專利名稱：一種檢測無鱗魚致病菌柱狀黃菌的方法和檢測試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種魚類致病菌的檢測技術(shù)，特別是無鱗魚致病菌柱狀黃桿菌的檢 測方法和檢測試劑盒以及相應(yīng)的引物。
背景技術(shù)：
隨著大口鯰、斑點叉尾鮰等名貴經(jīng)濟無鱗魚的高密度養(yǎng)殖，細菌性疾病的發(fā)生 日益嚴重，特別是苗種階段尤其明顯。因此，只有不斷地完善防治方法，認真貫徹“全 面預(yù)防，積極治療”的方針，才能收到預(yù)期的防病效果。預(yù)防疾病的一個重要基礎(chǔ)是判 斷養(yǎng)殖水體中或魚體內(nèi)中是否存在某些特定的魚類致病菌以及已經(jīng)存在的致病菌的種類 和數(shù)量，從而才能夠采取合適的方法對癥下藥。因此，如何快速、準確地檢測和判斷某 些細菌的感染，以有助于闡明其致病機理，及時治療和控制魚病的發(fā)生，一直就是眾人 所努力攻克的難題。目前，針對致病菌的檢測和診斷技術(shù)多種多樣，包括選擇性培養(yǎng)基鑒別培養(yǎng) 法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、斑點酶聯(lián)免疫吸附試驗(DOT-ELISA)、單克隆抗體技 術(shù)(MonoclonalAntibodyTechnique)等。這些方法各有其特點，但在生產(chǎn)應(yīng)用中多表現(xiàn)出 培養(yǎng)時間較長、只能用于粗略檢測，不甚精確、敏感性和特異性差等不足。而在檢測和 診斷技術(shù)中，聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase ChainReaction，PCR)因其具有的簡便、快速、 敏感、特異、適于早期和大量樣品檢測的優(yōu)點，已在該研究領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。但是對 于無鱗魚中斑點叉尾鮰和大口鯰主要致病菌柱狀黃桿菌和溫和氣單胞菌等，目前國內(nèi)尚 沒有相關(guān)的PCR檢測技術(shù)方面的研究報告。為了及時監(jiān)控?zé)o鱗魚養(yǎng)殖中的魚病發(fā)生，迫切需要一種能快速檢測魚體內(nèi)或養(yǎng) 殖水體中是否存在致病菌的技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的之一是提供一種檢測無鱗魚致病菌的試劑盒，包含引物A，其核 苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示，擴增來自柱狀黃桿菌(Flavobacteriumcolumnare)的基因。所述試劑盒還含有如SEQ ID NO 3所示核苷酸序列的陽性對照物。本發(fā)明的另一目的是提供一種檢測無鱗魚致病菌的方法，包括以下步驟1)提取待檢樣本中的DNA ；2)用引物對樣本中的DNA進行擴增，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示；3)用SEQ ID NO 3所示的核苷酸序列制備標準陽性模板，并進行稀釋和定 量；4)對DNA擴增結(jié)果進行檢測。本發(fā)明方法步驟1)所述的待測樣本取自魚體或養(yǎng)殖水體。
本發(fā)明的再一個目的是提供一種選自如SEQ ID NO 1 2所示寡核苷酸序列的 用途，其用于擴增或檢測來自柱狀黃桿菌的基因。


圖1柱狀黃桿菌常規(guī)PCR測試引物及檢測體系11-18 引物對FC1F/FC1R，11及12為空白對照；21-28 引物對FC2F/FC2R，21及22為空白對照；31-37 引物對 FC3F/FC3R，31 及 32 為空白對照；M DNA marker I.圖2柱狀黃桿菌常規(guī)PCR檢測體系的特異性1 空白對照；2 豚鼠氣單胞菌ATCC 15468 ； 3 嗜水氣單胞菌；4 熒光假 單胞菌；5 河弧菌；6 溫和氣單胞菌；7-8 柱狀黃桿菌；M DNA marker I.圖3柱狀黃桿菌常規(guī)PCR檢測體系的靈敏度1-7 基因組DNA從0.2納克到0.2菲克的10倍梯度稀釋；8 空白對照；M DNA marker I.圖4草魚樣品檢測結(jié)果(柱狀黃桿菌)1 空白對照；2-14 魚池采集的病魚樣品；15 陽性對照；M DNAmarkerI.圖5鯉魚樣品檢測結(jié)果(柱狀黃桿菌)1 空白對照；2-9 待檢測病魚樣品；10 陽性對照；M DNAmarkerI.圖6水體中柱狀黃桿菌的檢測結(jié)果1 空白對照；2-6 水樣；7-8 陽性對照；M DNAmarkerI
具體實施例方式根據(jù)已有文獻資料報道，柱狀黃桿菌為常見的魚類致病菌，在養(yǎng)殖無鱗魚的發(fā) 病魚體和養(yǎng)殖水體中常常存在，因此，我們選取柱狀黃桿菌作為研究靶標，以PCR作為 技術(shù)手段，以保守的毒力基因序列作為靶標序列，研究和建立PCR快速檢測技術(shù)體系， 從基因水平上，通過多學(xué)科的聯(lián)合研究，在魚致病性細菌的早期、快速、定量檢測方面 進行一些積極的探索，加強魚病的預(yù)防和診斷。以下實施例是為了對本發(fā)明作進一步詳細說明，并非對發(fā)明的限制。本發(fā)明的實驗方法均參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》(F.M.奧斯伯等主編，科 學(xué)出版社2005年出版)所建議的實驗條件。 實施例一弓I物的設(shè)計和陽性對照物的篩選合成1、從GeneBank上查找靶標病原菌柱狀黃桿菌的保守基因序列，并根據(jù)這些序 列設(shè)計引物及探針。引物交由上海生工(上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司)合成。2、實驗材料及試劑材料魚類常見致病菌柱狀黃桿菌、溫和氣單胞菌、河弧菌、熒光假單胞菌、 豚鼠氣單胞菌和嗜水氣單胞菌。前五個菌株均購自中科院武漢水生生物研究所，嗜水氣 單胞菌由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)魚病研究中心提供。使用前均用相應(yīng)的培養(yǎng)基活化，并用細菌基 因組DNA提取試劑盒(Tiangen)提取基因組DNA。將提取的基因組DNA 10倍梯度稀 釋，用于評價PCR體系的靈敏度；
試劑5U/μ L Taq DNA polymerase (Promega,含 10 Xreaction buffer 禾口 25mM Mg2+)、IOmM dNTPs (Promega)、DNA marker I (Tiangen) ； Millipore H2O 高壓滅菌后分
裝，于-20度保存?zhèn)溆谩?、引物、菌株測試用常規(guī)PCR測試所設(shè)計的引物和購買的菌株，PCR反應(yīng)體系根據(jù)各組分的濃度 配制，擴增程序根據(jù)引物的TM值及產(chǎn)物的大小編寫。常規(guī)PCR擴增在Bio-RadMycycler 梯度擴增儀上進行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測所得到的PCR產(chǎn)物。4、PCR體系性能測試PCR體系優(yōu)化好以后，測試該體系的檢測特異性及靈敏度。結(jié)果1、柱狀黃桿菌A.常規(guī)PCR測試購買的細菌及設(shè)計的引物我們設(shè)計的三對引物序列如下FC1F/FC1R、FC2F/FC2R、FC3F/FC3R從圖1可以看出，對于柱狀黃桿菌，我們所設(shè)計的三對引物均可擴增出靶標條 帶，表明購買的柱狀黃桿菌、自行設(shè)計的引物以及使用的PCR擴增體系均可用于后續(xù)的 實驗。考慮到常規(guī)PCR產(chǎn)物需要電泳等特點，我們根據(jù)經(jīng)驗選用FC2F/FC2R引物對(其 核苷酸序列如SEQ ID NO: 1 2所示，)用于后面的實驗。B.常規(guī)PCR檢測體系的特異性對于常見的幾種非靶標魚類致病菌，使用我們建立的常規(guī)PCR檢測體系均為檢 測陰性，對柱狀黃桿菌為檢測陽性，這表明我們所建立的常規(guī)PCR檢測體系具有極好的 特異性，可以用于柱狀黃桿菌的快速檢測(圖2)。C.常規(guī)PCR檢測體系的靈敏度將提取的柱狀黃桿菌基因組DNA作10倍梯度稀釋，用作模板測試所建立的常規(guī) PCR體系的檢測靈敏度。實驗結(jié)果表明，我們所建立的常規(guī)PCR體系可以檢測到pg級 的基因組DNA，說明該體系具有較好的檢測靈敏度(圖3)。實施例2試劑盒的制備和組成成分組成1、PCR反應(yīng)液800 μ L (10 μ L/次，80次，含核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2 所示的引物、dNTPs、Mg2+、Taq酶緩沖液)2、Taq 酶 20 μ L (0.25 μ L/次，80 次)3、6% Chelex-100 16mL(DNA 提取液，200 μ L/次，80 次)4、DNA 陽性對照 160 μ L (2 μ L/次，80 次)5、滅菌超純水 2mL制備方法將Taq酶緩沖液(終濃度2X)、上下游引物(終濃度0.6 μ M)、 dNTPs (終濃度0.4mM)、Mg2+ (終濃度4mM)依次加入離心管，用無菌超純水補足總體積 至800 μ L。Taq酶為商品酶，購于promega公司，-20度保存。DNA陽性對照制備方 法見實施案例3。滅菌超純水使用Millip0re純水儀制備，高壓滅菌后分裝。以上成分均 需-20°C保存，使用時取出融化，短暫離心后使用。稱取6g Chelex-100粉末(Bio-Rad)， 溶于IOOmL無菌超純水中，即為6% Chelex-100溶液，4°C保存?zhèn)溆谩?br> 實施例3檢測待測病魚樣本1)提取疑似患病魚取樣組織的DNA采集了一些患病及疑似患病的草魚和鯉魚樣品，使用chelex-100(Bio-Rad)煮 沸法快速提取DNA。方法如下取一小塊患病組織塊，加入200 μ L Millipore H2O,搗 爛，取出沒有搗爛的組織塊，剩余渾濁液12,OOOrpm離心lmin，棄上清，加入200 μ L Millipore H2O重懸。充分混勻后取50 μ L加入到200 μ L 6 %的chelex-100中，混勻， 56°C保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100°C保溫8min，劇烈震蕩，并于12,000離心3min， 取上清作為PCR的模板，用建立的常規(guī)PCR檢測體系進行檢測。常規(guī)PCR擴增在 Bio-RadMycycler梯度擴增儀上進行，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測分析得到的 PCR產(chǎn)物。剩余的模板于-20°C保存以備復(fù)檢。2)用實施例1制備的引物擴增樣本中的DNA，使用實施例2的試劑盒用以下程序做PCR反應(yīng)體系(終濃度)程序IXreactionbuffer 95 V 4min0.3 μ M primer F/primer R 94°C 15s0.2mM dNTPs56°C IOs X 382mM Mg2+72 °C 15s1.25U Taq DNA polymerase 72V 5min2 μ L Template4 °C holdAdd Millipore H2O to 20 μ L3)陽性對照物及標準模板的制備用建立的常規(guī)PCR體系擴增柱狀黃桿菌基因組DNA，2%瓊脂糖凝膠電泳分離 得到特定的靶標條帶。用干凈的手術(shù)刀切下包含靶標條帶的凝膠，瓊脂糖凝膠DNA回 收試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司)回收靶標DNA。將回收的部分DNA加入 到連接體系中(10yL，含線性克隆載體、連接酶和連接酶buffer)，16°C連接過夜。次 日，將全部的連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到制備好的大腸桿菌感受態(tài)，并涂布于含有氨芐青霉素的LB 平板，37°C培養(yǎng)至長出菌落。挑取菌落并制備成菌懸液，使用載體引物及菌落PCR驗證 并挑選陽性克隆子。將陽性克隆子對應(yīng)的細菌于LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，并取ImL 提取質(zhì)粒DNA(普通質(zhì)粒小提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，從而得到陽性 對照物。測定提取的質(zhì)粒DNA的濃度，稀釋到一定倍數(shù)作為陽性對照用于PCR檢測。4)檢測擴增DNA(方法同實施案例3的樣品制備和PCR檢測)待測患病草魚的鰓糜爛，灰色或紫色，腹部充血漲腫，尾部有紅色或暗紅色條 紋，與柱狀黃桿菌感染引起的癥狀接近，但不排除有其它細菌的混合感染。待測患病鯉魚皮膚糜爛或充血，有的魚有白絨毛狀物質(zhì)附著，尾部及后腹部在 水中呈白色，死亡較快。A.柱狀黃桿菌檢測結(jié)果(草魚樣本)見圖4。在采集的13個樣品中，樣品6、7、8、10、12、13出現(xiàn)擴增條帶，位 置與陽性對照的擴增條帶一致，為陽性結(jié)果；樣品4、11擴增的靶標條帶不明顯，為弱陽性；其余樣品，包括空白對照均無靶標條帶產(chǎn)生。說明柱狀黃桿菌為草魚的主要致病 菌。柱狀黃桿菌檢測結(jié)果(鯉魚樣本)見圖5。在采集的7個樣品中，樣品4和7產(chǎn)生與陽性對照一致的靶標條帶， 表明待檢樣品中有柱狀黃桿菌存在；樣品9產(chǎn)生的靶標條帶不明顯，為弱陽性；其余樣 品，包括空白對照均無靶標條帶生成。說明柱狀黃桿菌為鯉魚的致病菌之一。從圖4和圖5可以看出，對于草魚病魚樣品，柱狀黃桿菌的檢出率較高，這和草 魚的實際患病情況吻合，這表明我們建立的常規(guī)PCR檢測體系具有很好的檢測效果，可 以用于魚病的檢測和預(yù)測，為魚病的防治提供科學(xué)依據(jù)。實施例4:水體樣本的檢測1)細菌DNA的獲取從養(yǎng)殖水體中采樣，用無菌離心管取水樣lmL， 12,OOOrpm離心lmin，棄上清，加入200 μ L Millipore H2O重懸。充分混勻后取50 μ L加 入到200 μ L 6%的Chelex-IOO中，混勻，56°C保溫20min，劇烈震蕩混勻后于100°C保溫 8min,劇烈震蕩，并于12,000離心3min，取上清作為PCR的模板，用建立的常規(guī)PCR檢 測體系進行檢測。常規(guī)PCR擴增在Bio-RadMycycler梯度擴增儀上進行，瓊脂糖凝膠電 泳結(jié)合凝膠成像系統(tǒng)檢測分析得到的PCR產(chǎn)物。剩余的模板于_20°C保存以備復(fù)檢。2)用實施例1制備的引物擴增樣本中的DNA，使用實施例2的試劑盒及實施例 3的PCR程序擴增及檢測。3)結(jié)果見圖6。在所取的5個水樣本中，樣本3和6有擴增條帶出現(xiàn)，且大 小與陽性對照的一致，表明有柱狀黃桿菌的檢出。與該水體中魚的患病情況一致，表明 本發(fā)明試劑盒可以用于水體檢測，以預(yù)測該水體中魚的發(fā)病情況。本發(fā)明試劑盒能快速準確地檢測病魚和養(yǎng)殖水體中的柱狀黃桿菌，方法簡便， 檢測樣本量大，為有針對性治療和有效預(yù)防魚病提供了可靠的診斷結(jié)果，避免了盲目施 治導(dǎo)致的農(nóng)藥濫用，為消費者提供安全的水產(chǎn)品提供了保證。本發(fā)明核苷酸序列SEQ ID NO 1 3如下SEQ ID NO 1、2 (引物對)柱狀黃桿菌常規(guī)PCR特異性引物FC2F/FC2R擴增片段的序列(138bp)SEQ ID NO 1 FC2F Sense primer 5-AATATCTCAAACGAATGGAACTTC-32 4bpSEQ ID NO: 2 F C 2 R Anti-sense primer 5-TTGGCATTATTTGTCATGTTAGC-323bp擴增產(chǎn)物Product:138bpSEQ ID NO 3柱狀黃桿菌常規(guī)PCR特異性引物FC2F/FC2R擴增片段的序列(138bp)1545 aatatc tcaaacgaat1561 ggaacttcgg atgtgtatac aacgcttaac caaacaaatt tagacgcttctaaattgtca1621 tattttcaaa atggtactcg ttttcagcta aatgctaatg ctaacatgacaaataatgcc1681 aa
權(quán)利要求
1.一種檢測無鱗魚致病菌的試劑盒，其特征是包含引物A，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 2所示，擴增來自柱狀黃桿菌的基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的試劑盒，其特征是所述試劑盒還含有如SEQID NO 3所 示核苷酸序列的陽性對照物。
3.—種檢測無鱗魚致病菌的方法，其特征是1)提取待檢樣本中的DNA；2)用引物對樣本中的DNA進行擴增，所述引物的核苷酸序列如SEQID NO 1 2 所示；3)用SEQIDNO 3所示的核苷酸序列制備標準陽性模板，并進行稀釋和定量；4)對DNA擴增結(jié)果進行檢測。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征是步驟1)所述的待測樣本為魚體或養(yǎng)殖水體。
5.—種選自如SEQID NO: 1 2所示寡核苷酸序列的用途，其特征是其用于擴增 或檢測來自柱狀黃桿菌的基因。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種檢測無鱗魚致病菌柱狀黃桿菌的方法和檢測試劑盒，試劑盒包含引物A，其序列如SEQ ID NO1～2所示，擴增來自柱狀黃桿菌的基因，用本發(fā)明的方法可以快速準確地檢測無鱗魚體內(nèi)或養(yǎng)殖水體是否含有致病菌，做到有針對性的防治魚病。
文檔編號C12Q1/68GK102010896SQ20101018083
公開日2011年4月13日 申請日期2010年5月5日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月3日
發(fā)明者劉衍鵬, 康琦, 肖丹, 黃冠軍 申請人:通威股份有限公司