專利名稱：：來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌的培養(yǎng)方法及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種菌種的培養(yǎng)方法，特別是一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌的培養(yǎng)方法；本發(fā)明還涉及糞產(chǎn)堿桿菌的用途。
背景技術(shù)：
：目前，植物病害主要依賴化學(xué)殺菌劑防治，由于過量的使用導(dǎo)致了環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品的污染，同時(shí)一些病原菌對農(nóng)藥產(chǎn)生了抗藥性。生物防治的方法彌補(bǔ)了化學(xué)防治的不足，日益受到重視，已經(jīng)成為植物病害防治的重要手段。但目前用于生物防治的微生物菌株多數(shù)來自于陸地，而多年來對陸地微生物的篩選，導(dǎo)致篩選到產(chǎn)生新型抗病機(jī)制的微生物的幾率越來越少，因而越來越多的人們把目光投向了海洋，希望從海洋環(huán)境中極其具多樣性的微生物中開發(fā)出新型抗病原菌活性物質(zhì)，用于植物病害的生物防治。近幾年以來，從海洋中尋找微生物新種和具有特殊功能的生理活性物質(zhì)成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)，海洋微生物已經(jīng)成為農(nóng)用抗生素的新資源。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種對9種植物病原真菌有強(qiáng)抗菌作用的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(^c^i^"es/secah'sWrai"KZJOl)的培養(yǎng)方法。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(^cah'ge/7es/aecahsstrai/KZJ01)的培養(yǎng)方法，其特點(diǎn)是，其具體分離培養(yǎng)步驟如下(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有10mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，170r/min，25。C條件下?lián)u床培養(yǎng)48h;(2)菌體的分離搖床培養(yǎng)48h后，用移液槍取富集培養(yǎng)48h的富集培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.OniL無菌海水的試管中，制備成10—'的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10—2、10—3、l(T4、10—5、10—fi、10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、10—6和10—7的樣品稀釋液0.2ml放到2216E固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25'C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，長出菌落；(3)菌株的純化分別挑取2216E固體培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到2216E固體培養(yǎng)基平板上，置于25。C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到2216E試管斜面中保存；(4)菌株篩選按下述方法分別對上述若干個(gè)純化的菌株進(jìn)行抑制植物病原真菌實(shí)驗(yàn)；取純化的菌株分別在2216E固體培養(yǎng)基平板上活化培養(yǎng)24小時(shí)，取9種植物病原真菌分別在PDA平板上活化培養(yǎng)3d;然后在PDA平板的中央接種活化3d的直徑為5mm的植物病原真菌的菌苔，培養(yǎng)24小時(shí)后，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿邊緣15mm處劃線接種lcm活化24小時(shí)的純化的菌株，25t:倒置恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況，培養(yǎng)5d后測量抑菌帶寬度；以不接菌為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；選取一株對9種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于10mm的菌株，記為KZJ01菌株；(5)菌株的鑒定將KZJ01菌株于25。C下培養(yǎng)24h，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、運(yùn)動性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、生長需要NaCl試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)，并進(jìn)行16SrDNA測序分析；結(jié)果為KZJ01菌株革蘭氏染色陰性，無芽孢，細(xì)胞桿狀；沒有鞭毛，不能運(yùn)動；在2216E固體培養(yǎng)基平板上菌落乳白半透明，邊緣整齊；KZJ01菌株氧化酶反應(yīng)陽性，好氧，性質(zhì)初步鑒定為產(chǎn)堿菌屬(J/ca/^e"M);16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于J/ca/z'gew"/aecafe，二者的16SrDNA序列相似性為99%，該菌株即為糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(y^cs7j'ge/e51/aecs力'sstrainKZJ01)。本發(fā)明技術(shù)方案中所述的菌株的鑒定方法中涉及的菌落和細(xì)胞形態(tài)觀察、革蘭氏染色、運(yùn)動性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、生長需要NaCl試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)及16SrDNA測序分析的實(shí)驗(yàn)及分析方法均采用現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)方法。16SrDNA測序分析得到的16SrDNA已在Genebank公開。本發(fā)明中所涉及的生物材料"糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(^cah'ge/7"/aecah'sstrainKZJ01)"菌株已于2008年11月27日在Genebank公開(登錄號為:FJ436432)，網(wǎng)址為(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi7db二nuccore&id=215254287)。該菌株為公知公用材料，在該專利申請日期起二十年內(nèi)，公眾如果需要，淮海工學(xué)院海洋學(xué)院實(shí)驗(yàn)室可對外提供。本發(fā)明中涉及的培養(yǎng)基(1)富集培養(yǎng)液主要成分蛋白胨10g、酵母膏5g、牛肉膏5g、NaC15g、陳海水1000mL，pH7.5-8.0。(2)2216E固體培養(yǎng)基平板主要成分為蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、瓊脂20g、陳海水1000mL，pH7.5-8.0。(3)2216E發(fā)酵培養(yǎng)液蛋白胨5g、酵母膏l(xiāng)g、陳海水1000mL，pH7.5-8,0。(4)PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)基成分為馬鈴薯浸汁(20%)100mL，葡萄糖2g，瓊脂1.5-2g，自然pH。上述4種培養(yǎng)基均按常規(guī)方法制備。本發(fā)明所述的糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(j/ca//ge""/aecafcstrainKZJ01)具有抑制植物病原真菌的用途。以下是發(fā)明人所做的抑菌實(shí)驗(yàn)。1、供試的9種植物病原真菌。玉米,J、珍王病菌(5&o/aWamqyd&)、玉米圓珍王病菌(//e/w/wf/zos/wn'wmcar6o"ww)、d、麥赤霧病菌(尸wsan'wmgramzVe"nm)、t帛花枯菱病菌(Fws"n.wmox評w臓f.sp.vasinfectum)、雪腐鐮刀病菌(^Fkra〃'訓(xùn)"zWe)、斑點(diǎn)落葉病菌(爿/femaWaa/fenw/a)、小麥根腐病菌(5zJ9o/an.ssoraAim.(3wa)、細(xì)鏈格抱病菌"/teman'afern^)、番茄早疫病菌to/""0是由中國農(nóng)科院所土傳病害實(shí)驗(yàn)室提供，實(shí)驗(yàn)室保存。2、糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(J〗cW^"e/7es/aecah'sstrainKZJ01)對病原真菌生長的抑制作用測定。7采用平板對峙法。按下述方法對糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01進(jìn)行抑制植物病原真菌實(shí)驗(yàn)；取糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01分別在2216E固體培養(yǎng)基平板上活化培養(yǎng)24小時(shí)，取9種植物病原真菌分別在PDA平板上活化培養(yǎng)3d;然后在PDA平板的中央接種活化3d的直徑為5mm的植物病原真菌的菌苔，培養(yǎng)24小時(shí)后，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿邊緣15mm處劃線接種1cm活化24小時(shí)的純化的菌株，25"C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況，培養(yǎng)5d后測量抑菌帶寬度；以不接菌為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。3、糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl無菌發(fā)酵液對植物病原真菌生長和孢子萌發(fā)的抑制作用測定。3.1無菌發(fā)酵液的制備將活化Id的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01菌株斜面用5mL的無菌水沖洗，用移液槍取3mL接種到盛有50mL2216E發(fā)酵培養(yǎng)液的三角瓶內(nèi)，25°C，180r/min振蕩培養(yǎng)48h。培養(yǎng)液在4。C、5000r/min離心10min，上清液用直徑0.22pm的細(xì)菌過濾器過濾，制得無菌發(fā)酵液，備用。3.2無菌發(fā)酵液對植物病原真菌菌絲生長作用的測定將植物病原真菌菌苔接在PDA平板的中央，在四周對稱打孔，每孔加入制備好的無菌發(fā)酵液200UL，以2216E發(fā)酵培養(yǎng)液為對照，25t:恒溫培養(yǎng)。5d后觀察菌落生長狀況并測量抑菌圈的寬度，重復(fù)3次。3.3糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl對植物病原真菌菌絲破壞作用的顯微觀察用解剖針輕輕挑取抑菌帶邊緣的病原真菌菌絲，在顯微鏡下觀察病原真菌的菌絲生長狀態(tài)。3.4無菌發(fā)酵液對病原真菌孢子萌發(fā)的作用測定用無菌水洗下培養(yǎng)5d的小麥根腐病菌和斑點(diǎn)落葉病菌(A"/^r"ato)的菌落，用四層紗布過濾除去菌絲，濾液室溫下3500r/min下離心5min，沉淀即為分生孢子，用制備好的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01無菌發(fā)酵液配制孢子懸浮液，濃度為106個(gè)孢子/mL。取0.1mL孢子懸浮液涂布在無菌玻片上，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿內(nèi)，25。C下黑暗恒溫保濕培養(yǎng)，分別于2h、4h、6h、8h、10h觀察孢子萌發(fā)情況，計(jì)算萌發(fā)率。如果10h對照的孢子萌發(fā)率低于90%，則繼續(xù)觀察計(jì)算12h的孢子萌發(fā)率。同時(shí)觀察芽管的生長狀態(tài)，測量芽管長度。以2216E發(fā)酵培養(yǎng)液為對照。孢子萌發(fā)率(％)=孢子萌發(fā)數(shù)/調(diào)查孢子總數(shù)。4、結(jié)果與分析。4.1糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(^cah>e/7es/seca7AstrainKZJ01)抑菌作用的測定結(jié)果。供試的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01對不同的植物病原真菌具有明顯的抑制作用，菌株對不同供試病菌的抑菌作用有所不同，結(jié)果見表l。表l糞產(chǎn)堿桿菌對植物病原真菌生長的抑制作用(抑菌圈直徑)(mm)<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01對植物病原真菌的抑制作用較強(qiáng)，對供試的9種病原真菌都有明顯的抑制作用，抑菌圈直徑均達(dá)到10mm以上。其中對斑點(diǎn)落葉病菌(Aa/femata)、小麥赤霉病菌(Fgra附z'weanw2)禾口番茄早疫病菌(Aso/am.)的抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑分別達(dá)15.2mm、14mm和13.9mm，其次對玉米圓斑病菌(//.ca^o"wm)、細(xì)鏈格孢病菌(Afe"w&)和棉花枯萎病菌(Fox，/wwmf.sp.vasinfectum)也有較強(qiáng)的抑制作用，抑菌圈直徑分別為13.5mm、12mm禾n12.8mm;X寸雪腐鐮刀病菌(Fm'va/e)、小麥根腐病菌(及sorahm'a"a)、玉米小斑病菌(及ma_y^fc)的抑制作用較弱，抑菌圈直徑為11.5mm、11.3mm、10,0mm。4.2糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01無菌發(fā)酵液對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用。糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01無菌發(fā)酵液對植物病原真菌菌絲抑制作用的測定結(jié)果見表2。糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl無菌發(fā)酵液對植物病原真菌菌絲的抑制作用較強(qiáng)，對所有供試植物病原真菌的菌絲均有一定的抑制作用，對斑點(diǎn)落葉病菌(Aa/tenato)、細(xì)鏈格孢病菌".te"M&)和番茄早疫病菌U.菌絲的抑制作用最為明顯，抑菌圈直徑分別為11.2mm、1.08mm和10.4mm表2糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01無菌發(fā)酵液對植物病原真菌菌絲生長的抑制作用(抑菌圈直徑)(mm)供試病原菌抑菌圈直徑11.27.510.87.510.88.09.0丑.so^ot/打/awa8.3Aso/awZ10.44.3糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl"JcaJi《e/7es/aecs7isszLrahKZJ01)對植物病原真菌菌絲的破壞作用。取抑菌帶處的菌絲在顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)植物病原真菌的菌絲生長異常，表現(xiàn)出菌絲扭曲，部分菌絲頂端呈球形膨大，生長受阻；或表現(xiàn)出菌絲細(xì)胞壁變薄局部破裂；菌絲細(xì)胞原生質(zhì)收縮，出現(xiàn)空泡；也有部分菌絲斷裂，泡囊破裂，原生質(zhì)外泄。而對照的菌絲則原生質(zhì)分布均勻，形態(tài)正常，粗細(xì)均勻，分支多，生長旺盛。4.4糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01無菌發(fā)酵液對植物病原真菌孢子萌發(fā)的抑制作用。糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01的無菌發(fā)酵液對供試的2種植物病原真菌的分生孢子萌發(fā)均具有明顯的抑制作用。處理2h后，對照的孢子萌發(fā)率分別達(dá)到22.3%和9.3%,處理的孢子尚未萌發(fā)。隨著時(shí)間的延長，孢子萌發(fā)率逐漸增加，對照的萌發(fā)率增長較快，10個(gè)小時(shí)后萌發(fā)率分別達(dá)到了96.2%和92.4%,處理的孢子萌發(fā)率僅為37.4%和43.6%,10h的抑制率分別為61.2%禾卩63.6%，見表3。表3糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01的無菌發(fā)酵液對2種病原真菌分生孢子萌發(fā)的影響(萌發(fā)率)(％)處理病原真菌時(shí)間(h)Time(h)抑制率(■>/。)Inhibitoryrates(%)246810(10h)KZ.T01發(fā)酵液ck0.022.34.328.617.868.329.189.737.496.261.1KZI01發(fā)酵液0.00.87.627.443.663.6ck9.323.753.265.492.4-顯微觀察結(jié)果表明對照的孢子原生質(zhì)分布均勻，形態(tài)正常。發(fā)酵液處理的有些分生孢子縊縮，原生質(zhì)凝集于兩端；部分孢子膨大呈球狀，細(xì)胞壁變11薄，甚至部分崩解。無菌發(fā)酵液能抑制芽管生長，使芽管畸形、扭曲，甚至串珠狀膨大，有的孢子萌發(fā)產(chǎn)生的芽管短粗，其上有小泡囊產(chǎn)生；有的芽管頂端膨大，巻曲，粗短，孢子體異常，細(xì)胞壁變薄等多種狀態(tài)。對照的芽管多分枝、細(xì)長，發(fā)芽點(diǎn)處不畸形，極少出現(xiàn)泡囊。5、結(jié)論與討論糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl"/ca//ge""/aecafoWra/wKZJ01)及其發(fā)酵液對供試的植物病原真菌具有較強(qiáng)的抗菌作用；顯微觀察結(jié)果表明其導(dǎo)致病原真菌菌絲扭曲，分生孢子芽管的畸形。無菌發(fā)酵液對病原真菌菌絲生長和芽管的破壞作用表明，經(jīng)糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01"/ca"ge"^/aecafcstrainKZJ01)的無菌發(fā)酵液處理的病原真菌的孢子和菌絲，芽管或菌絲畸形膨大，進(jìn)而破裂。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，無菌發(fā)酵液處理后分生孢子萌發(fā)率明顯降低，造成芽管生長異常，說明糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl"/c"http://gewey/aeca/&strainKZJOl)的無菌發(fā)酵液既可通過直接抑制孢子的萌發(fā)，也可通過芽管畸形和斷裂起到抑制孢子萌發(fā)作用，這一結(jié)果說明分離得到的糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl"/c^'gew^/aecafcstrainKZJOl)能夠通過兩種途徑有效控制病原真菌孢子的萌發(fā)和阻止病菌侵入寄主。具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實(shí)施例l。一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(^ca"'《e/es/aecahsKZJOl)的培養(yǎng)方法，其具體分離培養(yǎng)歩驟如下(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥l(xiāng)Og放入盛有l(wèi)OmL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，170r/min，25。C條件下?lián)u床培養(yǎng)48h;(2)菌體的分離搖床培養(yǎng)48h后，用移液槍取富集培養(yǎng)48h的富集培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.OmL無菌海水的試管中，制備成10—'的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10—2、10—3、l(T4、l(T、l(T、10—7的樣品稀釋液；然后分別取10—5、10—6和10—7的樣品稀釋液0.2ml放到2216E固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25t:的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，長出菌落；(3)菌株的純化分別挑取2216E固體培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到2216E固體培養(yǎng)基平板上，置于25'C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到2216E試管斜面中保存；(4)菌株篩選按下述方法分別對上述若干個(gè)純化的菌株進(jìn)行抑制植物病原真菌實(shí)驗(yàn)；取純化的菌株分別在2216E固體培養(yǎng)基平板上活化培養(yǎng)24小時(shí)，取9種植物病原真菌分別在PDA平板上活化培養(yǎng)3d;然后在PDA平板的中央接種活化3d的直徑為5mm的植物病原真菌的菌苔，培養(yǎng)24小時(shí)后，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿邊緣15mm處劃線接種lcm活化24小時(shí)的純化的菌株，25"C倒置恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況，培養(yǎng)5d后測量抑菌帶寬度；以不接菌為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；選取一株對9種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于10mm的菌株，記為KZJ01菌株；(5)菌株的鑒定將KZJ01菌株于25。C下培養(yǎng)24h，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、運(yùn)動性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、生長需要NaCl試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)，并進(jìn)行16SrDNA測序分析；結(jié)果為KZJ01菌株革蘭氏染色陰性,無芽孢，細(xì)胞桿狀；沒有鞭毛，不能運(yùn)動；在2216E固體培養(yǎng)基平板上菌落乳白半透明，邊緣整齊；KZJ01菌株氧化酶反應(yīng)陽性，好氧，性質(zhì)初步鑒定為產(chǎn)堿菌屬(v4/c^/ge"");16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于力ca"ge"^/aecafe，二者的16SrDNA序列相似性為99%，該菌株即為糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(爿2csJ2'《e/7as1i^ecsJj'61strainKZJOl)。本實(shí)施例培養(yǎng)方法所得的糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(^ca7&朋"/secah'sstrainKZJOl)具有抑制9種植物病原真菌菌絲生長的作用，而且對其中2種植物病原真菌的分生孢子的萌發(fā)有抑制作用。權(quán)利要求1、一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(AlcaligenesfaecalisstrainKZJ01)的培養(yǎng)方法，其特征在于，其具體分離培養(yǎng)步驟如下(1)富集培養(yǎng)從連云港海域采集海泥，將海泥10g放入盛有10mL的無菌海水的三角瓶中振蕩搖勻，取5mL懸浮液加入到50mL富集培養(yǎng)液中，170r/min，25℃條件下?lián)u床培養(yǎng)48h；(2)菌體的分離搖床培養(yǎng)48h后，用移液槍取富集培養(yǎng)48h的富集培養(yǎng)液1.0mL加入到盛有9.0mL無菌海水的試管中，制備成10-1的樣品稀釋液；然后采用梯度稀釋的方法連續(xù)稀釋，分別制備成10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的樣品稀釋液；然后分別取10-5、10-6和10-7的樣品稀釋液0.2ml放到2216E固體培養(yǎng)基平板上，用涂布棒涂布均勻后，置于25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，長出菌落；(3)菌株的純化分別挑取2216E固體培養(yǎng)基平板上的菌落，用三區(qū)劃線的方法接種到2216E固體培養(yǎng)基平板上，置于25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，反復(fù)劃線直至得到純的菌株單菌落，將若干個(gè)純化的菌株分別轉(zhuǎn)接到2216E試管斜面中保存；(4)菌株篩選按下述方法分別對上述若干個(gè)純化的菌株進(jìn)行抑制植物病原真菌實(shí)驗(yàn)；取純化的菌株分別在2216E固體培養(yǎng)基平板上活化培養(yǎng)24小時(shí)，取9種植物病原真菌分別在PDA平板上活化培養(yǎng)3d；然后在PDA平板的中央接種活化3d的直徑為5mm的植物病原真菌的菌苔，培養(yǎng)24小時(shí)后，在植物病原真菌四周距培養(yǎng)皿邊緣15mm處劃線接種1cm活化24小時(shí)的純化的菌株，25℃倒置恒溫培養(yǎng)，觀察病原菌的生長狀況，培養(yǎng)5d后測量抑菌帶寬度；以不接菌為對照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次；選取一株對9種植物病原真菌的抑菌帶寬度平均值大于10mm的菌株，記為KZJ01菌株；(5)菌株的鑒定將KZJ01菌株于25℃下培養(yǎng)24h，觀察記錄菌落和細(xì)胞形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色、運(yùn)動性試驗(yàn)、過氧化氫酶試驗(yàn)、生長需要NaCl試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)和硝酸鹽還原試驗(yàn)，并進(jìn)行16SrDNA測序分析；結(jié)果為KZJ01菌株革蘭氏染色陰性，無芽孢，細(xì)胞桿狀；沒有鞭毛，不能運(yùn)動；在2216E固體培養(yǎng)基平板上菌落乳白半透明，邊緣整齊；KZJ01菌株氧化酶反應(yīng)陽性，好氧，性質(zhì)初步鑒定為產(chǎn)堿菌屬(Alcaligenes)；16SrDNA的同源性分析表明，KZJ01菌株最接近于Alcaligenesfaecalis，二者的16SrDNA序列相似性為99％，該菌株即為糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(AlcaligenesfaecalisstrainKZJ01)。2、權(quán)利要求1所述的糞產(chǎn)堿桿菌KZJOl(^cah>e/7"/aecah'sstrainKZJ01)的抑制植物病原真菌的用途。全文摘要本發(fā)明是一種來自海洋的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01(AlcaligenesfaecalisstrainKZJ01)的培養(yǎng)方法，其特征在于，它經(jīng)過富集培養(yǎng)、菌體的分離、菌株的純化、菌株篩選、菌株的鑒定等步驟得到糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01。本發(fā)明培養(yǎng)方法所得的糞產(chǎn)堿桿菌KZJ01具有抑制9種植物病原真菌菌絲生長的作用，而且對其中2種植物病原真菌的分生孢子的萌發(fā)有抑制作用。文檔編號C12N1/20GK101481671SQ20091002890公開日2009年7月15日申請日期2009年1月21日優(yōu)先權(quán)日2009年1月21日發(fā)明者劉云鶴,夏振強(qiáng),暴增海,王偉霞,馬桂珍申請人:淮海工學(xué)院