義廯并霧，弧菌(P76r/osp.)，彎曲桿菌(C,y/函"ersp.)，耶爾森菌(7e"e"/asp.))，腸熱病(例如，沙門氏菌(&7邁o刀e/7ssp.))，沙眼和性傳播疾病(例如，衣原體(C力/a/z^d/asp.)),土拉菌病(例如，弗朗西斯菌(尸w/c"ce77asp.)),和鼠疫(例如，耶爾森菌(Few/zz/asp.))的免疫的無內(nèi)毒素的減毒或0M疫苗。在一些實(shí)施方案中，本文所述的無毒的活的革蘭氏陰性'細(xì)菌可用于生成治療性抗體來進(jìn)行治療和研究應(yīng)用。例如，在一些實(shí)施方案中利用無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌或其部分(例如，膜制品)對(duì)受試者進(jìn)行主動(dòng)免疫，隨后使用由人超免疫血清制備的抗體來被動(dòng)保護(hù)受試者免受細(xì)菌感染和膿毒癥。不過，治療性抗體的生成在宿主動(dòng)物中更加常規(guī)地得以實(shí)現(xiàn)，所述宿主動(dòng)物諸如，但不限于，靈長(zhǎng)類，兔，狗，豚鼠，小鼠，大鼠，綿羊，山羊等。例如利用無毒的活的革蘭氏陰性細(xì)菌作為免疫原本身在宿主動(dòng)物中生成抗體來生成治療性抗體，用于施用于人受試者。此外本文所迷的無毒的活的革蘭氏陰性細(xì)菌還可用作宿主來呈現(xiàn)外源抗體(例如，免疫原性肽或蛋白質(zhì))，其被用來在宿主動(dòng)物中生成治療性抗體。例如，無毒的活的革蘭氏陰性細(xì)菌，除了實(shí)質(zhì)上是LPS缺陷型之外，可以進(jìn)行遺傳操作(例如，通過對(duì)于本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員來說已知的確立的克隆方法)以表達(dá)非天然蛋白質(zhì)和肽，所述蛋白質(zhì)和肽可用作免疫原進(jìn)行抗體生產(chǎn)。這些免疫原包括，但不限于，使抗體乾向針對(duì)癌細(xì)胞和其它引發(fā)疾病的細(xì)胞的肽，用于病毒細(xì)胞靶向的病毒外殼蛋白，等等。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供無毒的活的革蘭氏陰性細(xì)菌，其可用于呈遞免疫原性蛋白質(zhì)來生成治療性抗體。針對(duì)免疫原性蛋白質(zhì)的抗體可以是任何單克隆或多克隆抗體，只要它能夠識(shí)別抗原性蛋白來生^抗體。.5、.''、''在一些實(shí)施方案中，將包含表達(dá)脂質(zhì)IVa的外膜的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌)用于藥物篩選的目的(例如，篩選解熱劑)?！鰽PI突變體菌林具有非常低的透性屏障，使得它對(duì)于大的疏水藥物分子特別易感，所述大的疏水藥物分子正常情況下不能穿透OM。對(duì)化合物文庫(kù)的全細(xì)胞生物測(cè)定正常情況下使用透化劑諸如甲苯，EDTA,陽(yáng)離子肽等通過促進(jìn)穿透OM來幫助鑒定命中結(jié)果(hits)。一旦制成母體先導(dǎo)有效物質(zhì)，就可以使用藥物化學(xué)來改進(jìn)溶解性，分配，大小等以生產(chǎn)抗生素。從這些篩選遺漏了許多潛在的有效物質(zhì)，因?yàn)樗龌衔锊荒芙咏?M內(nèi)的蛋白質(zhì)靼標(biāo)。在這些篩選中利用例如AAPI突變體菌林通過降低透性屏障而不需要提供其它試劑緩解了0M透過性問題。類似地，在生成DNA文庫(kù)過程中，當(dāng)用DNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化例如厶API突變體菌林時(shí)，AAPI的這種低OM透過性是一種優(yōu)勢(shì)。高轉(zhuǎn)化效率細(xì)胞對(duì)于所有重組DNA技術(shù)都是必需的，對(duì)于這些應(yīng)用來說AAPI菌林是一種有用的宿主。實(shí)施例實(shí)施例I本實(shí)施例描述了△API突變體TCM15和KPM22。構(gòu)建G-API和L-API都缺失的營(yíng)養(yǎng)缺陷型厶API突變體TCM15，根據(jù)對(duì)于大腸桿菌確立的KD0「脂質(zhì)A定理，它的生長(zhǎng)依賴于外源A5P。在不包括A5P的情況下，TCM15不能在固體培養(yǎng)基上形成菌落，無論生長(zhǎng)培養(yǎng)基、溫育溫度或時(shí)間如何。當(dāng)在具有0.2%甘油作為唯一碳源的液體MOPS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，盡管缺乏A5P，細(xì)胞分裂照常在32"8小時(shí)遲滯后繼續(xù)。顯示大腸桿菌KPM22菌林為非條件性AAPI突變體，其能夠在富營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中于37。C持續(xù)生長(zhǎng)而無最初的遲滯期，盡管在細(xì)胞提取物中仍然沒有可測(cè)量的API活性。如表2中所示，在LB培養(yǎng)基中倍增時(shí)間增加到親本野生型菌株的近兩倍。表2.在不同溫度下LB培養(yǎng)基中的世代時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>a.2-3代后，生長(zhǎng)速率為非指數(shù)型。在變化到非容許溫度(42。C)后，指數(shù)生長(zhǎng)速度在2-3代后不再維持。編碼ir&"的質(zhì)粒(KPM25)在升高的溫度恢復(fù)ICPM22的生長(zhǎng)，提示由于KDO合成中的阻抑，細(xì)胞被膜有缺陷。為了進(jìn)一步研究KPM22，利用酚-氯仿-石油醚(PCP)抽提方法從細(xì)胞中抽提LPS樣品(參見，例如，C.Galanos，等人，Eur.J.Biochem.9，245(1969);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。測(cè)定LPS抽提物的糖組成以確定內(nèi)部核心糖組分[KDO和L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)]和脂質(zhì)A[D-葡糖胺(GlcN)](見圖1A)。野生型BW30270[1GlcN:0.9KDO:2.2庚糖]和KPM25[1.0GlcN:1.0KDO:2.5庚糖]的比例都與大腸桿菌K-12制造的優(yōu)勢(shì)LPS種類(糖形I)的比例[l.0GlcN:1.0KDO:2.O庚糖]相一致(參見，例如，S.Milller-Loennies，等人，J.Biol.Chem.278,34090(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。相比之下對(duì)于KPM22只檢測(cè)到痕量的KD0或庚糖，盡管GlcN仍然存在，提示脂質(zhì)A主鏈完整。對(duì)制備自蛋白酶K處理的全細(xì)胞裂解物的LPS樣品進(jìn)行銀染SDS-PAGE分析對(duì)KPM22未檢測(cè)出條帶(見，圖IB;上部的圖)。在用mAbA6抗體進(jìn)行探查之前用酸處理印跡膜以切割糖核，所述抗體識(shí)別脂質(zhì)A的非糖基化的1，4'-雙磷酸化p-l，6-連接的GlcN二糖主鏈。來自KPM22的單一條帶被抗體所識(shí)別，所述條帶比Re內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)遷移得快，但與合成的脂質(zhì)IVa處于同一水平(圖IB,中間圖，分別是泳道6和16)。當(dāng)省略了酸水解步驟時(shí)，只有制備自KPM22的LPS樣品和合成的脂質(zhì)IVa被mAbA6識(shí)別，證實(shí)天然脂質(zhì)A結(jié)構(gòu)是非糖基化的(圖1B，下部圖)。利用純化的LPS樣品通過負(fù)離子模式的電噴射離子化傅立葉變換離子回旋(ESIFT-ICR)質(zhì)譜測(cè)定ICPM22中LPS前體的化學(xué)型(見，圖2，表3)。表3.ESIFT-ICRMS峰列表觀察到的計(jì)算的質(zhì)質(zhì)量"量8化學(xué)組成標(biāo)記703.52703.517磷脂，PB(33:1)(例如1*16:0+1*17:1)PE1178.671178,.6612*GlcN,2*P,3*卿-14:0LAtri1360.831360..8282*GlcN，2*戶，3*卿-14:0，1*12:0LAtetr1404.861404,,8542*GlcN，2*戶，4*,-14:0脂IVa'質(zhì)1527.871527..8632*GlcN,2*尸，4*,-14:0，1587.021587..0212*GlcN，2*尸，4*(OH)-14:0，1*12:0TA1797.221797,,2192*GlcN,2*戶，4*(OH)--14:0，1*12:0,1*14:0LAhexa3813.753813.,734LAhexa+l*Gal，3*Glc,4*Hep,2*KD0,2*^糖形I3893.723893..700LAhexa+l*Gal,3*Glc，4*Hep，2*KD0,3*糖形I3915.713915.,699LAhexa+l*Gai,3*Gic,+l*Na4*Hep,2*跳3*,,糖形I3995.633995.,653Uhexs+l*Gal，3*Glc，+l*Na4*Hep,2*KD0,4*戶，糖形I4017.664017,6"LAhexa+l*Gal,3*Glc，+2*Na4*Hep,2*固，4*尸，糖形I4038.694038.,697LAhexa+l*Gal,3*Glc，4*Hep，2*跳5*尸，糖形I3927.683927.689Uhexa+l*Gal,2*Glc,3*Hep，l*Rha，3*KD0，糖形IV4007.674007.655LAhexa+l*Gal,2*Glc,3*Hep，l*Rha,3*KD0,糖形IV4029.644029.654LAhexa+l*Gal，2*Glc,3*Hep，l*Rha，3*KD0,糖形IV4050.704050.,698LAhexa+l*Gal，2*Glc,3P+1豐尸-層，+l*Na3*Hep，l*Rha,3*KD0,糖形IV4140.674140.722LAhexa+l*GlcNAc，l*Gal，3*Glc，4*Hep，2*KD0,3*尸，+2*Na糖形II4198.744198.735LAhexa+l*GlcMc，l*Gal，3*Glc,4*Hep，2*KD0，4*尸，+l*Na糖形II4220.734220.724LAhexa+l*GlcNAc,l*Gal,3*Glc，4*Hep，2*KD0,4*尸,+2*Na糖形II4300.684300.698"，，Mc,K"，3*Glc，4*Hep,2*KD0,糖形n5*尸，+2*Na4241.814241,778LUa+^kMc，"G"，^"c，OHep，2化D0，糖J*尸，7*戶一^f1*Na43H.734321.745LA《G!cNAc，剛，雨C，兩,"43.74"41"4LA+1*GlcNAc^Ga丄》G丄c,柯ep》KD0，a.給出的質(zhì)量數(shù)指的是中性分子的單同位素質(zhì)量，其是在電荷解巻積化后由LPS級(jí)分的負(fù)離子ESIFT-ICR質(zhì)謙推導(dǎo)出來的。b.粗體的峰以文字標(biāo)記在圖4上。c.縮寫PE-磷脂酰乙醇胺；GlcN-D-葡糖胺；i2"磷酸；戶-Wf磷酸乙醇胺；Ga卜D-半乳糖；Glc-D-葡萄糖；Hep-L-#磁-D-甘露-庚糖；KD0-2-酮3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸；Rha-鼠李糖；GlcNAc-A^乙?；鵇-葡糖胺；LAtri，tetra5perita》hexa脂質(zhì)A的?；癄顟B(tài)。在成熟大腸桿菌K-12LPS核心的不同糖形的特征質(zhì)量范圍內(nèi)[~3900到~4300u]，野生型BW30270和KPM25的質(zhì)鐠都顯示類似的峰模式和不均一性(見，圖2A，C)。在KPM22中的一個(gè)LPS相關(guān)峰具有1404.86u的分子質(zhì)量，與1，4，-雙磷酸化的四?；|(zhì)A(脂質(zhì)IVa，計(jì)算的質(zhì)量1404.854u)的結(jié)構(gòu)相符(見，圖2B)。脂質(zhì)IVa是LPS途徑中的中間產(chǎn)物，其充當(dāng)順序添加兩個(gè)KD0殘基的受體以形成KDO廣脂質(zhì)IVa，其中后面的?；D(zhuǎn)移酶LpxL和LpxM接下來分別將脂肪酸月桂酸和肉豆蔻酸轉(zhuǎn)移至KDO廣脂質(zhì)IVa，形成六?；疜D02-脂質(zhì)A。Raetz與合作者已經(jīng)顯示來自大腸桿菌的這兩種酶都顯示對(duì)于脂質(zhì)底物中KD0的絕對(duì)底物需要，以便具有活性(參見，例3口，K.A.Brozek，C.R.Raetz,J.Biol.Chem.265，15410(1990);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，這解釋了在來自KPN!"的脂質(zhì)A中仲?；湹娜狈?。為了確定脂質(zhì)IVA的亞細(xì)胞定位并確定它是否運(yùn)送至KPM22的0M，使用不連續(xù)蔗糖梯度離心來將OM與內(nèi)膜(IM)分離(見，圖3)。兩種膜都很好分辨，盡管KPM22的OM并未與野生型遷移地一樣遠(yuǎn)，提示浮力密度下降。除了在OM中積聚減少的情況下保持定位在IM中的0M孔蛋白(OMP)蛋白(~35kDa)的量增加以外，通過SDS-PAGE分析的整體總蛋白質(zhì)含量和構(gòu)成類似。已經(jīng)顯示許多OM蛋白依賴于LPS的分子伴倡特性進(jìn)行其折疊和產(chǎn)生功能(參見，例如，H.deCock，J.Tommassen，EmboJ.15，5567(1996);P.V.Bulieris,等人，J.Biol.Che邁.278，9092(2003);K.Sen,H.Nikaido,J.Bacteriol.173，926(1991);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，0MP的減少可以反映KPM22的蛋白質(zhì)運(yùn)輸速率和/或插入0M效率的降低。對(duì)分離的0M級(jí)分測(cè)定3-羥基肉豆蔻酸(3-0HC14:0)-—種特征性LPS/脂質(zhì)IVA脂肪酸標(biāo)記的存在。野生型和KPM22的0M分別包含11.7和31.ljig的3-0HC14:0每mg干膜，提示事實(shí)上在KPM22的0M中存在至少等于野生型中LPS量的顯著量的脂質(zhì)IVA。另外，ESIFT-ICR質(zhì)鐠分析揭示了在KPM22的0M和IM中的脂質(zhì)IVA的峰，而在來自野生型的兩種膜級(jí)分中都未檢測(cè)到屬于脂質(zhì)IVA的峰?？傊?，這表明盡管脂質(zhì)IVA被運(yùn)送至KPM22的0M上，但脂質(zhì)IVA運(yùn)送速率已經(jīng)與其合成速率脫節(jié)了。仲?；溕婕巴ㄟ^提高酰基鏈數(shù)目來維持0M內(nèi)的低度流動(dòng)性(參見，例如，H.Nikaido，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67，593(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，所述低度流動(dòng)性是功能所需的條件。飽和?；湹木o密包裝誘導(dǎo)疏水相互作用網(wǎng)絡(luò)，其通過范德華力維持0M外葉的完整性。盡管只包含四個(gè)?；湶⑶覜]有內(nèi)部糖核，在KPM22中脂質(zhì)IVa仍被運(yùn)輸并且隨后能夠支持0M生物合成。KPM22的0M中的脂質(zhì)IVa層的空前性質(zhì)重新定義了腸桿菌科中存活所必需的LPS結(jié)構(gòu)。正常情況下KD0被認(rèn)為是功能性LPS層的基本組分，因?yàn)榈侥壳盀橹怪粯?gòu)建了大腸桿菌中KD0生物合成酶的條件突變體(參見，例如，C.J.Belunis，等人，J.Biol.Chem.270，27646(1995);R.C.Goldman,W.E.Kohlbrenner，J.Bacteriol.163,256(1985);P.D.Rick，M.J.0sborn，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.69，3756(1972);在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。這歸因于KDO(并且可爭(zhēng)辯地部分歸因于附于KD0遠(yuǎn)側(cè)的其它糖)在脂質(zhì)雙層內(nèi)維持低度流動(dòng)性的作用(參見，例如，H.Nikaido，Microbiol.Mol.Biol.Rev.67，593(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。據(jù)信二價(jià)陽(yáng)離子，即Mg2+和Ca、與負(fù)電荷形成離子橋，所述負(fù)電荷是由磷酸化脂質(zhì)A主鏈和KD0的羧酸酯二者貢獻(xiàn)的，使得靜電排斥最小并促進(jìn)強(qiáng)烈的側(cè)向相互作用。另外，0M表面上的KD0定位將KD0置于接近0M蛋白處，許多OM蛋白質(zhì)的折疊和功能依賴于包含核心的LPS的分子伴侶特性(參見，例如，H.deCock,J.Tommassen，EmboJ.15，5567(1996);P.V.Bulieris，等人，J.Biol.Chem.278，9092(2003);K.Sen，H.Nikaido，J.Bacteriol.173，926(1991);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。為了確證在KPM22中KD0的非必需性質(zhì)，破壞編碼KD0生物合成中第一個(gè)關(guān)鍵步驟(ir&力和最后步驟(附a力的基因。與KPM22/KPM25(圖1B，泳道8，9)相比，外源性A5P或質(zhì)粒攜帶的API分別在KPM31/KPM40(泳道12，15)或KPM34/KPM42(泳道11，14)中都未恢復(fù)成熟LPS合成，這與KPM22在沒有完整KD0途徑的情況下存活的能力相一致。通過透射電子顯微鏡(TEM)檢查KPM22的細(xì)胞形態(tài)?？傮w上，KPM22的結(jié)構(gòu)與親本菌林非常相似(圖4)。通過TEM并未觀察到顯而易見的的分裂缺陷并且細(xì)胞維持正常的桿狀。對(duì)于KPM22辨別出兩種清晰的膜(圖4D),以及在兩種膜之間的代表外周胞質(zhì)的區(qū)域。與野生型相比外周胞質(zhì)體積被均一地壓縮。出現(xiàn)在KPM22表面上的小膜嚢泡提示0M的不穩(wěn)定性(圖4C)。外膜嚢泡(OMV)形成可能是由鄰近脂質(zhì)IVa分子的1，4，-GlcN磷酸之間的靜電排斥作用引發(fā)的(其并不被糖核的穩(wěn)定化相互作用所補(bǔ)償)，提高膜曲率和導(dǎo)致嚢泡由細(xì)菌表面擠出。考慮到ESI-MS分析未檢測(cè)到4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖并且只檢測(cè)到最小限度的磷酸乙醇胺修飾，電荷排斥對(duì)于KPM22特別相關(guān)，所述4-氨基-4-脫氧-L-阿拉伯糖和磷酸乙醇胺都作用來減少凈負(fù)電荷的量(參見，例如，C.R.Raetz，C.Whitfield,Annu.Rev.Biochem.71，635(2002);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。KPM22中適應(yīng)由于極端LPS截短導(dǎo)致的OM完整性喪失的補(bǔ)償機(jī)制引發(fā)與其它0M結(jié)合糖脂的穩(wěn)定化作用。在來自腦膜炎奈瑟氏菌(^/zze/7/邱/"V/s)的LPS缺陷型突變體中，據(jù)報(bào)道莢膜多糖合成對(duì)于生存能力是絕對(duì)必需的(參見，例如，P.vanderLey,L.Steeghs,J.Endotoxin.Res.9，124(2003)。大腸桿菌K-12并不合成莢膜多糖，但是除了LPS之外還有兩種其它的細(xì)胞表面多糖，即應(yīng)激誘導(dǎo)的粘液外泌多糖莢膜異多糖酸(M-抗原)(參見，例如，A.Markovitz，SurfacecarbohydratesoftheprokaryoticcellI.W.Sutherland,Ed.(AcademicPress,Inc.,NewYork,N.Y.,1977)，vol.I,pp.415-462);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)和磷酸甘油酯連接的腸道細(xì)菌共同抗原(ECA)(參見，例如，H.M.Kuhn,等人，F(xiàn)EMSMicrobiol.Rev.4，195(1988);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。不可透析的甲基戊糖的水平?jīng)]有區(qū)別(圖5A)，其是莢膜異多糖酸的組成糖標(biāo)記(參見，例如，S.Gottesman等人，J.Bacteriol.162，1111(1985);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。細(xì)胞裂解物的免疫印跡分析揭示甘油磷脂?；Y(jié)合的ECA的量事實(shí)上在KPM"中減少(圖5B)，這與環(huán)狀ECA從酚抽提物的KPM22譜中消失相一致，所述環(huán)狀ECA包含四個(gè)三糖重復(fù)單位(2429.89u)(圖6)。因而，除了脂質(zhì)IVa之外，KPM22的0M包含痕量水平的ECA和同等低的野生型水平的莢膜異多糖酸?？傊?，KPM22被膜代表了在大腸桿菌中報(bào)道的能夠保持生存能力的最低的OM糖脂含量。LPS層的一個(gè)主要功能是充當(dāng)大的疏水分于和防御素(多聚陽(yáng)離子肽)二者擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞的滲透屏障，以及保持外周胞質(zhì)間隔區(qū)的內(nèi)容物。除了提供針對(duì)宿主應(yīng)答的非特異性防御的措施之外，在OM內(nèi)鄰近LPS分子之間的強(qiáng)側(cè)向相互作用使得LPS層特別適于這種功能。通過外膜孔蛋白(0MP)蛋白通道實(shí)現(xiàn)小的親水性分子、營(yíng)養(yǎng)物和抗生素的選擇性滲透。針對(duì)KPM22篩選一組抗生素和去污劑以測(cè)量脂質(zhì)IVa作為滲透屏障的有效性(見表4)。表4.KPM22的滲透屏障特性最小抑菌濃度(pg/mL)<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>a74，000單位/g.b'膽酸鈉和脫氧膽酸鹽的混合物。e.勦菌素；20，261單位/mgKPM22對(duì)于多種大的疏水抗生素超級(jí)易感，所述抗生素一般僅對(duì)革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌具有相當(dāng)?shù)男Я?。正常情況下被OM排斥接近它們的作用位點(diǎn)，這些化合物在KPM22中接近細(xì)胞內(nèi)靶標(biāo)。糖核未阻止接近膜表面，進(jìn)一步促進(jìn)了分配和隨后穿過受損的脂質(zhì)雙層。不過，小的(〈600Da)，相對(duì)親水性的化合物的最小抑菌濃度(MIC)最多得到適度的降低，所述化合物得以穿越OM主要是通過OMP。值得關(guān)注的例外是帶正電荷的氨基糖苷卡那霉素。有人提出氨基糖苷卡那霹素得以進(jìn)入主要是通過吸收的自我促進(jìn)機(jī)制，涉及不依賴于OMP的與LPS的起始電荷配對(duì)相互作用(參見，例如，R.E.Hancock,等人，Antimicrob.Agents.Chemother.35,1309(1991);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。KPM22對(duì)于去污劑特別敏感，對(duì)于十二烷基硫酸鈉MIC降低超過4000倍。由于人腸道中的膽汁鹽(膽固醇代謝物)濃度為4到16mM(~1650-6650fig/mL)(參見，例如，B.Borgstrom，ActaMed.Scand,196，1(1974);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，KPM22受損的OM將不再適于保護(hù)細(xì)胞免受其宿主環(huán)境侵害。令人吃驚的是，多粘菌素E(黏菌素)(一種具有去污劑樣作用機(jī)制的陽(yáng)離子肽)的MIC，在KPM22中只降低了~4倍。多粘菌素在膜表面上積聚至臨界集聚濃度與在薄層狀雙層內(nèi)形成微胞損傷有關(guān)，所述損傷隨后充當(dāng)通過0M的自我促進(jìn)運(yùn)輸?shù)耐ǖ?參見，例如，A.Wiese等人，J.Membr.Biol.162，127(1998);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。與LPS相比脂質(zhì)IVa具有降低的電荷/表面積比，突出了帶負(fù)電荷的內(nèi)核殘基在多粘菌素結(jié)合中的作用。由于所選擇的抗生素具有多種作用機(jī)制，在疏水性化合物之間MIC的變化有可能是滲透性變化的結(jié)果，其與一般性適應(yīng)或藥物流出機(jī)制的反映相反。KPM22的滲透特性證明KDO生物合成抑制通過降低OM屏障的固有抗性作為擴(kuò)大現(xiàn)存抗生素活性鐠的手段的潛力。細(xì)菌內(nèi)毒素是引發(fā)人體內(nèi)先天免疫應(yīng)答的強(qiáng)促炎性分子，即使是當(dāng)僅有痕量存在的時(shí)候(參見，例如，E.S.VanAmersfoort,等人，CIin.Microbiol.Rev.16，379(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。革蘭氏陰性細(xì)菌誘導(dǎo)的膿毒性休克是由不平衡的失調(diào)免疫應(yīng)答造成的。部分地，這一病理生理級(jí)聯(lián)是由LPS活化巨噬細(xì)胞觸發(fā)的，其繼而分泌一批炎性介質(zhì)。由巨噬細(xì)胞釋放的最早細(xì)胞因子中的一種是多效性的細(xì)胞因子TNFi(腫瘤壞死因子)。利用基于ELISA的測(cè)定由受刺激的人單核細(xì)胞分泌的hTNF-a來測(cè)量LPS制品的內(nèi)毒素潛力(圖7)。在高達(dá)ljig/mL的濃度上來自KPM22的制品無內(nèi)毒素活性，這與利用色譜純化的脂質(zhì)IVa的較早研究相一致(參見，例如，D.T.Golenbock,等人，J.Biol.Che邁.266，19490(1991);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。在大腸桿菌和相關(guān)細(xì)菌中，KD0抑制不僅提高細(xì)菌對(duì)宿主應(yīng)答和抗生素的易感性，還具有通過降低內(nèi)毒素負(fù)載來減少膿毒癥風(fēng)險(xiǎn)的潛力。將LPS從細(xì)胞質(zhì)翻轉(zhuǎn)到IM周質(zhì)面上的內(nèi)膜ABC(ATP結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白在體外對(duì)于六?；疞PS/脂質(zhì)A底物是高度選擇性的(參見，例如，ZhouZhou，Z.，等人，J.Biol.Chem.273，12466-12475(1998);Doerrler，W.T.，等人，/.脅/.C力e邁."7，36697-36705(2002);在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。MsbA最初被鑒定為L(zhǎng)pxL(HtrB)溫度敏感性表型的多拷貝阻抑基因(參見，例如，Polissi，A.，andGeorgopoulos，C.Mol.Microbiol.20，1221-1233(1998);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。用KPM22基因組DNA的粘粒文庫(kù)補(bǔ)償營(yíng)養(yǎng)缺陷型TCM15菌林揭示MsbA是△Kdo表型的多拷貝阻抑基因。分離十七個(gè)包含iz^^位點(diǎn)的粘?？寺?。正如A5P營(yíng)養(yǎng)缺陷型的喪失和在固體瓊脂培養(yǎng)基上形成菌落能力的恢復(fù)所表明的那樣，包含只具有與野生型相同的完整野生型釕^序列的3.5kb插入片段的粘粒亞克隆(P固W52)，能夠直接拯救TCM15而不需要開發(fā)推測(cè)的阻抑基因突變(表5)。TCM15(pMMW52)的生長(zhǎng)速率類似于KPM22(表2和5)。這些結(jié)果表明盡管脂質(zhì)IVA在體外是不良底物(見，Doerrler，W.T.和Raetz,C.R.，/.C力e瓜277，36697-36705(2002);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，但當(dāng)脂質(zhì)IVa以高濃度存在時(shí)其通過簡(jiǎn)單的質(zhì)量作用成為體內(nèi)MsbA的底物。表5.MsbA對(duì)TCM15營(yíng)養(yǎng)缺陷型的多拷貝抑制<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>(33)aCfu值對(duì)應(yīng)于直接鋪平板(TCM15)或電轉(zhuǎn)化后；b在可測(cè)量的情況下，于37。C的世代時(shí)間(min)列在括號(hào)中；。15pMA5P,10jiMG6P。d對(duì)于攜帶質(zhì)粒的菌林包括Amp(lOOjugmL-l);6克隆載體；f包含淑W的亞克隆。實(shí)施例II此實(shí)施例描述了用在涉及KPM22和TCM15的研究中的細(xì)菌菌林，質(zhì)粒，和引物。用在涉及KPM22和TCM15的研究中的細(xì)菌菌林，質(zhì)粒，和引物列于表6中。表6.細(xì)菌菌林，質(zhì)粒，和引物菌林/質(zhì)粒/引物描述來源或參考文獻(xiàn)BW30270SL3749SL3750SL3748SL3769SL1102TCM15KPM22KPM25KPM31KPM34KPM40KPM42Pl大腸桿菌K-12MG1655;r;7/f/V2/腸沙門氏菌鼠傷寒血清變型fi1.e/2f"/cssv.TyphimuriumJ(rAi^W，LPS的Ra化學(xué)型)腸沙門氏菌鼠傷寒血清變型(r/a/W7，LPS的Rb2化學(xué)型)腸沙門氏菌鼠傷寒血清變型(r/a""，LPS的Rb3化學(xué)型)腸沙門氏菌鼠傷寒血清變型6V7/，LPS的Rdl化學(xué)型)腸沙門氏菌鼠傷寒血清變型LPS的Re化學(xué)型)BW30270(A^/^A^"幼；A5P營(yíng)養(yǎng)缺陷型TCM15MOPS基本培養(yǎng)基衍生物具有pT7ir&Z的KPM22KPM22(A她力具有pT7ir&"的KPM31KPM22(A具有pT7i^"的KPM40具有大腸桿菌K-12i:^"的pT7-7;Amp*GCTGCATTAATTAATCGACATTTTACTCAAGATTAAGGCGATCCTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTC(SEQIDNO:9)大腸桿菌品種保藏中心(CGSC#7925)沙門氏菌品種保藏中心(SGSC#228)沙門氏菌品種保藏中心(SGSC#229)沙門氏菌品種保藏中心(SGSC#227)沙門氏菌品種保藏中心(SGSC#231)沙門氏菌品種保藏中心(SGSC#258)T.C.Meredith和R.W.Woodard，J.Bacteriol.，出版中，(2005);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)T.CMeredith和R.W.Woodard,J.Biol.Chem.,278,32771(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)InvitrogenP2GTCTTAACGCAGAACGCTAATACTTTATTTTTCAAGCAAAAAAGAATTCCGGGGATCCGTInvitrogenCGACC(SEQIDNO:10)P3ACAGCTAAATACATAGAATCCCCAGCACATCCATAAGTCAGCTATTTACTGTGTAGGCTGMWGBiotechGAGCTGCTTC(SEQIDNO:11)P4TAATGGGATCGAAAGTACCCGGATAAATCGCCCGTTTTTGCATAACAACCCATATGAATAMWGBiotech_TCCTCCTTAG(SEQIDNO:12)_a對(duì)同源區(qū)作下劃線。將所有菌林都生長(zhǎng)在標(biāo)準(zhǔn)Luria-Bertani培養(yǎng)基(10g胰蛋白胨，5g酵母提取物，10gNaCl)或MOPS-基本培養(yǎng)基(參見，例如，F(xiàn).C.Neidhardt,P.L.Bloch，D.F.Smith,J.Bacteriol.119，736(1974);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)中，所述培養(yǎng)基含0.2°/。甘油作為唯一碳源。將大腸桿菌菌林KPM22用作宿主，根椐Datsenko和Wanner的方案利用噬菌體入Red重組酶系統(tǒng)進(jìn)行染色體和,j基因破壞(參見，例如，K.A.Datsenko,B.Wanner，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，6640(2000);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。分別使用15jag/mL和100^ig/mL的卡那霉素和氨節(jié)西林。分別使用以pKDl3(ira")或pKD4(ira")作為模板的引物對(duì)Pl/P2或P3/P4以構(gòu)建KPM31和KPM40的插入盒。如所述那樣利用FLP重組酶系統(tǒng)切除抗生素抗性標(biāo)記(參見，例如，K.A.Datsenko,B.L.Wanner,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.97，6640(2000);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，不同的是將所有質(zhì)粒都在37。C進(jìn)行處理。實(shí)施例III本實(shí)施例描述了KPM22的生長(zhǎng)。KPM22的生長(zhǎng)包括在37°CTCM15在MOPS-基本培養(yǎng)基中的指數(shù)分裂培養(yǎng)物，該培養(yǎng)基添加了1(^MD-葡萄糖6-磷酸和15pMD-阿拉伯糖5_磷酸，將所述培養(yǎng)物稀釋(l:200v/v)入缺少糖磷酸補(bǔ)充物的相同培養(yǎng)基中。在持續(xù)24-32小時(shí)的初始遲滯后，生長(zhǎng)重新開始并將培養(yǎng)物在LB瓊脂平板上進(jìn)行菌落純化。實(shí)施例IV本實(shí)施例描述了對(duì)于涉及KPM22的實(shí)驗(yàn)所進(jìn)行的生長(zhǎng)速率測(cè)定。將過夜培養(yǎng)物生長(zhǎng)在30X:下并用來接種新鮮預(yù)熱的LB培養(yǎng)基(30C37。C,或42。C)至OD一等于0.05-0.1。通過測(cè)量OD綱腿的變化來監(jiān)測(cè)生長(zhǎng)，并在OD達(dá)到~0.7時(shí)稀釋培養(yǎng)物以維持指數(shù)生長(zhǎng)。倍增時(shí)間列于表7中。表7.在不同溫度下LB培養(yǎng)基中的世代時(shí)間<table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>a.2-3代后，生長(zhǎng)速率為非指數(shù)型。實(shí)施例V本實(shí)施例描述了對(duì)于涉及KPM22和TCM15的實(shí)驗(yàn)的LPS純化。通過將500mL每種菌林生長(zhǎng)在LB培養(yǎng)基中來常規(guī)地制備樣品，所述培養(yǎng)處于37。C、恒定通風(fēng)、250rpm。通過離心(10min，8000x《，4'C)收集靜止期培養(yǎng)物的細(xì)胞，在蒸餾水中洗滌，并再次離心。如以往所述通過用乙醇(95%),丙酮，和二乙醚處理對(duì)生物質(zhì)進(jìn)行脫水(參見，例如，U.Zahringer等人,J.Biol.Chem.279，21046(2004);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。根據(jù)酚-氯仿-石油醚方法通過干燥細(xì)胞的抽提來進(jìn)行LPS的分離(參見，例如，C.Galanos，0.Ltideritz，O.Westphal，Eu.rJ.Biochem.9，245(1969);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。相對(duì)于蒸餾水對(duì)將要分析糖組成的等份粗制酚抽提物(圖lA)進(jìn)行充分透析(MWCO-1000Da)，并通過凍干法收集。通過逐滴加入水沉淀由粗制酚相純化用于質(zhì)鐠分析和測(cè)量人TNFa細(xì)胞因子稀放的LPS樣品。只對(duì)BW30270和KPM25形成了絮狀沉淀，通過離心對(duì)其進(jìn)行收集，接下來用80%苯酚洗滌并且隨后用丙酮洗滌。將沉淀物溶于水中，并分別由其各自的酚相母液中透析。凍干后，將樣品重懸于緩沖液(20mMTris-HCl,pH=7.5，10mMNaCl，10mMMgCh)中,用DNA酶I(2(Vg/mL)和RNA酶A(20jig/mL)于37"C處理8小時(shí)，隨后用蛋白酶K(100^ig/mL)處理16小時(shí)。通過超速離心(SW41Ti懸籃式轉(zhuǎn)子，200，OOOxg，2小時(shí)，15C)收集LPS樣品，用蒸餾水洗滌三次，并在凍干前相對(duì)于水進(jìn)行充分透析。代表性的LPS純化產(chǎn)率列于表8中。表8.LPS純化總結(jié)菌林最終OD600nm濕細(xì)胞質(zhì)量(g)干細(xì)胞質(zhì)量(g)觀察到的Ppt.a酚溶性(mg)LPSPPt.(mg)純化的產(chǎn)量b(mg)%產(chǎn)率cBW302705.272.500.56+7.013.512.12.1KPM223.611.880.43一13.3N/A7.21.7KPM255.752.580.65+9.115.713.02.0a.Ppt.-沉淀物。b.在DNA酶I/RNA酶A/蛋白酶K處理后。c.基于干細(xì)胞質(zhì)量。實(shí)施例VI本實(shí)施例描述了對(duì)于涉及KPM22和TCM15的實(shí)驗(yàn)的糖類組成分析。利用比色化學(xué)測(cè)定法對(duì)來自粗制酚抽提物的LPS樣品的D-葡糖胺(GlcN),2-酮3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸(KDO)，和L-甘油-D-甘露-庚糖(庚糖)含量進(jìn)行測(cè)定。通過在500jliL的4MHC1中于IOO'C將LPS樣品(lmg)水解18小時(shí)來測(cè)定GlcN含量。利用乙?；被菧y(cè)定法來量化釋放的GlcN(參見，例如，J.L.Strominger，J.T.Park，R.E.Thompson,J.Biol.Chem.234，3263(1959);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。利用LPS適用的硫代巴比妥酸測(cè)定法測(cè)量KDO含量(參見，例如，Y.D.Karkhanis，J.Y.Zeltner,J.J.Jackson,D.J.Carlo,Anal.Biochem.85，595(1978);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，同時(shí)利用改進(jìn)的半胱氨酸-硫酸測(cè)量法估計(jì)庚糖的量(參見，例如，M.J.0sborn，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.50,499(1963);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。實(shí)施例VII本實(shí)施例描述對(duì)于涉及KPM22和TCM15的實(shí)驗(yàn)的SDS-PAGE電泳和脂質(zhì)A/ECA免疫印跡。才艮據(jù)Hitchcock和Brown的方法通過SDS-PAGE分析全細(xì)胞裂解物的LPS模式(參見，例如，P.J.Hitchcock,T.M.Brown,J.Bacteriol.154，269(1983);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。簡(jiǎn)言之，從LB瓊脂平板上刮取每種樣品的菌落并在Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水中混懸至相同的濁度。通過離心收集洗滌過的細(xì)胞沉淀，加入裂解緩沖液(50]nl62.5mMTris-HCl，pH6.8，2%SDS，5%2-巰基乙醇，10%甘油，0，002%溴酚藍(lán))，將樣品在沸水浴中加熱10分鐘。向每種全細(xì)胞裂解物中加入蛋白酶K(25pg，10^12.5mg/ml)并于56。C溫育1小時(shí)。將相同體積加樣到13柳S-PAGE凝膠上，隨后以恒定電流(15mA)跑電泳。將凝膠銀染進(jìn)行LPS分析(參見，例如，P.J.Hitchcock,T.M.Brown,J.Bacteriol.154,269(1983);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，或如所述利用Tris-甘氨酸緩沖液(2OmMTris,15OmM甘氨酸，pH8.3，20%甲醇)以恒定電壓(26V)由凝膠電轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜(參見，例如，H.Towbin,T.Staehelin,J.Gordon,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.76，4350(1979);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。在將印跡與mAbA6—起溫育之前，將膜在1%的醋酸中煮沸1小時(shí)以便在通過常規(guī)免疫方法顯色(參見，例如，R.Pantophlet,L.Brade，H.Brade,J.EndotoxinRes.4，89(1997);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)之前切割a2，6-KD0-GlcN鍵，所述mAbA6識(shí)別脂質(zhì)A的非糖基化的1，4'-雙磷酸化P1，6-連接的GlcN二糖主鏈(參見，例如，L.Brade,O.Holst,H.Brade，Infect.Immun.61,4514(1993);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。將真正的合成脂質(zhì)IVa(化合物406)用作標(biāo)準(zhǔn)(參見，例如，M.Imoto等人，Bull.Chem.Soc.Japan60，2197(1987);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。利用mAb898對(duì)腸道細(xì)菌共同抗原(ECA)免疫印跡進(jìn)行探測(cè)(參見，例如，H.Peters等人，Infect.Immun.50，459(1985);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。將免疫印跡與堿性磷酸酶綴合的山羊抗小鼠IgG(H+L)—起溫育并在氮藍(lán)四唑和5-溴-4-氯-3-丐l咮基磷酸底物存在時(shí)進(jìn)行顯色。實(shí)施例VIII本實(shí)施例描述了在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中所用的電噴射離子化傅立葉變換離子回旋質(zhì)譜(ESIFT-ICRMS)。在負(fù)離子模式下利用APEXII儀(BrukerDaltonics，Billerica，USA)來進(jìn)行ESIFT-ICRMS，所述APEXII儀裝備了7Tesla自動(dòng)屏蔽磁鐵和Apollo離子源。利用廠商提供的標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)序列獲得質(zhì)譜。將樣品以10ng/jal的濃度溶于2-丙醇，水，和三乙胺的50:50:0.001(v/v/v)混合物中，并以2pl/min的流速噴霧。毛細(xì)入口電壓設(shè)置為3.8kV，干氣溫度設(shè)置為150。C。鐠形是電荷解巻積化的并且給出的質(zhì)量數(shù)指的是中性單同位素質(zhì)量。在以往發(fā)表過的來自大腸桿菌K-12菌林W3100的LPS的詳細(xì)結(jié)構(gòu)分析的基礎(chǔ)上解釋峰指配(參見，例如，S.Miiller-Loennies，B.Lindner,H.Brade，J.Biol.Chem.278,34090(2003);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。只將豐度最大的離子總結(jié)于表9中，因?yàn)橛幸恍┓肿臃N類具有重疊同位素峰，其不能被明確鑒定。表9.ESIFT-ICRMS峰列表觀察到的質(zhì)計(jì)算的質(zhì)量a,b量a703.:52703.5171178..671178.6611360..831360.8281404.,861404.8541527.,871527.8631587.,021587.0211797.,221797.2193813.,753813.7343893.,723893.7003915.,713915.6993995.,633995.6534017.,664017.6454038.,694038.6973927.683927.6894007.674007.6554029.64術(shù)9.6544050.704050.698化學(xué)組成c標(biāo)記c磷脂，PE(33:1)(例如1*16:0+1*17:1)2*GlcN,2*GlcN,2*GlcN，2*GlcN,2*GlcN，2*GlcN,1*14:02*P,3*(OH)—14:02*戶，3*(OH)—14:0,1*12:02*尸，4*卿-14:02*戶，4*(OH)-14:0，2*P，4*(OH)-14:0，1*12:02*尸，4*(OH)—14:0,1*12:0LAhexa+l*GalLAheXa+l*GalLAhexa+l*Gal+l*NaUl*Gal+l*NaLAhex,+l*Gal+2*NaLAhexa+l*Gall*Pl*NaLAhexa+l*Gal，2*Glc，3*Hep,l*Rha,3*KD0,3*/M*NaLAhexa+l*Gal，2*Glc,3*Hep，l*Rha,3*KD0,LAhexa+l*Gal,2*Glc，3*Hep，l*Rha，3*KD0，4*A2*NaLAhexa+l*Gal，2*Glc，3*Hep,l*Rha，3*KDO,3*Glc,4*Hep,2*KD0,2*糖形3*Glc,4*Hep,2*KDO,糖形3*Glc，4*Hep,2*跳3*,，糖形3*Glc，4*Hep,2*KDO，4*,糖形3*Glc，4*Hep,2*KD0，4*,,糖形3*Glc，4*Hep,2*KDO,5*戶，糖形PELAtetra脂質(zhì)IVaLApentaLAheXaIIIIII糖形糖形糖形糖形IVIVIVIV3P+1豐尸一麟+l*Na4140.674140.722LAhexa+P2*跳'GlcNAc，l*Gal，3*戶，+2*Na3*:Glc，4*Hep,糖形II4198.744198.735LAhexa+l*GlcNAc,l*Gal，2*KD0，4*尸，+l*Na3*Glc，4:*Hep,糖形II4220.734220.724LAhexa+l'2*KD0，*GicNAc，l*Gal，4*戶，+2*Na3*Glc，4:*Hep,糖形II4300.684300.6982*KD0,'GlcNAc，l*Gal，5*,,+2*Na3*Glc,4:*Hep,糖形II4241.814241.778IAexa+l'2*KD0，'GlcNAc，l*Gal，>腫3*NaGlc，4'*Hep，糖形II4321.734321.745LAhexa+l*2*KD0，'GlcNAc,l*Gal，—尸，3**NaGlc,4'*Hep,糖形II4343.744343.734LAhexa+l*2*KD0,'GlcNAc，l*Gal，化3*Glc,4'Hep,糖形IIa.給出的質(zhì)量數(shù)指的是中性分子的單同位素質(zhì)量，其是在電荷解巻積化后由LPS級(jí)分的負(fù)離子ESIFT-ICR質(zhì)鐠推導(dǎo)出來的。b.粗體的峰以文字標(biāo)記在圖4上。c.縮寫PE-磷脂酰乙醇胺；GlcN-D-葡糖胺；卜磷酸；戶-^舲磷酸乙醇胺；Gal-D-半乳糖；Glc-D-葡萄糖；Hep-L-伊磁-D-甘露-庚糖；KD0-2-酮3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸；Rha-鼠李糖；GlcNAc-^"乙?；鵇-葡糖胺；LAtri，tetra，penu，hexa-脂質(zhì)A的酰化狀態(tài)。實(shí)施例IX本實(shí)施例描述了涉及KPM22和TCM15的實(shí)驗(yàn)中莢膜異多糖酸的量化。通過Kang和Markovitz所報(bào)道方法的改進(jìn)來評(píng)估莢膜異多糖酸(參見，例如，S.Kang,A.Markovitz,J.Bacteriol.93,584(1967);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。刮取來自LB瓊脂平板的菌落并重懸于10mL蒸餾水中至相同濁度(OD,J，浸在沸水浴中15分鐘以釋放細(xì)胞外多糖，并通過離心(10min，8000xg)澄清。通過特異性比色反應(yīng)利用真正的L-巖藻糖作標(biāo)準(zhǔn)，對(duì)上清液測(cè)定莢膜異多糖酸的組分甲基戊糖(L-巖藻糖)，(參見，例如，Z.Dische，L.B.Shettles，J.Biol.Chem.175,595(1948);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。將BW30270勦液樣分離物包括進(jìn)來作為陽(yáng)性對(duì)照。實(shí)施例X本實(shí)施例描述了在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中所用的透射電子顯微方法(TEM)。將于37C生長(zhǎng)在LB培養(yǎng)基中早期對(duì)數(shù)期的細(xì)胞培養(yǎng)物于室溫固定在2%四氧化鋨中90分鐘。在與2%乙酸雙氧鈾造影溶液一起于室溫溫育1小時(shí)之前，將細(xì)胞用蒸餾水洗滌3次。將細(xì)胞用蒸餾水再洗滌3次，隨后通過一系列逐漸升高的乙醇洗滌(30%，50%，70%，90%和無水乙醇，每一種于室溫15min)脫水。將脫水細(xì)胞于室溫在環(huán)氧丙烷中浸浴兩次每次15min，隨后浸入環(huán)氧丙烷/Epon混合物(1:1，v/v)中于4。C過夜溫育。隨后于60。C過夜進(jìn)行聚合作用。將塊切成超薄切片(80-100nm),放在格子上，并在檸檬酸鉛溶液中造影。在PhilipsCM-IOO透射電子顯微鏡上獲得圖像，所述透射電子顯微鏡裝備了自動(dòng)compustage和Kodak1.6Megaplus高分辨率數(shù)碼相機(jī)。實(shí)施例XI本實(shí)施例描述了在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中所用的最小抑菌濃度(MIC)測(cè)定。除了獲自MicroSourceDiscoverySystems的頭孢噻啶之外，所用的抗生素都來自Sigma?；谄洳煌淖饔媚Ｊ胶蛯?duì)細(xì)胞的進(jìn)入性來選擇抗生素。在LB培養(yǎng)基中利用所述的標(biāo)準(zhǔn)連續(xù)微量稀釋方法測(cè)量所有研究的抗生素和藥物的MIC(參見，例如，R.Vuorio，M.Vaara，Antimicrob.AgentsChemother.36，826(1992);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。刮取來自LB瓊脂平板的菌落并混懸于具有不同濃度抗生素的培養(yǎng)基中(1(T細(xì)胞/mL)。將培養(yǎng)物于37nC振蕩(200rpm)孵育18小時(shí)，此時(shí)通過目測(cè)評(píng)估生長(zhǎng)。將報(bào)告的MIC值解釋為藥物完全抑制生長(zhǎng)的最低濃度。實(shí)施例XII本實(shí)施例描述了在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中所用的人TNFa細(xì)胞因子測(cè)定。利用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(ELISA)測(cè)量如上所述分離的LPS制品對(duì)于人單核細(xì)胞(MNC)的胂瘤壞死因子(TNF)a細(xì)胞因子誘導(dǎo)能力。通過劇烈渦旋將LPS樣品重懸于Hanks'平衡鹽溶液并于4。C過夜陳化，隨后在使用前即刻進(jìn)行超聲處理/渦旋。將抽自健康供體的肝素化血液直接與等體積的Hanks，平衡鹽溶液混合并根據(jù)廠商的說明書利用Leucosep系統(tǒng)以Lymphoprep培養(yǎng)基(來自GreinerBio—0ne)通過差速梯度離心進(jìn)行分離。用RPMI1640(3mML-谷氨酰胺，IOO單位/mL青霉素，100pg/mL鏈霉素)將MNC洗滌兩次并轉(zhuǎn)移至96孔平板中(7.5xl()5細(xì)胞/孔)。如之前所述的那樣進(jìn)行MNC的刺激(參見，例如，M.Mueller等人，J.Biol.Chem.279，26307(2004);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，將上清液于4C保存過夜。如Copeland等人所述通過ELISA測(cè)定hTNFa產(chǎn)生(參見，例如，S,Copeland,H.S.Warren，S.F.Lowry，S.E.Calvano，D.Remick,CIin.Diagn.Lab.Immunol.12,60(2005);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。在三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中一式兩份收集數(shù)據(jù)，代表性數(shù)據(jù)集在圖7中報(bào)告。實(shí)施例XIII本實(shí)施例描述了KPM22粘粒文庫(kù)的構(gòu)建。如廠商(Stratagene)所述，通過用Sa〃3A部分消化，連接入SuperCosl中，并利用GigapackIIIXL包裝提取物進(jìn)行包裝，由KPM22基因組DM構(gòu)建粘粒文庫(kù)。通過在LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)來制備用于噬菌體感染的TCM15，所述LB培養(yǎng)基包含0.2。/。(w/v)麥芽糖和10mMMgS04以及另外添加了A5P和G6P。選捧轉(zhuǎn)化體在缺少補(bǔ)充糖磷酸的LB平板上的生長(zhǎng)，以及粘粒載體抗生素抗性標(biāo)記(100^gmL-lAmp)。通過部分Saw3A消化，隨后連接入中等拷貝數(shù)pMBL19克隆載體的化/nHI位點(diǎn)來對(duì)粘粒進(jìn)行亞克隆(參見，例如，Nakano，Y.,等人，Gene162，157-158(1995);在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。實(shí)施例XIV本實(shí)施例描述了在涉及gutQ基因的實(shí)驗(yàn)中所用的材料。引物由Invitrogen合成?；蚪M大腸桿菌K-12MG1655DM購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC700926D)。利用PromegaWizardDNA純化試劑盒進(jìn)行質(zhì)粒純化。對(duì)宿主質(zhì)粒和蛋白質(zhì)表達(dá)分別使用化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue(Stratagene)和大腸桿菌BL21(DE3)(Novagen)。菌林BW30270Cr/A+，大腸桿菌K-12MG1655的衍生物，獲自大腸桿菌品種保藏中心(CGSC并7925)。糖和糖磷酸購(gòu)自Sigma-Aldrich，除了D-葡糖醇6-磷酸是由D-葡萄糖6-磷酸的四硼氫化鈉還原制備的(參見，例如，Bigham,E.C.，等人，(1984)JMedChem27，717-26;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，通過陰離子交換色譜(AGMP-1，Bio-Rad)進(jìn)4亍純化并通過凝膠過濾脫鹽(Bio-GelP-2，Bio-Rad)。利用Bio-Rad蛋白質(zhì)測(cè)定試劑以BSA作為標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。實(shí)施例XV本實(shí)施例描述了gutQ基因的克隆、過表達(dá)和純化。利用標(biāo)準(zhǔn)PCR方法用F-R引物對(duì)(表IO)擴(kuò)增gz/^基因，用和&邊貝進(jìn)行限制性酶切，并直接連接入類似限制性酶切的線性化pT7-7表達(dá)載體中，所述表達(dá)載體已經(jīng)用小牛堿性磷酸酶進(jìn)行過處理。表10_引物的核香酸序列_引物序列(5'-3')(SEQIDNO:l)GGTGCTAGAATTCATATGAGTGMGCACTACTGAACffR(SEQIDNO:2)GMTTCGGATCCAAGTTAAATAATCCCGGCCTGATAGAAATCCTGCbGQF(SBQIDN0:3)GATCGATGTGATCATAACCGGAGAGAGCAATGAGTGAAGCGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGQR(SEQIDN0:4)CGGCTGGCGAAACGTCTGGGATTGAAGGATTAAATAATCCATTCCGGGGATCCGTCGACCKDF(SEQIDNO:5)GCGATGTTGTACTGGTTATCGCCAATACTCGTTGAATAACTGGAAACGCATTGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCGKDR(SEQIDN0:6)GCGACGCACCTGCTTTGCTCArTGTTGTTTATCCTTGAATCTTTACACTACGGATATGMTATCCTCCTTAGGDF(SEQIDN0:7)ATGAATCAGGTTGCCGTTCTCGDR(SEQIDN0:8)CACCAGATTCACCTGTAGCG_Uel位點(diǎn)下劃線。Wa邁M位點(diǎn)下劃線。使用連接混合物轉(zhuǎn)化化學(xué)感受態(tài)大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞，通過限制性分析和DNA測(cè)序來鑒定具有pT7-gutQ質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化體。用質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞，通過限制性分析復(fù)查，并保存于-8QX:。將大腸桿菌BL21(DE3)/pT7-gutQ細(xì)胞于37。C振蕩(250rpm)生長(zhǎng)于包含氨千西林(100mg/L)的2xYT培養(yǎng)基中。一旦培養(yǎng)物到達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)中期(0D6。。~0.7-0.9),讓培養(yǎng)物冷卻至18°C,隨后用最終濃度0.4mM的異丙基-P-D-硫代半乳糖苷進(jìn)行誘導(dǎo)。于181C生長(zhǎng)16小時(shí)后，通過離心(6，500xg,15min,4"C)收獲細(xì)胞。將細(xì)胞沉淀物混懸于20mL緩沖液A(20mMTris-HC1;lmMDL-二硫蘇糖醇(DTT);pH=8.0)中，隨后在冰上超聲波裂解(5x30秒；脈沖之間2分鐘間歇)。通過離心(29，000xg，40min，4'C)去除細(xì)胞碎片并將上清液濾過0.22^MMillex⑧濾器。將溶液加樣到HiLoad(16/10)QSepharose快流柱上，所述柱已經(jīng)用緩沖液A進(jìn)行預(yù)平衡。經(jīng)120分鐘利用緩沖液A中的Q-900mM梯度的NaCl來洗脫蛋白質(zhì)。合并通過SDS-PAGE測(cè)定主要包含重組蛋白質(zhì)(33kDa)的級(jí)分。于室溫在攪拌的同時(shí)緩慢加入硫酸銨飽和溶液，直到達(dá)到15%飽和度。通過離心(29，OOOxg，30min,22。C)澄清溶液，并將上清液提高到30%飽和度。通過離心(29，000xg，30min，22°C)收集蛋白質(zhì)沉淀，重懸于緩沖液A，并相對(duì)于2L的緩沖液A于rC過夜透析。通過SDS-PAGE判斷，制品大于~95°/。同質(zhì)性，產(chǎn)率為180mggutQ/L細(xì)胞培養(yǎng)物。實(shí)施例XVI方法。l還原性條件下于'12%聚丙烯酰胺凝^上對(duì)蛋白質(zhì)樣品(:5-10ing)進(jìn)行SDS-PAGE，并用0.25。/。考馬斯亮蘭R250溶液進(jìn)行染色。通過曲辛-SDSPAGE分析LPS樣品(疊加4%T,3%C;分離16.5°/。T，6%C)(參見，例如，Lesse，A.J.，等人，(1990)JImmunolMethods126,109-17;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，并通過銀染顯現(xiàn)》見察(參見，例如，Hitchcock,P.J.&Brown,T.M.(1983)JBacterio1154,269-77;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。實(shí)施例XVII本實(shí)施例描述了在本發(fā)明過程中所進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中所用的酶測(cè)定。如以往所述(參見,例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W.(2003)JBiolChem278,32771-7;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，通過不連續(xù)半胱氨酸-^唑比色測(cè)定法來測(cè)定API活性(參見，例如，Dische,Z.，Borenfreund，E.(1951)JBiolChem192，583-587;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，所述測(cè)定適于96-孔微板。所有培養(yǎng)板都包含內(nèi)部Ru5P標(biāo)準(zhǔn)和適當(dāng)?shù)腁5P對(duì)照一式三份。一個(gè)單位的酶活性定義為于37C每分鐘轉(zhuǎn)化lpmol糖磷酸。開發(fā)出第二種更加敏感的偶聯(lián)測(cè)定法來測(cè)定粗制細(xì)胞提取物中的API活性，其利用來自擬南芥(JraWdo;^"Ma7/a/7a)的3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸8-磷酸合酶(kdsA)。這種酶催化不可逆的A5P和PEP的立體定向縮合以形成3-脫氧-D-甘露-辛酮糖酸8-磷酸(KD08P)和無機(jī)磷酸。將包含5|nL純化kdsA溶液(3mg/mL;10U/mg)，10mMRu5P，6mMPEP，和于40uLlOOmMTris-HCl(pH-8.25)中的lmMEDTA的反應(yīng)混合物于37。C孵育3分鐘。通過加入10pL細(xì)胞提取物來起始反應(yīng)。5分鐘后，通過加入50jliL的10%(w/v)三氯乙酸來結(jié)束反應(yīng)。通過Aminoff高碘酸-硫代巴比妥酸測(cè)定法(參見，例如，Sheflyan，G.Y.，等人，(1998)JournaloftheAmericanChemicalSociety120，11027-11032;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)測(cè)定產(chǎn)生的KD08P。在這些條件下，kdsA在KD08P的形成中不是限速的。通過于340nm監(jiān)測(cè)NADH的形成利用連續(xù)的分光光度測(cè)定來測(cè)量D-葡糖醇6-磷酸脫氫酶(gutD)活性。在通過加入終濃度為20mM的D-葡糖醇6-磷酸來起始反應(yīng)之前，將酶溶液(100mMTris-HC1，pH=8.7，5mMNAD+)于25。C預(yù)溫育2分鐘。實(shí)施例XVIII本實(shí)施例描述了gutQ的表征。根據(jù)對(duì)于ksdD報(bào)道的方法來類似地進(jìn)行g(shù)utQ的表征(參見，例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W.(2003)JBiolChem278，32771-7;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。簡(jiǎn)言之，對(duì)于底物特異性，將酶樣品稀釋在100mMTrizma-HCl緩沖液(pH-8.25)中并通過用底物(15nMgutQ,10mM糖，lmMEDTA)起始反應(yīng)進(jìn)行測(cè)定。于37°C10分鐘后，包含潛在替代底物D-阿拉伯糖，D-核糖5-磷酸，D-葡萄糖6-磷酸(G6P)，D-葡萄糖l-磷酸，D-葡糖胺6-磷酸，或D-甘露糖6-磷酸的反應(yīng)被終止并測(cè)定酮醣的存在。通過"PNMR測(cè)定D/L-甘油醛3-磷酸，D-赤蘚糖4-磷酸，和D-果糖6-磷酸的產(chǎn)物出現(xiàn)。于37。C利用不連續(xù)的微板測(cè)定法來測(cè)定動(dòng)力學(xué)常數(shù)并通過添加底物來啟動(dòng)。濃度一般為0.2(-10Jn。2分鐘后，終止反應(yīng)(50mMTris-HCl，pH=8.25，5nMgutQ,lmMEDTA)，此時(shí)消耗了大約少于10。/。的底物。一式三份測(cè)定起始速率(r。)并利用非線性最小方差回歸擬合標(biāo)準(zhǔn)Michaelis-Menten方程式以4更對(duì)Ru5P的形成和消失測(cè)定&和t,值。如對(duì)kdsD所述的那樣利用31PNMR測(cè)定平衡常數(shù)(X)(參見，例如，Meredith,T.C.&Woodard，R.W.(2003)JBiolChem278，32771-7;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。通過將酶稀釋在不同pH值(pH-6.25-10，于37。C進(jìn)行調(diào)節(jié))的BTP緩沖液中來測(cè)定gutQ的pH最適值。以3分鐘的反應(yīng)時(shí)間如上面所述測(cè)量活性，一式三份(100mMBTP，15nMgutQ，10mMA5P，1mMEDTA)。將分離的gutQ酶樣品稀釋在100mMTri纖-HCl緩沖液(pKh8.25)中并與不同的二價(jià)金屬或EDTA—起于4'C溫育30分鐘。隨后以3分鐘的反應(yīng)時(shí)間一式三份在飽和底物條件下于37。C測(cè)定剩余活性(15nMgutQ，10mMA5P，IOjaM金屬或EDTA)。實(shí)施例XIX本實(shí)施例描述對(duì)于涉及gutQ的實(shí)驗(yàn)的大腸桿菌菌林構(gòu)建和生長(zhǎng)條件。將大腸桿菌菌林BW30270用作宿主，根據(jù)Datsenko和Wanner的方法利用噬菌體入Red重組酶系統(tǒng)進(jìn)行染色體guW和ir^"基因破壞(參見，例如，Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)ProcNat1AcadSciUSA97，6640-5;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。使用50pg/mL的卡那霉素和氯霉素。分別使用引物對(duì)GQF-GQR和KDF-KDR,以pKD13(h力)或pKD3(c")作為模板，來構(gòu)建BW30270(A^/^;:h/7)和BW30270(A^/^7.'.'cW)，其列在表10中。隨后如所述利用FLP重組酶系統(tǒng)切除抗性標(biāo)記(參見，例如，Datsenko,K.A.&Wanner,B.L.(2000)ProcNatlAcadSciUSA97，6640-5;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。利用GQF-GQRPCR產(chǎn)物插入片段由BW30270(△1&歷類似地構(gòu)建BW30270(△^z/^Air&A，所不同的是培養(yǎng)基和平板在所有時(shí)間都添加了G6P(1(^M)和ASP(1華M)，以便隨后在電轉(zhuǎn)化之后進(jìn)行操作。對(duì)所有使用菌林進(jìn)行菌落純化，測(cè)試所有抗生素抗性的喪失，并對(duì)相關(guān)基因座進(jìn)行測(cè)序以確認(rèn)預(yù)期的缺失位點(diǎn)。將培養(yǎng)物于37。C振蕩(250rpm)生長(zhǎng)在添加了硫胺(ljig/mL)和指定碳源的M9基本培養(yǎng)基(26)或MOPS基本培養(yǎng)基中(參見，例如，Neidhardt，F(xiàn).C.，Bloch，P.L&Smith,D.F.(1974)JBacteriol119，736-47;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。將BW30W0(A^/^Ai:^")培養(yǎng)物另外添加G6P(1(^M)和A5P(5-5(^M)。向攜帶pT7-7(AmpR)質(zhì)粒的那些菌林添加氨芐西林(1OOjig/mL)。實(shí)施例XX本實(shí)施例描述了細(xì)胞提取物的制備，用于酶測(cè)定、LPS分析和RT-PCR。過夜培養(yǎng)物生長(zhǎng)在基本培養(yǎng)基中，所述基本培養(yǎng)基具有甘油(0.2W作為唯一碳源和指定添加劑。將培養(yǎng)物稀釋(1:20v/v)入新鮮基本培養(yǎng)基中并于37。C振蕩兩小時(shí)以便讓細(xì)菌恢復(fù)指數(shù)生長(zhǎng)。在此時(shí)期通過添加A5P(5pM)和G6P(10pM)預(yù)i秀導(dǎo)BW30270(△^/^Air^幼的培養(yǎng)物以便上調(diào)己糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)("力i)。通過離心將細(xì)胞沉淀以除去微量G6P(6，500xg，5min，22°C),隨后接種入新鮮培養(yǎng)基。當(dāng)指出時(shí)，向培養(yǎng)物中加入10mMD-葡糖醇，再繼續(xù)生長(zhǎng)四到六小時(shí)以便讓gW操縱子上調(diào)，此時(shí)所有培養(yǎng)物都在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的早期到中期。通過離心(6，500xg，5min,4'C)收獲細(xì)胞。用水冷的l%NaCl溶液洗滌用于測(cè)定API和gutD活性的級(jí)分兩次，并接著重懸在緩沖液(20mMTris-HC1,ImMDTT,pH=8.O)中。將細(xì)胞用超聲處理破裂，通過離心(29，000xg，20min，4。C)澄清，并冷凍。用Dulbecco磷酸鹽緩沖鹽水洗滌用于LPS分析的樣品2次，將沉淀重新懸浮在裂解緩沖液G00mMTris(pH=6.8)，2%SDS,4%2-巰基乙醇，10%甘油)中。根據(jù)Hitchcock和Brown的方法處理基于OD綱咖等數(shù)目的細(xì)胞(參見，例如，Hitchcock,P.J.&Brown,T.M.(1983)JBacteriol154，269-77;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。根據(jù)生產(chǎn)商手冊(cè)將待分析RNA的細(xì)胞沉淀快速重新懸浮在最大細(xì)菌增量試劑(MaxbacterialEnhancementreagent)中并利用TRIzol(Invitrogen)進(jìn)行提取。通過用無RNA酶的DNA酶消化來進(jìn)一步純化RNA樣品并利用RNeasymini試劑盒(Qiagen)進(jìn)行分離。通過瓊脂糖電泳檢查RNA的質(zhì)量并利用在260nm的UV吸光度定量。利用SuperscriptII一步RT-PCR系統(tǒng)(Invitrogen),才艮據(jù)指導(dǎo)，用lpg純化的總RNA作為模板和GDF-GDR引物(0.2pM)擴(kuò)增^/M基因的最開始的342個(gè)堿基對(duì)，來進(jìn)行定量RT-PCR。實(shí)施例XXI本實(shí)施例描述了gutQ的純化和表征。利用Q-Sepharose陰離子交換層析法隨后進(jìn)行硫酸銨沉淀，以兩步完成純化到均質(zhì)。通過SDS-PAGE,所述蛋白質(zhì)表現(xiàn)為單一的清晰的高分子量條帶(~33kDa),并且比活性是329U/mg。確定gutQ的生化特性類似于kdsD的生化特性。動(dòng)力學(xué)參數(shù)，pH最適值，輔因子需求的缺乏和四級(jí)結(jié)構(gòu)都是相當(dāng)?shù)?。將與A5P享有共同的官能度的單糖作為gutQ的潛在備選底物進(jìn)行測(cè)試。在半胱氨酸-味唑比色測(cè)定中，2-酮己糖和2-酮戊糖形成紫紅色的生色團(tuán)，其在540nm吸收光(參見，例如，Dische,Z.,Borenfreund，E.(1951)JBiolChem192，583-587;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)?？梢酝ㄟ^測(cè)量樣品與對(duì)照在A"^吸光度的比率的增加來觀察醛糖向酮糖的轉(zhuǎn)化。所測(cè)試的糖都沒有被轉(zhuǎn)化為它們各自的酮糖形式。短鏈磷酸化醛糖D/L-甘油醛3-磷酸和D-赤蘚糖4-磷酸以及D-果糖6-磷酸作為通過"P-NMR確定的備選底物。在檢測(cè)限內(nèi)，顯示gutQ是A5P和Ru5P的特異性糖磷酸醛醇-酮醇異構(gòu)酶。實(shí)施例XXII本實(shí)施例證明gutQ能夠維持脂多糖生物合成。為了評(píng)估gutQ作為API在體內(nèi)發(fā)揮功能的能力，利用入Red(Y，P，"0)同源重組系統(tǒng)構(gòu)建BW3O27O(A^^0和BW30270(Ai:&幼(參見,例如，Datsenko，K丄&Wa畫r，B丄(2000)ProcNatlAcadSciUSA97,6640-5;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。沒有一個(gè)突變是致死的，示意其他API編碼基因的存在，所述其他API編碼基因可以提供基本的LPS生物合成所需要的足夠量的A5P。不管gut操縱子是否被誘導(dǎo)，LPS凝膠顯示幾乎等量的野生型K-12LPS核心(見，圖8A),提示A5P合成在這些生長(zhǎng)條件下在任何菌林中都不是限速的。在BW30270(Aird^)中基礎(chǔ)水平的gutQ足以提供足夠的A5P來維持存活力并且制造功能性LPS層，強(qiáng)烈提示gutQ在細(xì)胞內(nèi)作為API發(fā)揮功能。實(shí)施例XXIII本實(shí)施例描述了在AAPI菌林BW30270(AgutQAkdsD)中的LPS生物合成。通過利用G6P誘導(dǎo)型己糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(w力/;)提供外源A5P來破壞在BW30270中的i7/^和ir^"基因。A5P是高度親和性的(盡管是不可誘導(dǎo)的)己糖磷酸轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)(y力/)的底物(參見，例如，Kadner，R丄，Murphy，G.P.&Stephens,C.M.(1992)JGenMicrobiol138(PtlO)，2007—14;Rick，P.D.&Osborn，M.J.(1972)ProcNat1AcadSciUSA69，3756-60;Eidels，L.，Rick,P.D.,Stimler，N.P.&Osborn,M.J.(1974)JBacteriol119，138-43;在此將每一篇的全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。將具有低濃度的無機(jī)磷酸(l.3mM)的M0PS-基本培養(yǎng)基用于防止無機(jī)磷酸抑制介導(dǎo)的轉(zhuǎn)運(yùn)(參見，例如，Shattuck-Eidens，D.M.&Kadner，R.J.(1981)JBacteriol148，203-9;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的天然底物G6P是A5P有效誘導(dǎo)并轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞中所需要的。單獨(dú)的A5P或G6P不能恢復(fù)生長(zhǎng)，因?yàn)樵谘芯窟M(jìn)程中不存在可檢測(cè)到的生長(zhǎng)，除非A5P和G6P都包含在培養(yǎng)基中(見，圖9A)。因此，gutQ和kdsD是對(duì)于KD0合成的唯一細(xì)胞內(nèi)A5P來源。在培養(yǎng)基中用A5P補(bǔ)充培養(yǎng)物，從而使脂多糖生物合成能夠進(jìn)行。通過利用其中耗盡了培養(yǎng)基中的A5P的過夜培養(yǎng)物作為接種物和延長(zhǎng)溫育時(shí)間，在BW30270(A^/^AU^)中合成的成熟LPS的量取決于包含在培養(yǎng)基中的A5P的量(圖9B)。實(shí)施例XXIV本實(shí)施例描迷了gut操縱子的表達(dá)。將BW30270，BW30270(厶gW0,和BW30270(pT7-gutQ)培養(yǎng)在包含雙重碳源-D-葡萄糖和D-葡糖醇的M9基本培養(yǎng)基中。所有的三種菌林以幾乎相同速率生長(zhǎng)并且在D-葡萄糖從培養(yǎng)基中耗盡后顯示約40分鐘的特征性的通常長(zhǎng)的二次生長(zhǎng)遲滯時(shí)間(參見，例如，Lengeler,J.&Lin，E.C.(1972)JBacteriol112，840-8;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)。在這些條件下，誘導(dǎo)不受gutQ的影響。將菌林BW30270，BW30270(Ag"/^，和BW30270(△i^^培養(yǎng)在包含甘油作為碳源的M9基本培養(yǎng)基中。甘油是B類碳源并且不導(dǎo)致明顯的分解代謝產(chǎn)物阻遏(參見，例如，Lengeler，J.W.(1986)MethodsEnzymol125,473-85;在此將其全部?jī)?nèi)容通過參考引用并入本文)，通過升高的cAMP水平促進(jìn)D-葡糖醇對(duì)^^操縱子的誘導(dǎo)。在所有的三種菌林中測(cè)量總API(kdsD和/或gutQ)和gutD比活性(表11)。表11.^勿應(yīng)炎參參哞^/^和^V^^活遂義應(yīng)^f麥菌林a葡糖醇bgutD活性11API活性"WT->114±3+242±1448±5——>113±3+374±1315±2△她"——>12±1+581±4846±5pT7-gutQ——>12573±78+323±282457±117a菌林培養(yǎng)在具有0.2%甘油作為碳源的M9基本培養(yǎng)基中。b在收獲前4小時(shí)，將D-葡糖醇以10mM加入顯示(+)的培養(yǎng)物中。。以nmoles/min/mg報(bào)道比活性。d值包括kdsD和/或gutQ活性。BW3O27O(A^^0和BW30270(AircTs^的^/t操縱子保持可i秀導(dǎo)，當(dāng)與親本BW30270菌林比較時(shí)，在通過gutD活性估計(jì)的誘導(dǎo)程度上僅有兩倍的差異。當(dāng)將D-葡糖醇加入培養(yǎng)基中時(shí)，在BW30270和BW30270(Air^幼中總的API活性水平都增加，顯示gutQ與gutD—起被上調(diào)。在加入D-葡糖醇后，在BW30270(A^/^)中觀察到的API水平?jīng)]有改變，盡管菌林保持能夠上調(diào)gutD。在缺失山梨糖醇的培養(yǎng)基中，大部分的API活性歸因于kdsD，證實(shí)了鑒定kdsD為組成型表達(dá)的LPS生物合成酶。將BW30270(pT7-gutQ)用于研究升高的API水平對(duì)gW操縱子的作用(表10)。API水平的基礎(chǔ)水平在BW30270(pT7-gutQ)中增加了~250倍,盡管在gutD水平中觀察不到明顯的差異，因?yàn)椴倏v子保持被阻遏，除非在培養(yǎng)基中提供D-葡糖醇。實(shí)施例XXV本實(shí)施例顯示了A5P對(duì)于gut操縱子的上調(diào)是重要的。因?yàn)楫?dāng)單一的API基因被破壞時(shí)在調(diào)節(jié)中沒有觀察到差異，不能直接觀察到表型可能是由于API的第二拷貝的抑制作用。在BW30270(△^z/^Air&^中研究gW操縱子的可誘導(dǎo)性。將過夜培養(yǎng)物培養(yǎng)在MOPS基本培養(yǎng)基(0.2%甘油，15pMA5P，10^MG6P)中,并且稀釋到新鮮培養(yǎng)基(0.2%甘油，5pMA5P，10pMG6P)中，以將細(xì)胞回復(fù)到指數(shù)生長(zhǎng)。在振蕩2小時(shí)后，收獲細(xì)胞并且將其用于接種僅包含甘油和A5P的培養(yǎng)基。因?yàn)榧?xì)胞對(duì)于"力p轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行了預(yù)先誘導(dǎo)，沒有加入G6P。選擇兩個(gè)濃度的A5P(5和5(^M)從而使LPS水平和生長(zhǎng)速率方面的差異在研究進(jìn)程中最小化。在50jaMA5P,gutD保持可誘導(dǎo)到接近野生型水平(表12)。表12.在△Ji7/細(xì)胞提取物中的弄gz^f;的比活性義濕許蘿菌林a葡糖醇bA5P0iM)gutD活性。gutQ活性cAg一AMy"H^JIN.D.d"~+50278±33N.D.d—5〉1N,D.d+59.8±1N.D.dAgu豐脅"—5>11366±180pT7-gutQ+5356±27976±101a菌林培養(yǎng)在包含0.2°/。甘油的MOPS基本培養(yǎng)基中并且用1OpMG6P/5jiMA5P進(jìn)行預(yù)先誘導(dǎo)b在收獲前4小時(shí)，將D-葡糖醇以10mM加入到顯示(+)的培養(yǎng)物中。c以nmoles/min/mg才艮道的比活性。dN.D.-沒有檢測(cè)到活性.gutQ蛋白質(zhì)產(chǎn)物本身對(duì)于表達(dá)不是必需的。當(dāng)A5P濃度減少到5pM時(shí)，在D-葡糖醇培養(yǎng)的細(xì)胞中在gutD活性上具有顯著的和可再現(xiàn)的減少。然而，在比較時(shí)，LPS的水平僅是稍微減少(圖9C)。這說明在A5P水平和gutD的量之間存在直接的關(guān)聯(lián)，并且差異不是由于由消耗LPS層導(dǎo)致的多效作用的后果。gutD基因的表達(dá)水平的分析顯示gutD的測(cè)量的比活性的減少與mRNA的量相關(guān)(圖9D)。當(dāng)由編碼gutQ的質(zhì)粒補(bǔ)償時(shí)，^/f操縱子在相同的生長(zhǎng)條件下保持可誘導(dǎo)。實(shí)施例XXVI本實(shí)施例顯示當(dāng)過量表達(dá)時(shí)，基因msbA使AKDO大腸桿菌細(xì)菌細(xì)胞在不包含D-阿拉伯糖5-磷酸培養(yǎng)基補(bǔ)充的瓊脂上生長(zhǎng)。最初將MsbA鑒定為L(zhǎng)pxL(HtrB)溫度敏感性表型的多拷貝阻抑基因(Polissi等人，1996,Mol.Microbiol.20:1221-1233，完全作為參考并入本文)。用KPM22基因組DNA的黏粒文庫(kù)補(bǔ)償營(yíng)養(yǎng)缺陷型TCM15(義J^^熟菌林揭示msbA是AKdo表型的多拷貝阻抑基因。分離包含msb^基因座的17個(gè)單獨(dú)的勦?？寺?。包含僅具有與野生型相同的完整野生型ms^序列的3.5kb插入物的黏粒亞克隆(p麗W52)能夠直接拯救TCM15，如通過A5P營(yíng)養(yǎng)缺陷型的喪失和在固體瓊脂上菌落形成能力的恢復(fù)來判斷。TCM15(pMMW52)的生長(zhǎng)速率驚人地類似于KPM22大腸桿菌菌林(Meredith等人，2006,ACSChem.Biol.1:33-42，完全作為參考并入本文)。特此，將上述說明書中提及的所有的出版物和專利通過參考引用并入本文。盡管本發(fā)明結(jié)合具體的優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行了描述，應(yīng)該理實(shí)際上，對(duì)于相關(guān)領(lǐng)域的技術(shù)人員顯而易見的進(jìn)行本發(fā)明所述方式的各種改進(jìn)意欲落在后附的權(quán)利要求的范圍內(nèi)。權(quán)利要求1.一種組合物，其包含實(shí)質(zhì)上缺乏脂多糖的活的大腸桿菌的外膜。2.權(quán)利要求l的組合物，其包含實(shí)質(zhì)上缺乏脂多糖的活的大腸桿菌。3.—種組合物，其包含具有KD0廣脂質(zhì)IVA生物合成途徑中的破壞的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。4.權(quán)利要求3的組合物，其中所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌缺乏D-阿拉伯糖5-磷酸異構(gòu)酶(API)表達(dá)。5.權(quán)利要求3的組合物，其中所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌包含突變從而使所述菌林實(shí)質(zhì)上不含KD0。6.權(quán)利要求5的組合物，其中所述突變選自由突變的gutQ基因和突變的kdsD基因組成的組。7.權(quán)利要求3的組合物，其中所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌包含突變從而使所述突變消除在KD02和脂質(zhì)IVA之間的關(guān)聯(lián)。8.權(quán)利要求7的組合物，其中所述突變包含突變的msbA基因和突變的kdsA基因。9.權(quán)利要求7的組合物，其中所述突變包含突變的msbA基因和突變的kdsB基因。10.權(quán)利要求7的組合物，其中所述突變包舍突變的msbA基因和突變的waaA基因。11.權(quán)利要求7的組合物，其中所述突變包含突變的yhjD基因和突變的kdsA基因。12.權(quán)利要求7的組合物，其中所述突變包含突變的yhjD基因和突變的kdsB基因。13.權(quán)利要求7的組合物，其中所述突變包含突變的yhjD基因和突變的waaA基因。14.權(quán)利要求3的組合物，其中所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌的外膜表達(dá)脂質(zhì)IVa。15.生產(chǎn)脂質(zhì)IVA的方法，其包括從權(quán)利要求14的所述活的革蘭氏陰性細(xì)菌中提取脂質(zhì)IVA。16.—種用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的組合物，其包含權(quán)利要求l的組合物。17.—種組合物，其包含缺乏gutQ和kdsD基因表達(dá)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌。18.權(quán)利要求17的組合物，其還包含外源D-阿拉伯糖5-磷酸。19.權(quán)利要求17的組合物，其中所述革蘭氏陰性細(xì)菌還過量表達(dá)msbA。20.—種組合物，其包含含有外膜的活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌，其中所述外膜包含脂質(zhì)IVA。21.權(quán)利要求20的組合物，其中所述外膜實(shí)質(zhì)上無LPS表達(dá)。22.—種用于在受試者中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的方法，其包括向所述受試者施用權(quán)利要求1的組合物，從而使所述施用誘導(dǎo)免疫應(yīng)答。全文摘要本發(fā)明提供無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌。特別地，本發(fā)明提供在外膜內(nèi)實(shí)質(zhì)上缺乏脂多糖(LPS，內(nèi)毒素)的活的革蘭氏陰性細(xì)菌(例如，大腸桿菌(E.coli))。本發(fā)明進(jìn)一步提供活的無毒的革蘭氏陰性細(xì)菌的產(chǎn)生方法及其用途。本發(fā)明還提供用于誘導(dǎo)免疫應(yīng)答和用于研究和開發(fā)治療劑的組合物和方法。文檔編號(hào)A61K39/00GK101472604SQ200780008031公開日2009年7月1日申請(qǐng)日期2007年1月19日優(yōu)先權(quán)日2006年1月19日發(fā)明者P·阿加沃爾,R·W·伍達(dá)德,T·C·梅瑞迪斯申請(qǐng)人:密歇根大學(xué)董事會(huì)