專利名稱：在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌 素成熟多肽的方法。
背景技術(shù)：
抗菌肽(antimicrobial peptides, AMPs)是指一類由12 100個氨基酸組成，帶 有凈正電荷，表現(xiàn)兩親性的且具有抗菌活性的小分子多肽的總稱。有關(guān)抗菌肽的研究已經(jīng) 有50多年的歷史，迄今為止，已鑒定各種不同生物來源的抗菌肽約有880種(Brogden K A， 2005)?？咕挠捎谄鋸V譜的抗菌活性(包括針對革蘭氏陽性細(xì)菌，革蘭氏陰性細(xì)菌、真菌、 甚至某些病毒等)而日益受到人們的關(guān)注。特別是過去數(shù)十年中，由于抗生素的濫用而導(dǎo) 致帶有抗生素抗性的致病菌株不斷出現(xiàn)，急需開發(fā)新型的抗菌藥物。抗菌肽因其存在著巨 大的藥用潛力因而有望成為抗生素的替代品之一。因此，近年來有關(guān)抗菌肽的研究進(jìn)展迅 速，包括抗菌肽的純化、表征、基因克隆和重組表達(dá)、蛋白晶體結(jié)構(gòu)的解析、結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系 等研究領(lǐng)域，人們對抗菌肽的了解越來越廣泛和深入。2003年，Mygind等人(Mygind P H.等，2005)首次報道從一種絲狀腐生真菌-假黑盤菌(Pseudoplectania nigrella)中鑒定和純化出一種defensin家族的抗菌肽-假黑 盤菌素(plectasin)，并解析了該多肽的三維結(jié)構(gòu)(PDB ID =IZFU)。假黑盤菌素的氨基酸序 列和結(jié)構(gòu)分析表明，它具有哺乳動物抗菌肽defensins家族的特征，但它的二硫鍵排列方 式又不同于任何一種亞家族，而與昆蟲來源的一些defensins相同。通過體外抑菌實驗，發(fā) 現(xiàn)假黑盤菌素對多種常見的人類革蘭氏陽性病原細(xì)菌-包括對抗生素敏感型及其耐藥菌 株都具有較強的抗菌能力(如表1所示)，而且其抑菌濃度與殺菌濃度并無多大差異。表1假黑盤菌素可作用于多種革蘭氏陽性病原細(xì)菌
0006利用生物工程的方法構(gòu)建轉(zhuǎn)基因工程菌來生產(chǎn)抗菌肽正逐漸成為研究熱點，Mygind等人曾將假黑盤菌素全基因?qū)朊浊够蚝谇怪械玫街亟M表達(dá)，其中米曲霉的表達(dá)量較高，達(dá)到了 10 50mg/L。畢赤酵母(Pichia pastoris)是應(yīng)用最為廣泛的外源蛋白表達(dá)宿主菌，它是甲醇 營養(yǎng)型酵母中的一種，能夠在以甲醇為唯一碳源的培養(yǎng)基中生長，這類酵母還包括漢遜酵 母、假絲酵母和球擬酵母等(熊向華，2006)。畢赤酵母是迄今最為成熟的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)之一，目前已有上百種外源蛋白基 因在畢赤酵母中獲得表達(dá)。外源基因在畢赤酵母中的表達(dá)需要有幾個基本條件一是需要 有高效的啟動子和終止子；二是要有同源序列以便外源基因能夠有效地整合到畢赤酵母基 因組中；三是要有高通量的篩選方法。另外，影響外源基因在畢赤酵母中表達(dá)的還有培養(yǎng)條 件、密碼子的偏好性以及蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)等。目前，已經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)有一些啟動子和終止子可應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其中應(yīng) 用最為廣泛的誘導(dǎo)型啟動子是畢赤酵母乙醇氧化酶(Alcohol Oxidase, A0X)啟動子，在畢 赤酵母中，有兩個不同的基因可編碼乙醇氧化酶分別是AOXl和A0X2，二者之間有97%的 氨基酸序列同源性。在畢赤酵母細(xì)胞中，基因AOXl的表達(dá)對乙醇氧化酶活性起主要作用。 甲醇代謝的第一步是甲醇氧化，生成甲醛和氫過氧化物。為避免細(xì)胞氫過氧化物中毒，甲醇 代謝在過氧化物酶體中進(jìn)行。AOXl基因的表達(dá)受到嚴(yán)格的調(diào)控，而且受到甲醇誘導(dǎo)可以達(dá) 到很高的水平，典型的是當(dāng)畢赤酵母細(xì)胞在含甲醇的培養(yǎng)基中生長時，AOXl表達(dá)產(chǎn)物可細(xì) 胞占總可溶性蛋白的30%以上。由于乙醇氧化酶啟動子調(diào)控外源基因表達(dá)需添加甲醇進(jìn)行誘導(dǎo)，而一些工業(yè)領(lǐng) 域，如食品和醫(yī)藥等要求最終產(chǎn)品中不得有甲醇等有毒和有害物質(zhì)殘留，為此，一些組成型 啟動子的應(yīng)用越來越受到研究者的關(guān)注。目前外源蛋白在畢赤酵母中的表達(dá)一般是通過外源基因整合到畢赤酵母基因組 中的方式，雖然也有一些攜帶外源基因的表達(dá)質(zhì)粒(如2μ)在畢赤酵母中能夠獨立復(fù)制并 表達(dá)外源蛋白的報道，但這種非整合型的表達(dá)方式存在著質(zhì)粒不穩(wěn)定和易丟失等缺點，目 前已很少有人應(yīng)用。外源基因整合到畢赤酵母基因組中需要有同源序列參與，即外源基因 若要整合到酵母基因組中，載體中需要包含一段核苷酸序列，它們與酵母基因組中的某段 DNA序列完全相同或基本一致，常用的同源序列有畢赤酵母來源的某個啟動子或終止子等。 有了同源序列還不夠，外源質(zhì)粒的狀態(tài)也會極大地影響外源基因整合的效率，一般線性化 質(zhì)粒的整合效率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于閉合的環(huán)形質(zhì)粒，而線性化的位點在不破壞外源基因的條件下， 整合既可以發(fā)生在同源序列的內(nèi)部，也可以在外部，都不影響整合的效率。高通量的篩選方法對獲得高效表達(dá)外源基因的重組菌株來說也是十分重要的。通 常用于表達(dá)外源蛋白的畢赤酵母菌株都是基因缺陷型菌株，例如本發(fā)明中所使用的GS115 菌株就是組氨酸基因缺陷型的，當(dāng)攜帶有組氨酸合成酶基因的外源質(zhì)粒整合到酵母基因組 中時，恢復(fù)了 GS115合成組氨酸合成酶的能力，使只有整合了外源質(zhì)粒的重組菌才能夠在 組氨酸缺陷的培養(yǎng)基中生長。除了使用缺陷型酵母菌株作為篩選標(biāo)記外，外源質(zhì)粒上還應(yīng) 攜帶有某種抗性基因以便使重組菌株產(chǎn)生相應(yīng)的抗生素抗性，例如G418抗性或Zeocin抗 性等，根據(jù)重組菌株對抗生素的抵抗能力的不同，可對外源基因整合的拷貝數(shù)進(jìn)行粗略的 篩選?？截悢?shù)的多少對外源蛋白表達(dá)量的影響還需實驗確定。質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)化酵母后，可以 先利用缺陷型培養(yǎng)基進(jìn)行初篩，能夠生長的重組菌株再轉(zhuǎn)接到含有不同濃度抗生素的培養(yǎng)基進(jìn)行拷貝數(shù)的篩選，也可以將轉(zhuǎn)化后的菌液直接涂布在抗生素篩選平板上，由于抗生素抗性物質(zhì)的積累需要一定時間，會使重組菌株的生長略為緩慢。畢赤酵母作為外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)有諸多優(yōu)點，它屬于低等真核生物，兼具真核生 物和原核生物的特點。畢赤酵母是單細(xì)胞生物，遺傳背景的研究相對透徹，其生理生化特性 已較為清楚，對于它的基因工程操作相對于植物或動物細(xì)胞來說，更加簡便和快捷，同時， 它作為真核生物又具備了原核生物所沒有的特性，如蛋白的翻譯后加工和修飾，包括二硫 鍵的形成、糖基化和脂?；?。對于有細(xì)胞毒性的外源重組蛋白，可以將它定位于畢赤酵母 的過氧化物酶體中，既可以保證宿主細(xì)胞不被毒性蛋白所傷害，又可以防止蛋白酶對外源 重組蛋白的降解。而對于胞外表達(dá)的蛋白來說，由于畢赤酵母本身的分泌蛋白很少，因此， 利于外源重組蛋白的分離和純化。畢赤酵母菌株及其代謝產(chǎn)物對于任何哺乳動物均沒有毒 性，而且它能夠進(jìn)行高密度發(fā)酵，培養(yǎng)成本低廉，操作簡單，極適合于工業(yè)化的大規(guī)模發(fā)酵 生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽的方法。為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種含有編碼假黑盤菌素成熟多肽的DNA序列 的表達(dá)載體，其包括酵母組成型啟動子，位于啟動子下游的編碼α-因子分泌信號肽的核 苷酸序列以及編碼假黑盤菌素成熟多肽DNA序列，所述編碼假黑盤菌素成熟多肽的DNA序 列的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識別序列GAGAAAAGA。前述的表達(dá)載體，其中所述酵母的組成型啟動子為畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫 酶啟動子。前述的表達(dá)載體，其中所述編碼假黑盤菌素成熟多肽的基因是按照畢赤酵母所偏 愛的密碼子進(jìn)行優(yōu)化的基因，具有如SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列。前述的表達(dá)載體，其出發(fā)載體為pPIC9K。本發(fā)明還提供含有上述表達(dá)載體的宿主，優(yōu)選為畢赤酵母，更優(yōu)選為畢赤酵母 GS115基因工程菌。本發(fā)明進(jìn)一步提供含有上述表達(dá)載體的畢赤酵母GS115基因工程菌的培養(yǎng)方法， 其包括步驟1)菌體培養(yǎng)在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，接種前用氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值為 5. 7 6. 0，然后在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL PTMl溶液；按10v/v%的比例接入 種子液，28 30°C，370 380轉(zhuǎn)/分通氣攪拌培養(yǎng)22 24小時；2)飼喂碳源通過蠕動泵向步驟1)的發(fā)酵液中流加含有12mLPTMl/L發(fā)酵液的 50%甘油，流加量為18mL/hr/L發(fā)酵液，28 30°C通氣攪拌培養(yǎng)4 6小時，在培養(yǎng)過程中 加入氨水以維持PH值為5. 7 6. 0，同時調(diào)整通氣量，使溶氧量維持在20%以上；然后，在 培養(yǎng)的第3 4天，繼續(xù)流加含有12mL PTM1/L發(fā)酵液的50%甘油，使甘油濃度始終維持在 1. 5 2%，溶氧量始終維持在20%以上，溫度維持在28 30°C，pH維持在5. 7 6. 0 ；其中，所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為IOXBasal Salts+4%甘油；所述PTMl含有0. 6%硫 酸銅、0. 008%碘化鈉、0. 3%硫酸錳、0. 02%鉬酸鈉、0. 002%硼酸、0. 05%氯化鈷、2%氯化 鋅、6. 5%硫酸亞鐵、0. 025%生物素和0. 5%硫酸。
本發(fā)明還提供上述畢赤酵母GS115基因工程菌分泌的重組蛋白的純化方法，其包括離心除菌、過濾和分子篩柱層析的步驟。本發(fā)明另外提供一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽的方法，其是利 用上述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生假黑盤菌 素成熟多肽。本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)以組成型方式表達(dá)和生產(chǎn)重組假黑盤菌素成熟多 肽，該重組多肽具有天然多肽相類似的生物活性，即能夠抑制或殺滅多種革蘭氏陽性細(xì)菌， 甚至對某些具有抗生素抗性的致病菌株也能產(chǎn)生抑制作用。按照一個優(yōu)選的實施方案，本 發(fā)明提供了假黑盤菌素成熟多肽在畢赤酵母中以組成型方式高效表達(dá)和生產(chǎn)的方法。該重 組假黑盤菌素成熟多肽具有與天然假黑盤菌素相類似的抗菌活性。同時，本發(fā)明提供了假 黑盤菌素成熟多肽在畢赤酵母中可高密度發(fā)酵生產(chǎn)以及重組蛋白快速分離和純化的方法。本發(fā)明所述的重組假黑盤菌素成熟多肽是在畢赤酵母中以組成型方式表達(dá)和生 產(chǎn)的，首先是編碼重組假黑盤菌素成熟多肽的基因被按照畢赤酵母所偏愛的密碼子進(jìn)行優(yōu) 化并完全人工合成出來，然后，該人工合成的基因被插入到一個帶有α-因子分泌信號肽 核苷酸編碼序列的酵母表達(dá)載體上以形成一個新的融合基因。α-因子分泌信號肽的作 用是操縱外源的重組假黑盤菌素成熟多肽向畢赤酵母胞外的分泌。在該質(zhì)粒載體上，還含 有一個組成型啟動子，該啟動子位于α “因子信號肽與假黑盤菌素成熟多肽所形成的融合 基因的上游，它操縱融合基因在畢赤酵母細(xì)胞中的高效表達(dá)。該質(zhì)粒載體經(jīng)線性化后，可 通過電融合法或氯化鋰等方法導(dǎo)入到畢赤酵母細(xì)胞中，進(jìn)而通過同源重組穩(wěn)定整合到酵母 基因組上，該重組酵母在發(fā)酵培養(yǎng)過程中可穩(wěn)定和高效地表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽，并在 α-因子分泌信號肽的引導(dǎo)下分泌到胞外的培養(yǎng)基中。本發(fā)明所述的重組蛋白可以是假黑盤菌素成熟多肽的全部，然而，在某些具體實 施方案中，所表達(dá)的外源基因也可能只是該多肽的一部分。在某些具體實施方案中，假黑盤 菌素成熟多肽重組蛋白可與另外一個具有不同生物學(xué)功能的蛋白基因以獨立或融合方式 同時在一個酵母細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，以達(dá)到方便提純或提高其生物活性的目的。蛋白的融合可以 通過蛋白翻譯后加工，共價結(jié)合的方式，或通過DNA重組技術(shù)使基因在翻譯表達(dá)前即拼接 在一起。發(fā)酵產(chǎn)品中假黑盤菌素的純度直接關(guān)系到該重組蛋白的應(yīng)用范圍及所生產(chǎn)相關(guān) 產(chǎn)品成本的高低，按照一個優(yōu)選的實施方案，為了快速純化假黑盤菌素重組蛋白，可以首先 將酵母發(fā)酵上清液使用不同截流分子量的過濾裝置進(jìn)行預(yù)處理，然后再使用分子篩進(jìn)行柱 層析，在純化過程中的每一個環(huán)節(jié)，都可使用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行檢測，通過上述方法 可獲得純度達(dá)到99%的假黑盤菌素重組蛋白。本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞的質(zhì)粒載體包含編碼假黑盤菌素成熟多肽或其 衍生物的DNA序列以及操縱該DNA序列在所述酵母細(xì)胞中表達(dá)的組成型啟動子組成。在某 些具體實施方案中，質(zhì)粒載體還包括一個選擇性或標(biāo)記基因，用于重組畢赤酵母細(xì)胞的篩 選和檢測。在某些具體實施方案中，本發(fā)明采用的組成型啟動子是酵母甘油醛-3-磷酸脫 氫酶啟動子(GAPDH)，其是從畢赤酵母中克隆得到甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列，并將 其插入到到畢赤酵母表達(dá)載體PPIC9K中以取代載體原位置上的誘導(dǎo)型啟動子-乙醇氧化 酶啟動子，使該表達(dá)載體能夠以組成型方式高效地表達(dá)外源重組蛋白。
本發(fā)明提供的用于轉(zhuǎn)化畢赤酵母的質(zhì)粒表達(dá)載體，其含有的編碼外源蛋白的基因是編碼假黑盤菌素成熟多肽的基因，其表達(dá)的外源重組蛋白具有抑菌或殺菌作用。更確切 地，本發(fā)明所述的假黑盤菌素成熟多肽與假黑盤菌的天然蛋白或由其它常規(guī)表達(dá)系統(tǒng)生產(chǎn) 的該重組多肽相類似，作為抑菌或殺菌劑可以廣泛地應(yīng)用到醫(yī)療、食品、飼料和科研等領(lǐng) 域。本發(fā)明還提供了畢赤酵母細(xì)胞遺傳轉(zhuǎn)化以及酵母重組子篩選的方法，包括如下步 驟1)按照畢赤酵母所偏愛的密碼子，對假黑盤菌素成熟多肽基因進(jìn)行優(yōu)化，并人工合成 該多肽基因；2)畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的克??；3)構(gòu)建一個質(zhì)粒表達(dá)載 體，其含有編碼假黑盤菌素成熟多肽或其衍生物的DNA序列，該DNA序列首先與α _因子分 泌信號肽核苷酸編碼序列拼接形成融合基因，然后它們被置于畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫 氫酶啟動子控制之下；4)通過電融合法或其它方法，用上述線性化后的質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化 酵母細(xì)胞，并將轉(zhuǎn)化后的畢赤酵母細(xì)胞涂布于RDB固體平板選擇培養(yǎng)基上，能夠在該培養(yǎng) 基上生長的酵母單菌落就是含有外源基因的酵母重組子；5)挑取重組酵母細(xì)胞單菌落，分 別接種到含有不同濃度G418(濃度依次為0. 5,1. 0,1. 5,2. Omg/mL)的YPD固體平板培養(yǎng)基 上，能夠在高濃度G418平板上生長的酵母單菌落具有較高的外源基因拷貝數(shù)，可能具有較 高的外源蛋白表達(dá)水平。按照一個優(yōu)選的實施方案，本發(fā)明提供了經(jīng)過優(yōu)化的重組畢赤酵母培養(yǎng)條件以及 重組蛋白的快速分離及純化方法，包括如下三個步驟1)菌體培養(yǎng)階段，以10v/v%的接種 量接種酵母工程菌后，經(jīng)過22 24小時的培養(yǎng)，酵母菌體濕重將達(dá)到95 100g/L左右；2) 碳源飼喂和蛋白表達(dá)階段，在該培養(yǎng)階段，酵母菌體的濕重將達(dá)到180 190g/L左右，此時 繼續(xù)補加碳源，并維持一定的PH值和溶氧量，使菌體高密度發(fā)酵，在酵母菌體生長的同時， 重組蛋白得到穩(wěn)定和高效地表達(dá)；3)蛋白純化，發(fā)酵液經(jīng)過離心和三次不同規(guī)格的濾膜過 濾處理，然后再經(jīng)過一次分子篩柱層析，重組假黑盤菌素成熟多肽的純度可達(dá)99%以上。本發(fā)明的優(yōu)選實施方案為畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，其它的酵母表達(dá)系統(tǒng)也可按照本發(fā) 明提供的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)化、表達(dá)和生產(chǎn)。因此，所有這些酵母表達(dá)系統(tǒng)都應(yīng)包括在本發(fā)明的范 圍之內(nèi)。酵母轉(zhuǎn)化使用的質(zhì)粒載體是一個整合型的質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)，按照一個優(yōu)選的實施方 案，本發(fā)明所使用的質(zhì)粒表達(dá)載體是經(jīng)過改造的PPIC9K，其所含有的AOXl誘導(dǎo)型啟動子被 畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶組成型啟動子所取代。具體地，本發(fā)明包括如下步驟1)按照畢赤酵母所偏愛的密碼子，對假黑盤菌素 成熟多肽基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，然后人工合成該基因并將其插入到PEASY-Tl質(zhì)粒的T位點 內(nèi)，用得到的中間質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，使中間載體得到復(fù)制，然 后進(jìn)行DNA測序，分析所插入外源基因的正確性和完整性；2)通過常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)， 將該外源基因定向插入到PPIC9K質(zhì)粒中的Xho I和Not I位點之間；3)根據(jù)已公布的DNA 序列(GenBank :U62648. 1)，合成引物，以畢赤酵母基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，可獲 得畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子，將該DNA序列插入到pEASY-Tl質(zhì)粒的T位點內(nèi)， 用得到的中間質(zhì)粒載體DNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α感受態(tài)細(xì)胞，使中間載體得到復(fù)制，然后進(jìn) 行DNA測序，分析所插入外源DNA片段的正確性和完整性；4)利用常規(guī)的分子生物學(xué)技術(shù)， 通過內(nèi)切酶和連接酶處理，將畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子插入到上述的PPIC9K中并取代載體原位置上的誘導(dǎo)型啟動子-乙醇氧化酶啟動子，以便使該表達(dá)載體能夠以組 成型方式穩(wěn)定和高效地表達(dá)外源蛋白；5)高表達(dá)酵母重組子的篩選，經(jīng)過電融合或其它轉(zhuǎn) 化方法，將上述重組后的酵母表達(dá)載體導(dǎo)入酵母受體細(xì)胞，在RDB固體平板選擇培養(yǎng)基上 培養(yǎng)，待酵母單菌落出現(xiàn)后，再將其逐一轉(zhuǎn)接到含不同濃度G418的YPD固體平板培養(yǎng)基上， 能夠抵抗高濃度G418的酵母重組子由于具有較高的假黑盤菌素基因拷貝數(shù)，因而有可能 具有較高的外源蛋白表達(dá)量，因此，挑選能夠在最高濃度G418的YPD固體平板培養(yǎng)基上生 長的酵母重組子進(jìn)行后續(xù)操作；6)提供重組畢赤酵母最適生長培養(yǎng)和表達(dá)的條件，重組畢 赤酵母的高密度發(fā)酵包括菌體培養(yǎng)和蛋白表達(dá)兩個階段，在每個階段選擇最適的培養(yǎng)時間 和環(huán)境條件，發(fā)酵液分別經(jīng)離心除菌、過濾、分子篩柱層析等步驟后，可得到純度達(dá)99%以 上的假黑盤菌素成熟多肽重組蛋白。選擇假黑盤菌素成熟多肽在畢赤酵母中以組成型方式表達(dá)和生產(chǎn)，是因為該多肽 具有廣譜和高效的抑菌或殺菌活性，該重組多肽作為抑菌或殺菌劑可被廣泛地用于醫(yī)療、 食品、飼料和科研等領(lǐng)域。盡管假黑盤菌素具有誘人的應(yīng)用前景，但是它的規(guī)?；凸I(yè)化 生產(chǎn)問題一直沒有得到很好地解決，而選擇畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是因為它是目前最常用的一 個外源基因表達(dá)系統(tǒng)。借由上述技術(shù)方案，本發(fā)明至少具有下列優(yōu)點及有益效果(1)本發(fā)明首次利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)成功地以組成型方式表達(dá)和生產(chǎn)假黑盤菌素成熟多肽(抗菌肽)重組蛋白；(2)本發(fā)明采用密碼子優(yōu)化后的假黑盤菌素成熟多肽基因以提高其在畢赤酵母細(xì) 胞中的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)效率；(3)本發(fā)明采用畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調(diào)控假黑盤菌成熟多肽基 因在畢赤酵母中以組成型方式高效和穩(wěn)定地表達(dá)；(4)本發(fā)明特別優(yōu)化了畢赤酵母工程菌發(fā)酵生長條件以提高假黑盤菌成熟多肽重 組蛋白的生物產(chǎn)量以及從發(fā)酵上清液中快速提純該重組外源蛋白的方法，純化工藝簡單易 行，適用于規(guī)?；a(chǎn)假黑盤菌素蛋白，最終制備的假黑盤菌成熟多肽重組蛋白純品具生 物活性，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、食品、飼料以及科研等領(lǐng)域。


圖1為本發(fā)明假黑盤菌素成熟多肽基因密碼子優(yōu)化前后對比，N代表密碼子優(yōu)化 前的基因序列，M代表密碼子優(yōu)化后的基因序列；圖2為本發(fā)明密碼子經(jīng)過優(yōu)化的假黑盤菌素成熟多肽基因的克隆及其組成型酵 母表達(dá)載體mpGPIC9K的構(gòu)建流程圖；圖3為本發(fā)明利用抑菌圈法，檢測假黑盤菌素重組蛋白對金黃色葡萄球菌的殺菌 效果示意圖，1-3為加入雞溶菌酶，濃度分別為4mg/mL、2mg/mL和lmg/mL，4-6為加入重組假 黑盤菌素蛋白，濃度分別為50ug/mL、100ug/mL和200ug/mL，CK-為陰性對照；圖4為本發(fā)明利用抑菌圈法，檢測畢赤酵母菌株MP-P不同培養(yǎng)時間的發(fā)酵上清液 抑菌圈形成情況示意圖，CK-為陰性對照；圖5為本發(fā)明電泳檢測純化后的假黑盤菌素成熟多肽，1為工程菌發(fā)酵液上清，2 為工程菌發(fā)酵液上清經(jīng)過50KDa中空纖維過濾后的濾液，3為經(jīng)IOKDa納濾膜過濾后的透過液，4為經(jīng)2. 5KDa納濾膜過濾后的回流液，5為經(jīng)過脫鹽、分子篩柱層析和凍干后所獲得的重組蛋白純品，6為蛋白Marker。
具體實施例方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。實施例1假黑盤菌素成熟多肽基因的人工合成根據(jù)已知的假黑盤菌素全長基因序列(GenBank :AJ964941)，按照畢赤酵母所偏 愛的密碼子，在不改變氨基酸序列的前提下，人工合成編碼假黑盤菌素成熟多肽的基因，合 成的成熟多肽基因全長為123bp (包括終止密碼子)，共編碼40個氨基酸殘基(見SEQ ID 而1)，分子量約為4.41 1在人工合成該多肽核苷酸編碼序列過程中，在該基因的5’端 第一個密碼子GGT前合成和添加了限制性酶切位點XhoI以及酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割 識別序列CTCGAGAAAAGA(見SEQ ID NO 2)；在該基因的3’端終止密碼子TAA后增加了限 制性酶切位點Not I。密碼子優(yōu)化后的假黑盤菌素成熟多肽基因與改造前相比，改變了其中 的19個核苷酸堿基，總共涉及到19個密碼子，而G+C含量由原來的45%變?yōu)?6%，基因改 造前后序列對比如圖1所示。人工合成的假黑盤菌素成熟多肽基因及其兩端的附屬序列如 SEQ ID N0:2所示(基因拼接和合成工作由上海博亞生物技術(shù)公司完成)。實施例2假黑盤菌素成熟多肽基因的克隆將上述人工合成的假黑盤菌素成熟多肽基因片段直接插入到pEASY-Tl (購自北 京TransGenic公司)質(zhì)粒中的T位點內(nèi)，得到含有質(zhì)粒載體mp-T的細(xì)菌克隆，然后，通過 DNA測序，確定其所含的假黑盤菌素成熟多肽基因的正確性和完整性(DNA測序由北京標(biāo)凱 科技有限公司完成)。實施例3畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子的克隆根據(jù)已知的畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子序列(GenBank :U62648. 1)，分 別合成位于啟動子兩端的引物F和R，其中F為5 ‘ -ATGGATCCTTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTC C-3'(劃線處為 BamH I 切割位點)，R 為 5' -ATGAGCTCTGTGTTTTGATAGTTGTTCAATTGATTG-3 ‘(劃線處為Sac I切割位點)，以畢赤酵母基因組DNA為模板(基因組提取方法參見《分子 克隆實驗指南第三版》)，以F和R為引物，通過PCR擴(kuò)增得到甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子 序列(GAPDH，其序列如SEQID NO :3所示)，將擴(kuò)增片段直接插入到pEASY_Tl質(zhì)粒中的T位 點內(nèi)，得到含有中間質(zhì)粒載體GAPDH-T的細(xì)菌克隆，然后，通過核苷酸測序分析，確定GAPDH 的正確性和完整性。實施例4酵母表達(dá)載體mpGPIC9K的構(gòu)建用限制性內(nèi)切酶BamH I和Sac I進(jìn)行雙酶切，將連接在中間質(zhì)粒載體GAPDH-T中 的GAPDH DNA片段切下來，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收該DNA片段。用同樣的限制性 內(nèi)切酶處理質(zhì)粒PPIC9K(美國Invitrogen公司產(chǎn)品)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線 性化后的PPIC9K質(zhì)粒DNA。將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起得到中間質(zhì) 粒載體GPIC9K。用限制性內(nèi)切酶Xho I和Not I進(jìn)行雙酶切，將插入在中間質(zhì)粒載體mp-T中的 假黑盤菌素成熟多肽基因切下，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收假黑盤菌素成熟多肽基因 DNA片段。再用相同的限制性內(nèi)切處理質(zhì)粒GPIC9K DNA，通過瓊脂糖凝膠電泳分離和回收線性化后的GPIC9K質(zhì)粒DNA。將上述兩個DNA片段混合后并用連接酶連接在一起得到假黑 盤菌素成熟多肽畢赤酵母組成型高效表達(dá)載體mpGPIC9K，該表達(dá)載體的構(gòu)建流程圖如圖2 所示。然后用該質(zhì)粒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞DH5 α (購自美國GIBCO公司)，進(jìn)行質(zhì)粒 的復(fù)制和保存。質(zhì)粒載體pPIC9K購自美國Invitrogen公司，它是一個酵母誘導(dǎo)型表達(dá)質(zhì)粒載體， 它含有一個高效的誘導(dǎo)型啟動子-醇氧化酶啟動子(AOXl)，在甲醇的誘導(dǎo)下，可調(diào)控下游 插入外源基因的高效表達(dá)。在該表達(dá)載體多克隆位點前含有α-因子分泌信號肽核苷酸編 碼序列，在與外源基因融合表達(dá)以后，可引導(dǎo)外源重組蛋白向酵母細(xì)胞外分泌。在分泌到胞 外的過程中，該信號肽序列可以被酵母自身的Kex2或Stel3基因表達(dá)產(chǎn)物切割下來，從而 不改變外源重組蛋白的N端序列。實施例5mpGPIC9K質(zhì)粒DNA的制備采用堿裂解法(參見分子克隆試驗指南)，從上述的大腸桿菌DH5 α細(xì)胞中小制備提取mpGPIC9K質(zhì)粒DNA，然后用1 2倍過量的限制性內(nèi)切酶Sal I進(jìn)行酶切，使之完全線 性化，可利用瓊脂糖凝膠電泳檢測酶切是否完全。然后用酚和氯仿分別抽提上述酶切產(chǎn)物， 乙醇沉淀，棄上清，收集沉淀，經(jīng)冷凍干燥后，將沉淀重新溶解在無菌的去離子水中，-20°C 保存?zhèn)溆谩嵤├?酵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)化將_72°C保存的畢赤酵母菌株GS115(購自美國Invitrogen公司)接種到5mL YPD 液體培養(yǎng)基中(1%酵母提取物，2%胰蛋白胨，2%葡萄糖)，28°C震蕩培養(yǎng)1天左右，將培 養(yǎng)好的菌液以接種量重新接種于IOOmL YPD液體培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜(8h)至 OD600nm = 1. 3 1. 5,4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵母細(xì)胞重懸在200mL冰 預(yù)冷的滅菌去離子水中，緩慢重懸菌體，4°C 4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清，將沉淀的酵 母細(xì)胞重懸在200mL冰預(yù)冷的IM山梨醇中溶液中，4°C 4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，倒掉上清， 將沉淀的酵母細(xì)胞重懸在40mL冰預(yù)冷的IM山梨醇中溶液中，40C 4000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘， 倒掉上清，將沉淀的酵母細(xì)胞重懸在ImL冰預(yù)冷的IM山梨醇中溶液中，吸取SOuL于1. 5mL 離心管中，與上述線性化表達(dá)載體mpGPIC9K質(zhì)粒DNA (4 5ug)充分混勻，然后轉(zhuǎn)移到冰浴 后的0. 2cm無菌電擊杯中，利用電擊儀PrecisionPulse (美國BTX公司產(chǎn)品)將線性化 的表達(dá)載體mpGPIC9K質(zhì)粒DNA導(dǎo)入酵母感受態(tài)細(xì)胞中，使用的電擊參數(shù)為電壓1. 5kV，電 容50uF，電阻200Ω。電擊完成后，立即向電擊杯中加入ImL室溫的YPD培養(yǎng)基，充分混勻 后，28°C靜置1小時，然后均勻涂布于RDB選擇培養(yǎng)基平板(1. 34% YNB，IM山梨醇，葡萄 糖，0. 00004% Biotin,0. 005%谷氨酸，0. 005% 甲硫氨酸，0. 005%賴氨酸，0. 005%亮氨酸， 0. 005%異亮氨酸，2%瓊脂粉)上，倒置于28°C恒溫培養(yǎng)箱中2 3天，至菌落出現(xiàn)。實施例7高表達(dá)重組酵母菌株的篩選將在RDB培養(yǎng)基上生長的酵母單菌落(轉(zhuǎn)化子)用無菌牙簽逐一挑取到含有梯度 G418 的 YPD 培養(yǎng)基平板(分別含有 0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL、2mg/mL G418)上，倒置于 28°C恒溫培養(yǎng)箱中1 2天。隨著攜帶有G418抗性基因的外源質(zhì)粒整合到酵母基因組中 的拷貝數(shù)的增加，轉(zhuǎn)化子對G418的抗性也增強。挑取能夠在含有2mg/mL G418的YPD平板 上生長的酵母轉(zhuǎn)化子，接種于IOOmLBMGY培養(yǎng)基(1 %酵母提取物，2%酪蛋白胨，IOOmM磷酸 鉀緩沖液(ρΗ7· 0)，1. 34% YNB,0. 00004% Biotin, 1ν/ν%甘油)中 28°C震蕩培養(yǎng) 4 天，發(fā)酵液10000轉(zhuǎn)/分離心5分鐘，收集含有重組假黑盤菌素成熟多肽的上清液，該上清液可直接用于抑菌活性的測定。重組蛋白抑菌活性的測定采用抑菌圈法，所用的溶壁微球菌(Micrococcus Lysodeikticus)和金黃色葡萄球菌(S. aureus)購自中國科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中 心，菌種編號分別為CGMCC1. 0634和CGMCC 1.2465。將溶壁微球菌或金黃色葡萄球菌接種 于5mL LB液體培養(yǎng)基中(每L含有蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g, pH7. 0)，37°C震 蕩培養(yǎng)至0D_nm約為1. 0，吸取IuL培養(yǎng)物于45°C的尚未凝固的固體LB培養(yǎng)基中，迅速混 勻，倒制平板。待平板凝固后，用打孔器在其上打出直徑約5mm的圓孔，將發(fā)酵液上清20uL 加入孔中，37°C靜置過夜，具有抑菌活性的發(fā)酵液將會使圓孔周圍出現(xiàn)透明圈，并且根據(jù)抑 菌圈半徑的大小可以判斷發(fā)酵液抑菌活性的強弱(如圖3所示)。隨機(jī)挑取10個能夠在2mg/mL G418的YPD平板上生長的轉(zhuǎn)化子，發(fā)酵培養(yǎng)，取發(fā) 酵液上清進(jìn)行抑菌活性測定。測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有能夠在2mg/mL G418的YPD平板上生長的 轉(zhuǎn)化子都具有抑菌活性，并且抑菌活性強弱差別不明顯。將能夠在溶壁微球菌和金黃色葡萄球菌平板上都能產(chǎn)生抑菌圈的重組子挑選出 一株作為工程菌加以保存，并將其命名為MP-P。實施例8重組酵母菌的高密度發(fā)酵1.種子液的制備將重組酵母菌株MP-P接種于IOmL BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，以10% 的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmL BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，再以10%的接種量轉(zhuǎn)接于IL BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)過夜，將其轉(zhuǎn)接到4L BMGY培養(yǎng)基中，28°C震蕩培養(yǎng)2天，作為 高密度發(fā)酵的種子液。2.重組酵母在50L發(fā)酵罐中的高密度發(fā)酵發(fā)酵過程可以分為以下兩個階段1)菌體培養(yǎng)階段在50L發(fā)酵罐(鎮(zhèn)江東方生 物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司)中盛有30L基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(IOXBasal Salts 2. 67% 磷酸、0. 093%硫酸鈣、1. 82%硫酸鉀、1. 49%硫酸鎂、0. 413%氫氧化鉀+4%甘油)，在接種 前先加入氨水使該培養(yǎng)基的PH值維持在6. 0左右(氨水同時也可作為酵母菌體生長的氮 源)，再按下述比例，在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37ml微量鹽溶液PTMl (0. 6 %硫酸 銅，0. 008%碘化鈉，0. 3%硫酸錳，0. 02%鉬酸鈉，0. 002%硼酸，0. 05%氯化鈷，2%氯化鋅， 6. 5%硫酸亞鐵，0. 025%生物素，0. 5%硫酸)。按10%的比例接種此前制備好的種子液， 28°C通氣攪拌(轉(zhuǎn)速自始至終維持在380轉(zhuǎn)/分)培養(yǎng)24小時左右。培養(yǎng)過程中，隨著 酵母菌體的生長，培養(yǎng)基中的溶氧量將由100%逐漸降低，當(dāng)培養(yǎng)基中的碳源消耗完后，溶 氧量將再度升高至80%以上，此時菌體的濕重將達(dá)90-95g/L ；2)飼喂碳源和蛋白表達(dá)階段 (24 96h)在接種第二天，通過蠕動泵流加補料液，補料液為50%甘油(其中含有12mL PTM1/L)，流加量為18mL/hr/L發(fā)酵液。28°C通氣攪拌培養(yǎng)4 6小時，此時的菌體濕重將 達(dá)180 190g/L。隨著菌體的生長，pH值逐漸降低，用氨水維持pH值在6.0左右，同時調(diào) 整通氣量使此階段的溶氧量始終維持在20%以上。在培終維持2%左右(每天大概加入 720mL)，溶氧量始終大于20%，溫度維持養(yǎng)的第3 4天，繼續(xù)流加50%的甘油(其中含有 12mLPTMl/L)，使甘油濃度始在28°C，pH維持在6.0左右。每隔24小時取數(shù)毫升發(fā)酵液經(jīng) 5000rpm 4°C下離心10分鐘，取30uL發(fā)酵液上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測，發(fā)現(xiàn)有肉眼可觀察到的一條蛋白帶，分子量約為5KDa，與推測中的假黑盤菌素成熟多肽分子量基本吻合。從抑菌圈活性檢測中發(fā)現(xiàn)，自接種開始算起，在培養(yǎng)96小時后，重組蛋白的表達(dá)量就已經(jīng)達(dá)到 最高峰(如圖4所示)。實施例9重組蛋白的純化待一個發(fā)酵周期全部結(jié)束之后，留取500mL發(fā)酵液作為種子液(接種量為5% ) 直接進(jìn)行下一輪的發(fā)酵過程。類似的操作累計進(jìn)行3輪，在每輪發(fā)酵過程中，均對菌體的生 長量和重組蛋白的表達(dá)量進(jìn)行了測定。另外，在每輪發(fā)酵過程完全結(jié)束后，還取少許菌液涂 布于YPD固體平板上，并從中任意挑取10個酵母單菌落，快速提取其基因組(蔡傳奇等， 2001) DNA，進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌體的生物量、生長速度以及重組蛋白的表達(dá)量在各 輪發(fā)酵過程中基本保持穩(wěn)定，另外，PCR的檢測結(jié)果也證實重組畢赤酵母菌株具有很好的遺 傳穩(wěn)定性(見表2)。表2MP-P菌株的遺傳穩(wěn)定性和外源蛋白表達(dá)穩(wěn)定性的測定 在一個發(fā)酵周期結(jié)束之后，除留下500mL發(fā)酵液作為種子液外，其余的發(fā)酵液用 于重組蛋白的純化。發(fā)酵液經(jīng)5000rpm 4°C離心10分鐘，留取上清。發(fā)酵液上清首先用截 流分子量為50KDa的中空纖維濾柱(天津膜天膜工程技術(shù)有限公司，產(chǎn)品型號M0F-503， 使用方法見該公司說明)過濾，收集透過液，澄清的透過液再用截流分子量為IOKDa的納 濾膜(上海朗極化工科技有限公司，產(chǎn)品編號2426538)處理，保留分子量小于IOKDa的透 過液，將透過液再用截流分子量為2. 5KDa的納濾膜(上海朗極化工科技有限公司，產(chǎn)品編 號2405515)處理，保留分子量大于2. 5KDa的回流液，回流液終體積約為700mL。將此回 流液進(jìn)行脫鹽處理，向700mL回流液中加入6. 3L蒸餾水，即將回流液稀釋10倍，然后將稀 釋液再次通過上述2. 5KDa的納濾膜處理，此時得到的回流液中鹽離子濃度也相應(yīng)稀釋10 倍，如此重復(fù)操作5次，即回流液中鹽離子濃度稀釋IO5倍，最終得到700mL回流液，將此回 流液冷凍干燥后，可得到初步提純的重組蛋白凍干粉。該樣品經(jīng)分子篩柱層析進(jìn)一步分離 提純，分子篩柱層析條件為柱填充料為S印hadex G75(美國GE公司產(chǎn)品)，柱高35cm，直 徑16mm，流速lmL/min，洗脫緩沖液為20mM磷酸鉀緩沖液pH6. 2，樣品上樣量為500uL (含 凍干粉50mg)，每ImL流出液收集一管，從每管收集液中取少量進(jìn)行抑菌圈實驗和4 12% Bis-Tris Mini Gels (美國 Invitrogen 產(chǎn)品)電泳。抑菌圈較大且在 Bis-Tris Mini Gels 上顯示單一目的條帶的收集液被匯集在一起，作為最終制得的重組蛋白純品。在上述純化流程中，每個操作步驟之后都留取少量樣品以便進(jìn)行總蛋白量、純度 和回收率的測定(如表3所示)。
最終制得的重組蛋白純品進(jìn)行Bis-Tris Mini Gels電泳，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色和脫 色后，電泳圖經(jīng)LabWork軟件(美國UVP公司產(chǎn)品)分析，結(jié)果顯示重組蛋白濃度達(dá)到99% 以上(如圖5所示)，重組蛋白的表達(dá)量約為0. 16g/L。表3重組假黑盤菌素成熟多肽的純化 雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在 本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之作一些修改或改進(jìn)，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因 此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn)，均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。參考文獻(xiàn)Brogden KA. Nat Rev Microbiol. 2005 Mar ；3 (3) 238-50歐艷秋，中山大學(xué)研究生學(xué)刊，2008，29 (2) 24-28Ouellette AJ. Curr Top Microbiol Immunol. 2006 ；306 1-25.H Jenssen,et al. Clinical Microbiology Reviews,July 2006,19(3) :491_511Powers JP, et al. P印tides. 2003Nov ;24 (11) :1681_91Per H. Mygind, et al. Nature 2005(437) :975_980熊向華等，生物技術(shù)通訊，2006，17 (5) :771_774蔡傳奇等，生物工程學(xué)報，2001，17 (2) 155-160.
權(quán)利要求
一種含有編碼假黑盤菌素成熟多肽的DNA序列的表達(dá)載體，其包括酵母組成型啟動子，位于啟動子下游的編碼α-因子分泌信號肽的核苷酸序列以及編碼假黑盤菌素成熟多肽的DNA序列，所述編碼假黑盤菌素成熟多肽的DNA序列的5’端具有酵母Kex2基因表達(dá)產(chǎn)物切割識別序列GAGAAAAGA。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述酵母組成型啟動子為畢赤酵母 甘油醛-3-磷酸脫氫酶的啟動子。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述編碼假黑盤菌素成熟多肽的 DNA序列如SEQ ID No. 2所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的表達(dá)載體，其特征在于，所述表達(dá)載體的出發(fā)載體為 PPIC9K。
5.含有權(quán)利要求1-4任意一項所述表達(dá)載體的宿主。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主，其為畢赤酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主，其為畢赤酵母GS115基因工程菌。
8.權(quán)利要求7所述基因工程菌的培養(yǎng)方法，其包括步驟1)菌體培養(yǎng)在基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，接種前用氨水調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的PH值為5.7 6. 0，然后在每升基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入4. 37mL PTMl溶液；按10v/v%的比例接入 種子液，28 30°C，370 380轉(zhuǎn)/分通氣攪拌培養(yǎng)22 24小時；2)飼喂碳源通過蠕動泵向步驟1)的發(fā)酵液中流加含有12mLPTMl/L發(fā)酵液的50%甘 油，流加量為16 18mL/hr/L發(fā)酵液，28 30°C通氣攪拌培養(yǎng)4 6小時，在培養(yǎng)過程中 加入氨水以維持PH值為5. 7 6. 0，同時調(diào)整通氣量，使溶氧量維持在20%以上；然后，在 培養(yǎng)的第3 4天，繼續(xù)流加含有12mL PTM1/L發(fā)酵液的50%甘油，使甘油濃度始終維持在 1. 5 2%，溶氧量始終維持在20%以上，溫度維持在28 30°C，pH維持在5. 7 6. 0 ；其中，所述基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基為IOXBasal Salts+4%甘油；所述PTMl含有0. 6%硫酸 銅、0. 008%碘化鈉、0. 3%硫酸錳、0. 02%鉬酸鈉、0. 002%硼酸、0. 05%氯化鈷、2%氯化鋅、6.5%硫酸亞鐵、0. 025%生物素和0. 5%硫酸。
9.權(quán)利要求7所述基因工程菌分泌的重組蛋白的純化方法，其包括離心除菌、過濾和 分子篩柱層析的步驟。
10.一種在重組畢赤酵母中表達(dá)假黑盤菌素成熟多肽的方法，其是利用權(quán)利要求1-4 任一項所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母經(jīng)過發(fā)酵培養(yǎng)，分泌產(chǎn)生假黑 盤菌素成熟多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種在畢赤酵母細(xì)胞中以組成型方式表達(dá)和生產(chǎn)假黑盤菌素成熟多肽重組蛋白的方法，其包括1)優(yōu)化假黑盤菌素成熟多肽基因；2)采用分子克隆等方法得到畢赤酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子DNA序列，將假黑盤菌素成熟多肽基因置于甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動子調(diào)控之下，與質(zhì)粒連接得到新的、組成型和分泌型的畢赤酵母高效表達(dá)載體；3)利用該載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，獲得的重組畢赤酵母菌株產(chǎn)生具有生物活性的假黑盤菌素成熟多肽；4)對該工程菌株高密度發(fā)酵條件以及重組蛋白的表達(dá)和純化進(jìn)行優(yōu)化。采用本發(fā)明方法制備得到的假黑盤菌素成熟多肽可應(yīng)用于醫(yī)療、食品、飼料及科研等領(lǐng)域，適于規(guī)?；a(chǎn)假黑盤菌素蛋白。
文檔編號C12R1/84GK101845454SQ20101014991
公開日2010年9月29日 申請日期2010年4月16日 優(yōu)先權(quán)日2010年4月16日
發(fā)明者劉德虎 申請人:劉德虎