專利名稱：獲得基于RNA干擾(RNAi)對(duì)植物病原體攻擊有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法
獲得基于RNA干擾(RNAi)對(duì)植物病原體攻擊有抗性的轉(zhuǎn)基
因植物的方法本發(fā)明涉及獲得基于RNA干擾(RNAi)對(duì)植物病原體攻擊有抗性的轉(zhuǎn)基因植物以 保護(hù)所述植物免受寄生蟲(chóng)和植食性動(dòng)物(phytophage)的攻擊的方法，所述方法包括在植 物組織中表達(dá)適合于抑制GPCR受體的功能性的dsRNA，所述GPCR受體的功能對(duì)于真菌、食 草昆蟲(chóng)或植物病原線蟲(chóng)是至關(guān)重要的。具體地，本發(fā)明涉及可使用免受真菌、食草昆蟲(chóng)或植 物病原線蟲(chóng)攻擊的預(yù)防性保護(hù)處理獲得的，在其組織中表達(dá)dsRNA的植物。RNAi是在進(jìn)化過(guò)程中保存的存在于所有生物中的自然過(guò)程。其是各種雙鏈RNA片 段籍以能夠干擾和消除基因表達(dá)的基因沉默機(jī)制。一旦確定了雙鏈RNA分子(dsRNA)，所謂 的RNAi機(jī)器就能夠激活RNAi機(jī)制(Brandt，2002)。通過(guò)稱為dicer的酶，dsRNA序列被切成具有更短長(zhǎng)度(19_21個(gè)堿基對(duì))的片 段(Hamilton和Baulcombe，1999)。短dsRNA片段(稱為短干擾RNA或siRNA)與稱為 RISC(RNA-干擾沉默復(fù)合物)的酶促?gòu)?fù)合物結(jié)合。dsRNA可能通過(guò)解旋酶(helicase)打開(kāi) 只有反義RNA鏈仍然與RISC結(jié)合，而有義鏈被降解。RISC復(fù)合物能夠在存在于細(xì)胞溶膠中 的眾多mRNA中識(shí)別與所述同一復(fù)合物相結(jié)合的反義RNA片段互補(bǔ)的mRNA。如果siRNA與 mRNA之間的配對(duì)是完全的(或幾乎完全的)，那么RISC的組分(稱為argonaute蛋白)能 夠切割mRNA (Hammond等人，2001)。兩個(gè)所得的mRNA片段(一個(gè)在5’不具有頭，而另一個(gè) 在3’不具有A極的尾)從而能夠被細(xì)胞本身的RNA酶快速降解。另一種常見(jiàn)蛋白質(zhì)(雖 然未普遍存在于RNAi機(jī)器中)是RNA依賴性RNA聚合酶(RdRP)，其從單個(gè)螺旋RNA模塊 (mould)開(kāi)始合成dsRNA以產(chǎn)生RNAi擴(kuò)增機(jī)制。有關(guān)RNAi可作為強(qiáng)大且容易的基因沉默方法這一發(fā)現(xiàn)已喚起了整個(gè)科學(xué)界的關(guān) 注。該現(xiàn)象的普遍存在已使得其能夠在許多物種中得到研究。許多實(shí)驗(yàn)實(shí)際上基于將整個(gè) 生物體簡(jiǎn)單地浸入含有dsRNA的溶液或通過(guò)用表達(dá)dsRNA的細(xì)菌進(jìn)行的喂飼。這已使得 能夠快速鑒定在秀麗隱桿線蟲(chóng)中參與RNAi的基因，以及在果蠅、植物和真菌中發(fā)現(xiàn)其同源 物，并且已證明最初分類為抑制性PTGS (quelling PTGS)(轉(zhuǎn)錄后基因沉默)的現(xiàn)象全都是 其根源建立在單個(gè)祖先機(jī)制中的單一過(guò)程的部分。在植物背景中，利用RNAi的基因沉默的應(yīng)用已使得能夠產(chǎn)生具有增加的對(duì)疾病、 昆蟲(chóng)的抗性水平或具有高營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)的具有農(nóng)業(yè)利益的品種。例如，一些研究者通過(guò)RNAi技術(shù)已促成改良水稻植物。他們降低了麥谷蛋白的水 平，產(chǎn)生稱為L(zhǎng)GC-I (低麥谷蛋白含量1)的水稻品種，其適合于不能降解麥谷蛋白的腎虛患 者(Kusaba 等人，2003)。其他RNAi應(yīng)用涉及通過(guò)沉默參與毒素的生物合成的基因而除去植物內(nèi)毒素。利 用dsRNA使咖啡植物的可可堿合酶失活，從而使得能夠生成去除了咖啡因的咖啡(Ogita等 人，2003)。還已對(duì)具有農(nóng)業(yè)利益的植物的病原體和植食性動(dòng)物進(jìn)行了使用dsRNA的沉默 實(shí)驗(yàn)，以抑制其一些至關(guān)重要的基因的表達(dá)。在鞘翅類昆蟲(chóng)(coleopteran)(赤擬谷盜 (Tribolium castaneum))末期幼蟲(chóng)和成蟲(chóng)中顯微注射dsRNA已使得基因得到沉默并且其
4功能得到研究(Tomoyasu和Denel 1，2004)。一些研究者已使用用富含特定dsRNA的合成飲 食喂養(yǎng)的玉米根螢葉甲(Diabrotica virgifera virgiferaLeconte)的幼蟲(chóng)進(jìn)行測(cè)試，以 鑒定該昆蟲(chóng)的生活力所必需的基因。此類測(cè)試鑒定到其失活(因干擾而引起的失活)引起 幼蟲(chóng)死亡的14個(gè)至關(guān)重要的基因。表達(dá)一種此類dsRNA的轉(zhuǎn)基因玉米植物已顯示可與利 用表達(dá)毒素Bt的轉(zhuǎn)基因植物獲得的保護(hù)水平相當(dāng)?shù)母弑Ｗo(hù)水平(Baum等人，2007)。然而 與后者不同，表達(dá)dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物具有減少的環(huán)境影響。事實(shí)上，在該情況下昆蟲(chóng)基因 的抑制作用只取決于siRNA與待滅活的靶序列之間的特異性識(shí)別。因此，與將“外源”分子 導(dǎo)入至環(huán)境中和與非靶生物的相互作用相關(guān)的問(wèn)題得到消除。為了控制病原體和植食性生物，待滅活的基因靶的選擇是至關(guān)重要的。G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)包括一大組結(jié)構(gòu)和功能彼此相似的蛋白質(zhì)，其在所有真核 生物中發(fā)揮至關(guān)重要的功能。它們由跨膜7次，具有細(xì)胞外氨基末端和細(xì)胞內(nèi)羧基末端的 單個(gè)多肽組成；在與細(xì)胞外配體(肽、小分子、離子、光和芳香族化合物)結(jié)合后，受體通過(guò) 在細(xì)胞中引發(fā)導(dǎo)致第二信使(cAMP、Ca2+、cGMP、IP3)產(chǎn)生的反應(yīng)來(lái)被激活。大多數(shù)具有農(nóng)業(yè)利益的生物具有眾多的GPCR，其中大部分是其重要機(jī)能的正確 運(yùn)行或其致病性的基礎(chǔ)。最廣泛研究的物種(其基因組已進(jìn)行了完全測(cè)序和登記，并且 其中存在相當(dāng)多的關(guān)于發(fā)育生物學(xué)的信息)很明顯是模式生物黑腹果蠅(Drosophila melanogaster)、秀HI3隱桿線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)、酵母(Saccharomyces)禾口鏈抱 霉(Neurospora)。黑腹果蠅是最廣泛研究的節(jié)肢動(dòng)物，并且被當(dāng)作用于有害昆蟲(chóng)的研究的模式生 物。在果蠅基因組中，已鑒定了大約270個(gè)GPCR，其被分入5個(gè)家族。最近還已完成蚊子 (岡比亞按蚊(Anopheles gambiae))的基因組序列。詳細(xì)的生物信息學(xué)方法已導(dǎo)致在該雙 翅類昆蟲(chóng)的基因中鑒定了具有巨大衛(wèi)生利益的276個(gè)GPCR。關(guān)于此類基因在不同發(fā)育期的 表達(dá)特異性的大量信息也是可獲得的，并且已利用黑腹果蠅的基因組進(jìn)行了詳細(xì)的比較分 析。秀麗隱桿線蟲(chóng)是從遺傳學(xué)、神經(jīng)生物學(xué)、細(xì)胞和分子角度進(jìn)行了廣泛研究的模式 后生動(dòng)物(metazoan)。對(duì)于該生物，還完成了基因組序列，并且除了信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、神經(jīng)生物學(xué)、 發(fā)育、行為、生殖外，在文獻(xiàn)中還提供了關(guān)于生物信息學(xué)、表達(dá)的大量信息。由公共機(jī)構(gòu)資 助的項(xiàng)目也處于領(lǐng)先階段，其目標(biāo)在于從20個(gè)不同種類的線蟲(chóng)寄生蟲(chóng)鑒定大約315. 000個(gè) EST (表達(dá)序列標(biāo)簽)。所有此類信息的可獲得性允許非?？焖俚乜寺PCR的cDNA，從而將 其用作RNAi的靶和潛在的殺線蟲(chóng)劑。另一方面，關(guān)于真菌的GPCR可獲得的信息較少。已在子囊菌(ascomycete)和擔(dān) 子菌(basidiomycete)中鑒定了總共兩個(gè)由GPCR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑a)信息素反應(yīng)(GPCR = STE)；b)對(duì)營(yíng)養(yǎng)因子的反應(yīng)(葡萄糖傳感器)?？色@得多得多關(guān)于子囊菌和擔(dān)子菌中的異源三聚體G蛋白(GPCR的直接效應(yīng) 物)的信息(Li等人，2007)。已鑒定了至少3個(gè)Ga亞基，并且已獲得不同真菌種類 (酵母、鏈孢霉、曲霉菌(Aspergillus)、黑粉菌⑴stilago)、鐮孢菌(Fusarium)、炭疽菌 (Colletotrichus)、隱球叢赤殼屬(Cryphonectria)等)的無(wú)效突變體，這表明G蛋白參與 廣泛的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑信息素反應(yīng)、對(duì)營(yíng)養(yǎng)素的敏感性、不育性、生命培養(yǎng)(life growth)、毒力和病原性、子囊孢子的發(fā)育、形態(tài)發(fā)生、發(fā)光(light)。因此很明顯滅活此類GPCR會(huì)干 擾病原真菌的至關(guān)重要的信號(hào)?？傊ㄟ^(guò)RNAi對(duì)任何生物的GPCR的干擾因而是極具特異性的，因?yàn)槔ハx(chóng)、線蟲(chóng)、 真菌和哺乳動(dòng)物的GPCR之間的基因同源性的百分比從未超過(guò)20-30% (參見(jiàn)下面的表1)。 類似地，屬于相同目的種的GPCR之間的同源性百分比從不完全相同(大約90% )，這確保 了對(duì)環(huán)境有害的生物和有益的生物的種之間的區(qū)別(數(shù)據(jù)未公布)。^l.給定的昆蟲(chóng)種與生物的其他種之間的同源性程度的實(shí)例人類 20-30%屬于相同目的昆蟲(chóng) 90%屬于不同目的昆蟲(chóng) 30-55%。到目前為止，大多數(shù)用作殺蟲(chóng)劑、殺線蟲(chóng)劑或殺真菌劑的物質(zhì)是廣譜性分子，因此 存在對(duì)特異性干擾有害生物的存活和能育性但同時(shí)對(duì)非靶生物和環(huán)境具有最低影響或無(wú) 影響的更具選擇性方法的巨大需要。目前市場(chǎng)上提供的殺線蟲(chóng)劑是例如高毒性的、昂貴的 并且難以使用。作為在California和Florida用于控制果樹(shù)和蔬菜上的線蟲(chóng)、真菌和細(xì)菌 的最廣泛使用的產(chǎn)品二溴甲烷是一種神經(jīng)毒素，其還降低大氣中的臭氧。使用的其他殺線 蟲(chóng)劑是涕滅威(Temik)和1’1，3-二氯丙烯(TeloneII)，兩者對(duì)于人類來(lái)說(shuō)都是致癌性的?；谏衔闹兴赋龅模@然存在對(duì)更具選擇性，從而具有更小的環(huán)境影響的特異 性干擾植物病原生物(即寄生蟲(chóng)和植食性動(dòng)物)的存活和可育性的新方法和相關(guān)生物學(xué)靶 的需要。本申請(qǐng)者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)GPCR受體可以是用于控制植物的寄生蟲(chóng)和植食性動(dòng)物例如真 菌、昆蟲(chóng)和線蟲(chóng)的方便的靶。許多此類GPCR事實(shí)上具有非常特異于有害生物的基因序列， 因此dsRNA的分子能夠抑制其功能性并且不能損害宿主生物(植物)或所述植物的非靶消 費(fèi)者(即，人類，其他動(dòng)物)。特別地，本申請(qǐng)者已制備了利用dsRNA的表達(dá)抑制GPCR受體 的功能性的方法，所述受體的功能對(duì)于真菌、食草昆蟲(chóng)或植物病原體線蟲(chóng)是至關(guān)重要的?？膳c本發(fā)明的技術(shù)、目的相關(guān)的有利方面概述于下文中a)選擇性，可損害食草昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)或寄生性真菌，但不損害其他有益生物(即蜜 蜂)；b)食品安全，原因同上所述，而且還基于RNA分子可被容易地降解并且不保留在 環(huán)境中這一事實(shí)；c)在即使使用系統(tǒng)性化學(xué)處理(systemic chemicaltreatment)通常也特別難以 到達(dá)的植物部分(例如金字塔式的組織(pyramid))中也表達(dá)dsRNA的可能性；d)變應(yīng)原性危險(xiǎn)的潛在不存在，因?yàn)椴槐磉_(dá)宿主植物的新型蛋白質(zhì)；e)利用適當(dāng)選擇克隆，選擇與野生型具有高/完全蛋白質(zhì)組學(xué)同源性的植物的可 能性。本申請(qǐng)者現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)用于通過(guò)RNA干擾獲得抗一種或多種植物病原體的攻擊的轉(zhuǎn) 基因植物的方法，所述方法包括下列步驟a)分離編碼G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或其部分的cDNA核苷酸序列，所述受體的功 能對(duì)于所述植物病原體是至關(guān)重要的；b)構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含由兩個(gè)特異性重組位點(diǎn)側(cè)翼連接的通過(guò)步驟
6a)確定的編碼GPCR或其部分的cDNA核苷酸序列；c)使步驟b)的表達(dá)載體與二元載體重組反應(yīng)以獲得重組質(zhì)粒，所述二元載體包 含組成型或組織特異性啟動(dòng)子、相同的特異性重組位點(diǎn)和內(nèi)含子序列；d)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)的感受態(tài) 細(xì)胞內(nèi)和轉(zhuǎn)化植物；e)培養(yǎng)植物并且在所述植物中獲得dsRNA的組成型或組織特異性表達(dá)。具體地，該方法使用雙鏈RNA表達(dá)以抑制GPCR受體的功能性，所述受體的功能性 對(duì)于真菌、食草昆蟲(chóng)或植物病原體線蟲(chóng)是至關(guān)重要的，并且所述dsRNA在植物組織中表達(dá) 以使其能夠通過(guò)真菌吸器(haustorium)被吸收或能被昆蟲(chóng)或線蟲(chóng)攝入。所述植物病原體優(yōu)選選自當(dāng)在幼蟲(chóng)狀態(tài)下時(shí)通常為食草性的鱗翅類 (Iepidopteran)或鞘翅類(coleopteran)的昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)和真菌。根據(jù)一些優(yōu)選實(shí)施方 案，成蟲(chóng)或幼蟲(chóng)階段的食草昆蟲(chóng)可以是?；页嵋苟?Spodoptera littoralis)、煙芽夜 蛾(Heliotis virescens) 0根據(jù)另外的優(yōu)選實(shí)施方案，所述線蟲(chóng)選自南方根結(jié)線蟲(chóng) (Meloidogyneincognita)、北牛艮結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyne hapla)、馬鈴暮金線蟲(chóng)(Globodera rostochiensis)。再次地，根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，植物病原體真菌可選自粉孢子 (oidium)、銹菌、s印toriae、黑星菌(venturia)、鏈格孢(alternaria)。此類真菌可在葉面 或在植物的地下部分?jǐn)U散，并且遷入表面部分以及更內(nèi)部的組織。在本發(fā)明的精神中，可在整個(gè)植物的組織中組成性地或在某些部分例如葉面或在 根系統(tǒng)中通過(guò)使用特異性啟動(dòng)子(根特異性啟動(dòng)子)表達(dá)一種或多種dsRNA。植物的地下 部分中的表達(dá)的目的可以在于控制例如陸生植物病原體(terrestrial phytopathogen)， 然而在根系統(tǒng)中表達(dá)用于線蟲(chóng)或其他有害昆蟲(chóng)的控制。因此，根據(jù)本發(fā)明的一些優(yōu)選實(shí)施 方案，當(dāng)dsRNA表達(dá)是組織特異性的時(shí)，所述組織選自葉面、樹(shù)干、根系、蓓蕾、花、果實(shí)。根據(jù)本發(fā)明的方法涉及選擇一種或多種GPCR受體作為RNA干擾的靶，所述 受體必須對(duì)于將使得植物針對(duì)其產(chǎn)生抗性的植物病原體是至關(guān)重要的。視昆蟲(chóng)、線 蟲(chóng)或真菌而定，可將不同類型的GPCR受體用作靶。所述GPCR靶受體優(yōu)選選自咽側(cè) 體抑制激素(allatostatin) C或Α、章魚(yú)胺/酪胺、PBAN肽、利尿激素、脂肪動(dòng)員激素 (adipokinetichormone)、神經(jīng)肽、多巴胺、血清素和視紫質(zhì)樣的受體。根據(jù)一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中，當(dāng)所述食草昆蟲(chóng)是?；页嵋苟陼r(shí)，編碼GPCR受體 或其部分的 cDNA 的核苷酸序列選自 AlstAR(SEQ IDNO:l)、Alst CR(SEQ ID NO 2) ,DHR(SEQ ID NO 3),AKHR(SEQ IDNO 4),LGRl(SEQ ID NO 5)、Oct/TyrR(SEQ ID NO 6)、0R83b(SEQID NO 7)和PBAN-R(SEQ ID NO :8)。關(guān)于其他鱗翅類種類，例如煙芽夜蛾，本發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)與 斜紋夜蛾(Spodoptera)的咽側(cè)體抑制素C的GPCR受體同源的GPCR受體可代表該類型的 食草昆蟲(chóng)的選擇靶。關(guān)于使用本發(fā)明的方法獲得抗線蟲(chóng)寄生蟲(chóng)特別是南方根結(jié)線蟲(chóng)種類的線蟲(chóng)寄生 蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物而言，本發(fā)明的發(fā)明者已發(fā)現(xiàn)通過(guò)RNAi可沉默的6種可能的GPCR靶沉默 受體。編碼上述GPCR受體的cDNA的核苷酸序列選自血清素樣受體(秀麗隱桿線蟲(chóng)的血 清素受體的同源物，SEQ ID NO :9)、多巴胺樣受體(秀麗隱桿線蟲(chóng)的多巴胺CeDop-I受體 的同源物，SEQ ID N0:10)、神經(jīng)肽受體(秀麗隱桿線蟲(chóng)的神經(jīng)肽的受體的同源物Q2TGX5_ MELIC，SEQ ID NO :11)和屬于視紫質(zhì)樣GPCR家族的視紫質(zhì)樣受體(秀麗隱桿線蟲(chóng)的GPCR的同源物(T27D1. 3 ；T07D4. 1 ；B0563. 6 ；F02E8. 2)。根據(jù)本發(fā)明方法的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，可在獲得的轉(zhuǎn)基因植物的組織中表達(dá)一種 或多種dsRNA。這樣，可能獲得表達(dá)2或3個(gè)不同類型dsRNA的品系，從而相同植物既可抗 植食性動(dòng)物(其主要以葉為食)又可抗根部寄生蟲(chóng)的攻擊。雖然保持了對(duì)單個(gè)種類有害生 物的抗性的特異性，但可產(chǎn)生抗各種種類甚至彼此極不相同的有害生物種類(即在系統(tǒng)發(fā) 育上屬于完全遠(yuǎn)緣的類群(門(mén)))的植物。因此，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)特別優(yōu)選實(shí)施方案，可 在每一個(gè)步驟中使用核苷酸cDNA序列平行地重復(fù)根據(jù)本發(fā)明的方法的步驟a至c)，以獲得 一種或多種重組質(zhì)粒(所述重組質(zhì)粒用于d)共轉(zhuǎn)化相同的植物或dl)轉(zhuǎn)化不同的植物并 且將其雜交)，所述cDNA序列編碼對(duì)于不同植物病原體(即線蟲(chóng)或昆蟲(chóng)、不同種的線蟲(chóng)、昆 蟲(chóng)或真菌)是至關(guān)重要的GPCR受體。由于轉(zhuǎn)化植物之間的雜交育種，同樣可產(chǎn)生表達(dá)抗昆 蟲(chóng)GPCR(即斜紋夜蛾、Heliotis)和抗線蟲(chóng)GPCR(南方根結(jié)線蟲(chóng))的特異性dsRNA的植物。本發(fā)明還涉及RNA干擾技術(shù)用于保護(hù)具有農(nóng)藝學(xué)利益的植物(例如，谷物、茄科 植物、藤本植物(vine)、蔬菜)、觀賞植物(例如薔薇等)、環(huán)境植物(例如針葉樹(shù)、菩提樹(shù) (linden tree)、白楊等)的用途。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，使用茄科植物，優(yōu)選煙 草，更特別地?zé)煵?Nicotiana tabacum)。本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及抗一種或多種植物病原體的轉(zhuǎn)基因植物，所述植物可按 照上文中定義的方法獲得。按照本發(fā)明的方法進(jìn)行了遺傳改造以抑制植物病原體GPCR受 體的植物可用于生產(chǎn)目的在于用于人類或用于動(dòng)物飼養(yǎng)的食物，而且還可用于生產(chǎn)用于工 業(yè)目的的生物質(zhì)(紙、纖維、藥理物質(zhì)、用于能量產(chǎn)生的生物質(zhì)或基礎(chǔ)化學(xué)物質(zhì)等)。根據(jù)本 發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，所述轉(zhuǎn)基因植物是對(duì)其最有危害性的寄生蟲(chóng)之一(昆蟲(chóng)海灰翅 夜蛾)有抗性的煙草植物。特別地，轉(zhuǎn)基因煙草植物(即，煙草)表達(dá)能夠抑制?；页嵋苟?GPCR 受體的 dsRNA(選自 AlstAR(SEQ ID NO :1)、AlstCR(SEQ ID NO 2)、DHR(SEQ ID NO 3),AKHR(SEQ ID NO 4)、LGRl (SEQ ID NO :5)、0ct/TyrR(SEQ ID NO :6)、0R83b(SEQ ID NO: 7)和PBAN-R (AF401480，SEQ IDNO :8)(通過(guò)相同昆蟲(chóng)在幼蟲(chóng)期攝入表達(dá)所述dsRNA的植物 組織)。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及抗海灰翅夜蛾的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在 于其為煙草植物并且表達(dá)其中反義鏈與編碼受體AlstCR(SEQ ID NO : 或DHR (SEQ ID NO 3)的mRNA互補(bǔ)的dsRNA。根據(jù)另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明涉及抗南方根結(jié)線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在 于其為煙草植物并且表達(dá)其中反義鏈與編碼SEQ IDNO 11的mRNA互補(bǔ)的dsRNA。因此本發(fā)明的一個(gè)目的涉及用于預(yù)防性處理植物以使其抗一種或多種昆蟲(chóng)、線蟲(chóng) 和植物病原體真菌的攻擊的方法，其包括上述方法的步驟a) _e)。為了確保其最佳發(fā)育，必 要時(shí)，可將所獲得的植物經(jīng)歷使用肥料、培養(yǎng)調(diào)節(jié)劑或生物刺激劑或使用殺真菌產(chǎn)品、除草 劑、殺蟲(chóng)劑和殺線蟲(chóng)劑(合成或天然的)的處理步驟。此類應(yīng)用可允許相對(duì)于使用本專利 技術(shù)客體獲得的抗微生物劑活性更低的選擇寄生蟲(chóng)抗性的危險(xiǎn)，并且使用殺蟲(chóng)劑與利用本 發(fā)明技術(shù)獲得的抗微生物劑活性可能實(shí)現(xiàn)協(xié)同作用?，F(xiàn)特別地參考附圖，以舉例說(shuō)明性、但非限定性的目的描述本發(fā)明，其中-

圖1顯示從?；页嵋苟昕寺〉木幋aGPCR受體AlstAR、AlstCR、DHR、AKHR、LGRl、 OctR, 0R83b、PBANR 的 cDNA 的序列；-圖2顯示從南方根結(jié)線蟲(chóng)克隆的編碼GPCR受體=MiSerRl樣、MiDopRl樣和MiNpRl樣的cDNA的序列；-圖3顯示轉(zhuǎn)基因植物AlstCR的RT-PCR分析(泳道1至7)；WTl和WT2 非轉(zhuǎn)化 煙草植物；M 已知的分子量標(biāo)準(zhǔn)；C+ 質(zhì)粒pENTR+AlstCR ；-圖4顯示與以表達(dá)特異于AlstCR的dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草植物喂食?；页嵋苟暧?蟲(chóng)4周后的死亡率相關(guān)的直方圖；-圖5顯示以表達(dá)特異于AlstCR和DHR的dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草植物喂食的南方根 結(jié)線蟲(chóng)幼蟲(chóng)的死亡率的趨勢(shì)；-圖6顯示與野生型植物和表達(dá)MiNpRl樣/dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物被南方根結(jié)線蟲(chóng) 感染的煙草根的百分?jǐn)?shù)相關(guān)的直方圖。為了本發(fā)明的舉例說(shuō)明性的、但非限定性的目的，我們描述了茄科植物即煙草的 轉(zhuǎn)化(以保護(hù)所述植物免受其兩種最有害的寄生蟲(chóng)昆蟲(chóng)海灰翅夜蛾和線蟲(chóng)南方根結(jié)線蟲(chóng) 攻擊)的兩個(gè)實(shí)例。實(shí)施例1 轉(zhuǎn)化煙草植物以保護(hù)其免受昆蟲(chóng)?；页嵋苟甑墓舨牧虾头椒℅PCR靶的選擇被選擇作為本發(fā)明內(nèi)此實(shí)施方案的靶的海灰翅夜蛾受體如下1. AlstAR(咽側(cè)體抑制素A的推定的受體)；2. AlstCR(咽側(cè)體抑制素C的推定的受體)這兩個(gè)GPCR是至關(guān)重要的，因?yàn)樗鼈兘Y(jié)合其主要功能是抑制在“咽側(cè)體”的部 分上合成保幼激素的咽側(cè)體抑制素。除了參與變態(tài)激活過(guò)程(Weaver等人，1994)外，咽 側(cè)體抑制素、神經(jīng)肽對(duì)于調(diào)控腸平滑肌的收縮和在卵巢的發(fā)育和功能性方面也是重要的 (Aguilar 等人，2003 ；Meyering-Vos 等人，2006)；3. DHR (利尿激素DH的受體)對(duì)于利尿調(diào)控是重要的(Johnson等人，2004)；4. PBAN-R(信息素生物合成的激活神經(jīng)肽PBAN的受體)其結(jié)合促進(jìn)性信息素的 合成和釋放的小肽(Rafaeli等人，2007)；5.AKHR(脂肪動(dòng)員激素AKH的推定的受體)對(duì)于碳水化合物和脂質(zhì)的代謝并且對(duì) 飛行性能也是重要的(Maubli等人，2002)；6. LGRl (含有富含亮氨酸的重復(fù)的G蛋白偶聯(lián)受體)屬于含有富含亮氨酸的重復(fù) 的G蛋白偶聯(lián)受體(LGR)種類并且在生殖中發(fā)揮基礎(chǔ)作用(Nishi等人，2000)；7. Oct/TyrR，章魚(yú)胺和酪胺的推定的受體其能夠與神經(jīng)遞質(zhì)例如章魚(yú)胺和酪胺 相互作用，從而在感覺(jué)和分泌器官的神經(jīng)調(diào)節(jié)過(guò)程中是重要的(Farooqui，2007)；8. 0R83b (嗅覺(jué)受體家族的受體)；與嗅覺(jué)受體(OR)家族的只在嗅覺(jué)感覺(jué)神經(jīng)元的 小的亞群體中表達(dá)的其他成員不同，ORSIBb在幾乎所有觸角神經(jīng)元中表達(dá)(Neuhaus等人， 2005)。其并非在嗅覺(jué)功能中發(fā)揮直接作用，而是與常規(guī)OR成員相互作用并且是它們從細(xì) 胞體定位至感覺(jué)纖毛所必需的，在所述感覺(jué)纖毛中發(fā)生與有氣味的分子的相互作用。由于 其在嗅覺(jué)系統(tǒng)中發(fā)揮的總體作用，ORSIBb對(duì)于氣味的感覺(jué)，從而對(duì)于昆蟲(chóng)的營(yíng)養(yǎng)是絕對(duì)至關(guān) 重要的。為了進(jìn)行RNAi實(shí)驗(yàn)，從斜紋夜蛾克隆所有編碼GPCR的序列，但已存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中 的編碼PBAN-R的基因(AF401480)除外。
使用通過(guò)比較不同昆蟲(chóng)種類的此類基因中的保守區(qū)域而產(chǎn)生的簡(jiǎn)并引物，利用通 過(guò)從海灰翅夜蛾提取的總1 離反轉(zhuǎn)錄的00嫩，分離編碼受體418丨41 、0冊(cè)、11^1、(《8313、0(^/ TyrR的序列以及編碼受體AlstCR和受體AKHR的序列的部分。在另一方面，對(duì)于PBAN-R， 使用從V期幼蟲(chóng)分離編碼序列的特異性引物。對(duì)于其它受體，基于文獻(xiàn)中可獲得的表達(dá)數(shù) 據(jù)，使用昆蟲(chóng)的不同組織和培養(yǎng)期分離序列。具體地，從卵擴(kuò)增編碼受體LGR的基因，而從 V期幼蟲(chóng)分離DHR ；利用從個(gè)體成蟲(chóng)的頭部提取的RNA擴(kuò)增編碼受體AlstAR、AlstCR、AKHR、 0R83b、Oct/TyrR的基因。測(cè)定PCR產(chǎn)物的序列并且將其用于設(shè)計(jì)5’和3’ RACE-PCR實(shí)驗(yàn) 的特異性引物。將分離的序列克隆在質(zhì)粒pCR 2, 1-T0P0 (Invitogen)中并且進(jìn)行完全 測(cè)序(圖1)。選擇的受體的分離和克隆受體AlstAR的克降為了分離編碼?；页嵋苟甑难蕚?cè)體抑制素A的受體的cDNA，基于通過(guò)家蠶、黑腹 果蠅和美洲大蠊的同源受體的氨基酸序列之間的比對(duì)確定的保守區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。引物的 序列示于下面(括號(hào)內(nèi)的核苷酸表示簡(jiǎn)并的位置；引物即是寡核苷酸的混合物，各自在該 特定的位置上包含不同的核苷酸)IFw :atg (ac) g (acgt) (at) (gc) (acgt) ac (agct) ac (agct) aa (tc) (tc) t (agct) (tc) t(agct)at(tc)a(ag) (tc) (SEQ ID NO :12)2Fw gt (agct) cc (agct) tt (tc) ac (agct) gc (agct) ac (agct) ga (tc) ta (tc) gt (agct)atg(SEQ ID NO :13)IRv :gt(agct)ac (agct) (ac) g(agct)atggt(agct)gt(agct)gt(agct)gt (agct) gt (agct)(SEQ ID NO :14)2Rv :tgg (at) s (agct) tg (tc) gt (agct) aa (tc) cc (atcg) gt (atgc) (ac) t (tc) ta (tc) gc (agct)(SEQ ID NO :15)。使用由!Iomega商業(yè)化的試劑盒從海灰翅夜蛾個(gè)體成蟲(chóng)的頭提取總RNA。將RNA 的樣品經(jīng)歷使用rDNasil (Ambion)的處理以消除污染的基因組DNA。在變性的上樣染料 存在的情況下，將2μ 1 RNA加載至瓊脂糖凝膠上并且使用RNA的特異性分子量標(biāo) 準(zhǔn)(i^rmentas)作為參照進(jìn)行定量。將基因工具軟件(Perkin Elmer)用于定量。使用 RevertAid M-MuLV 逆轉(zhuǎn)錄酶(Fermentas)和 500ng oligodT (Promega)將 1 μ g 總 RNA 轉(zhuǎn)錄 成 cDNA。通過(guò)cDNA的擴(kuò)增，經(jīng)過(guò)30個(gè)PCR循環(huán)(在98°C下進(jìn)行10秒，在50°C下進(jìn)行30 秒，在72°C下進(jìn)行30秒)、然后在72°C下延伸10分鐘而獲得507bp的片段。在于相應(yīng)緩 沖液中含有2. 5 μ M濃度的各引物、0. 2mM脫氧核苷酸(Fermentas)和1個(gè)單位的Wiusion High-FidelityDNA聚合酶(Finnzymes)的50 μ 1體積中進(jìn)行反應(yīng)。將獲得的片段克隆入克隆載體pCR2. ldnvitrogen)，然后使用特異于所述載體的 寡核苷酸 M13Fw 和 M13Rv 測(cè)定序列(CeingeBiotecnologie Avanzate scarl)?；谒鲂蛄?，設(shè)計(jì)下列寡核苷酸組以分別用于3’ RACE(組1 ；有義)和 5，RACE (組 2 ；反義)ILl Is GCATCCCATAGCTTCCATGT (SEQ ID NO 16)
2s GGTGATATTAACCACAGCTATTCCCGTGGGC (SEQ ID NO :17)3s GTATGCTGACGAGGTTGTGGAAGAGTGCTCC (SEQ ID NO :18)4s AAGGTGACGAGAATGGTTGTG (SEQ ID NO :19)5s GCGCAGATAGTGTCGCATGTA (SEQ ID NO :20)組2 las AGACGACTCTTCCACAACCTCGTCAGCATAC (SEQ ID NO :21)2as GTTAATATCACCACCCATAT (SEQ ID NO :22)3as GCCCACGGGAATAGCTGTGGTTAATATCACC (SEQ ID NO :23).使用5’ /3’ RACEKIT(其中錨定引物和oligo(dT)錨定引物用其序列示于下文中 的oligo SLl和oligo (dT) SLl替代)通過(guò)PCR-RACE獲得基因的5，和3，末端SLl GGTTTAATTACCCAACTTTGAG(SEQ ID NO 24)dTSLl GGTTTAATTACCCAACTTTGAGTTTTTTTTTTTTTTTT(ACG)(SEQID NO 25).用引物Is和SLl擴(kuò)增使用1.87 μ M引物dTSLl合成的1 μ 1 cDNA,以獲得該基因 的3，末端。擴(kuò)增條件是40個(gè)循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒、在46°C下進(jìn)行30秒、在 72°C進(jìn)行30秒的循環(huán))，然后在72°C下延長(zhǎng)10分鐘。使用上述條件作為擴(kuò)增條件，使用引 物SLl與組1的各引物組合來(lái)進(jìn)行隨后的擴(kuò)增。如上所述獲得650bp的片段，將其克隆在pCR2. 1中并且進(jìn)行測(cè)序。為了擴(kuò)增5’末端，遵循由試劑盒的提供商指定的方案，并且使用引物Ias用于合 成cDNA，使用引物2aS-3aS和SLl進(jìn)行擴(kuò)增。獲得大約500bp的片段，克隆該片段并且進(jìn)行 測(cè)序。為了獲得編碼整個(gè)基因的cDNA，使用下列引物擴(kuò)增用于與簡(jiǎn)并引物反應(yīng)的 μ cDNA 5，-ATGGCGTCGACTGAAGAC-3，(SEQ ID NO 26)3，-TCAGACGATGTCATGGCA-5，(SEQ ID NO 27).使用的擴(kuò)增條件如下40個(gè)循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒，在60°C下進(jìn)行30秒 和在72°C進(jìn)行1分鐘)，然后在72°C下延長(zhǎng)10分鐘。獲得大約1080個(gè)堿基的片段，將其克 隆在載體PCR2. 1中，并且進(jìn)行測(cè)序。受體0R83b的克隆為了分離編碼海灰翅夜蛾的受體ORSIBb的cDNA，設(shè)計(jì)特異性的反向引物和簡(jiǎn)并的 正向引物。正向引物的簡(jiǎn)并性只對(duì)一個(gè)位置感興趣，因?yàn)閬?lái)源于甜菜夜蛾、煙芽夜蛾、美洲 棉鈴蟲(chóng)和甘藍(lán)夜蛾的各自核苷酸序列之間的比對(duì)顯示彼此之間具有非常高的保守程度。引 物的序列示于如下Fw ATGACCAA(AG)GTGAAGGCCCAG (SEQ ID NO :28)Rv GTGTTGGTACAACTCAAGTAA (SEQ ID NO :29)。使用如之前的段落中所述制備的cDNA，在30個(gè)循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒， 在50°C下進(jìn)行30秒和1. 5分鐘的延伸)中使用的兩個(gè)引物中每一個(gè)各250nM擴(kuò)增該1 μ 1 的cDNA。獲得大約1，500bp的片段，如上所述將其克隆入載體pCR2. 1并且進(jìn)行測(cè)序。受體DHR的克隆為了分離?；页嵋苟甑氖荏wDHR的cDNA，基于煙草天蛾、黑腹果蠅、稻褐飛虱和美
11洲蟋蟀的相應(yīng)蛋白質(zhì)序列間的比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。使用的引物的序列如下IFw TT (TC) (TC) T (ATCG) TA (TC) TT (TC) AA (AG) GA (ATCG) (TC) T (ATG) (AC) G (ATCG) TG(TC) (SEQ ID NO :30)2Rv :A (AG) (TC) TT (ATCG) GT (ATCG) AT (ATCG) A (AG) (ATCG) ACCCACAT (ATCG) AT (SEQ ID NO 31)。使用已描述的方法從V期幼蟲(chóng)提取RNA。為了定量RNA和合成cDNA，使用針對(duì)Als tAR的克隆所描述的方案。通過(guò)45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒，在48°C下進(jìn)行30秒和在72°C下 進(jìn)行1分鐘)，然后在72°C進(jìn)行10分鐘的延伸來(lái)獲得550bp的片段，然后將其克隆入載體 PCR2. 1并且進(jìn)行測(cè)序?；谛蛄?，設(shè)計(jì)特異性引物并且按照已描述的方法將其用于隨后的3’和5’ RACE 反應(yīng)。引物的序列如下組1:Is AACCTCATGTCGACGTATATTCTGTCT (SEQ ID NO 32)2s ATGCTTGTAGAAGGTTTGTACCTGTAC (SEQ ID NO :33)3s TGGGTTATATGCAGGTGCTTCGTCAAC (SEQ ID NO :34)組2:las GGATGGGGTGCGCCGGCGGTGTTCCTA (SEQ ID NO :35)2as CATACATATGACCAGAATCGTACACGA (SEQ ID NO :36)3as GGCGAGGTAGATGAGGCTGGTGACGTC (SEQ ID NO :37)。對(duì)于3，，通過(guò)40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒，在46°C下進(jìn)行30秒和在 72°C下進(jìn)行1分鐘)、然后在72°C下延伸10分鐘分離到大約650bp的片段。對(duì)于5’，按照 上述方法通過(guò)40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)獲得大約500bp的片段。將下列引物用于完整cDNA的分離5，-ATGGCGGAGAAGTGCCTGGCG-3，(SEQ ID NO 38)3，-TCATACCGTGAGTCGTATGCT-5，(SEQ ID NO :39)。使用1 μ 1 cDNA (利用從V期幼蟲(chóng)提取的RNA合成的)，利用Fw和Rv引物通過(guò)45 個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒，在55°C下進(jìn)行30秒和在72°C下進(jìn)行30秒)、然后 在72°C下延伸10分鐘來(lái)擴(kuò)增1190bp的片段。受體LGRl的克隆為了分離?；页嵋苟甑氖荏wLGRl的cDNA，基于家蠶、黑腹果蠅和埃及斑蚊的相應(yīng) 蛋白質(zhì)序列間的比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。使用的引物的序列如下IFw :GC (ATGC) TA(TC) (TC) T (AGCT) AC (AGCT) CA (TC) (GC) (AGCT) (AGCT) TT (TC) CA (TC) TG (TC) TG (TC) (SEQ ID NO :40)IRv :TC (AGCT) A (TC) (AGCT) GG (AGCT) A (AG) (AG) CA (AGCT) AT (AGCT) (GC) (AT) (AGCT)GT(SEQ ID NO :41)。按照已描述的方法從?；页嵋苟甑穆烟崛NA。為了定量RNA和合成cDNA，使用 針對(duì)克隆AlstAR描述的方案。通過(guò)45個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒，在48°C下進(jìn)行30秒，在72°C下進(jìn)行1. 5分鐘)、然后在72°C下延伸10分鐘來(lái)獲得大約1，250bp的片段，然后將其克隆入載 體pCR2. 1并且進(jìn)行測(cè)序。根據(jù)序列的分析，設(shè)計(jì)了下述引物，然后通過(guò)之前描述的方法將其用于隨后的3’ 和5，RACE反應(yīng)組1:Is TGATGAAAATGCCTTCGC (SEQ ID NO 42)2s CACGAACCAGTCAACAACAC (SEQ ID NO :43)3s GAAAGCGTACCTGACGCATCATTTCCA (SEQ ID NO :44)4s GTTATCAGTAATTACTTTAACTATAGT (SEQ ID NO :45)組2:las ACTGCCGGAGTCTGAGAAGTA (SEQ ID NO :46)2as GTACTCCTCGCTCGTAGTCG (SEQ ID NO :47)3as CATTTCGACTGCATTATAGC (SEQ ID NO :48)4as GCCTTCTAGGTCTATAGCTTG (SEQ ID NO :49)。按照之前段落中描述的方法，通過(guò)對(duì)從?；页嵋苟曷烟崛〉腞NA開(kāi)始合成的cDNA 進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)來(lái)分離大約500bp的片段和860bp的片段，將其克隆入載體pCR2. 1，并 且分別在3’和5’進(jìn)行測(cè)序。為了分離相應(yīng)于編碼?；页嵋苟晔荏wLGRl的完整序列的cDNA，使用分別相應(yīng)于 末端5’和3’的下列引物5，-ATGTATTGGAGATTATGTATTTGGGCT-3，(SEQ ID NO 50)3，-TTAAAGCGGTACCTCACTACTGTCTTT-5，(SEQ ID NO :51)。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法分離、克隆2，250bp的片段并且進(jìn)行測(cè)序。受體Oct/TyrR的克隆為了分離編碼?；页嵋苟甑氖荏wOct/TyrR的cDNA，基于家蠶、煙芽夜蛾和甘藍(lán)夜 蛾的相應(yīng)基因的核苷酸序列之間的比對(duì)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物。使用的引物的序列如下IFw CCAGAATGGGA(AG)GC(AT)AT (TC)TGCAC (SEQ ID NO :52)2Rv AC (AG) CCCATTAT (TG) AT (AG) CC (TC) AG (AG) G (SEQ ID NO :53)。將引物用于從按照上述方法制備的、從個(gè)體成蟲(chóng)的頭提取的RNA合成的cDNA擴(kuò)增 1，090bp的片段。在將片段克隆入載體pCR2. 1并且測(cè)序后，設(shè)計(jì)用于3’和5’ RACE反應(yīng)的 下列引物組1:Is CCAGAAAATTGACACCAA (SEQ ID NO 54)2s GAGAGTAACTCGAAAGAAAC (SEQ ID NO :55)3s TGCTGTTTATCAATTCATTGAAGA (SEQ ID NO :56)組2:las AGTTCTTTTTTTAGTGGCCAAA (SEQ ID NO :57)2as GACAAGGCGTATCAGGTTC (SEQ ID NO :58)3as ACCCTAGAAGTGGCGGAGAGCTAATA (SEQ ID NO :59)。
按照上述段落中描述的方法，通過(guò)對(duì)由從海灰翅夜蛾的個(gè)體成蟲(chóng)的頭提取的RNA 開(kāi)始合成的cDNA進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)來(lái)分離大約380bp的片段和590bp的片段，將其克隆 入載體PCR2. 1，并且分別在3，和5，進(jìn)行測(cè)序。為了分離相應(yīng)于編碼受體Oct/TyrR的完整序列的cDNA，使用下列引物5，-ATGGGGCAAACAGCTACACAC-3，(SEQ ID NO 60)3，CTCTGTATGAAACCGTGA-5，(SEQ ID NO :61)。通過(guò)40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)(包括在98°C下進(jìn)行10秒，在55°C下進(jìn)行30秒和在72°C下 進(jìn)行1分鐘)分離1，434bp的片段并且克隆和測(cè)定其序列。受體PBANR的克降受體PBANR的序列已可在數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得，因而設(shè)計(jì)相應(yīng)于編碼區(qū)的5’和3’的引 物，其序列示于下文中5，-ATGACATTGTCAGCGCCCCCGATC-3，(SEQ ID NO 62)3，-TCAATCATGAATGTAACA-5，(SEQ ID NO :63)。按照上述方法，將引物用于擴(kuò)增從由V齡幼蟲(chóng)提取的RNA開(kāi)始合成的1 μ 1 cDNA. 通過(guò)進(jìn)行40個(gè)循環(huán)(包括在98 V下進(jìn)行10秒，在55 °C下進(jìn)行30秒，在72 °C下進(jìn)行40秒)、 然后在72°C下延伸10分鐘來(lái)進(jìn)行擴(kuò)增。獲得1，053bp的片段，然后按照所述方法將其克隆 入載體pCR2. 1并且進(jìn)行測(cè)序?？私稻幋a警體AlstCR的序列的一部分為了分離?；页嵋苟甑氖荏wAlstCR，基于蜜蜂、黑腹果蠅和岡比亞按蚊的各自蛋 白質(zhì)序列之間的同源性設(shè)計(jì)下列簡(jiǎn)并引物IFw :GA (AG) TG (TC) TT (TC) (TC) T (AGCT) AT (ATC) GG (ATGC) (SEQ IDNO :64)IRv (ATGC) GC (AG) CA (ATGC) GT (AG) CA (ATGC) GC (TC) TT (SEQ IDNO :65)。通過(guò)在45°C下進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，將引物IFw和IRv用于擴(kuò)增從由個(gè)體成蟲(chóng)的頭 提取的RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA。分離726bp的片段，然后將其克隆入載體pCR2. 1并且進(jìn)行測(cè)序?？寺【幋a受體AKHR的序列的部分為了分離?；页嵋苟甑氖荏wAKHR，基于家蠶和美洲大蠊的相應(yīng)受體的核苷酸序列 之間的同源性設(shè)計(jì)下列簡(jiǎn)并引物IFw :GACCTGATGTGC(AC)G(AC) (AG)TCATG (SEQ ID NO :66)IRv:GTC(AG)ATCCA(AG)TACCACAG(AG)CA (SEQ ID NO :67)。通過(guò)在45°C下進(jìn)行40個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，將引物IFw和IRv用于擴(kuò)增從由個(gè)體成蟲(chóng)的頭 提取的RNA轉(zhuǎn)錄的cDNA。分離534bp的片段，然后將其克隆入載體pCR2. 1并且進(jìn)行測(cè)序。在質(zhì)粒pENTER和PH7GW1WG2中克隆受體通過(guò)消化或使用與待分離的基因的序列同源的正向引物和反向引物通過(guò)PCR從 質(zhì)粒pCR 2. 1 -Τ0Ρ0 分離編碼受體 Al stAR、Al stCR、DHR、ΑΚΗ、0R83b 和 Oct/TyrR 的基 因，所述引物具有與質(zhì)粒PENTR的多接頭相容的限制性酶EcoRI (正向引物)和SioI (反向 引物)的識(shí)別序列。使用具有BamHI酶的識(shí)別序列的正向引物和包含B10 I位點(diǎn)的反向引 物，利用質(zhì)粒pCR 2. 1-T0P0擴(kuò)增LGRl受體。為了克隆PBAN受體，將包含EcoRI位點(diǎn)的正
向引物與具有被NotI酶切割的序列的反向引物一起使用。引物的序列示于下文中AlstAR Fw 5’ -GGAATTCCATGGCGTCGACTGAAGAC-3，0187](SEQ ID NO 68)
0188]AlstAR Rev 5’ -CCTCGAGGTCAGACGATGTCATGGCA-3’
0189](SEQ ID NO 69)
0190]AlstCR Fw 5’ -GGAATTCCCTGCGTTCCATTCACTGCTA-3’
0191](SEQ ID NO 70)
0192]AlstCR Rev 5’ -CCTCGAGGAAGAATTGGGTTCATGGCAG-3，
0193](SEQ ID NO 71)
0194]DHR Fw 5’ -GGAATTCCGATGGCGGAGAAGTGCCTGGC-3，
0195](SEQ ID NO:72)
0196]DHR Rev 5’ -CCTCGAGGGTCATACCGTGAGTCGTATGC-3，
0197](SEQ ID NO :73)
0198]AKH Fw 5' -GGAATTCCGGACCTGATGTGCCGAGTCATG-3'
0199](SEQ ID NO :74)
0200]AKH Rev 5’ -CCTCGAGGGCTTGTCGATCCAATACCAC-3，
0201](SEQ ID NO :75)
0202]LGR 15， -CGGGATCCCGGATGTATTGGAGATTATGTATTTGGGC-3’
0203](SEQ ID NO :76)
0204]LGRl Rev 5' -CCTCGAGGGTTAAAGCGGTACCTCACTAC-3'
0205](SEQ ID NO :77)
0206]0R83b Fw 5’ -GGAATTCCGATGACCAAAGTGAAGGCCCAGG-3’
0207](SEQ ID NO :78)
0208]0R83b Rev 5’ -CCTCGAGGGTTACTTGAGTTGTACCAACACC-3’
0209](SEQ ID NO :79)
0210]Oct/TyrR Fw 5’ -GGAATTCCGGGGCAAACAGCTACACACG-3’
0211](SEQ ID NO :80)
0212]Oct/TyrR Rev 5’ -CCTCGAGGGTCACGGTTTCATACAGAGTAAC-3，
0213](SEQ ID NO :81)
0214]PBAN-R Fw 5’ -GGAATTCCGATGACATTGTCAGCGCCCCCG-3，
0215](SEQ ID NO :82)
0216]PBAN-R Rev 5' -TAAAGCGGCCGCTCAATCATGAATGTAACAAAAA-3'
0217](SEQ ID NO :83)。
0218]使用50ng質(zhì)粒DNA，200yM的dNTP，0. 25 μ M正向引物，0. 25 μ M反向引物，5x Phusion HF 緩沖液，IU 的 Phusion High-FidelityDNA 聚合酶(Finnzyme s)在 50 μ 1 的終 體積中進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增程序包括在98°C進(jìn)行30秒的變性循環(huán)，35個(gè)循環(huán)(在90°C下 進(jìn)行10秒，在52°C下進(jìn)行30秒，在72°C下進(jìn)行1分鐘)和在72°C下進(jìn)行10分鐘的1個(gè)終 延伸循環(huán)。在的瓊脂糖凝膠上分離大約5μ1的擴(kuò)增產(chǎn)物以確認(rèn)其質(zhì)量和分子量。在 從用于擴(kuò)增的試劑中純化后(GenEluteTMPCR Clean-邱試劑盒，SIGMA)，將剩余的PCR反應(yīng) 物經(jīng)歷使用20U的適當(dāng)限制性內(nèi)切酶的消化，以產(chǎn)生粘性末端用于隨后在載體pENTR(其也 使用相同的限制性內(nèi)切核酸酶消化)中進(jìn)行克隆。使用20u的T4DNA連接酶(Biolabs)，
15在16°C下于20 μ 1的體積中進(jìn)行受體的基因(200ng)和載體pENTR(300ng)之間的連接反 應(yīng)。將10 μ 1的連接酶反應(yīng)用于轉(zhuǎn)化涂板在具有抗生素卡那霉素(50mg/l)的LB上的大腸 桿菌(E.coli)DH5感受態(tài)細(xì)胞以選擇具有pENTR質(zhì)粒的細(xì)胞克隆。在37°C下用液體LB和 卡那霉素接種獲得的集落，進(jìn)行整個(gè)晚上。提取質(zhì)粒DNA(Wizard PlusSV Minipreps DNA純化系統(tǒng)，Promega)并且用 IOu 的適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶進(jìn)行消化。將具有克隆的受體的pENTR質(zhì)粒用于與二元載體pH7GWlWG2(I)的重組反應(yīng)。在 BIGatewaysLR clonase II Enzyme Mix(Invitrogen)150ng pENTRM 粒與300ng pH7/GWlWG2(I)于25°C下一起溫育2小時(shí)。然后在37°C下用蛋白酶K阻斷反 應(yīng)，進(jìn)行10分鐘，將其用于轉(zhuǎn)化DH5 α細(xì)胞。通過(guò)用限制性內(nèi)切酶消化分析質(zhì)粒，然后通過(guò) 測(cè)序分析進(jìn)一步確認(rèn)。利用冷凍/除霜(freezing/defrosting)技術(shù)使用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根 癌土壤桿菌的感受態(tài)細(xì)胞(C58)。向100 μ 1的感受態(tài)細(xì)胞中加入約10 μ g質(zhì)粒并且將其在 冰上溫育5分鐘。將細(xì)胞置于干冰/乙醇中進(jìn)行5分鐘，然后轉(zhuǎn)移至37°C下進(jìn)行10分鐘。 向細(xì)胞中加入Iml LB，將其在下溫育3小時(shí)，然后涂板在含有利福平100mg/l和壯觀 霉素IOOmg/1的LB上。利用特異于每一個(gè)克隆的受體的引物通過(guò)PCR分析抗性集落。使用dsRNA轉(zhuǎn)化煙草將Gateway技術(shù)用于在煙草植物中表達(dá)dsRNA 從其中它們已被克隆并且序列已 被測(cè)定的pCR 2.1-TGPG 質(zhì)粒分離編碼受體的序列。使用與基因序列互補(bǔ)并且具有被 用于質(zhì)粒pENTRanvitrogen)克隆的限制性內(nèi)切酶識(shí)別的位點(diǎn)的寡核苷酸進(jìn)行PCR反應(yīng)。 該質(zhì)粒是一種進(jìn)入載體(Entry Vector)，其除了克隆DNA序列外，還由于存在側(cè)翼連接克 隆PCR產(chǎn)物的2個(gè)特異性重組位點(diǎn)(attLl和attU)而允許被轉(zhuǎn)移入表達(dá)載體(目的載 體，Destination Vector)。將重組克隆與二元載體pH7GWIWG (I)(植物系統(tǒng)生物學(xué)Plant System Biology)用于重組反應(yīng)以進(jìn)行植物表達(dá)。該質(zhì)粒的特征在于存在啟動(dòng)子35S用于 克隆在位點(diǎn)attRl和attR2下游的基因的組成型表達(dá)，所述位點(diǎn)attRl和attR2用于與進(jìn) 入載體重組并且將克隆基因的5’ -3’鏈轉(zhuǎn)移至一個(gè)內(nèi)含子序列上游和另一個(gè)相同內(nèi)含子 序列的下游。組成型啟動(dòng)子的存在確保了基因的表達(dá)，而內(nèi)含子序列允許dsRNA的形成。 pENTR的位點(diǎn)attLl和attL2與pH7GWIWG(I)的位點(diǎn)attRl和attR2之間的重組反應(yīng)由酶 Gateway LR Clonase (Invitrogen)介導(dǎo)。通過(guò)使用限制性內(nèi)切核酸酶進(jìn)行消化，然后 通過(guò)測(cè)序進(jìn)一步驗(yàn)證來(lái)表征重組質(zhì)粒。將此類質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至根癌土壤桿菌(菌株C58)的感 受態(tài)細(xì)胞以轉(zhuǎn)化煙草植物。對(duì)于各構(gòu)建體，將大約50個(gè)葉盤(pán)(leaf disk)與其共培養(yǎng)，并 且將相同量的葉盤(pán)與用空質(zhì)粒pH7GWIWG(I)轉(zhuǎn)化的土壤桿菌共培養(yǎng)作為對(duì)照用于隨后的 生物學(xué)測(cè)試。在用具有表達(dá)單個(gè)克隆的受體的質(zhì)粒PH7GW1WG2的根癌土壤桿菌轉(zhuǎn)化煙草植物 后，將葉外植體與在下培養(yǎng)的100 μ 1細(xì)菌培養(yǎng)物共培養(yǎng)3天，直至在IOml的液體培養(yǎng) 基 A10(3.6g/1 B5，250mg/lNH4N03，500mg/l MES，2%葡萄糖，1 μ g/ml 芐氨基嘌呤，0. 1 μ g/ ml萘乙酸，pH 5. 7)存在的情況下達(dá)到DO6tltl = 0. 8 通過(guò)用含有頭孢噻肟500 μ g/ml的新 鮮AlO培養(yǎng)基漂洗葉子的碎片來(lái)除去土壤桿菌。然后在抗生素潮霉素(30mg/l)存在的情至固體All培養(yǎng)基上。每周一次將外植體轉(zhuǎn)移至新鮮培養(yǎng)基上直至愈傷組 織形成，將其置于A12(具有等于200yg/ml頭孢噻肟濃度的All)上。將苗轉(zhuǎn)移至固體MS 30 (Murashige 和 Skoog 4. 4g/l，蔗糖 30g/l pH 5.7)和潮霉素上。轉(zhuǎn)基因植物的表征從0. 5g培養(yǎng)在選擇培養(yǎng)基上的煙草植物的葉子提取基因組DNA (GenElute Plant Genomic DNA minipr印試劑盒，Sigma)，將其用作模塊用于通過(guò)PCR驗(yàn)證外源DNA 的存在。通過(guò)從轉(zhuǎn)基因植物的葉子提取RNA(GenElute Mammalian Total RNA Miniprep 試劑盒，Sigma)以進(jìn)行cDNA的逆轉(zhuǎn)錄來(lái)就dsRNA的存在情況進(jìn)一步表征對(duì)PCR呈陽(yáng)性的 植物。為此目的，將2 μ g總RNA與250ng的隨機(jī)六聚物(Randomhexamer) (Invitrogen)于 70°C下一起溫育5分鐘，然后在冰上進(jìn)行5分鐘。向反應(yīng)物中加入含有ImM dNTPUX反應(yīng) 緩沖液、20u核糖核酸酶抑制劑的溶液，將混合物在25°C下溫育5分鐘。向樣品中加入200u RevertAid M-MuLV Reverse，將反應(yīng)物在25°C下溫育10分鐘，然后在42°C下進(jìn)行60分 鐘，然后在70°C下進(jìn)行10分鐘。將1μ 1 cDNA用于PCR反應(yīng)，并且對(duì)每一個(gè)受體，采用用于在pENTR中進(jìn)行克隆的 引物。使用?；页嵋苟甑挠紫x(chóng)進(jìn)行的測(cè)試為了進(jìn)行對(duì)ds RNA/AlstC-R和dsRNA/DHR轉(zhuǎn)基因植物的生物學(xué)測(cè)試，使用?；页?夜蛾的III齡幼蟲(chóng)。將每一個(gè)幼蟲(chóng)置于具有6cm直徑的容器，其中每天引入一個(gè)轉(zhuǎn)基因品 系的葉子碎片。作為對(duì)照，用經(jīng)空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化(從而不表達(dá)任何dsRNA)的植物的葉子喂食同 齡幼蟲(chóng)。結(jié)果通過(guò)對(duì)從葉子提取的基因組DNA進(jìn)行PCR就異源基因的存在情況表征在選擇培 養(yǎng)基上再生的植物，通過(guò)對(duì)從總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA進(jìn)行RT-PCR來(lái)驗(yàn)證dsRNA的產(chǎn)生。圖 3顯示對(duì)AlstC-R轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行的dsRNA的RT-PCR分析。在全部分析的7個(gè)品系中， dsRNA的表達(dá)水平相當(dāng)高，然而在對(duì)照植物(WTl和WT2)中未檢測(cè)到表達(dá)。為了確保擴(kuò)增反 應(yīng)正確進(jìn)行，將含有AlstCR基因的質(zhì)粒的陽(yáng)性對(duì)照(C+)用作模板。對(duì)于表達(dá)其他受體的 dsRNA (AlstA-R, DHR、PBAN-R、OctR)的植物獲得類似的結(jié)果。通過(guò)嫩枝插穗(nodal cutting)微繁殖全部陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植物，以獲得待用幼蟲(chóng)測(cè) 試的單個(gè)轉(zhuǎn)化株的均一群體。使用以在無(wú)菌條件下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)基因植物的葉碎片飼喂的海灰翅夜蛾的I齡幼蟲(chóng) 進(jìn)行幼蟲(chóng)測(cè)試。一起培養(yǎng)幼蟲(chóng)直至III期，然后將每一個(gè)幼蟲(chóng)分離在IOcm-培養(yǎng)皿中，其中 每天加入葉子碎片，進(jìn)行昆蟲(chóng)整個(gè)生命周期直至達(dá)到蛹期。在第一預(yù)實(shí)驗(yàn)中，對(duì)于每一個(gè)轉(zhuǎn)基因品系，將20個(gè)幼蟲(chóng)用于測(cè)試。圖4中的圖表 顯示從對(duì)表達(dá)針對(duì)AlstC-R的dsRNA的植物進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)獲得的結(jié)果。分析的轉(zhuǎn)基因品 系(C2、C3、Cfe和C7)標(biāo)示于橫坐標(biāo)軸上，而死亡百分率標(biāo)示于縱坐標(biāo)上。很明顯以轉(zhuǎn)基 因植物喂食的幼蟲(chóng)相對(duì)于以對(duì)照植物(WT)喂食的幼蟲(chóng)顯示高得多的死亡百分率。在4周 的喂食后，以對(duì)照為食的幼蟲(chóng)顯示大約3%的死亡率，而以轉(zhuǎn)基因品系為食的幼蟲(chóng)具有大約 80%的死亡率(品系A(chǔ)lstC-R 5a和7)和100%的死亡率(品系A(chǔ)lstC_R2和3)。在第二實(shí)驗(yàn)中，測(cè)試以兩種轉(zhuǎn)基因品系(分別表達(dá)針對(duì)AlstCR和DHR的dsRNA)
17為食的幼蟲(chóng)的死亡率，并且將其與以Wt植物為食的對(duì)照幼蟲(chóng)相比較。從I齡幼蟲(chóng)開(kāi)始，在 10天的時(shí)間內(nèi)測(cè)量幼蟲(chóng)群體的死亡率。在圖5中顯示的圖表中，以兩種轉(zhuǎn)基因植物為食的 幼蟲(chóng)的死亡率在8天后達(dá)到100%，然而在對(duì)照中仍然為60%。該實(shí)驗(yàn)清楚地表明，AlstCR 和DHR的dsRNA在植物中的存在導(dǎo)致了幼蟲(chóng)生活力的顯著降低，從而確認(rèn)了本發(fā)明提出的 技術(shù)的有效性。實(shí)施例2 轉(zhuǎn)化煙草植物以保護(hù)其免受線蟲(chóng)南方根結(jié)線蟲(chóng)的傷害材料和方法GPCR靶的選擇從南方根結(jié)線蟲(chóng)克隆的并且選擇作為本發(fā)明此實(shí)施方案的靶的該生物的GPCR受 體如下1.秀麗隱桿線蟲(chóng)血清素受體的同源物，稱為MiSerRl樣(圖2 ；SEQ ID NO 9)；2.秀麗隱桿線蟲(chóng)CeDop-I多巴胺受體的同源物，稱為MiDopRl樣(圖2 ；SEQ ID NO 10)；3.秀麗隱桿線蟲(chóng)CeNPRl樣神經(jīng)肽的同源物，稱為MiNPRl樣(圖2 ；SEQ ID NO 11)；4.秀麗隱桿線蟲(chóng)推定的GPCR的同源物(T27D1. 3)(屬于視紫質(zhì)樣GPCR的家族)， 稱為MiRhol樣；5.秀麗隱桿線蟲(chóng)推定的GPCR的同源物(T07D4. 1)(屬于視紫質(zhì)樣GPCR的家族)， 稱為MiRho2樣；6.秀麗隱桿線蟲(chóng)推定的GPCR的同源物(B0563. 6)(屬于視紫質(zhì)樣GPCR的家族)， 稱為MiRho3樣；7.秀麗隱桿線蟲(chóng)推定的GPCR的同源物(F02E8. 2)(屬于視紫質(zhì)樣GPCR的家族)， 稱為MiI ho4樣。除了這6個(gè)受體外，還在數(shù)據(jù)庫(kù)中鑒定到相應(yīng)于目的GPCR的另一個(gè)序列=MiNpRl 樣0i2TGX5_MELIC)，其是模式線蟲(chóng)秀麗隱桿線蟲(chóng)的神經(jīng)肽受體的類似物(圖2，SEQ ID NO 11)。用包含受體MKerRl 樣(SEQ ID NO 9) ,MiDopRl 樣(SEQ ID NO 10)和 MiNpRl 樣 (SEQ ID NO=Il)的基因序列(其在植物中產(chǎn)生dsRNA)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化煙草植物。分析的受體 的核苷酸序列示于圖2中。南方根結(jié)線蟲(chóng)的受體的克隆為了從南方根結(jié)線蟲(chóng)克隆受體MiSerRl樣和MiDopRl樣，用線蟲(chóng)的同源受體的 不同多肽序列查詢南方根結(jié)線蟲(chóng)的表達(dá)序列的數(shù)據(jù)庫(kù)(可在http //www, nematode, net/ BLAST/Cluster. BLAST/index. php 上獲得的)。鑒定的克隆為-Aff 735607 (對(duì)于 MiSerRl 樣)-Aff 571066 (對(duì)于 MiDopRl 樣)。從鑒定的克隆的序列開(kāi)始，設(shè)計(jì)特異性寡核苷酸，并且將其用于擴(kuò)增受體序列的 部分。然后使用之前描述的5’和3’Race法獲得完整受體的序列。關(guān)于MiNprl樣受體，使用 該基因的5’和3’上的特異性引物進(jìn)行克隆，所述基因的序列已存在于數(shù)據(jù)庫(kù)中0i2TGX5_MELIC)。用于擴(kuò)增的寡核苷酸如下
對(duì)于 MiSerRl 樣(SEQ ID NO 9)MiserRFlGATTTGGAAAATTTGGACGAT(SEQIDNO:84)
MiserRF2GGAGGGTCTTTTGTCCATGCA(SEQIDNO:85)
MiserRF3TCTCATCCAATAATTGCAATT(SEQIDNO:86)
MiserRRl:ACGTAATGCTGAATATCGAAG(SEQIDNO:87)
MiserRR2CAAATTTAAAATTGAAGCAGT(SEQIDNO:88)
MiserRR3:AGCCAAAGCAAGTGATATAAG(SEQIDNO:89)對(duì) MiDopRl 樣(SEQ ID NO 10)MidopR Fl:ACTCTTGGTGTTATTATGGGC(SEQIDNO:90)
MidopR F2TGGCTAGGTTATGCCAATTCT(SEQIDNO:91)
MidopR F3CGAGACTTTCGACGTGCCTTT(SEQIDNO:92)
MidopR Rl:AAAGGCACGTCGAAAGTCTCG(SEQIDNO:93)
MidopR R2:AGAATTGGCATAACCTAGCCA(SEQIDNO:94)
MidopR R3GCCCATAATAACACCAAGAGT(SEQIDNO:95)。下列寡核苷酸用于完整編碼區(qū)的擴(kuò)增MiserR 正向ATGTTAGAAAATGATTTGGAAAA (SEQ ID NO 96)MiserR 反向TTATTTTGATGATTCCATCA (SEQ ID NO 97)MiDopR 正向ATGTTGCCCTGGTGGCTACCTCT (SEQ ID NO 98)MiDopR 反向TTAAAAACATAAAAATCTCA (SEQ ID NO 99)MiNprR 正向ATGGAAGCATCTACAATGGAATT (SEQ ID NO 100)MiNprR 反向TCATATCCTCTCATCTGTAT (SEQ ID NO 101)。將所擴(kuò)增的受體克隆入載體PCR2. 1 (Invitrogen)并且進(jìn)行測(cè)序。與實(shí)施例1中針對(duì)編碼海灰翅夜蛾的GPCR受體的基因所描述的類似，將南方根結(jié) 線蟲(chóng)的cDNA轉(zhuǎn)移入質(zhì)粒pENTER中，然后轉(zhuǎn)移入用于植物的二元載體PH7GW1WG2中。將表達(dá)相應(yīng)于南方根結(jié)線蟲(chóng)的Mi NPRl樣的dsRNA的轉(zhuǎn)基因品系用于根感染測(cè) 試ο根感染實(shí)驗(yàn)將2周齡的煙草植物轉(zhuǎn)移至裝有與大約5-6個(gè)南方根結(jié)線蟲(chóng)蟲(chóng)癭(gall)(之前從 其他感染植物的根切取的)混合的無(wú)菌土壤的16cm-盆中。6周后，除去土壤，就蟲(chóng)癭的存 在情況分析植物的根。測(cè)量轉(zhuǎn)基因植物感染的總生物質(zhì)的量，并將其與WT對(duì)照未感染植物 感染的總生物質(zhì)的量相比較。結(jié)果如上所述，用南方根結(jié)線蟲(chóng)蠕蟲(chóng)感染屬于3個(gè)不同的表達(dá)NPRl樣dsRNA的轉(zhuǎn)基因 品系的煙草植物。3周后，估計(jì)轉(zhuǎn)基因植物中感染根的百分?jǐn)?shù)并且將其與未轉(zhuǎn)化對(duì)照植物 (WT)的所述百分?jǐn)?shù)相比較。如圖6中顯示的，轉(zhuǎn)基因植物的根與WT植物相比較顯示感染水 平的降低。該結(jié)果表明，表達(dá)南方根結(jié)線蟲(chóng)NPRl樣基因的dsRNA的轉(zhuǎn)基因植物對(duì)線蟲(chóng)感染 更具抗性，從而確認(rèn)此處提出的技術(shù)也可用于保護(hù)植物免受線蟲(chóng)攻擊。參考書(shū)目
-Aguilar R，Maestro JL,Vilaplana L,Pascual N,PiulachsMD,Belles X(2003). Regul Pept. Oct 15 ；115(3) :171-7.-Baum JA, Bogaert Τ, Clinton W, Heck GH, Feldman P, IIaganO, Johnson S, Plaetinck G, Munyikwa T, Pleau M, vaughn TY andRoberts J(2007). Nature Biotech, 25(11) :1322-1326.-Brantl, S. (2002)Biochimica et Biophysica Acta. 1575 :15-25.-Farooqui T (2007). Neurochem Res. 32 :1511-1529.-Hamilton, A.J. and Baulcombe, D.C. (1999). Science 286 :950-952.-Hammond, S. M. Boettcher, S. , Caudy, A. , Kobayashi, R. andHannon, G. (2001). Science 293 :1146-1150.-Johnson EC, Bohn LM and Taghert PH(2004). Journal of ExperBiol,207 743-748.-Kusaba, Μ. , Miyahara, K. , Lida, S. , Fukuoka, H. , Takario, Τ. , Sassa, H., Nishimura, M.，Nishio, Τ. (2003)Plant Cell 15 :1455-1467.-LiL, Wright SJ, Krystofova S, Park G, Borkovich KA (2007). Annu Rev Microbiol.,61 :423-452.-Meyering-Vos M，Merz S, Sertkol M, Hoffmann KH(2006). Insect Biochem Mol Biol. Jun ；36 (6) :492-504.-Neuhaus EM, Gisselmann G, Zhang W, Dooley R, Stortkuhl KHatt H(2005). Nature Neurosc,8(l) :15-17.-Nishi S, Hsu SY, Zell K and Hsueh Jff (2000). Endocrinology, 141 (11) 4081-4090.-Ogita, S. , H. , Uefuji, Y. , Yamaguchi, N. Koizumi and Sano, H. (2003). Nature 423 :823.-Rafaeli A,Bober R,Becker L,Choi MY,Fuerst EJ and JurenkaR(2007). Insect Molec Biol,16(3) :287-293.-Staubli F, Jorgensen TJD, Cazzamali G, Williamson M, LenzC, Sondergaard L，Ro印storff P and Grimmelikhuijzen JP(2002). PNAS,99(6) :3446-3451.-Tomoyasu, Y. and Denell, R. E. (2004). Dev. Genes Evo 1. 214 :575-578.-Weaver RJ, Freeman ZA, Pickering MG, Edwards JP. (1994). Comp. Biocchem. Physiol. C 107 :119-27.
權(quán)利要求
1.用于制備通過(guò)RNA干擾對(duì)一種或多種植物病原體的攻擊有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方 法，其包括下列步驟a)分離編碼G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)或其部分的cDNA核苷酸序列，所述受體的功能對(duì) 于所述植物病原體是至關(guān)重要的；b)構(gòu)建表達(dá)載體，所述表達(dá)載體包含由兩個(gè)特異性重組位點(diǎn)側(cè)翼連接的通過(guò)步驟a) 確定的編碼GPCR或其部分的cDNA核苷酸序列；c)使步驟b)的表達(dá)載體與二元載體進(jìn)行重組反應(yīng)，獲得重組質(zhì)粒，所述二元載體包含 組成型或組織特異性啟動(dòng)子、相同的特異性重組位點(diǎn)和內(nèi)含子序列；d)將所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)移至根癌土壤桿菌的感受態(tài)細(xì)胞內(nèi)和轉(zhuǎn)化植物；e)培養(yǎng)植物并且在所述植物中獲得dsRNA的組成型或組織特異性表達(dá)。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述植物病原體選自食草昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)和真菌。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述食草昆蟲(chóng)選自?；页嵋苟?Spodopteralittoralis), 煙芽夜蛾(Heliotis virescens)。
4.權(quán)利要求2的方法，其中所述線蟲(chóng)選自南方根結(jié)線蟲(chóng)(Meloidogyneincognita)、北 IH π^^. (Meloidogyne hap la) (Globodera rostochiensis)。
5.權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)的方法，其中當(dāng)dsRNA表達(dá)是組織特異性的時(shí)，所述組織選 自葉面、根系、樹(shù)干、蓓蕾、花、果實(shí)。
6.權(quán)利要求1至5中任一項(xiàng)的方法，其中所述GPCR受體選自咽側(cè)體抑制素A或C、章 魚(yú)胺/酪胺、PBAN肽、利尿激素、脂肪動(dòng)員激素、神經(jīng)肽、多巴胺、血清素或視紫質(zhì)樣的受體。
7.權(quán)利要求6的方法，其中當(dāng)所述昆蟲(chóng)是?；页嵋苟陼r(shí)，編碼GPCR受體或其部分的 cDNA 核苷酸序列選自 AlstAR(SEQ ID NO :1)、AlstCR(SEQ ID NO 2), DHR(SEQ ID NO :3)、 AKHR(SEQ ID NO 4),LGRl(SEQ ID NO :5)、Oct/TyrR(SEQ ID NO :6)、0R83b (SEQ ID NO :7) 和 PBAN-R(SEQ ID NO :8)。
8.權(quán)利要求6的方法，其中當(dāng)所述線蟲(chóng)是南方根結(jié)線蟲(chóng)時(shí)，編碼GPCR受體的cDNA核 苷酸序列選自血清素樣受體(SEQ ID NO :9)、多巴胺樣受體(SEQ ID N0:10)、神經(jīng)肽受體 (SEQ ID NO :11)、視紫質(zhì)樣受體。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中可在每一個(gè)步驟中使用編碼對(duì)于不同植物 病原體而言至關(guān)重要的GPCR受體的cDNA核苷酸序列平行地重復(fù)步驟a) -c)以獲得一個(gè)或多個(gè)重組質(zhì)粒，所述重組質(zhì)粒d)用于共轉(zhuǎn)化相同的植物或dl)轉(zhuǎn)化不同的植物并且將其雜 交。
10.前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的方法，其中所述植物屬于茄科(Solanaceae)，優(yōu)選煙草。
11.根據(jù)權(quán)利要求1至10中定義的方法可獲得的抗一種或多種植物病原體的轉(zhuǎn)基因植物。
12.權(quán)利要求10的轉(zhuǎn)基因植物，當(dāng)從屬于權(quán)利要求7時(shí)，其為抗?；页嵋苟甑臒煵葜参铩?br> 13.抗?；页嵋苟甑霓D(zhuǎn)基因植物，其特征在于其是煙草植物并且表達(dá)dsRNA，在所述 dsRNA中，反義鏈與編碼SEQ ID NO 2和 /或SEQ IDNO 3的mRNA互補(bǔ)。
14.抗南方根結(jié)線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)基因植物，其特征在于其是煙草植物并且表達(dá)dsRNA，在所述 dsRNA中反義鏈與編碼SEQ ID NO :11的mRNA互補(bǔ)。
15.用于預(yù)防性處理植物以使其對(duì)一種或多種植物病原體昆蟲(chóng)、線蟲(chóng)、真菌的攻擊具有 抗性的方法，其包括權(quán)利要求1至10中任一項(xiàng)定義的步驟a)_e)。
16.權(quán)利要求15的方法，其還包括用肥料、生物刺激劑、殺真菌劑、合成的或天然的殺 線蟲(chóng)劑、除草劑或殺蟲(chóng)劑處理所獲得的植物的步驟。
全文摘要
本發(fā)明涉及獲得基于RNA干擾對(duì)植物病原體(即寄生蟲(chóng)和植食性動(dòng)物)的攻擊具有抗性的轉(zhuǎn)基因植物的方法，其包括在植物組織中表達(dá)適合于抑制GPCR受體的功能性的雙鏈RNA(dsRNA)，所述GPCR受體的功能對(duì)于真菌、食草昆蟲(chóng)或植物病原性線蟲(chóng)是至關(guān)重要的。
文檔編號(hào)C12N15/82GK102124114SQ200980131951
公開(kāi)日2011年7月13日 申請(qǐng)日期2009年7月15日 優(yōu)先權(quán)日2008年7月17日
發(fā)明者D·安德倫納奇, F·阿龐納, M·G·庫(kù)魯奇, S·阿瑟羅 申請(qǐng)人:阿特拉生物科技有限責(zé)任公司