專(zhuān)利名稱(chēng)：一種普魯蘭酶及其生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是一種普魯蘭酶及其生產(chǎn)方法。屬于作用在α -1，6-糖苷鍵上的淀粉水解 酶。
背景技術(shù)：
淀粉是綠色植物光合作用的產(chǎn)品，在植物淀粉中，支鏈淀粉的含量約占70% 95 %，如玉米中74 %、馬鈴薯中76 %、小麥中75 %、稻谷中占81 %，糯米中占100 %。支鏈淀 粉的相對(duì)分子量很大，大約100萬(wàn) 600萬(wàn)。支鏈淀粉中，如同在直鏈淀粉中一樣，D-葡萄 糖單位也通過(guò)α-1，4-苷鍵連接成一直鏈，只不過(guò)在此直鏈上又通過(guò)α-1，6-苷鍵形成側(cè) 鏈，在側(cè)鏈上又會(huì)出現(xiàn)另一個(gè)分支側(cè)鏈。因此結(jié)構(gòu)很復(fù)雜，成樹(shù)形分支結(jié)構(gòu)。由于支鏈淀粉 中約含有4% 5%的α-1、6-糖苷鍵，而傳統(tǒng)淀粉酶對(duì)淀粉中的α-1、6_糖苷鍵的水解能 力較弱，一直影響著淀粉最終水解度的提高。普魯蘭酶(Pullulanase，EC. 3. 2. 1.41)能夠?qū)Ｒ恍郧虚_(kāi)支鏈淀粉分支點(diǎn)中的 α-1、6-糖苷鍵，剪下整個(gè)側(cè)枝，而使其變成直鏈淀粉。有效的彌補(bǔ)了糖化酶在淀粉水解中 的不足，普魯蘭酶與糖化酶復(fù)合使用具有良好的 協(xié)同效果，在糖化酶用量低于傳統(tǒng)用量的 50%的條件下，可使DE值高達(dá)98%以上。普魯蘭酶與β-淀粉酶混合使用時(shí)，幾乎可以全 部將淀粉轉(zhuǎn)化為麥芽糖。從而能夠生產(chǎn)出80%以上的超高麥芽糖漿。在啤酒生產(chǎn)工藝中， 添加普魯蘭酶在提高糖化效果的同時(shí)縮短了糖化時(shí)間，在干啤酒生產(chǎn)中應(yīng)用它減少糊精含 量，提高了啤酒的品質(zhì)。另外，將普魯蘭酶用于直鏈淀粉的生產(chǎn)、釀造酒精、味精、抗消化淀 粉、歧化環(huán)糊精、緩慢消化淀粉、高直鏈淀粉制造等以淀粉為原料的工業(yè)產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)，都可以 得到很高的產(chǎn)率，極大的提高了淀粉資源的利用率。進(jìn)而為人類(lèi)生活需要的食品、飲料、保 健品、藥品以及紡織、食品包裝、及環(huán)境保護(hù)提供了優(yōu)質(zhì)原料。但現(xiàn)有技術(shù)中的的普魯蘭酶還存在如下不足1.耐熱性差，最適溫度在60°C左右，超過(guò)60°C活力迅速下降；2.耐酸性差，pH低于5. 0不穩(wěn)定；3.酶活力低，制造成本過(guò)高；4.價(jià)格昂貴。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于避免上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，而提供一株耐熱、耐酸性能 好，酶活力高、性能穩(wěn)定而且價(jià)格較低的普魯蘭酶產(chǎn)品。本發(fā)明的目的還在于提供一種發(fā)酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的普魯蘭 酶液態(tài)生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。本發(fā)明的目的可以通過(guò)如下措施來(lái)達(dá)到本發(fā)明的普魯蘭酶，其特征在于a.酶學(xué)特性
最適pH 3. 8 4. 4，穩(wěn)定pH 3. 5 4. 5 ；最適作用溫度為50°C ~65V ；b.選用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為產(chǎn)酶菌種，來(lái)源于中國(guó)工業(yè) 微生物菌種保藏管理中心(CICC編號(hào)10185)，采用底料與補(bǔ)料復(fù)合加料液態(tài)發(fā)酵工藝制 備，達(dá)到如下工藝技術(shù)指標(biāo)①產(chǎn)品酶活力彡1100u/ml②發(fā)酵周期72 80小時(shí)③液體酶回收率彡86. 5%。發(fā)明人選用的地衣芽孢桿菌，其最適pH及耐熱性與糖化酶比較接近，有著較好的 配伍性，能更好地應(yīng)用于以淀粉為原料的食品加工行業(yè)。
適合的產(chǎn)酶菌種與液態(tài)發(fā)酵工藝巧妙結(jié)合，產(chǎn)生了意想不到的技術(shù)效果，從而完 成了本發(fā)明的任務(wù)。本發(fā)明的目的還可以通過(guò)如下措施來(lái)達(dá)到本發(fā)明的發(fā)明人通過(guò)改變菌種發(fā)酵條件來(lái)提高酶活力，使生產(chǎn)的普魯蘭酶活性 高，性能穩(wěn)定。下面公開(kāi)一種本發(fā)明的普魯蘭酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟a.菌禾中培養(yǎng)培養(yǎng)基包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分①液態(tài)培養(yǎng)基糯米淀粉30蛋白胨5KH2PO412K2H PO45MgSO4 · 7H201pH7. 0②斜面培養(yǎng)基糯米淀粉1. 0蛋白胨5酵母膏5KH2PO44. 5MgSO4 · 7H201瓊脂2. 0pH7. 0③分離培養(yǎng)基紅色普魯蘭糖3酵母膏5KH2PO44. 5MgSO4 · 7H201瓊脂2. 0pH7. 0
④發(fā)酵培養(yǎng)基液A組分豆餅粉50玉米漿20糯米粉30CaCl20. 45pH7. 0液B組分檸檬酸三鈉20K2H PO16KH2PO44pH7. 5其中液A 液B = 9 1 (體積比)，接種前混合；菌種培養(yǎng)工藝條件分離平板34°C 36小時(shí)；液體種子34°C 24小時(shí)搖床轉(zhuǎn)速200r/m ；斜面培養(yǎng)34°C 2 3天；發(fā)酵搖瓶34°C 3天搖床轉(zhuǎn)速200r/m ；b.種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)①以重量份數(shù)計(jì)的培養(yǎng)基原料組分淀粉6豆餅粉5玉米漿2CaCl20. 15檸檬酸三鈉0. 2K2H PO1. 2KH2PO40. 4硫酸銨0. 4消泡劑0. 04pH7. 0②滅菌工藝條件:121°C _124°C，0. 11 0. 12Mpa下，滅菌30分鐘；③培養(yǎng)工藝條件罐壓 Mpa0. 05 0. 08溫度V34風(fēng)量 m3/h30攪拌轉(zhuǎn)速r/min 180④移種條件菌體染色深、粗壯，無(wú)雜菌，酶活力在10u/ml左右。c.液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶①包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分
淀粉2糯米粉3豆餅粉5玉米漿2CaCl20. 15檸檬酸三鈉 0. 2K2H PO1.6
KH2PO40. 5硫酸銨0. 4消泡劑0. 04pH7. 0②液化水解加入高溫淀粉酶100重量份升溫至90°C，保溫30分鐘；③滅菌工藝條件121°C 124°C，0. 11 0. 12Mpa 下，滅菌 30 分鐘；④發(fā)酵工藝條件罐壓 Mpa0. 05 0. 08溫度V34風(fēng)量m3/h0 24 小時(shí) 1 0.324 48 小時(shí) 1 0. 548小時(shí) 出料1 0.6攪拌轉(zhuǎn)速r/min 180 pH5 6. 7 ；d.補(bǔ)料①包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分淀粉20糯米粉6CaCl20. 15消泡劑0.04pH7.0②液化水解加入高溫淀粉酶500重量份升溫至90°C，保溫30分鐘；③滅菌工藝條件121 °C 124°C，0. 11 0. 12Mpa 下，滅菌 30 分鐘；④補(bǔ)料方法當(dāng)DO降至最低再升至35%時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料，控制DO在30%-40% ；e.出料培養(yǎng)72小時(shí)左右，酶活力增長(zhǎng)緩慢，菌體開(kāi)始部分自溶，即可放；f.普魯蘭酶提取
發(fā)酵液一預(yù)處理一壓濾一超濾一標(biāo)準(zhǔn)化一精濾一調(diào)配一灌裝一檢測(cè)一成品。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，支鏈淀粉對(duì)于本發(fā)明采用的地衣芽胞桿菌產(chǎn)酶具有更強(qiáng)大的誘導(dǎo)作 用。這是因?yàn)橹ф湹矸巯啾绕渌荚淳哂懈嗟闹ф?，?duì)普魯蘭酶的產(chǎn)生具有更強(qiáng)的誘導(dǎo) 作用。糯米粉結(jié)構(gòu)中支鏈淀粉含量為100%，全部是支鏈淀粉，適量的糯米粉組分有利于地 衣芽胞桿菌產(chǎn)酶。氮源對(duì)發(fā)酵產(chǎn)酶有重要影響，實(shí)驗(yàn)表明，豆餅粉和酵母膏效果較佳，其次為牛肉膏 和蛋白胨。無(wú)機(jī)氮源中硫酸銨對(duì)產(chǎn)酶有一定的促進(jìn)作用。而硝酸銨則對(duì)酶的合成有抑制作 用。pH是微生物生長(zhǎng)代謝的重要參數(shù)，PH對(duì)產(chǎn)酶活力有明顯的影響。實(shí)驗(yàn)表明，在 PH6. 5士0. 2發(fā)酵產(chǎn)酶酶活最高，而隨著pH的逐漸升高或者降低，酶活則都會(huì)降低低，在 pH5. 5和pH8. 0的時(shí)候，酶活就下降到了 20%左右，而在pH 4. 5和pH 9. 0的時(shí)候，就基本 上沒(méi)有酶活力了。此外，通風(fēng)量、無(wú)機(jī)鹽的組分和含量、培養(yǎng)溫度、發(fā)酵時(shí)間等都對(duì)菌種產(chǎn)酶活力有 重要影響。本發(fā)明的發(fā)明人對(duì)液態(tài)發(fā)酵工藝中的培養(yǎng)基原料組分進(jìn)行了多次實(shí)驗(yàn)，對(duì)碳源、 氮源、PH值、通風(fēng)量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵周期及加料方式都進(jìn)行了周密、細(xì)致、嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膬?yōu)化篩選。 上述所有液態(tài)發(fā)酵工藝條件的協(xié)調(diào)配合，極大的提高了采用菌株的產(chǎn)酶能力。
本發(fā)明的普魯蘭酶，適用于啤酒外加酶法糖化工藝，酒精、味精、氨基酸、乳酸等以 淀粉為原料的發(fā)酵工業(yè)，超高麥芽糖漿制造工業(yè)，抗消化淀粉、歧化環(huán)糊精、緩慢消化淀粉 等改性淀粉產(chǎn)品，以及直鏈淀粉、高直鏈淀粉制造。本發(fā)明的普魯蘭酶及其生產(chǎn)方法所公開(kāi)的技術(shù)方案，相比現(xiàn)有技術(shù)具有突出的實(shí) 質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步，并能產(chǎn)生如下積極效果1提供了一種耐熱、耐酸性能好，酶活力高、性能穩(wěn)定而且價(jià)格較低的普魯蘭酶產(chǎn)
P
ΡΠ O2.提供了一種發(fā)酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的普魯蘭酶液態(tài)生物發(fā)酵 生產(chǎn)方法。3.產(chǎn)品用途廣泛。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明下面將結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步詳述實(shí)施例1本發(fā)明的一種普魯蘭酶的制備方法，包括如下步驟a.菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分①液態(tài)培養(yǎng)基糯米淀粉30蛋白胨5KH2PO412K2H PO45MgSO4 · 7H20 1
pH7.0②斜面培養(yǎng)基糯米淀粉1.0蛋白胨5酵母膏5KH2PO44.5MgSO4 · 7H20 1瓊脂2.0pH7.0③分離培養(yǎng)基紅色普魯蘭糖 3酵母膏5KH2PO44.5MgSO4 · 7H20 1瓊脂2.0pH7.0④發(fā)酵培養(yǎng)基液A組分豆餅粉50玉米漿20糯米粉30CaCl20. 45pH7.0液B組分檸檬酸三鈉 20K2H PO16KH2PO44pH7.5其中液A 液B = 9 1(體積比)，接種前混合；菌種培養(yǎng)工藝條件分離平板34°C 36小時(shí)；液體種子34°C 24小時(shí)搖床轉(zhuǎn)速200r/m ；斜面培養(yǎng)34°C 2 3天；發(fā)酵搖瓶34°C 3天搖床轉(zhuǎn)速200r/m ；b.種子罐擴(kuò)大培養(yǎng)①以重量份數(shù)計(jì)的培養(yǎng)基原料組分淀粉6豆餅粉5玉米漿2
CaCl20. 15檸檬酸三鈉 0.2K2HPO1.2KH2PO40.4硫酸銨0.4消泡劑0.04pH7.0②滅菌工藝條件:121°C _124°C，0. 11 0. 12Mpa下，滅菌30分鐘；③培養(yǎng)工藝條件罐壓 Mpa0. 05 0. 08溫度V34風(fēng)量 m3/h30攪拌轉(zhuǎn)速r/min 180④移種條件菌體染色深、粗壯，無(wú)雜菌，酶活力在10u/ml左右。c.液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶①包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分淀粉2糯米粉3豆餅粉5玉米漿2CaCl20. 15檸檬酸三鈉0. 2K2H PO1.6KH2PO40. 5硫酸銨0.4消泡劑0.04pH7. O②液化水解加入高溫淀粉酶100重量份升溫至90°C，保溫30分鐘；③滅菌工藝條件121 °C 124°C，0. 11 0. 12Mpa 下，滅菌 30 分鐘；④發(fā)酵工藝條件罐壓 Mpa0. 05 0. 08溫度V34風(fēng)量m3/hO 24 小時(shí) 1 0.324 48 小時(shí) 1 0. 548小時(shí) 出料1 0.6攪拌轉(zhuǎn)速r/min 180 pH5 6. 7 ；
d.補(bǔ)料①包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分淀粉20糯米粉6
CaCl20. 15消泡劑0. 04pH7.0②液化水解加入高溫淀粉酶500重量份升溫至90°C，保溫30分鐘；③滅菌工藝條件121°C 124°C，0. 11 0. 12Mpa下，滅菌30分鐘；④補(bǔ)料方法當(dāng)DO降至最低再升至35%時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料，控制DO在30%-40% ；e.出料培養(yǎng)72小時(shí)左右，酶活力增長(zhǎng)緩慢，菌體開(kāi)始部分自溶，即可放；f.普魯蘭酶提取發(fā)酵液一預(yù)處理一壓濾一超濾一標(biāo)準(zhǔn)化一精濾一調(diào)配一灌裝一檢測(cè)一成品。技術(shù)指標(biāo)①產(chǎn)品酶活力彡1100u/ml②發(fā)酵周期72-80小時(shí)③液體酶回收率彡86. 5%。
權(quán)利要求
一種普魯蘭酶，其特征在于a.酶學(xué)特性最適pH 3.8～4.4，穩(wěn)定pH 3.5～4.5；最適作用溫度為50℃-65℃b.選用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為產(chǎn)酶菌種，來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC編號(hào)10185)，采用底料與補(bǔ)料復(fù)合加料方式，液態(tài)發(fā)酵工藝制備，達(dá)到如下工藝技術(shù)指標(biāo)①產(chǎn)品酶活力≥1100u/ml；②發(fā)酵周期72～80小時(shí)③液體酶回收率≥86.5％。
2.—種權(quán)利要求1的普魯蘭酶的制備方法，其特征在于包括如下步驟 a.菌種培養(yǎng)培養(yǎng)基包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分①液態(tài)培養(yǎng)基糯米淀粉30蛋白胨5KH2P0412K2H P045MgS04 7H20 1 pH7.0②斜面培養(yǎng)基糯米淀粉 1. 0 蛋白胨5酵母膏5KH2P044. 5MgS04 7H20 1 瓊脂2.0pH7.0③分離培養(yǎng)基 紅色普魯蘭糖3 酵母膏5 KH2P04 4. 5 MgS04 7H20 1 瓊脂 2.0 pH 7.0④發(fā)酵培養(yǎng)基 液A組分 豆餅粉 50 玉米漿 20 糯米粉 30CaCl2 0. 45 pH7.0液B組分 檸檬酸三鈉20 16k2hp0kh2po44ph7. 536小時(shí)；24小時(shí)搖床轉(zhuǎn)速200r/m ； 2 3天；3天搖床轉(zhuǎn)速200r/m ；其中液A 液B = 9 1(體積比)，接種前混合； 菌種培養(yǎng)工藝條件 分離平板34°C 液體種子34°C 斜面培養(yǎng)34 °C 發(fā)酵搖瓶34°C b.種子罐擴(kuò)大培養(yǎng) ①以重量份數(shù)計(jì)的培養(yǎng)基原料組分 淀粉 豆餅粉 玉米漿 CaCl2檸檬酸三鈉 k2h po kh2po4 硫酸銨 消泡劑 ph6 5 2，0.15 0. 2，1.2 40. 4，0. 4 0. 04 7. 0②滅菌工藝條件③培養(yǎng)工藝條件 罐壓Mpa 溫度。C風(fēng)量m3/h 攪拌轉(zhuǎn)速r/min121 °C -124°C，0. 11 0. 12Mpa 下，滅菌 30 分鐘，0. 08，0. 05 34 30 180④移種條件菌體染色深、粗壯，無(wú)雜菌，酶活力在10u/ml左右,c.液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭酶①包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分淀粉2糯米粉3豆餅粉5玉米漿2CaCl9，0. 15檸檬酸三鈉 0. 2 K9HP01.6KH2P040. 5硫酸銨0.4消泡劑0.04pH7.0②液化水解加入高溫淀粉酶100重量份升溫至90°c，保溫30分鐘；③滅菌工藝條件121 °C 124°C，0. 11 0. 12Mpa 下，滅菌 30 分鐘；④發(fā)酵工藝條件罐壓 Mpa 0. 05 0. 08溫度。C 34風(fēng)量m3/h0 24小時(shí) 1 0. 3 24 48小時(shí) 1 0. 5 48小時(shí) 出料1 0. 6 攪拌轉(zhuǎn)速r/min 180 pH5 6. 7 ；d.補(bǔ)料①包括如下按照重量份數(shù)計(jì)的原料組分淀粉20糯米粉6CaCl20. 15消泡劑0. 04PH7. 0②液化水解加入高溫淀粉酶500重量份升溫至90°C，保溫30分鐘；③滅菌工藝條件121 °C 124°C，0. 11 0. 12Mpa 下，滅菌 30 分鐘；④補(bǔ)料方法當(dāng)DO降至最低再升至35%時(shí)，開(kāi)始補(bǔ)料，控制DO在30% -40% ；e.出料培養(yǎng)72小時(shí)左右，酶活力增長(zhǎng)緩慢，菌體開(kāi)始部分自溶，即可放；f.普魯蘭酶提取發(fā)酵液一預(yù)處理一壓濾一超濾一標(biāo)準(zhǔn)化一精濾一調(diào)配一灌裝一檢測(cè)一成品。
3.權(quán)利要求1的普魯蘭酶，其特征在于適用于啤酒外加酶法糖化工藝，酒精、味精、氨 基酸、乳酸等以淀粉為原料的發(fā)酵工業(yè)，超高麥芽糖漿制造工業(yè)，抗消化淀粉、歧化環(huán)糊精、 緩慢消化淀粉等改性淀粉產(chǎn)品，以及直鏈淀粉、高直鏈淀粉制造。
全文摘要
本發(fā)明是一種普魯蘭酶及其生產(chǎn)方法。屬于作用在α-1，6-糖苷鍵上的淀粉水解酶。其特征在于a.酶學(xué)特性最適pH 3.8～4.4，穩(wěn)定pH 3.5～4.5；最適作用溫度為50℃-65℃；b.選用地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)為產(chǎn)酶菌種，來(lái)源于中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC編號(hào)10185)，采用底料與補(bǔ)料復(fù)合加料方式，液態(tài)發(fā)酵工藝制備，達(dá)到如下工藝技術(shù)指標(biāo)①產(chǎn)品酶活力≥1100u/ml，②發(fā)酵周期72-80小時(shí)，③液體酶回收率≥86.5％。提供了一種耐熱、耐酸性能好，酶活力高、性能穩(wěn)定而且價(jià)格較低的普魯蘭酶產(chǎn)品，及其發(fā)酵酶活力高、提取收率高、制造成本低的液態(tài)生物發(fā)酵生產(chǎn)方法。適用于以淀粉為原料的發(fā)酵工業(yè)以及改性淀粉產(chǎn)品、直鏈淀粉、高直鏈淀粉制造。
文檔編號(hào)C12N9/44GK101831416SQ20101010128
公開(kāi)日2010年9月15日 申請(qǐng)日期2010年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月22日
發(fā)明者劉順啟, 王仲連, 王興吉, 郭慶文 申請(qǐng)人:山東隆科特酶制劑有限公司