專利名稱：：一種檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)pcr方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種定殖數(shù)量檢測的方法。
背景技術(shù)：
：產(chǎn)甲酸草酸桿菌(Oxalobacterformigenes)是一種以草酸作為唯一的碳源和能源的專性厭氧的革蘭氏陰性菌。它是MiltonJ.Alison于1985年在綿羊的瘤胃中首先發(fā)現(xiàn)的(AllisonMJ,CookHM,MilineDB,GallagherS,ClaymanRV.Oxalatedegradationbygastrointestinalbacteriafromhumans.J.Nutr.(1986)116:455-460.AllisonMJ,DawsonKA,MayberryWR,FossJG.Oxalobacterformigenesgen.nov.,sp.nov.:oxalate-degradinganaerobesthatinhabitthegastrointestinaltract.ArchMicrobiol1985;141:1_7.)，并進(jìn)一步又在豬、大鼠和人等腸道或糞便內(nèi)被分離到。草酸是一種人體內(nèi)主要由肝臟行成的代謝終產(chǎn)物，也廣泛存在于包括菠菜、巧克力、茶等食物和飲料中。這一物質(zhì)是人的草酸鈣腎結(jié)石中的主要成分。草酸在人的尿中的濃度高低對腎結(jié)石形成與否起著重要作用?，F(xiàn)有研究表明產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)不僅能夠通過降解食物中的草酸以減少腸道對食物中草酸向血液中的吸收，并且能夠與腸道黏膜相互作用導(dǎo)致血液中過高的草酸向腸道反向轉(zhuǎn)運(yùn)，達(dá)到降低血液中的草酸的濃度，進(jìn)而降低尿中草酸的濃度。然而，很多研究顯示產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)在腎結(jié)石病患者的腸道內(nèi)的定殖率明顯低于在健康人的腸道內(nèi)的定值率，這說明該菌株的定殖與否是腎結(jié)石形成的主要因素之一。更重要的是，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)腎結(jié)石疾病的再發(fā)率同樣與產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)的定殖有重要的關(guān)系，研究表明二者成顯著的負(fù)相關(guān)性。產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)已經(jīng)被用于治療高草酸癥疾病的研究中。研究顯示該菌株作為益生菌劑口服進(jìn)入該病患者體內(nèi)，能夠顯著改善患者尿中草酸的含量。因此，產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)在腸道內(nèi)定殖數(shù)量對于腸道內(nèi)草酸含量以及血液中草酸含量降低至關(guān)重要，對于該菌株數(shù)量的檢測在產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)在預(yù)防和治療腎結(jié)石疾病以及與草酸有關(guān)的疾病如高草酸癥的治療中的應(yīng)用必將具有深遠(yuǎn)的重要意義?，F(xiàn)有檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌數(shù)量的方法有Ro11-Tube法、QT-PCR法、實(shí)時(shí)PCR法。現(xiàn)有的這些產(chǎn)甲酸草酸桿菌檢測方法還存在以下的缺點(diǎn)和不足1、Roll-Tube法Roll_Tube法主要是利用稀釋培養(yǎng)法，在一種叫Roll-Tube的管中，將含產(chǎn)甲酸草酸桿菌的糞便樣品與培養(yǎng)基先稀釋再混合培養(yǎng)一定時(shí)間(一般為4-5天)，計(jì)算管壁上透明圓圈的數(shù)量即為所檢測的菌數(shù)。該方法的缺點(diǎn)是不得不使用大量的厭氧設(shè)備，而且不得不大量配制培養(yǎng)基。在菌落計(jì)數(shù)過程中，是以計(jì)算在Roll-Tube管壁上透明圓圈，而制備培養(yǎng)基時(shí)極容易產(chǎn)生氣泡，這就導(dǎo)致了很大程度的誤差。概括起來，該方法最大的缺點(diǎn)是費(fèi)時(shí)費(fèi)力，獲得結(jié)果周期長。2、QT-PCR法Sidhu等(1999)為了解決Roll-Tube法費(fèi)時(shí)費(fèi)力的缺點(diǎn)，發(fā)明了QT-PCR法。QT-PCR法是將所有糞便樣品提取DNA，然后設(shè)計(jì)引物做常規(guī)PCR，在瓊脂糖凝膠電泳上檢測PCR產(chǎn)物的亮度，與事先測得的產(chǎn)甲酸草酸桿菌的PCR產(chǎn)物的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較，計(jì)算后獲得菌數(shù)。該方法快速、但它存在致命的缺陷是PCR產(chǎn)物的濃度不能完全代表原始PCR模板的濃度(即所要測試的產(chǎn)甲酸草酸桿菌的DNA濃度)，當(dāng)模板濃度過大或過小，該方法不能真實(shí)反映實(shí)際所要測試的產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖數(shù)量，最終導(dǎo)致檢測結(jié)果誤差較大。3、實(shí)時(shí)PCR法目前，該方法是用于檢測原始DNA濃度的最有效、最準(zhǔn)確的方法。SurgeyProkopovich等2007首先引入該方法用于測試產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖數(shù)量，為的是解決QT-PCR法測試原始DNA不準(zhǔn)確的弊端。具體內(nèi)容是提取糞便樣品的DNA，然后利用實(shí)時(shí)PCR法通過測試PCR進(jìn)行時(shí)在對數(shù)期開始的循環(huán)數(shù)(CT數(shù))，達(dá)到檢測樣品產(chǎn)甲酸草酸桿菌的原始DNA濃度。方法快速，但是現(xiàn)有的實(shí)時(shí)PCR方法所使用的引物僅對第一亞組的甲酸草酸桿菌有效，而且引物本身專一性也不好，設(shè)計(jì)引物無法完全匹配有些產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)的序列，這導(dǎo)致實(shí)時(shí)PCR運(yùn)行時(shí)，CT開始時(shí)間滯后，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果與實(shí)際數(shù)據(jù)相比明顯偏低，檢測結(jié)果不準(zhǔn)確。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有檢測產(chǎn)甲酸草酸桿菌數(shù)量的方法存在的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果誤差較大、獲得結(jié)果的周期長的問題，而提供了一種檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法。本發(fā)明檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法按照以下步驟進(jìn)行一、提取待檢測的糞便樣品的基因組DNA，然后分別用第一亞組的引物和第二亞組的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測即確定出待檢測的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌是第一亞組還是第二亞組,其中，這兩組PCR反應(yīng)體系25iil均由0.2mMdNTP、0.5UTaqDNA聚合酶、lOOng糞便樣品的基因組DNA、1.25iiM的上游引物、1.25iiM的下游引物、1XPCR緩沖液和余量的去核酸酶的純凈水組成，第一亞組的上游引物為5'-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，第一亞組的下游引物為5‘-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3‘；第二亞組的上游引物為5‘-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，第二亞組的下游引物為5'-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3‘；二、待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌為第一亞組，則以第一亞組代表菌HC-1作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的為第二亞組，則以第二亞組代表菌OxK作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；以上實(shí)時(shí)PCR的上游引物為5‘-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，下游引物為5‘-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3‘；其中，實(shí)時(shí)PCR具體步驟為將標(biāo)準(zhǔn)品的DNA稀釋為0.00002ng/iil、0.0002ng/u1,0.002ng/u1,0.02ng/u1,0.2g/iU和2ng/yl六個(gè)不同濃度梯度，然后將待檢測的糞便樣品基因組DNA和這六個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA加入到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系為25iiL由lXQuantiTectSYBRGreenPCRkit(Qiagen,Inc.)、1.25iiM上游引物、1.25iiM下游引物、lOOng的樣品和余量的去核酸酶的純凈水組成；三、將實(shí)時(shí)PCR測得的糞便樣品DNA中的產(chǎn)甲酸草酸桿菌DNA的質(zhì)量代入如下公式產(chǎn)甲酸草酸桿菌的菌數(shù)=產(chǎn)甲酸草酸桿菌的DNA的質(zhì)量(ng)X4.82X105個(gè)菌數(shù)/ng，即得到了糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖數(shù)量。本發(fā)明的檢測方法在國內(nèi)外首次使用PCR法快速地鑒定出人的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)屬于哪一亞組的實(shí)際問題，而后再針對是哪一亞組使用實(shí)時(shí)PCR法準(zhǔn)確地進(jìn)行檢測人的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)的定殖數(shù)量。本發(fā)明的檢4測方法操作簡單，誤差小，便于推廣，獲得結(jié)果的周期短，與現(xiàn)有的方法相比較，時(shí)間縮短了80%以上，且本發(fā)明所得到結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小。圖1為具體實(shí)施方式一中第一亞組引物和第二亞組引物用于鑒定標(biāo)準(zhǔn)品的電泳圖，圖中1泳道表示第一亞組代表菌HC-1用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，2泳道表示第一亞組代表菌HC-1用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，3泳道表示第二亞組代表菌OxK用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，4泳道表示第二亞組代表菌OxK用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，5泳道表示第一亞組代表菌HC-1和第二亞組代表菌OxK混合用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，6泳道表示第一亞組代表菌HC-1和第二亞組代表菌OxK混合用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；圖2為具體實(shí)施方式一中第一亞組引物和第二亞組引物用于鑒定含有第一亞組產(chǎn)甲酸草酸桿菌糞便樣品的電泳圖，圖中1泳道表示第一亞組樣品I用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，2泳道表示第一亞組樣品I用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，3泳道表示第一亞組樣品II用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，4泳道表示第一亞組樣品II用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，5泳道表示表示第一亞組樣品III用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，6泳道表示表示第一亞組樣品III用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果；圖3為具體實(shí)施方式一中第一亞組引物和第二亞組引物用于鑒定含有第二亞組產(chǎn)甲酸草酸桿菌糞便樣品的電泳圖，圖中1泳道表示第二亞組樣品I用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，2泳道表示第二亞組樣品I用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，3泳道表示第二亞組樣品II用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，4泳道表示第二亞組樣品II用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，5泳道表示表示第二亞組樣品III用第一亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果，6泳道表示表示第二亞組樣品III用第二亞組引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增的結(jié)果。具體實(shí)施例方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一本實(shí)施方式檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法按照以下步驟進(jìn)行一、提取待檢測的糞便樣品的基因組DNA，然后分別用第一亞組的引物和第二亞組的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測即確定出待檢測的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌是第一亞組還是第二亞組，其中，這兩組PCR反應(yīng)體系25iil均由0.2mMdNTP、0.5UTaqDNA聚合酶、lOOng糞便樣品的基因組DNA、1.25iiM的上游引物、1.25iiM的下游引物、1XPCR緩沖液和余量的去核酸酶的純凈水組成，第一亞組的上游引物為5‘-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，第一亞組的下游引物為5‘-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3‘；第二亞組的上游引物為5‘-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，第二亞組的下游引物為5'-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3‘；二、待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌為第一亞組，則以第一亞組代表菌HC-1作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的為第二亞組，則以第二亞組代表菌OxK作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；以上實(shí)時(shí)PCR的上游引物為5'-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，下游引物為5'-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3‘；其中，實(shí)時(shí)PCR具體步驟為將標(biāo)準(zhǔn)品的DNA稀釋為0.00002ng/iil、0.0002ng/u1,0.002ng/u1,0.02ng/u1,0.2g/iU和2ng/yl六個(gè)不同濃度梯度，然后將待檢測的糞便樣品基因組DNA和這六個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA加入到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系為25iiL由lXQuantiTectSYBRGreenPCRkit(Qiagen,Inc.)、1.25iiM上游引物、1.25iiM下游引物、lOOng的樣品和余量的去核酸酶的純凈水組成；三、將實(shí)時(shí)PCR測得的糞便樣品DNA中的產(chǎn)甲酸草酸桿菌DNA的質(zhì)量代入如下公式產(chǎn)甲酸草酸桿菌的菌數(shù)=產(chǎn)甲酸草酸桿菌的DNA的質(zhì)量(ng)X4.82X105個(gè)菌數(shù)/ng，即得到了糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖數(shù)量。本實(shí)施方式步驟一中提取糞便樣品基因組DNA的提取是采用QiagenstoolDNAkit(QiagenInc.)完成的，方法按照說明書進(jìn)行，其中使用Beckman而640測定基因組DNA的濃度，然后將所有樣品DNA濃度稀釋或濃縮到20ng/yl備用。本實(shí)施方式步驟一中以第一亞組代表菌株HC-1和第二亞組代表菌株OxK的DNA作正對照。本實(shí)施方式步驟二中在進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR時(shí)，每個(gè)待測的糞便樣品或標(biāo)準(zhǔn)品均重復(fù)三次。本實(shí)施方式步驟二中待檢測的糞便樣品基因組DNA和這六個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA分別以5ill/(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品DNA)加入到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中。本實(shí)施方式步驟二中實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中的樣品為待檢測的糞便樣品基因組DNA或標(biāo)準(zhǔn)品DNA。本實(shí)施方式步驟二中的第一亞組代表菌HC-1和第二亞組代表菌OxK記載于MiltonJ.Alison教授發(fā)表的文章中(AllisonMJ,CookHM，MilineDB,GallagherS,ClaymanRV.Oxalatedegradationbygastrointestinalbacteriafromhumans.J.Nutr.(1986)116:455-460.AllisonMJ,DawsonKA,MayberryWR,FossJG.Oxalobacterformigenesgen.nov.，sp.nov.:oxalate-degradinganaerobesthatinhabitthegastrointestinaltract.ArchMicrobiol1985；1411-7.)>HarmeetSidhu^ig^^fitJi(SidhuH,EnatskaL,OgdenS,WilliamsWN,AllisonMJandPeckAB.EvaluatingchildrenintheUkraineforcolonizationwiththeintestinalbacteriumOxalobacterformigenesusingpolymerasechainreaction-baseddetectionsystem.Mol.Diagn.(1997)2:89-97.SidhuH,HolmesRP,AllisonMJandPeckAB.DirectquantificationoftheentericbacteriumOxalobacterformigenesinhumanfecalsamplesbyquantitativecompetitive-templatePCR.(1999)37:1503-1509.)和RossP.Holmes教授發(fā)表的文章中(ProkopovichS,KnightJ,AssimosDGandHolmesRP.VariabilityifOxalobacterformigenesandoxalateinstoolsamples.J.Urology(2007)178:2186-2190.SidhuH.HolmesRP,AllisonMJandPeckAB.DirectquantificationoftheentericbacteriumOxalobacterformigenesinhumanfecalsamplesbyquantitativecompetitive-templatePCR.(1999)37:1503-1509.),第一亞組代表菌HC-1和第二亞組代表菌OxK可從MiltonJ.Alison教授、HarmeetSidhu教授或RossP.Holmes教授處獲得。其中關(guān)于第一亞組和第二亞組的分離方法也記載于MiltonJ.Alison教授發(fā)表的文章中。本實(shí)施方式步驟三中的4.82XIO5是經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得的Ing產(chǎn)甲酸草酸桿菌DNA所對應(yīng)的菌數(shù)。本實(shí)施方式步驟三中實(shí)時(shí)PCR使用的儀器為ABIPrsim7000。本實(shí)施方式的檢測方法操作簡單，便于推廣，獲得結(jié)果的周期短，且得到結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小。具體實(shí)施方式二本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是步驟一中PCR(第一亞組引物和第二亞組引物)反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性10min、30個(gè)循環(huán)的94°C變性30sec、60°C復(fù)性30sec和72°C延伸30sec，最后在72°C延伸lOmin。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一或二不同的是步驟三中實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性15min，45個(gè)循環(huán)的94°C變性30sec、53°C復(fù)性30sec和72°C延伸lmin。其它步驟及參數(shù)與具體實(shí)施方式一或二相同。本實(shí)施方式中實(shí)時(shí)PCR儀在每個(gè)延伸反應(yīng)后30sec進(jìn)行SYBRGreen熒光定量分析并記錄定量結(jié)果。具體實(shí)施方式四本實(shí)施方式檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法按照以下步驟進(jìn)行一、提取待檢測的糞便樣品的基因組DNA，然后分別用第一亞組的引物和第二亞組的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測即確定出待檢測的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌是第一亞組還是第二亞組，其中，這兩組PCR反應(yīng)體系25μ1均由0.2mMdNTP、0.5UTaqDNA聚合酶、IOOng糞便樣品的基因組DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1XPCR緩沖液和余量的純凈水組成，第一亞組的上游引物為5‘-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，第一亞組的下游引物為5‘-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3‘；第二亞組的上游引物為5‘-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，第二亞組的的下游引物為5'-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3‘；二、待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的為第一亞組產(chǎn)甲酸草酸桿菌，則以第一亞組甲酸草酸桿菌HC-I作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測得的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的為第二亞組產(chǎn)甲酸草酸桿菌，則第二亞組甲酸草酸桿菌OxK作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR測測得糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；實(shí)時(shí)PCR的上游引物為5'-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3‘，下游引物為5‘-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3‘；其中，實(shí)時(shí)PCR方法為將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為0.00002ng/μ1、0.0002ng/y1、0.002ng/μ1、0·02ng/y1、0.2g/y1和2ng/μ1六個(gè)不同濃度梯度，然后將所待測定的糞便樣品和這六個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品以5μ1/樣品加入到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系為25μL由IXQuantiTectSYBRGreenPCRkit(Qiagen,Inc.)、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、IOOng的樣品和余量的純凈組成；三、將實(shí)時(shí)PCR測得的糞便樣品DNA中的產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量代入如下公式產(chǎn)甲酸草酸桿菌的菌數(shù)=產(chǎn)甲酸草酸桿菌的DNA的質(zhì)量(ng)X4.82X105個(gè)菌數(shù)/ng，即得到了糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖數(shù)量；其中步驟一中第一亞組引物和第二亞組引物的反應(yīng)條件均為94°C預(yù)變性10min、30個(gè)循環(huán)的94°C變性30sec、60°C復(fù)性30sec和72°C延伸30sec，最后在72°C延伸IOmin；步驟三中實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性15min，45個(gè)循環(huán)的94°C變性30sec、53°C復(fù)性30sec和72°C延伸lmin。本實(shí)施方式步驟一中提取糞便樣品的基因組DNA的提取是采用QiagenstoolDNAkit(QiagenInc.)完成的，方法按照說明書進(jìn)行，其中使用Beckman而640測定基因組DNA的濃度，然后將所有樣品DNA濃度稀釋或濃縮到20ng/y1備用。本實(shí)施方式步驟一中以第一亞組代表菌株HC-I和第二亞組代表菌株OxK的DNA作正對照。本實(shí)施方式步驟二和步驟三中的純凈水均為去核酸酶的純凈水。本實(shí)施方式步驟二中每個(gè)待測的糞便樣品和標(biāo)準(zhǔn)品均重復(fù)三次實(shí)時(shí)PCR。本實(shí)施方式步驟二中待檢測的糞便樣品基因組DNA和這六個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA分別以5μ1/(樣品或標(biāo)準(zhǔn)品DNA)加入到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中。本實(shí)施方式步驟二中實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中的樣品為待檢測的糞便樣品基因組DNA或標(biāo)準(zhǔn)品DNA。本實(shí)施方式步驟三中的4.82XIO5是經(jīng)實(shí)驗(yàn)測得的Ing產(chǎn)甲酸草酸桿菌DNA所對應(yīng)的菌數(shù)。本實(shí)施方式步驟三中實(shí)時(shí)PCR使用的儀器為ABIPrsim7000。本實(shí)施方式隨機(jī)選取來自20個(gè)確認(rèn)是產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)定殖的受測試人的新鮮的糞便樣品用于糞便基因組DNA的提取?；蚪MDNA的提取是采用QiagenstoolDNAkit(QiagenInc.)完成的。最終常規(guī)PCR的產(chǎn)物在0.7%瓊脂糖凝膠電泳上進(jìn)行鑒定，以第一亞組的代表菌HC-I和第二亞組的代表菌OxK作為正對照，結(jié)果顯示所有20個(gè)結(jié)果與實(shí)際通過生理生化方法鑒定的基因型(即屬于哪個(gè)亞組)的結(jié)果完全一致，由此可知，本實(shí)施方式步驟一中檢測方法結(jié)果100%準(zhǔn)確。本實(shí)施方式隨機(jī)選取確認(rèn)是20個(gè)產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)定殖的受測試人的新鮮的糞便樣品，其中有10個(gè)確定是第一亞組的產(chǎn)甲酸草酸桿菌，有10個(gè)確定是第二亞組的產(chǎn)甲酸草酸桿菌。經(jīng)本實(shí)施方式步驟二檢測后，所得到的電泳圖如圖1圖3所示，圖1圖3中只顯示每亞組各三個(gè)樣品的結(jié)果，其它樣品所得結(jié)果一樣，所以沒有顯示，有PCR產(chǎn)物的為陽性，無PCR產(chǎn)物為陰性。陽性結(jié)果表明所測試的樣品屬于所使用的引物代表的亞組。使用現(xiàn)有的Roll-Tube計(jì)數(shù)法與本實(shí)施方式的方法進(jìn)行比較，比較結(jié)果如表1和表2所示，其中待測的樣品是隨機(jī)選取來自20個(gè)確認(rèn)是產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)定殖的受測試人的新鮮的糞便樣品，這20個(gè)樣品中有10個(gè)樣品中為第一亞組產(chǎn)甲酸草酸桿菌，另外10個(gè)樣品中為第二亞組產(chǎn)甲酸草酸桿菌。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>從表1和表2可以看出，20個(gè)樣品的實(shí)時(shí)PCR法技術(shù)結(jié)果與以前的Roll-Tube計(jì)數(shù)法非常接近。證明該方法非常有效，但比之Roll-Tube計(jì)數(shù)法快速、簡潔，鑒定周期縮短了85%以上。使用現(xiàn)有的實(shí)時(shí)PCR法(SurgeyProkopovich等使用)與本實(shí)施方式的方法進(jìn)行比較，比較結(jié)果如表3所示。表3<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>注HC_1第一亞組的對照菌株，OxK第二亞組的對照菌株，A和C第一亞組受測試人B第二亞組受測試人，*表示受測試者食用的不同草酸含量(50-750mg)的食物，產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)與食物草酸含量呈正比。表中數(shù)據(jù)顯示只有受測試人C的計(jì)數(shù)結(jié)果是正確的。通過對表3的數(shù)據(jù)分析可知，現(xiàn)有的實(shí)時(shí)PCR方法無法準(zhǔn)確地鑒定第一亞組部分樣品和第二亞組全部樣品。為了進(jìn)一步分析具體原因，我們對所檢測的20個(gè)樣品及兩個(gè)亞組代表菌標(biāo)準(zhǔn)品的oxc基因(常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)PCR引物的模板)的前500bp進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示現(xiàn)有的實(shí)時(shí)PCR方法所使用的引物僅對部分第一亞組的樣品有效，而且引物本身專一性也不好，設(shè)計(jì)引物無法完全匹配有些產(chǎn)甲酸草酸桿菌(0.formigenes)的序列，這導(dǎo)致實(shí)時(shí)PCR運(yùn)行時(shí)，CT開始時(shí)間滯后，導(dǎo)致計(jì)數(shù)結(jié)果與實(shí)際數(shù)據(jù)相比明顯偏低(數(shù)據(jù)未顯示)。而本實(shí)施方式所使用的引物是針對上述測序結(jié)果設(shè)計(jì)的，如表3所示不僅對第一亞組的樣品有效，對第二亞組的樣品同樣有效，本實(shí)施方式的方法不僅操作便捷，且準(zhǔn)確度高。權(quán)利要求一種檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法，其特征在于檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法按照以下步驟進(jìn)行一、提取待檢測的糞便樣品的基因組DNA，然后分別用第一亞組的引物和第二亞組的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，電泳檢測即確定出待檢測的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌是第一亞組還是第二亞組，其中，這兩組PCR反應(yīng)體系25μl均由0.2mMdNTP、0.5UTaqDNA聚合酶、100ng糞便樣品的基因組DNA、1.25μM的上游引物、1.25μM的下游引物、1×PCR緩沖液和余量的去核酸酶的純凈水組成，第一亞組的上游引物為5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第一亞組的下游引物為5′-AAAACGCTGACCGTCATCTT-3′；第二亞組的上游引物為5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，第二亞組的下游引物為5′-GAACTTCTGACCATCCTGTT-3′；二、待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌為第一亞組，則以第一亞組代表菌HC-1作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；待檢測的糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的為第二亞組，則以第二亞組代表菌OxK作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR檢測糞便樣品中產(chǎn)甲酸草酸DNA的質(zhì)量；以上實(shí)時(shí)PCR的上游引物為5′-ATGTAGAGTTGACTGATGGC-3′，下游引物為5′-GCCAGGTTCGTGATAGGAAT-3′；其中，實(shí)時(shí)PCR具體步驟為將標(biāo)準(zhǔn)品的DNA稀釋為0.00002ng/μl、0.0002ng/μl、0.002ng/μl、0.02ng/μl、0.2g/μl和2ng/μl六個(gè)不同濃度梯度，然后將待檢測的糞便樣品基因組DNA和這六個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品DNA加入到實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系中，實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系為25μL由1×QuantiTectSYBRGreenPCRkit、1.25μM上游引物、1.25μM下游引物、100ng的樣品和余量的去核酸酶的純凈水組成；三、將實(shí)時(shí)PCR測得的糞便樣品DNA中的產(chǎn)甲酸草酸桿菌DNA的質(zhì)量代入如下公式產(chǎn)甲酸草酸桿菌的菌數(shù)＝產(chǎn)甲酸草酸桿菌的DNA的質(zhì)量(ng)×4.82×105個(gè)菌數(shù)/ng，即得到了糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌的定殖數(shù)量。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法，其特征在于步驟一中PCR的反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性10min、30個(gè)循環(huán)的94°C變性30sec、60°C復(fù)性30sec和72°C延伸30sec，最后在72°C延伸lOmin。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法，其特征在于步驟三中實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)條件95°C預(yù)變性15min，45個(gè)循環(huán)的94°C變性30sec、53°C復(fù)性30sec和72°C延伸lmin。全文摘要一種檢測糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量的實(shí)時(shí)PCR方法，它涉及一種定殖數(shù)量檢測的方法。本發(fā)明解決了現(xiàn)有檢測產(chǎn)甲酸草酸桿菌數(shù)量的方法存在的費(fèi)時(shí)費(fèi)力，結(jié)果誤差較大、獲得結(jié)果的周期長的問題。方法一、確定檢測的糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌是第一亞組還是第二亞組；二、實(shí)時(shí)PCR檢測、三、根據(jù)公式進(jìn)行計(jì)算即得到糞便中產(chǎn)甲酸草酸桿菌定殖數(shù)量。本發(fā)明的檢測方法操作簡單，誤差小，便于推廣，獲得結(jié)果的周期短，與現(xiàn)有的方法相比較，時(shí)間縮短了80％以上，且本發(fā)明所得到結(jié)果準(zhǔn)確，誤差小。文檔編號C12Q1/68GK101831499SQ201010181319公開日2010年9月15日申請日期2010年5月24日優(yōu)先權(quán)日2010年5月24日發(fā)明者于丁,姜巨全,徐偉慧,李士龍,王志剛申請人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)