專利名稱：IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種能作為酶標(biāo)記抗體用于免疫測(cè)定的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶 融合蛋白，屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
堿性磷酸酶(AlkalinePhosphatase, AP)和辣根過(guò)氧化物酶(Horseradish Peroxidase,HRP)是酶免疫測(cè)定(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)中較為常 用的免疫標(biāo)記用酶。在ELISA中應(yīng)用，AP系統(tǒng)的敏感性一般高于應(yīng)用HRP系統(tǒng)，空白值也 較低。但由于AP較難得到高純度制劑，穩(wěn)定性較HRP低，價(jià)格較HRP高，制備酶結(jié)合物時(shí)得 率較HRP低等原因，因此國(guó)內(nèi)在ELISA中一般均采用HRP。堿性磷酸酶在免疫測(cè)定中作為標(biāo)記用酶，是通過(guò)催化相應(yīng)底物顯色實(shí)現(xiàn)的。常用 標(biāo)記用酶的AP有兩個(gè)來(lái)源，分別從大腸桿菌和小牛腸膜中提取，牛小腸堿性磷酸酶比活高 達(dá)2000U/mg蛋白，大腸桿菌堿性磷酸酶比活40-60U/mg蛋白。大腸桿菌為原核生物而不能 對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行糖基化。序列分析表明AP活性中心Aspl01-Serl02-Ala103序列高度保守。 糖基化可能是影響其活性的重要因素，但并未得到證實(shí)。目前，免疫酶標(biāo)試劑制備方式是采用雙功能試劑(如戊二醛，過(guò)碘酸鹽等)將抗體 與酶偶聯(lián)，按以上方法制備的結(jié)合物一般混有未結(jié)合的酶和抗體。理論上結(jié)合物中混有游 離酶不影響ELISA中最后的酶活性測(cè)定，因經(jīng)過(guò)洗滌，非特異性吸附于固相上的游離酶已 被洗去。但游離的抗體則會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)相應(yīng)的固相抗原，因而減低結(jié)合到固相上的酶 標(biāo)抗體量，故制備的結(jié)合物應(yīng)予以純化。因此，傳統(tǒng)的抗體與酶的標(biāo)記方式需要交聯(lián)、純化 等多步蛋白質(zhì)操作；而且偶聯(lián)后往往存在蛋白質(zhì)活性降低，抗體_酶結(jié)合物不均一，因而降 低了檢測(cè)的靈敏度。利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)免疫測(cè)定標(biāo)記用酶，可改變從生物體分離提純的生產(chǎn)方 式，也是得到符合標(biāo)記要求高純度酶的一條新途徑。而將標(biāo)記酶直接與抗體融合表達(dá)的方 式制備，可克服化學(xué)交聯(lián)劑偶聯(lián)方法的弊端。理論上盡管將堿性磷酸酶與抗體融合表達(dá)，但目前研究主要集中在單鏈抗體 (ScFv)與AP融合蛋白的構(gòu)建，但是每檢測(cè)一種抗原就要制備相應(yīng)的融合抗體，在不能或不 便構(gòu)建抗體-酶融合蛋白時(shí)則融合標(biāo)記受阻。因此，尋找一種可結(jié)合多種一抗的二抗并與 酶以融合表達(dá)方式來(lái)制備免疫酶標(biāo)試劑具有重要意義。IgG抗體親和肽是來(lái)自葡萄球菌蛋白A (staphylococcal protein A, SpA)的ZZ結(jié) 構(gòu)域。SpA為金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁的單鏈多肽，分子量為42kD，能通過(guò)疏水作用結(jié)合人、 兔等多種動(dòng)物IgG的Fc段，且這種結(jié)合不影響IgG的Fab段與抗原特異性結(jié)合的免疫活性， 根據(jù)SpA這一特性，SpA不僅用于免疫球蛋白和單克隆抗體的純化，還被多種標(biāo)記物(HRP， AP，F(xiàn)ITC，膠體金等)偶聯(lián)標(biāo)記用于免疫測(cè)定；因SpA與IgG結(jié)合不受種屬限制，被稱為“廣 泛二抗”。
針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的在于提供一種無(wú)需再次標(biāo)記即可用于酶免疫測(cè) 定的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白(IgG affibody-Alkaline Phosphatase fusion protein，簡(jiǎn)寫 IgG Ab-AP)。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的一種IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗體親和肽和堿性磷酸 酶構(gòu)成的融合蛋白，其一經(jīng)產(chǎn)生即具有與IgG抗體的結(jié)合活性和AP催化活性，且二者 標(biāo)記比例為1 1;該融合蛋白的酶比活力為386 士 82U/mg;與兔IgG抗體的親和常數(shù) Ka ^ 6. 7 X IO7L · moF10本發(fā)明的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法，步驟如下(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，然后構(gòu)建重組載體；(2)電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，選取重組載體整合到酵母基因組上的菌株；(3)經(jīng)G418抗性壓力篩選高拷貝表達(dá)菌株；(4)培養(yǎng)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白；(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。具體如下(1)構(gòu)建重組載體首先在分泌型堿性磷酸酶基因上游和下游提供限制性內(nèi)切酶 切割位點(diǎn)Sac I及Pst I，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增不帶N-信號(hào)肽及C-末端擴(kuò)展肽的堿性磷酸酶 基因，將其插入到IgG抗體親和肽下游；然后在IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶基因上游和下 游提供限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)Not I，通過(guò)PCR擴(kuò)增并插入pPIC9K的Not I位點(diǎn)，構(gòu)建畢赤 酵母表達(dá)載體PlgG Ab-AP/9k ；(2)電轉(zhuǎn)化，并選取整合成功的菌株①挑取巴斯德畢赤酵母單菌落，接種于5mLYPD培養(yǎng)基中，30°C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜， 得過(guò)夜培養(yǎng)物；②取100 50(^1^的過(guò)夜培養(yǎng)物接種至5001111^ 0培養(yǎng)基中，301，250印111培養(yǎng)至 OD6tltl 達(dá)到 1.3-1. 5，得菌液；③將菌液于4°C，3000rpm離心5min，然后用500mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌體；④按步驟③離心，用250mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；⑤按步驟③離心，用20mL冰預(yù)冷的IM的山梨醇將菌體沉淀重懸；⑥按步驟③離心，用ImL冰預(yù)冷的IM的山梨醇重懸菌體；將細(xì)胞置于冰上；⑦將1 μ g經(jīng)Sal I線性化的pAb_AP/9k載體DNA加入到80 μ L細(xì)胞中，將混合物 移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；⑧電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓1500V，電容25 μ F，電阻200 Ω ；Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)進(jìn)行畢 赤酵母的電轉(zhuǎn)化，將目的基因?qū)氲疆叧嘟湍钢校虎嵬ㄟ^(guò)組氨酸缺陷型突變的互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子將電轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞立即涂布到缺少 組氨酸的MD瓊脂平板上，在30°C孵育48-72h ；⑩挑取MD平板的酵母單菌落，通過(guò)菌落PCR直接檢查載體是否與基因組整合，選 取載體與基因組整合的菌落進(jìn)行下一步操作；(3)篩選高拷貝表達(dá)菌株將上述⑩驗(yàn)證正確的單菌落，用槍尖點(diǎn)種于含有不同
5G418濃度(1. Omg/mL-4. Omg/mL)的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2_5天，出現(xiàn)G418抗性克?。?4)誘導(dǎo)表達(dá)將通過(guò)G418壓力篩選的高拷貝單菌落(G418濃度4. Omg/mL平板生 長(zhǎng)的菌落)，接種于BMGY培養(yǎng)基中，30°C，280rpm培養(yǎng)至OD600達(dá)到2 6 ；3000g離心5min 收集細(xì)胞，棄去上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，30°C，280rpm誘導(dǎo)蛋白 表達(dá)；每24h補(bǔ)加一次甲醇至甲醇濃度為0. 5%，120小時(shí)結(jié)束誘導(dǎo)；(5)提取純化①取誘導(dǎo)后的發(fā)酵液，4°C，lOOOOrpm，離心IOmin ；②收集上清，并用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，使用Millipore超濾器，4°C，4000rpm，離心 30min濃縮，得濃縮發(fā)酵液；③將IOmL Ni-NTA倒入2. 5 X IOcm柱中，用3個(gè)柱床體積的緩沖液A在4°C進(jìn)行柱
平衡；④將濃縮發(fā)酵液上樣，用6個(gè)柱床體積的緩沖液B清洗；⑤用6個(gè)柱床體積的緩沖液C洗脫目的蛋白；⑥使用Millipore超濾器，4°C，4000rpm，離心30min濃縮，將濃縮液以0. OlMTBS 稀釋，得稀釋液；⑦將稀釋液加入IgG-S印harose-4B 柱，流速 0. 2ml/min，以 0. OlMTBS 洗至 OD280nm < 0. 02為止，然后換用0. lmol/L pH2. 3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，流速0. 2ml/min,收集洗 脫液；⑧使用Millipore超濾器，4 °C，4000rpm，離心30min濃縮，即得IgG抗體親和
肽-堿性磷酸酶融合蛋白。所述緩沖液A為50mM Tris，pH 8. 0的溶液，其中，含有IOmM咪唑及0. 3M氯化鈉。所述緩沖液B為50mM Tris，pH 8. 0的溶液，其中，含有20mM咪唑及0. 3M氯化鈉。所述緩沖液C為50mM Tris, pH 8. 0的溶液，其中，含有250mM咪唑及0. 3M氯化鈉。經(jīng)上述制備方法得到的IgG親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白具有高度均一性，無(wú)需 體外標(biāo)記即可用于酶免疫測(cè)定；在Dot-ELISA檢測(cè)兔IgG抗體中，與常規(guī)標(biāo)記的山羊抗兔 IgG-AP檢測(cè)效果相當(dāng)。本發(fā)明的IgG親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白是利用畢赤酵母表達(dá)的，為糖基化產(chǎn) 物，其堿性磷酸酶活性高于從大腸桿菌提取的天然堿性磷酸酶。本發(fā)明是利用基因工程技術(shù)直接將抗體或抗原與酶以融合的方式表達(dá)，不但避免 了繁瑣且低效率的酶與蛋白質(zhì)的化學(xué)交聯(lián)，而且無(wú)需得到純化的酶和抗體或抗原。本發(fā)明將堿性磷酸酶基因與IgG親和肽重組構(gòu)建IgG親和肽_堿性磷酸酶融合蛋 白，并利用巴斯德畢赤酵母分泌表達(dá)，該融合蛋白一經(jīng)產(chǎn)生即具有與IgG抗體的結(jié)合活性 和AP催化活性，無(wú)需再次標(biāo)記即可用于酶免疫測(cè)定；同時(shí)，IgG親和肽僅與IgG的Fc段結(jié) 合，提高了與IgG親和特異性，且無(wú)需每檢測(cè)一種抗原而制備相應(yīng)的融合抗體。由背景技術(shù)可知，SpA被稱為“廣泛二抗”，但盡管SPA已作為一種“廣泛二抗”或 “替代二抗”在免疫測(cè)定中應(yīng)用，但SpA的IgG結(jié)合活性來(lái)自E、D、A、B、C 5個(gè)高度同源的 IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域。研究發(fā)現(xiàn)，其IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域不僅與IgG的Fc段結(jié)合，也與某些IgG的 Fab段(如人IgGl的F (ab' )2)結(jié)合。為克服其弊端，以ZZ親和肽結(jié)構(gòu)域代替SpA的5個(gè)同源IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域，使IgG結(jié)合結(jié)構(gòu)域的分子量減小到14kD，也克服了 SpA與某些IgG的 Fab段結(jié)合的缺點(diǎn)。因此本發(fā)明采用僅與IgG Fc段結(jié)合的ZZ結(jié)構(gòu)域-IgG抗體親和肽，避 免對(duì)IgG的Fab段與抗原特異性結(jié)合的影響。本發(fā)明的IgG親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白，具有IgG親和肽和堿性磷酸酶的生 物學(xué)活性，無(wú)需體外標(biāo)記即可用于酶免疫測(cè)定，且其活性較常規(guī)大腸桿菌提取的堿性磷酸 酶更高，本發(fā)明具有活性高、使用方便、效果好等優(yōu)點(diǎn)。


圖1為含有融合蛋白基因的表達(dá)載體plgG Ab-AP/9k的質(zhì)粒圖；圖2為IgG Ab-AP融合蛋白-山羊抗兔IgG-HRP百分結(jié)合率抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線；圖3為IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白、山羊抗兔IgG-AP檢測(cè)兔IgG抗體 的對(duì)比示意圖。本發(fā)明中涉及的培養(yǎng)基的配方如下YPD 1 % east Extract ；2% Peptone ；2% Dextrose ；2% Agar ；MD 1. 34% YNB ；4X10_5% Biotin ；2% Dextrose ；1. 5% Agar ；BMGY 1 % Yeast Extract ；2% Peptone ；IOOmM potassium phosphate buffer, ρΗ6· 0 ；1. 34% YNB ；4X10-5% Biotin ；1% glycerol ；BMMY 1 % Yeast Extract ；2% Peptone ；IOOmM potassium phosphate buffer, ρΗ6· 0 ；1. 34% YNB ；4Χ10_5% Biotin ；0. 5% methanol。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步的說(shuō)明。實(shí)施例1 IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白基因表達(dá)載體的構(gòu)建為將堿性磷酸酶基因與IgG親和肽基因連接，首先在分泌型堿性磷酸酶基因 (secreted alkaline phos-phatase，SEAP，GenBank Accession No :U35316)上游禾口下游提 供限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)Sac I及Pst I，通過(guò)PCR擴(kuò)增不帶N-信號(hào)肽及C-末端擴(kuò)展肽的 堿性磷酸酶基因(1467bp)，插入IgG親和肽下游(pEZZ18的Sac I及Pst I位點(diǎn))；第二步 在IgG親和肽-AP基因上游和下游提供限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)Not I，通過(guò)PCR擴(kuò)增并插入 PPIC9K的Not I位點(diǎn)，構(gòu)建畢赤酵母表達(dá)載體plgG Ab_AP/9k，如圖1所示。實(shí)施例2電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母GS115為在巴斯德畢赤酵母GS115中轉(zhuǎn)化pAb_AP/9k并隨后整合進(jìn)基因組中，載體首先 用Sal I線性化，使用Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀電轉(zhuǎn)化進(jìn)行1)挑取酵母單菌落，接種于5mLYPD培養(yǎng)基中，30°C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜；2)取100-500 μ L的過(guò)夜培養(yǎng)物接種至500mLYPD培養(yǎng)基中，30°C，250rpm培養(yǎng)至 OD600 達(dá)到 1. 3-1. 5 ；3)將菌液于4°C，3000rpm離心5min，用500mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌體；4)按步驟3離心，用250mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；5)按步驟3離心，用20mL冰預(yù)冷的IM的山梨醇將菌體沉淀重懸；6)按步驟3離心，用ImL冰預(yù)冷的IM的山梨醇重懸菌體；將細(xì)胞置于冰上；
7)約1 μ g經(jīng)Sal I線性化的pAb_AP/9k載體DNA加入80 μ L細(xì)胞，將混合物移至 預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；8)按照Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)儀操作要求，進(jìn)行畢赤酵母的電轉(zhuǎn)化，將目的基因 導(dǎo)入到畢赤酵母中；9)通過(guò)組氨酸缺陷型突變的互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子。將細(xì)胞立即涂布到缺少組氨酸的 MD瓊脂平板上，在30°C孵育48-72h ；10)挑取MD平板的酵母單菌落，通過(guò)菌落PCR直接檢查載體是否與基因組整合。實(shí)施例3高拷貝菌株的篩選及目的蛋白的表達(dá)為了獲得高拷貝的基因工程菌，使用選擇壓力進(jìn)行篩選。將驗(yàn)證正確的單菌落，用 槍尖點(diǎn)種于含有不同G418濃度的YPD平板上。點(diǎn)種時(shí)，按照G418濃度由低到高順序點(diǎn)種 平板，30°C培養(yǎng)。將通過(guò)G418(4. Omg/mL)壓力篩選的高拷貝單菌落，接種于25mL BMGY中，30°C， 280rpm培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到2_6。3000g離心5min收集細(xì)胞。棄去上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸 細(xì)胞，轉(zhuǎn)入50mL BMMY中，30°C，280rpm誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；.每24h取樣lmL，并補(bǔ)加一次甲醇 至甲醇濃度0. 5%，120小時(shí)結(jié)束誘導(dǎo)。實(shí)施例4IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白的純化1)取誘導(dǎo)一定時(shí)間的發(fā)酵液，4°C，lOOOOrpm，離心lOmin。2)收集上清，并用0. 22 μ m濾膜過(guò)濾，使用Millipore超濾器(截留分子量為 IOkDa)，4°C，4000rpm，離心 30min 濃縮。3)將IOmL Ni-NTA倒入2. 5X IOcm柱中，用3個(gè)柱床體積的緩沖液A(50mM Tris, pH 8. 0 ；0. 3M氯化鈉；IOmM咪唑)在4°C進(jìn)行柱平衡。4)將濃縮發(fā)酵液上樣，用6個(gè)柱床體積的緩沖液(50mM Tris，pH 8. 0 ；20mM咪唑； 0. 3M氯化鈉)清洗。5)用6個(gè)柱床體積的緩沖液(50mM Tris, pH 8. 0 ；250mM咪唑；0. 3M氯化鈉)洗
脫目的蛋白。6)使用Millipore超濾器(截留分子量為IOkD)，4°C，4000rpm，離心30min濃縮， 將濃縮液以適當(dāng)0. 01MTBS稀釋。7)將步驟6溶液加入IgG-S印harose-4B柱，流速0. 2ml/min,以0. 01MTBS洗至 0D280nm < 0. 02為止，換用0. lmol/L ρΗ2· 3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，流速0. 2ml/min,收
集洗脫液。8)使用MiIlipore超濾器(截留分子量為IOkDa)，4°C，4000rpm，離心30min濃縮， 12% SDS-PAGE檢測(cè)純化效果。實(shí)施例5 IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白活性鑒定IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白是一雙功能蛋白質(zhì)，具有堿性磷酸酶的催 化活性及與IgG抗體結(jié)合的活性。堿性磷酸酶活性檢測(cè)原理
IgG Ab-AP
4-硝基苯磷酸酯^- 4-硝基苯酚+Pi
8
360 μ LpNPP 溶液(50mM 的 Tris-HCl 中含 2mM 乙酸鎂，pNPP 濃度 0. 25 10mM， ρΗΙΟ. 0)，加入IgG Ab-AP溶液40 μ L (BCA法定量，武漢博士德生物公司)，37°C反應(yīng)IOmin, 3. 6mLIMNaOH終止反應(yīng)，測(cè)定405nm的吸光度值。酶活力單位在上述條件下，每分鐘催化產(chǎn)生1 μ mol/L pNP所需的酶量定義為1 個(gè)活性單位(U)。Img酶所含有酶的單位數(shù)稱為比活力。根據(jù)下式計(jì)算計(jì)算活力單位U = MXA-1XeXb其中，M = IgG Ab-AP融合蛋白質(zhì)量；A = 405nm吸光度；ε = 18700[LXmol—1 Xcm—1] ；b = Icm經(jīng)測(cè)定，IgG Ab-AP融合蛋白的堿性磷酸酶比活力為 386士82U/mg蛋白，比活力高于市售大腸桿菌提取天然堿性磷酸酶。與兔IgG抗體親和活性測(cè)定1)兔IgG抗體用包被稀釋液稀釋后(lOOng/mL)包被酶標(biāo)板，每孔100 μ L，4°C溫 育過(guò)夜，TBST(含 0. 5% Tween-20 的 0. OlM TBS 溶液，ρΗ8· 0) X5minX3 次；2)每孔加入封閉液200μ L，于37°C封閉lh, TBSTX5minX3次；3將純化的IgG Ab-AP融合蛋白以適當(dāng)梯度稀釋后，與山羊抗兔 IgG-HRP(l 5000)按體積比1 1混勻；每孔加入上述混合液100 μ L，于37°C反應(yīng)結(jié)合 lh, TBSTX5minX3 次；4)每孔加入TMB底物液100 μ L，37°C避光顯色，當(dāng)對(duì)照孔出現(xiàn)明顯顏色反應(yīng)時(shí)，每 孔加入終止液50 μ L，于20min內(nèi)測(cè)定450/630nm ；5)以未包被兔IgG抗體的孔為空白值，以只加山羊抗兔IgG-HRP孔的A45(1/62(1值為Btl 值，加入不同濃度的IgG Ab-AP融合蛋白與山羊抗兔IgG-HRP混合液的A45(1/62(1值為B值。以 IgG Ab-AP融合蛋白的濃度負(fù)對(duì)數(shù)(-LogC)為橫坐標(biāo)，以山羊抗兔IgG-HRP百分結(jié)合率(B/ B0%)為縱坐標(biāo)，繪制抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖2所示。當(dāng)山羊抗兔IgG-HRP百分結(jié)合率為50%時(shí) 所對(duì)應(yīng)的IgG Ab-AP融合蛋白濃度倒數(shù)，即為IgG Ab-AP融合蛋白與兔IgG抗體的親和常數(shù)。經(jīng)測(cè)定，IgG Ab-AP融合蛋白與兔IgG抗體的親和常數(shù)Ka ^ 6. 7X IO7L · πιοΓ1。實(shí)施例6IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白在Dot-ELISA應(yīng)用1)取NC膜用鉛筆作好加樣方格(5mmX 5mm)并作好相應(yīng)標(biāo)記；2)將膜浸入0. 01mol/L pH7. 4的TBS中15 30min，取出用濾紙吸干；3)將要包被的抗體(兔IgG抗體)包被稀釋液稀釋至工作濃度；4)加樣0.5μ L于相應(yīng)格內(nèi)，室溫自然干燥后，將NC膜片放入封閉液中振蕩封閉 30min ；5)將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌3次，每次30min ；6)用濾紙吸干，將膜片放入酶標(biāo)記抗體溶液(山羊抗兔IgG-AP，1 2000)或IgG Ab-AP溶液中，室溫振蕩30min ；7)將膜片放入洗滌液中振蕩洗滌4次，每次30min ；8)將膜片浸入BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色溶液中，在振蕩條件下充分顯色，用流水 沖洗數(shù)分鐘，放入蒸餾水中終止反應(yīng)。如圖3所示，IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白與山羊抗兔IgG-AP檢測(cè)效果 相當(dāng)。
權(quán)利要求
IgG抗體親和肽 堿性磷酸酶融合蛋白，其特征在于是IgG抗體親和肽和堿性磷酸酶構(gòu)成的融合蛋白。
2.權(quán)利要求1所述的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法，其特征在于， 步驟如下(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，然后構(gòu)建重組載體；(2)電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母，選取重組載體整合到酵母基因組上的菌株；(3)經(jīng)G418抗性壓力篩選高拷貝表達(dá)菌株；(4)培養(yǎng)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)IgG抗體親和肽_堿性磷酸酶融合蛋白；(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟如下，具體步驟如下(1)構(gòu)建重組載體首先在分泌型堿性磷酸酶基因上游和下游提供限制性內(nèi)切酶切割 位點(diǎn)Sac I及Pst I，然后通過(guò)PCR擴(kuò)增不帶N-信號(hào)肽及C-末端擴(kuò)展肽的堿性磷酸酶基 因，將其插入到IgG抗體親和肽下游；然后在IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶基因上游和下游 提供限制性內(nèi)切酶切割位點(diǎn)Not I，通過(guò)PCR擴(kuò)增并插入pPIC9K的Not I位點(diǎn)，構(gòu)建畢赤酵 母表達(dá)載體PlgG Ab-AP/9k ；(2)電轉(zhuǎn)化，并選取整合成功的菌株①挑取巴斯德畢赤酵母單菌落，接種于5mLYPD培養(yǎng)基中，300C，250rpm培養(yǎng)過(guò)夜，得過(guò) 夜培養(yǎng)物；②取100 500μ L的過(guò)夜培養(yǎng)物接種至500mLYPD培養(yǎng)基中，30°C，250rpm培養(yǎng)至0D_ 達(dá)到1.3-1. 5，得菌液；③將菌液于4°C，3000rpm離心5min，然后用500mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水重懸菌體；④按步驟③離心，用250mL冰預(yù)冷的無(wú)菌水將菌體沉淀重懸；⑤按步驟③離心，用20mL冰預(yù)冷的IM的山梨醇將菌體沉淀重懸；⑥按步驟③離心，用ImL冰預(yù)冷的IM的山梨醇重懸菌體；將細(xì)胞置于冰上；⑦將1μ g經(jīng)Sal I線性化的pAb_AP/9k載體DNA加入到80 μ L細(xì)胞中，將混合物移至 預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中；⑧電轉(zhuǎn)參數(shù)電壓1500V，電容25μ F，電阻200 Ω ；Gene Pulser Xcell電轉(zhuǎn)進(jìn)行畢赤酵 母的電轉(zhuǎn)化，將目的基因?qū)氲疆叧嘟湍钢?；⑨通過(guò)組氨酸缺陷型突變的互補(bǔ)篩選轉(zhuǎn)化子將電轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞立即涂布到缺少組氨 酸的MD瓊脂平板上，在30°C孵育48-72h ；⑩挑取MD平板的酵母單菌落，通過(guò)菌落PCR直接檢查載體是否與基因組整合，選取載 體與基因組整合的菌落進(jìn)行下一步操作；(3)篩選高拷貝表達(dá)菌株將上述⑩驗(yàn)證正確的單菌落，用槍尖點(diǎn)種于含有不同G418 濃度的YPD平板上，30°C培養(yǎng)2-5天，出現(xiàn)G418抗性克??；(4)誘導(dǎo)表達(dá)將通過(guò)G418壓力篩選的高拷貝單菌落，接種于BMGY培養(yǎng)基中，30°C， 280rpm培養(yǎng)至OD6tltl達(dá)到2 6 ；3000g離心5min收集細(xì)胞，棄去上清，用BMMY培養(yǎng)基重懸 細(xì)胞，轉(zhuǎn)入BMMY培養(yǎng)基中，30°C，280rpm誘導(dǎo)蛋白表達(dá)；每24h補(bǔ)加一次甲醇至甲醇濃度為 0.5%，120小時(shí)結(jié)束誘導(dǎo)；(5)提取純化①取誘導(dǎo)后的發(fā)酵液，4°C，lOOOOrpm，離心IOmin；②收集上清，并用0.22 μ m濾膜過(guò)濾，使用Mi 11 ipore超濾器，4°C，4000rpm,離心30min 濃縮，得濃縮發(fā)酵液；③將IOmLNi-NTA倒入2. 5X IOcm柱中，用3個(gè)柱床體積的緩沖液A在4°C進(jìn)行柱平④將濃縮發(fā)酵液上樣，用6個(gè)柱床體積的緩沖液B清洗；⑤用6個(gè)柱床體積的緩沖液C洗脫目的蛋白；⑥使用Mi11 ipore超濾器，4°C，4000rpm,離心30min濃縮，將濃縮液以0. 0IM TBS稀釋， 得稀釋液；⑦將稀釋液加入IgG-S印harose-4B柱，流速0.2ml/min,以0. OlM TBS洗至OD28tlnm < 0. 02為止，然后換用0. lmol/L pH2. 3甘氨酸-鹽酸緩沖液洗脫，流速0. 2ml/min,收集洗 脫液；⑧使用Millipore超濾器，4°C，4000rpm，離心30min濃縮。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液A為50mMTris, pH 8.0 的溶液，其中，含有IOmM咪唑及0. 3M氯化鈉。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液B為50mMTris, pH 8. 0 的溶液，其中，含有20mM咪唑及0. 3M氯化鈉。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于所述緩沖液C為50mMTris, pH 8. 0 的溶液，其中，含有250mM咪唑及0. 3M氯化鈉。
7.權(quán)利要求1所述的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白作為酶標(biāo)記抗體用于免疫 測(cè)定的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白，是IgG抗體親和肽和堿性磷酸酶構(gòu)成的融合蛋白，能作為替代酶標(biāo)記抗體用于免疫測(cè)定，其一經(jīng)產(chǎn)生即具有與IgG抗體的結(jié)合活性和AP催化活性，且二者標(biāo)記比例為1∶1；該融合蛋白的酶比活力為386±82U/mg；與兔IgG抗體的親和常數(shù)Ka≌6.7×107L·mol-1。本發(fā)明的IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白的制備方法如下(1)將IgG抗體親和肽基因和堿性磷酸酶基因連接，構(gòu)建重組載體；(2)電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母；(3)經(jīng)G418抗性壓力篩選高拷貝表達(dá)菌株；(4)培養(yǎng)菌株，誘導(dǎo)表達(dá)；(5)提取純化IgG抗體親和肽-堿性磷酸酶融合蛋白。
文檔編號(hào)C12N15/62GK101948545SQ201010275380
公開日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2010年9月8日 優(yōu)先權(quán)日2010年9月8日
發(fā)明者唐金寶, 楊洪鳴, 梁淑娟, 陳永 申請(qǐng)人:濰坊醫(yī)學(xué)院