專(zhuān)利名稱：一種利用α-半乳糖苷酶合成α-低聚半乳糖的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶法合成方法，特別是涉及一種利用α-半乳糖苷酶合成α-低 聚半乳糖的方法。
背景技術(shù)：
在動(dòng)物中，含有α-半乳糖苷結(jié)構(gòu)的低聚糖通常與細(xì)胞表面脂類(lèi)、蛋白質(zhì)及 一些未知的復(fù)合糖相結(jié)合，α “半乳糖苷結(jié)構(gòu)大多存在于低聚糖的非還原性末端，有 著重要的生理功能。其中，兩個(gè)半乳糖殘基通過(guò)α-糖苷鍵連接的α-低聚半乳二糖 (a-Galactobiose, α -Gal2)參與了各種基于分子機(jī)理的配體-受體相互作用的生理過(guò)程 如免疫和病原體吸附細(xì)胞等重要的生理過(guò)程。α "Gal2還可以防止病原體感染、中和毒素、 調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等功能。由于兩個(gè)半乳糖殘基之間有多種連接方式，因此a-Gal2存在著多 種同分異構(gòu)體，而不同的同分異構(gòu)體有著不同的功能。α -低聚半乳糖作為一種功能性低聚 糖，有廣闊的應(yīng)用前景。α-半乳糖苷酶與其它的糖苷酶一樣都是糖蛋白，能催化很多底物末端的半乳糖 的斷裂，包括線性底物、有分支的寡糖、多糖以及人工合成的底物。很多動(dòng)物、植物、微生物 都能產(chǎn)生α-半乳糖苷酶，這些酶通常以異構(gòu)酶的形式存在。不同的微生物產(chǎn)生的α-半 乳糖苷酶的最適PH和溫度的范圍各不相同。α -半乳糖苷酶在食品、飼料及醫(yī)藥工業(yè)各方 面都具有很重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，α _低聚半乳糖的生產(chǎn)大致分為4種從天然原料提取、天然多糖水解、化學(xué) 合成、酶法合成。從天然原料中提取，主要是從豆科植物的種子中提取，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外報(bào)道 的有關(guān)提取原料主要有大豆、羽扇豆、豇豆、豌豆等，獲得的產(chǎn)物種類(lèi)較多，難以分離純化。 天然多糖轉(zhuǎn)化產(chǎn)品得率低，產(chǎn)物復(fù)雜，不易獲得純品?；瘜W(xué)合成法使用大量化學(xué)試劑，毒性 大，易殘留，生產(chǎn)成本高，并且需要繁瑣的羥基保護(hù)和去保護(hù)步驟，在實(shí)際生產(chǎn)中不可行。從 食品工業(yè)角度看，作為一種大量使用的功能性基料，必須考慮原料充足，方便，易得，無(wú)毒 性，生產(chǎn)成本低等問(wèn)題，因此，合理的方法是酶法合成。酶法合成主要以半乳糖為底物，通過(guò) α-半乳糖苷酶催化合成α-低聚半乳糖。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是以半乳糖作為底物，加入微生物來(lái)源的α-半乳糖苷酶，通過(guò) α-半乳糖苷酶的催化作用制備α-低聚半乳糖，并分離純化不同α-低聚半乳糖產(chǎn)物。


圖1為酶合成反應(yīng)產(chǎn)物的HPLC圖譜圖2為合成的α -低聚半乳糖的質(zhì)譜3為合成的α -低聚半乳糖的1H-NMR圖譜圖4為合成的α -低聚半乳糖的13C-NMR圖譜
具體實(shí)施例方式稱取l.Og半乳糖置于螺口瓶中，再加入一定量蒸餾水后進(jìn)行高壓處理(121°C， 20min)，使其完全溶解得到過(guò)飽和半乳糖溶液，自然冷卻至反應(yīng)溫度40°C。然后加入適量 的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液(PH5.5)和蒸餾水調(diào)整半乳糖濃度至60% (w/v) 0稱取一定量的 α-半乳糖苷酶(30U/g半乳糖)加入上述體系并置于40°C水浴中開(kāi)始反應(yīng)，然后每隔一定 時(shí)間取樣，沸水浴IOmin使酶滅活，得到各種α -低聚半乳糖產(chǎn)物。α-低聚半乳糖產(chǎn)物的分離純化方法反應(yīng)液加適量的去離子水稀釋后，經(jīng) 0.45 μ m濾膜過(guò)濾，濾液過(guò)活性炭-硅藻土(1 1, w/w)中壓層析柱。層析柱用一系列線 性濃度梯度的乙醇進(jìn)行洗脫，得到4種低聚半乳糖產(chǎn)物，其中2種互為同分異構(gòu)體的α-低 聚半乳二糖(包括α-(1 —6)Gal2和α - (1 — 3) Gal2)，2種為互為同分異構(gòu)體的α-低 聚半乳三糖(其中一種為—6)Gal3，另外一種可能為α-(1 — 3)Gal3))，合并不同 反應(yīng)產(chǎn)物、濃縮、冷凍干燥。反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1H-NMI^13C-NMR和ESI-TOF-MS分析。
權(quán)利要求
一種酶法合成α 低聚半乳糖的方法，其特征在于以半乳糖作為底物，由來(lái)源于微生物的α 半乳糖苷酶來(lái)催化合成反應(yīng)，合成4種α 低聚半乳糖，其中2種互為同分異構(gòu)體的α 低聚半乳二糖，2種為互為同分異構(gòu)體的α 低聚半乳三糖。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的α-低聚半乳糖的合成方法，其特征在于利用β-半乳糖苷 酶水解乳糖，制備得到半乳糖，作為酶反應(yīng)的底物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的α-低聚半乳糖的合成方法，其特征在于作為底物的半乳糖 濃度為50%，ρΗ4. 5，反應(yīng)溫度為40°C，酶的用量為30U/g。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的α-低聚半乳糖的合成方法，其特征在于反應(yīng)產(chǎn)物的分離純 化方法為反應(yīng)液加適量的去離子水稀釋后，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過(guò)濾，濾液過(guò)活性炭-硅藻土 (1 1, w/w)中壓層析柱。層析柱用一系列線性濃度梯度的乙醇進(jìn)行洗脫，合并、濃縮、冷 凍干燥，得到不同反應(yīng)產(chǎn)物。
全文摘要
本發(fā)明是一種利用α-半乳糖苷酶合成α-低聚半乳糖的方法，現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外報(bào)道的有關(guān)提取原料主要有大豆、羽扇豆、豇豆、豌豆等，獲得的產(chǎn)物種類(lèi)較多，難以分離純化?；瘜W(xué)合成法使用大量化學(xué)試劑，毒性大，易殘留，生產(chǎn)成本高。本發(fā)明為酶法合成，具有原料充足，方便，易得，無(wú)毒性，生產(chǎn)成本低等特點(diǎn)。以半乳糖為底物，通過(guò)α-半乳糖苷酶催化合成得到4種α-低聚半乳糖，其中2種互為同分異構(gòu)體的α-低聚半乳二糖，2種為互為同分異構(gòu)體的α-低聚半乳三糖。α-低聚半乳糖可參與各種基于分子機(jī)理的配體-受體相互作用的生理過(guò)程如免疫和病原體吸附細(xì)胞等，作為一種新型功能性低聚糖，具有廣闊的應(yīng)用前景。
文檔編號(hào)C12P19/14GK101974583SQ201010286810
公開(kāi)日2011年2月16日 申請(qǐng)日期2010年9月20日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月20日
發(fā)明者葉紅, 向小麗, 唐玉紅, 孫怡, 曾曉雄 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)