專利名稱：一株用于生產γ-亞麻酸的酵母工程菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株用于生產Y-亞麻酸的酵母工程菌，屬于基因工程領域，本發(fā)明 可用于通過酵母工程菌表達假狼紫草Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，將底物亞油酸催化轉變?yōu)楦?價值Y-亞麻酸。
背景技術：
1917年，德國化學家在月見草(Oenothera biennis)中發(fā)現了一種其它植物體中 極為少見的脂肪酸一Y-亞麻酸，后稱為維生素F。目前，Y-亞麻酸作為具有生理作用的 藥物，已經廣泛受到國內外醫(yī)學界的重視，用于防治心血管疾病、糖尿病、降低膽固醇及抑 制潰瘍、胃出血、婦女經前綜合癥等，另外，Y -亞麻酸在營養(yǎng)學及美容、化妝品方面也有應 用。Y-亞麻酸等多不飽和脂肪酸因在人類健康中具有重要作用而成為極具價值的產品，據 估計全球市場需求過萬噸。研究表明，Y-亞麻酸僅存在于紫草科等的少數植物中，目前主 要商業(yè)來源為月見草、玻璃苣(Borago officinalis)和黑醋栗(Ribes Nigrum)，也有通過 真菌的發(fā)酵提取獲得。然而，現在通過植物和真菌發(fā)酵生產Y-亞麻酸成本高且在質量和 產量上都不能滿足日益增長的市場需求。1993年，Reddy等人首次從一株產Y -亞麻酸的藍細菌(Synechocystis sp. PCC6803)中克隆到Δ6-脂肪酸脫氫酶基因，并在Δ6-脂肪酸脫氫酶缺陷的藍細菌 (Anabaena sp. PCC7120)中獲得了功能性表達，推動了 Δ6-脂肪酸脫氫酶遺傳學水平的研 究。1997年，Olga V. Sayanova等首次從高等植物琉璃苣中克隆Δ6-脂肪酸脫氫酶基因， 通過轉基因煙草驗證該基因活性。2003年，Heather Μ. Whitney根據保守結構域細胞色素 沾結合結構域設計簡并引物從毛茛科銀蓮花(Anemone leveillei)中克隆獲得兩個脫氫 酶基因ALl、AL2，其中ALl基因經酵母與擬南芥表達驗證具有Δ6-脂肪酸脫氫酶活性，毛茛 科銀蓮花△6-脂肪酸脫氫酶基因是非紫草科高等植物中克隆獲得的第一個△6-脂肪酸脫 氫酶基因。目前△ 6-脂肪酸脫氫酶基因在真菌細胞中的表達最常用的宿主是釀酒酵母，釀酒 酵母本身只能合成油酸，只有外源性添加亞油酸，轉基因酵母細胞才能合成Y -亞麻酸，我 國南開大學微生物學系將高山被孢霉△ 6-脂肪酸脫氫酶轉到畢赤酵母中獲得表達，然而同 樣的低油含量以及復雜組分使得進一步應用難以推廣。通過微生物的基因工程生產Y-亞 麻酸仍有待于深入研究。通過利用基因工程方法生產Y-亞麻酸在理論和方法上已經初步 建立，為以后大規(guī)模生產奠定基礎。

發(fā)明內容
本發(fā)明涉及一株用于生產Y-亞麻酸的酵母工程菌，屬于基因工程領域，本發(fā)明 將紫草中克隆獲得的Δ6-脂肪酸脫氫酶基因通過酶切連接構建到PYES2酵母表達載體，將 該表達載體用LiAc法轉化酵母感受態(tài)細胞，通過酵母表達系統(tǒng)啟動Δ6脂肪酸脫氫酶基因 的轉錄表達。本發(fā)明可用于將亞油酸轉變合成高價值Y-亞麻酸。
本發(fā)明可以通過以下技術方案實現提取假狼紫草基因組DNA，用特異性引物PCR的方法擴增獲得Δ6-脂肪酸脫氫酶 基因，將該基因用EcoRI和^CbaI作為酶切位點構建到PYES2酵母表達載體，制備酵母感受 態(tài)細胞，用LiAc法轉化酵母感受態(tài)細胞，利用該載體系統(tǒng)可在酵母工程菌中表達Δ6-脂肪 酸脫氫酶，從而將亞油酸轉變?yōu)楦邇r值Y-亞麻酸。


圖1為用于生產Y-亞麻酸的酵母表達載體的載體圖，圖中指出的為Δ6脂肪酸 脫氫酶基因的位置，通過T7啟動子啟動Δ6-脂肪酸脫氫酶基因的表達。圖加為γ -亞麻酸標準品氣相色譜圖；圖2b為酵母轉化空載體脂肪酸分析氣相 色譜圖；圖2c為酵母轉化△ 6-脂肪酸脫氫酶基因脂肪酸氣相色譜分析圖。
具體實施例方式紫草基因組DNA的提取(改進的CTAB法)(1)紫草葉片lOOmg，加入0. IgPVP及少許石英砂。加液氮研磨成粉末狀，置于 1. 5ml離心管內；(2)向每個離心管內加入600 μ L預熱的CTAB提取緩沖液，并輕輕混勻，65°C水浴 30min，其間不時搖動；(3)加入等體積的氯仿/異戊醇，輕緩顛倒離心管混勻，IOOOOrpm離心10-20min ；(4)將上清液轉入新的離心管中，加入1/10體積的10% CTAB，混勻，加入等體積的 氯仿/異戊醇，顛倒離心管混勻，IOOOOrpm離心IOmin ；(5)取上清液，重復步驟4操作一次；(6)將上清液轉入新的離心管中，加入1倍體積的1 X CTAB沉淀緩沖液，混勻，輕輕 搖晃至沉淀生成。如無明顯沉淀生成，可適當延長放置時間；(7) IOOOOrpm離心lOmin，棄上清液，沉淀用70%乙醇洗滌，室溫晾干；(8)用TE緩沖液50μ L使沉淀充分溶解，加入2μ L RNaseA酶液，37 °C水浴30min ；(9)加入等體積的酚/氯仿抽提，室溫放置lOmin，IOOOOrpm離心5min ；(10)取上清液，加入等體積的氯仿/異戊醇，顛倒混勻，室溫放置lOmin，IOOOOrpm 離心5min ； (11)取上清液，加入1/10體積的3mol/L NaAc及2倍體積的無水乙醇，混 勻，-20°C放置Ih;(12) 40C，IOOOOrpm 離心 5min，去上清；(13)沉淀用70%乙醇洗滌，室溫晾干；(14)用25 μ L TE溶解DNA，_20°C下保存?zhèn)溆谩?. 7%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的純度和完整性。NcD6D基因的PCR擴增引物正向引物5，ATGGCTACTGAAATCAAGAAG3，反向引物5，TTAACCATGAGTTTGAAGAGCTT3，。PCR 反應
權利要求
1.假狼紫草中克隆獲得的Δ6脂肪酸脫氫酶基因，其核苷酸序列如SEQID Ν0:1所示。
2.一株用于生產Y-亞麻酸的酵母工程菌，將假狼紫草中克隆獲得的Δ6脂肪酸脫氫 酶基因構建到PYES2酵母表達載體，轉化酵母工程菌得到，可用于將亞油酸轉變?yōu)楦邇r值 Y-亞麻酸。
3.如權利要求2所述的酵母工程菌，其特征在于將假狼紫草中克隆獲得的Δ6-脂肪 酸脫氫酶基因構建到PYES2酵母表達載體，轉化酵母工程菌獲得。
4.如權利要求2所述的酵母工程菌的使用，其特征在于權利要求2的酵母工程菌發(fā) 酵，催化反應產生Y-亞麻酸。
全文摘要
本發(fā)明涉及一株用于生產γ-亞麻酸的酵母工程菌，屬于基因工程領域，本發(fā)明將紫草科植物假狼紫草中克隆獲得的Δ6脂肪酸脫氫酶基因經測序鑒定后，通過酶切連接構建到PYES2酵母表達載體，將該表達載體用LiAc法轉化酵母感受態(tài)細胞，通過酵母表達系統(tǒng)啟動Δ6脂肪酸脫氫酶基因的轉錄表達。本發(fā)明可用于將亞油酸轉變合成高價值γ-亞麻酸。
文檔編號C12N1/19GK102134573SQ20101004552
公開日2011年7月27日 申請日期2010年1月22日 優(yōu)先權日2010年1月22日
發(fā)明者李冠, 杜鈺, 王賢磊, 田歆珍 申請人:新疆大學