專利名稱：捕獲核酸的方法和測(cè)定的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供 了包含酶促反應(yīng)的序列特異性的核酸靶物捕獲方法和系統(tǒng)。更具體 地，本發(fā)明包含，使用帽緣內(nèi)切核酸酶、連接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕獲和隨后檢 測(cè)靶核酸序列的基質(zhì)(例如微陣列載玻片)上和溶液形式中的復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針。
背景技術(shù)：
核酸微陣列技術(shù)的出現(xiàn)，使得在非常小的區(qū)域、例如在顯微鏡載玻片上建立數(shù)百萬(wàn)核 酸序列的陣列成為可能(例如，US 6，375，903和US 5，143，854)。最初，通過(guò)把預(yù)先合成的 DNA序列印跡到載玻片上來(lái)建立這樣的陣列。但是，在US 6，375，903中所述的無(wú)掩膜陣列 合成儀(MAS)的構(gòu)建，現(xiàn)在允許直接在載玻片本身上原位合成寡核苷酸序列。使用MAS儀器，要在微陣列上構(gòu)建的寡核苷酸序列的選擇是處于軟件控制之下， 使得現(xiàn)在可能基于研究人員的特定需要，建立個(gè)別地定制的陣列。一般而言，基于MAS的寡 核苷酸微陣列合成技術(shù)允許在標(biāo)準(zhǔn)顯微鏡載玻片的非常小的區(qū)域內(nèi)平行合成超過(guò)400萬(wàn) 獨(dú)特寡核苷酸特征。由于可以利用數(shù)百生物的完整基因組(它們的參照序列已經(jīng)普遍地儲(chǔ) 存在公開(kāi)數(shù)據(jù)庫(kù)中)，已經(jīng)將微陣列用于執(zhí)行從無(wú)數(shù)生物分離的核酸的序列分析。核酸微陣列技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于許多研究和診斷領(lǐng)域，諸如基因表達(dá)和發(fā)現(xiàn)、突變檢 測(cè)、等位基因的和進(jìn)化的序列對(duì)比、基因組繪圖、藥物發(fā)現(xiàn)和其它。許多應(yīng)用需要跨整個(gè)人 基因組搜索遺傳性變體和突變；例如可能成為人疾病的根源的變體和突變。在復(fù)雜疾病的 情況下，這些搜索通常導(dǎo)致與一種或更多種疾病有關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNP)或SNP集合。 已經(jīng)證實(shí)，鑒別這樣的SNP是一項(xiàng)費(fèi)力、費(fèi)時(shí)且費(fèi)用巨大的任務(wù)，其中經(jīng)常需要重新排序來(lái) 自受影響的個(gè)體和/或組織樣品的基因組DNA大區(qū)域、通常大于100千堿基(Kb)，以發(fā)現(xiàn)單 堿基變化或鑒別所有序列變體?；蚪M通常因過(guò)于復(fù)雜而難以整體研究，且必須使用技術(shù)來(lái)降低基因組的復(fù)雜 性。為了解決該問(wèn)題，一種方案是，減少來(lái)自DNA樣品的某些類型的豐富序列，參見(jiàn)US 6，013，440。替代方案采用富集基因組序列的方法和組合物，參見(jiàn)例如，Albert，Τ. J.，等 人，Nat. Meth.，4 (2007) 903_5(其通過(guò)援引整體并入本文)和Okou，D. T.,等人，Nat. Meth. 4(11) (2007) 907-9 (其通過(guò)援引整體并入本文)和美國(guó)專利申請(qǐng)?zhí)?1/789，135、 11/970, 949,61/032, 594和61/026，592 (它們都通過(guò)援引整體并入本文)，它們公開(kāi)了節(jié)省 成本地、快速地、有效地以使用者確定的方式減少基因組樣品的復(fù)雜性、允許進(jìn)一步處理和 分析的替代方案。但是，使用的方法具有低信噪比和再現(xiàn)性問(wèn)題。這樣，需要實(shí)現(xiàn)例如信噪比的提 高、測(cè)定之間再現(xiàn)性的增加、特異性的序列捕獲、與此同時(shí)保持定量的方法和系統(tǒng)。在研究 人員理解和鑒別疾病的原因和有關(guān)的治療性處理的努力中，這些方法會(huì)為他們提供極大的 數(shù)據(jù)效用。發(fā)明概述
本發(fā)明提供了包含酶促反應(yīng)的序列特異性的核酸靶物捕獲方法和系統(tǒng)。更具體地，本 發(fā)明包含，使用帽緣內(nèi)切核酸酶、連接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕獲和隨后檢測(cè)靶核酸序列的基質(zhì)(例如微陣列載玻片)上和溶液形式中的復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針。下面描述本發(fā)明的某些例證性的實(shí)施方案。本發(fā)明不限于這些實(shí)施方案。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，在原位合成寡核苷酸探針，或合成并印跡到基質(zhì)上，其中 所述探針固定在基質(zhì)(例如，微陣列載玻片、珠子、微球)上，且包含與靶序列互補(bǔ)的單鏈 5’末端、和包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)和與靶核苷酸互補(bǔ)的末端堿基的3’末端。在本發(fā)明的其它實(shí)施 方案中，合成的探針除了包含單鏈5’末端以外，另外包含結(jié)合到探針5’末端的結(jié)合部分 (例如生物素)、和包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)和與靶序列互補(bǔ)的末端堿基的3’末端，且所述探針保持在 溶液中。在某些實(shí)施方案中，在探針中發(fā)現(xiàn)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含由限制性內(nèi)切核酸酶(RE)識(shí)別 和切割的序列。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，靶核酸包括例如基因組DNA或其衍生物、RNA、 cDNA、微RNA (miRNA)、非編碼RNA (ncRNA)、啟動(dòng)子-相關(guān)的小RNA (PASR)等，加入它們，以與 探針相互作用。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)例如剪切，使核酸碎裂，而在其它實(shí)施方案中，通過(guò)例如 PCR或通過(guò)克列諾酶(Klenow)，擴(kuò)增核酸靶物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在碎裂或擴(kuò)增后，用 可檢測(cè)的部分(例如熒光、生物素、地高辛配基等部分)在3’末端標(biāo)記靶核酸。本發(fā)明不受 使用的檢測(cè)部分和/或方法的限制，且預(yù)見(jiàn)到，熟練的技術(shù)人員會(huì)理解為了檢測(cè)目的可以 結(jié)合到核酸的3’末端的檢測(cè)部分的眾多選項(xiàng)。在某些實(shí)施方案中，所述靶核酸序列的長(zhǎng)度 是至少100堿基對(duì)、至少200堿基對(duì)、至少300堿基對(duì)、至少400堿基對(duì)、至少500堿基對(duì)、 至少600堿基對(duì)。但是，本發(fā)明不限于靶核酸序列的大小，且預(yù)見(jiàn)到未碎裂的以及碎裂的和 衍生的核酸樣品(例如，PCR擴(kuò)增子、克列諾酶隨機(jī)引發(fā)的擴(kuò)增子等)與本發(fā)明的方法和測(cè) 定一起使用。在某些實(shí)施方案中，所述靶核酸序列包含單核苷酸多態(tài)性或拷貝數(shù)目變化。在某些實(shí)施方案中，查詢核苷酸放置在探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)之后，且在3’末端。在某 些實(shí)施方案中，查詢核苷酸放置在例如5’側(cè)的發(fā)夾結(jié)構(gòu)之前且與其緊鄰，且探針的3’末端 設(shè)計(jì)成與已知的靶序列互補(bǔ)。在某些實(shí)施方案中，近端核苷酸是5’側(cè)雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)上游2、 3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)將查詢核苷酸放置在探針序列的5’ 側(cè)或臂上，實(shí)現(xiàn)切割酶和連接酶的雙特異性(與單獨(dú)的切割酶特異性相比)。在某些實(shí)施方 案中，當(dāng)如所述將查詢核苷酸放置在5’側(cè)時(shí)，切割酶特異性取決于三部分(tripartite)結(jié) 構(gòu)、和用于連接發(fā)夾的3’末端和切割的靶物的5’末端的堿基特異性的底物。 在某些實(shí)施方案中，在適合發(fā)生雜交的條件下，將標(biāo)記的靶核酸與在基質(zhì)上或在 溶液中的探針一起溫育。雜交后，與探針的3’末端核苷酸互補(bǔ)的靶序列產(chǎn)生序列特異性的 結(jié)構(gòu)，其被帽緣內(nèi)切核酸酶(FEN)識(shí)別和切割。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，向反應(yīng)物中加入連接 酶(熱穩(wěn)定的連接酶)，用于將探針的3’末端連接到切割的靶核酸的5’末端，從而將靶核酸 共價(jià)連接到探針上。如果靶序列不與探針上的3’末端核苷酸互補(bǔ)，則不會(huì)形成切割結(jié)構(gòu)， 不會(huì)發(fā)生帽緣內(nèi)切核酸酶的切割，也不會(huì)進(jìn)行連接。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)將FEN加入雜 交的探針/靶物復(fù)合物，隨后單獨(dú)加入連接酶，依次發(fā)生酶促反應(yīng)。在其它實(shí)施方案中，同 時(shí)加入FEN和連接酶，使得反應(yīng)幾乎同時(shí)發(fā)生。在某些實(shí)施方案中，將RecJ外切核酸酶與 切割酶組合地加入反應(yīng)。在某些實(shí)施方案中，將ssDNA結(jié)合蛋白額外加入反應(yīng)。本發(fā)明不 限于特定機(jī)理。實(shí)際上，對(duì)機(jī)理的理解不是實(shí)踐本發(fā)明所必需的。盡管如此，預(yù)見(jiàn)到與FEN 組合地加入RecJ和/或ssDNA結(jié)合蛋白，會(huì)提供增強(qiáng)的切割酶活性，因?yàn)榕c缺少RecJ和 /或ssDNA結(jié)合時(shí)的反應(yīng)相比，RecJ在降解雜交的靶物片段的長(zhǎng)突出端中的外切核酸酶活性，會(huì)提供更適合最佳切割酶活性的底物。在某些其中探針固定在基質(zhì)(例如微陣列載玻片)上的實(shí)施方案中，從共價(jià)結(jié)合的 靶分子洗掉非特異性地結(jié)合的核酸分子。在某些其中標(biāo)記的探針保持在溶液中的實(shí)施方案 中，含有共價(jià)結(jié)合的靶分子的標(biāo)記的探針被用捕獲分子包被的基質(zhì)(例如珠子、載玻片、平 板等)捕獲。例如，如果探針是生物素標(biāo)記的，則用抗生蛋白鏈菌素包被的珠子會(huì)捕獲探針 /靶物復(fù)合物，從而使結(jié)合的靶分子與未結(jié)合的分子分離。在某些實(shí)施方案中，洗滌基質(zhì)，以 進(jìn)一步將捕獲的靶分子，從非特異性地結(jié)合的核酸分子純化。在某些實(shí)施方案中，使用熒光掃描儀，掃描包含共價(jià)結(jié)合的靶物的基質(zhì)，例如，以 檢測(cè)在靶序列上發(fā)現(xiàn)的熒光部分，且將含有序列信息的數(shù)據(jù)與使用者交流，例如通過(guò)計(jì)算 機(jī)或其它可視方式。在某些實(shí)施方案中，從基質(zhì)釋放結(jié)合的靶核酸，用于下游應(yīng)用，例如測(cè)序。例如，在 某些實(shí)施方案中，探針的發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含一個(gè)或更多個(gè)限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)或尿嘧啶。本 發(fā)明不限于任何特定可切割的序列，熟練的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到適合本發(fā)明的方法和測(cè)定的 眾多選項(xiàng)。一旦靶核酸如本文所述被捕獲、共價(jià)結(jié)合到探針上、并與非特異性地結(jié)合的核酸 分子分離，通過(guò)用RE或尿嘧啶-DNA-糖基化酶消化探針/靶物復(fù)合物、隨后進(jìn)行內(nèi)切核酸 酶VIII消化，從探針釋放靶序列，其中在探針發(fā)夾結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)了由RE識(shí)別的序列，或尿嘧 啶被合成進(jìn)探針發(fā)夾中。釋放后，使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如通過(guò)在水或低溶質(zhì) 溶液中溫育靶序列/探針復(fù)合物，從探針洗脫靶序列。將洗脫的靶分子應(yīng)用于下游用途，例 如測(cè)序反應(yīng)。本文所述的本發(fā)明的方法和測(cè)定可以用于，例如，檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性、基因組拷 貝數(shù)變化等?？梢匝芯炕蚪M異常與疾病和病癥的關(guān)聯(lián)，從而為研究和診斷目的提供關(guān)于 疾病和病癥的原因的洞察，以及在鑒別這樣的疾病和病癥的治療性處理中，提供用于藥物 發(fā)現(xiàn)的潛在靶物。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了捕獲靶核酸序列的方法，其包含，提供核酸樣 品，其中所述樣品包含檢測(cè)部分(優(yōu)選熒光部分諸如Cy-3 )，且可以包含或不包含靶序列、至 少一種帽緣內(nèi)切核酸酶、至少一種連接酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定的連接酶)和復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針， 其中所述探針包含靶序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，在發(fā)生雜交的條件下將所述核酸樣品應(yīng)用于所述寡 核苷酸探針，在允許發(fā)生酶促反應(yīng)的條件下將所述帽緣酶和連接酶應(yīng)用于所述雜交的核酸 /探針復(fù)合物，從而捕獲所述靶核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與帽緣內(nèi)切核酸酶組合地， 在反應(yīng)中包括RecJ外切核酸酶和ssDNA結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述核酸樣品是基 因組DNA樣品或其衍生物，其中所述樣品來(lái)自哺乳動(dòng)物、優(yōu)選人。在某些實(shí)施方案中，至少 一種所述靶序列包括單核苷酸多態(tài)性，而在其它實(shí)施方案中，所述靶序列是基因組拷貝數(shù) 變體。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含SEQ ID NO: 1。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)一步檢 測(cè)捕獲的靶核酸，例如利用熒光掃描儀。在某些實(shí)施方案中，所述探針固定在基質(zhì)(例如微 陣列載玻片)上，而在其它實(shí)施方案中，所述探針保持在溶液中。在某些實(shí)施方案中，所述探 針與凝膠墊結(jié)合。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了捕獲靶核酸序列的方法，其包含，提供核酸樣 品，其中所述樣品包含檢測(cè)部分(優(yōu)選熒光部分諸如Cy-3 )，且可以包含或不包含靶序列、至 少一種帽緣內(nèi)切核酸酶、至少一種連接酶(優(yōu)選熱穩(wěn)定的連接酶)和復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含可切割的序列，提供使探針 和靶核酸之間發(fā)生雜交的條件，在允許發(fā)生酶促反應(yīng)的條件下將所述帽緣酶和連接酶應(yīng)用 于所述雜交的核酸/探針復(fù)合物，從而捕獲所述靶核酸序列。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，與帽緣 內(nèi)切核酸酶組合地，在反應(yīng)中包括RecJ外切核酸酶和ssDNA結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中， 所述可切割的序列包含可被限制性內(nèi)切核酸酶識(shí)別和切割的限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)。在某 些實(shí)施方案中，通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶消化，從探針釋放靶核酸，隨后測(cè)序，以檢測(cè)靶序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在基質(zhì)上或在溶液中實(shí)現(xiàn)序列特異性的核 酸捕獲的組合物，其包含帽緣內(nèi)切核酸酶、連接酶和寡核苷酸探針，其中所述探針包含發(fā)夾 結(jié)構(gòu)和互補(bǔ)的靶核酸序列。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針固定在基質(zhì)(例如微陣列 載玻片或珠子)上。在某些實(shí) 施方案中，本發(fā)明包括試劑盒，其中所述試劑盒用于捕獲核酸靶序列，其 包含至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶、至少一種熱穩(wěn)定的連接酶、固定在基質(zhì)上或處于純化狀態(tài) 的復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針、和至少一種緩沖液。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，在試劑盒中另外包括 RecJ外切核酸酶和ssDNA結(jié)合蛋白。在某些實(shí)施方案中，所述寡核苷酸探針基本上由與靶序列互補(bǔ)的單鏈5’末端和 3’末端(其基本上由發(fā)夾結(jié)構(gòu)和與靶核苷酸互補(bǔ)的末端堿基組成)組成。在某些實(shí)施方案 中，查詢核苷酸放置在探針的5’側(cè)。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明包括試劑盒，其中所述試劑盒用于捕獲核酸靶序列，且 基本上由至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶、至少一種熱穩(wěn)定的連接酶、固定在基質(zhì)上或處于純化 狀態(tài)的復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針、RecJ外切核酸酶、ssDNA結(jié)合蛋白和至少一種緩沖液組成。本文使用的術(shù)語(yǔ)“樣品”以它最廣的含義使用。在一種含義中，它包括從任意來(lái)源 得到的核酸試樣。生物核酸樣品可以從動(dòng)物(包括人)得到，且包括從流體、固體、組織等 分離的核酸。生物核酸樣品也可以來(lái)自非人動(dòng)物，包括、但不限于，脊椎動(dòng)物諸如嚙齒動(dòng)物、 非人靈長(zhǎng)動(dòng)物、綿羊、?？苿?dòng)物、反芻動(dòng)物、兔類動(dòng)物、豬、山羊、馬科動(dòng)物、犬、貓科動(dòng)物、鳥(niǎo) 類等。生物核酸也可以從原核生物(如細(xì)菌)和其它非動(dòng)物真核生物(諸如植物)得到。預(yù) 見(jiàn)到，本發(fā)明不受核酸樣品來(lái)源的限制，來(lái)自任何生物界的任何核酸都可以用于本文所述 的方法中。本文使用的術(shù)語(yǔ)“核酸分子”是指含有來(lái)自任意樣品來(lái)源的分子的任意核酸，包括 但不限于，DNA或RNA。該術(shù)語(yǔ)包括含有DNA和RNA的任意已知堿基類似物的序列，所述堿 基類似物包括、但不限于4_乙酰基胞嘧啶，8-羥基-N6-甲基腺苷，氮丙啶基胞嘧啶， 假異胞嘧啶，5-(羧基羥基甲基)尿嘧啶，5-氟尿嘧啶，5-溴尿嘧啶，5-羧甲基氨基 甲基-2-硫尿嘧啶，5-羧甲基氨基甲基尿嘧啶，二氫尿嘧啶，肌苷，N6-異戊烯基腺嘌 呤，1-甲基腺嘌呤，1-甲基假尿嘧啶，1-甲基鳥(niǎo)嘌呤，1-甲基肌苷，2，2-二甲基鳥(niǎo) 嘌呤，2-甲基腺嘌呤，2-甲基鳥(niǎo)嘌呤，3-甲基胞嘧啶，5-甲基胞嘧啶，N6-甲基腺嘌 呤，7-甲基鳥(niǎo)嘌呤，5-甲氨基甲基尿嘧啶，5-甲氧基氨基甲基-2-硫尿嘧啶，β-D-甘 露糖基queosine，5’ -甲氧基羰基甲基尿嘧啶，5_甲氧基尿嘧啶，2_甲基硫_N6_異戊 烯基腺嘌呤，尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯，尿嘧啶-5-氧醋酸，oxybutoxosine，假尿嘧啶， queosine, 2_硫胞嘧啶，5_甲基_2_硫尿嘧啶，2_硫尿嘧啶，4_硫尿嘧啶，5_甲基尿 嘧啶，N-尿嘧啶-5-氧醋酸甲酯，尿嘧啶-5-氧醋酸，假尿嘧啶，queosine，2_硫胞嘧啶，和2，6- 二氨基嘌呤。本文使用的術(shù)語(yǔ)“寡核苷酸”是指包含2個(gè)或更多個(gè)、優(yōu)選超過(guò)3個(gè)、且通常超過(guò) 10個(gè)脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的分子。精確大小取決于許多因素，又取決于寡核苷酸 的最終功能和 用途?？梢砸匀我夥绞街苽涔押塑账?，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、反轉(zhuǎn)錄、或其 組合。術(shù)語(yǔ)寡核苷酸也可以與術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”互換使用。本文使用的術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”或“互補(bǔ)性”用于指通過(guò)堿基配對(duì)規(guī)則相關(guān)聯(lián)的多核苷 酸。例如，序列“5’-A-G-T-3’ ”與序列“3’-T-C-A-5’ ”是互補(bǔ)的?；パa(bǔ)性可以是“部分的”， 其中僅一些核酸堿基根據(jù)堿基配對(duì)規(guī)則相匹配?；蛘撸怂嶂g可以存在“完全的”或“全 部”的互補(bǔ)性。核酸鏈之間互補(bǔ)性的程度，對(duì)例如核酸鏈之間雜交的效率和強(qiáng)度、擴(kuò)增特異 性等有顯著影響。本文使用的術(shù)語(yǔ)“雜交”用于指互補(bǔ)核酸的配對(duì)。雜交和雜交的強(qiáng)度(即，核酸 之間締合的強(qiáng)度)，受到諸如核酸之間的互補(bǔ)程度、包含的條件的嚴(yán)格性、形成的雜合體的 Tm、和核酸內(nèi)G:C比等因素的影響。本發(fā)明不限于雜交條件的特定集合，優(yōu)選地采用嚴(yán)格的 雜交條件。嚴(yán)格的雜交條件是序列依賴性的，且隨不同的環(huán)境參數(shù)(例如，鹽濃度和有機(jī)試 劑的存在)而異。通常，選擇的“嚴(yán)格的”條件比特定核酸序列在確定的離子強(qiáng)度和PH下 的熱解鏈點(diǎn)(Tm)低約5°C至20°C。優(yōu)選地，嚴(yán)格的條件比結(jié)合互補(bǔ)核酸的特定核酸的熱解 鏈點(diǎn)低約5°C至10°C。所述Tm是50%的核酸與完全匹配的探針雜交時(shí)的溫度(在確定的 離子強(qiáng)度和PH下)。本文使用的術(shù)語(yǔ)“嚴(yán)格性”用于指進(jìn)行核酸雜交的溫度、離子強(qiáng)度和諸如有機(jī)溶劑 等其它化合物的存在的條件。在“低嚴(yán)格性條件”下，目標(biāo)核酸序列會(huì)與它的精確互補(bǔ)物，具 有單堿基錯(cuò)配的序列、密切相關(guān)的序列(例如，具有90%或更高同源性的序列)和僅具有部 分同源性的序列(例如，具有50-90%同源性的序列)雜交。在“中等嚴(yán)格性條件”下，目標(biāo) 核酸序列僅與它的精確互補(bǔ)物，具有單堿基錯(cuò)配的序列和密切相關(guān)的序列(例如，具有90% 或更高同源性)雜交。在“高嚴(yán)格性條件”下，目標(biāo)核酸序列僅與它的精確互補(bǔ)物，和(取 決于諸如溫度等條件)具有單堿基錯(cuò)配的序列雜交。換而言之，在高嚴(yán)格性條件下，可以升 高溫度，從而排除與具有單堿基錯(cuò)配的序列雜交。作為實(shí)例，“嚴(yán)格的條件”或“高嚴(yán)格性條件”包含，在42°C在50%甲酰胺、5xSSC (0. 75 M NaCl, 0. 075 M檸檬酸鈉)、50mM磷酸鈉(ρΗ6· 8)、0· 1%焦磷酸鈉、5χ登哈特溶液、 超聲處理過(guò)的鮭精DNA(50mg/ml)、0. 1%SDS和10%硫酸葡聚糖中雜交，在42°C在0. 2x SSC (氯化鈉/檸檬酸鈉)中和在55°C在50%甲酰胺中洗滌，然后在55°C在含有EDTA的0. 1 χ SSC中洗滌。對(duì)于中等嚴(yán)格的條件，預(yù)見(jiàn)到含有35%甲酰胺、5xSSC和0. 1% (w/v)十二烷基 硫酸鈉的緩沖液適用于在45。C雜交16-72小時(shí)。此外，預(yù)見(jiàn)到，根據(jù)探針長(zhǎng)度和希望的嚴(yán)格 性水平，在0-45%的范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)節(jié)甲酰胺濃度。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，通過(guò)升高雜 交溫度或甲酰胺濃度來(lái)補(bǔ)償探針長(zhǎng)度的變化，實(shí)現(xiàn)更長(zhǎng)探針(例如，大于50聚體)的探針 優(yōu)化。在許多參考手冊(cè)中，例如在本文援引的和并入的“Molecular Cloning: A Laboratory Manual ”中，提供了雜交條件的其它實(shí)例。類似地，通常為靶序列與對(duì)應(yīng)的探針陣列的雜交以經(jīng)驗(yàn)為主地確定“嚴(yán)格的”洗滌 條件。例如，首先雜交陣列，然后用含有連續(xù)更低濃度的鹽或更高濃度的去污劑的洗滌緩沖 液或在遞增的溫度洗滌，直到特異性與非特異性雜交的信噪比高得足以便利特異性雜交的檢測(cè)。作為實(shí)例，嚴(yán)格的溫度條件通常包括，超過(guò)約30°C、更通常超過(guò)約37°C、且偶爾超過(guò) 約45°C的溫度。嚴(yán)格的鹽條件通常小于約1000 mM、通常小于約500 mM、更通常小于約150 mM。嚴(yán)格的洗滌和雜交條件是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，且可以參見(jiàn)，例如，Wetmur，J. G., 和 Davidson, Μ. , J Mol Biol 31 (1968) 349-70 和 Wetmur, J. G. , Crit Rev Bio Mol Biol 26(3/4) (1991) 227-59;它們通過(guò)援引整體并入本文。本領(lǐng) 域眾所周知，可以采用多種等效條件來(lái)調(diào)節(jié)和調(diào)整嚴(yán)格性條件；考慮諸如下 述因素探針的長(zhǎng)度和性質(zhì)(0嫩、1 嫩、堿基組成)，和靶物的性質(zhì)(DNA、RNA、堿基組成、存在 于溶液中或被固定化等)，和鹽和其它組分的濃度(例如，是否存在甲酰胺、硫酸葡聚糖、聚 乙二醇)。這樣，雜交和洗滌溶液的組分和濃度會(huì)改變，以產(chǎn)生嚴(yán)格性條件。在本發(fā)明的優(yōu) 選實(shí)施方案中，利用通過(guò)Roche- NimbleGen (例如，NimbleChip CGH陣列，NimbleGen 雜交試劑盒，等)可商業(yè)得到的雜交和洗滌溶液。本文使用的術(shù)語(yǔ)“引物”是指，當(dāng)置于誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的 條件(即，在有核苷酸和諸如DNA聚合酶等誘導(dǎo)劑存在下，且在合適的溫度和pH)下時(shí)，能 起合成起始點(diǎn)的作用的寡核苷酸，無(wú)論是它在純化的限制酶切消化中天然存在的，還是合 成生產(chǎn)的。引物優(yōu)選地是單鏈的(為了擴(kuò)增中的最高效率)，但是可以備選地是雙鏈的。如 果是雙鏈的，首先處理引物，以分離它的鏈，然后用于制備延伸產(chǎn)物。優(yōu)選地，引物是寡脫氧 核糖核苷酸。引物必須足夠長(zhǎng)，以在有誘導(dǎo)劑存在下引發(fā)延伸產(chǎn)物的合成。引物的精確長(zhǎng) 度取決于多種因素，包括溫度、引物的來(lái)源和方法的用途。本文使用的術(shù)語(yǔ)“探針”是指，能與另一個(gè)目標(biāo)寡核苷酸的至少一部分雜交的寡核 苷酸(即，核苷酸序列)，無(wú)論是它在純化的限制酶切消化中天然存在的，還是合成地、重組 地或通過(guò)PCR擴(kuò)增生產(chǎn)的。探針可以是單鏈的或雙鏈的，但是在本發(fā)明中，預(yù)期探針是單鏈 的。探針可用于檢測(cè)、鑒別和分離特定基因序列。在本發(fā)明的實(shí)施方案中，探針包含5’單 鏈末端和含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的3’末端。在發(fā)夾結(jié)構(gòu)中可以存在或不存在限制性內(nèi)切核酸酶位 點(diǎn)ο當(dāng)提及核苷酸序列時(shí)，本文使用的術(shù)語(yǔ)“其衍生物”、“部分”或“片段”(如在“給 定核苷酸序列的衍生物”中)是指該序列的片段。所述片段的大小可以是從4個(gè)核苷酸至 整個(gè)核苷酸序列減去1個(gè)核苷酸(10、20、30、40、50、100、200個(gè)核苷酸等)。通過(guò)例如超聲 處理、PCR擴(kuò)增、克列諾擴(kuò)增、或本領(lǐng)域已知的將核苷酸序列減小成其更小的序列的任意其 它方式，可以得到片段。在本發(fā)明中，核酸序列的片段、衍生物優(yōu)選地是至少200堿基對(duì)、至 少300堿基對(duì)、至少400堿基對(duì)、至少500堿基對(duì)、至少600堿基對(duì)。但是，本發(fā)明不受限于 靶核酸序列的大小。本文使用的術(shù)語(yǔ)“純化的”或“純化”是指，從樣品去除組分(例如，污染物)和/ 或污染物。術(shù)語(yǔ)“純化的”是指，隔離的或分離的分子，從它們的天然環(huán)境取出的核酸或氨 基酸序列?！胺蛛x的核酸序列或樣品”因此是純化的核酸序列或樣品?！盎旧霞兓摹狈?子不含有至少60%、優(yōu)選至少75%、更優(yōu)選至少90%的它們天然伴隨的其它組分。在本發(fā)明 的某些實(shí)施方案中，“純化的”涉及未結(jié)合的樣品核酸分子和反應(yīng)組分(例如，酶等)與探針 /靶物復(fù)合物的分離，通常通過(guò)用一個(gè)或更多個(gè)嚴(yán)格性的洗滌緩沖液洗滌，從而從其它反應(yīng) 組分中“純化”探針/靶核酸復(fù)合物。本文使用的術(shù)語(yǔ)“查詢核苷酸”是指探針中的核苷酸，其與靶序列相互作用(例如，匹配的堿基對(duì)形成或錯(cuò)配)以測(cè)定特定突變諸如單核苷酸多態(tài)性，或使用復(fù)數(shù)種寡核 苷酸探針從樣品序列特異性地捕獲靶核苷酸。在某些實(shí)施方案中，查詢核苷酸放置為探針 3’末端處的末端堿基。在某些實(shí)施方案中，查詢核苷酸放置在探針的5’側(cè)或臂上(即，探 針的單鏈區(qū)域)，在發(fā)夾莖結(jié)構(gòu)的近端。在某些實(shí)施方案中，查詢核苷酸放置在發(fā)夾莖結(jié)構(gòu) 的上游，且與其緊鄰。在某些實(shí)施方案中，近端核苷酸是5’側(cè)雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)上游2、3、4、5、 6、7、8、9或10個(gè)堿基。查詢核苷酸也可以稱作“等位基因特異性的核苷酸”。在某些實(shí)施 方案中，如果在靶物中存在對(duì)應(yīng)的互補(bǔ)核苷酸，查詢核苷酸會(huì)與切割酶識(shí)別的靶分子建立 重疊的三部分結(jié)構(gòu)。


圖1顯示了使用帽緣內(nèi)切核酸酶和連接酶切割和連接靶分子到固定在微陣列固 體支持物上的探針上的一個(gè)示例性實(shí)施方案；A)與潛在靶DNA序列締合的靶DNA分子的一 條鏈的4種探針的集合，B)帽緣內(nèi)切核酸酶切割與互補(bǔ)探針締合的正確靶核酸序列，不切 割不正確的靶序列，和C)正確靶序列的5’末端與探針的3’末端連接，不正確的靶序列不 連接探針。圖2顯示了使用帽緣內(nèi)切核酸酶和連接酶切割和連接靶分子到溶液中的標(biāo)記的 探針上的一個(gè)示例性實(shí)施方案；A)當(dāng)形成侵入性復(fù)合物時(shí)，進(jìn)行序列特異性的切割，隨后 把靶分子(SEQ ID NO: 33)連接到生物素化的探針(SEQ ID NO: 32)上，和B) 將含有共 價(jià)結(jié)合的靶分子的標(biāo)記的探針捕獲到用抗生蛋白鏈菌素包被的珠子上。圖3顯示了本文所述寡核苷酸探針(SEQ ID NO: 1)的一個(gè)示例性發(fā)夾序列。圖4顯示了使用本發(fā)明的方法捕獲CPK6靶序列的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；靶序列被含有發(fā)夾 的探針捕獲，被FEN切割，并連接到探針上，而對(duì)照序列則不然。圖5顯示的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證實(shí)了本發(fā)明的方法在捕獲靶序列中的效率(正確的對(duì)比不 正確的堿基調(diào)用)，和捕獲正確的對(duì)比不正確的靶序列的差異倍數(shù)。圖6顯示了用于產(chǎn)生的碎裂的實(shí)驗(yàn)DNA的3種不同的大腸桿菌擴(kuò)增和限制酶切消 化圖譜。圖7例證了本發(fā)明在鑒別基因組突變中的應(yīng)用。圖8證實(shí)了 5’帽緣長(zhǎng)度對(duì)不同切割酶分子活性在正確執(zhí)行堿基調(diào)用的能力方面 的影響，通過(guò)低辨別評(píng)分來(lái)指示(<0.5 D評(píng)分)。圖9例證了 RecJ的增強(qiáng)切割酶活性的作用；A)顯示了沒(méi)有RecJ時(shí)的切割酶反 應(yīng)，B)顯示了在有RecJ存在下增強(qiáng)的切割酶活性。圖10解釋了在切割酶和連接酶反應(yīng)中單對(duì)比雙酶特異性的發(fā)夾構(gòu)型的對(duì)比。A， C)發(fā)夾構(gòu)型具有例如從5’至3’合成的寡聚體探針(SEQ ID NO: 11-14，34-37)，其含有 莖-長(zhǎng)度(6堿基對(duì)-12堿基對(duì))的發(fā)夾，且含有在3’末端的1堿基對(duì)突出端。B，D)發(fā) 夾構(gòu)型具有例如從5’至3’合成的寡聚體探針(SEQ ID NO: 16-19，38-41)，其含有莖-長(zhǎng) 度(6堿基對(duì)-12堿基對(duì))的發(fā)夾。它們產(chǎn)生堿基特異性的底物，用于連接發(fā)夾的3’末端 和切割的靶物的5，末端(SEQ ID N0: 15，42)。OL是指在查詢位點(diǎn)處的重疊。因此，OLl 是指1個(gè)核苷酸的重疊，0L0是指在查詢位點(diǎn)處的0個(gè)或沒(méi)有重疊。圖11顯示了使用不同發(fā)夾構(gòu)型，跨83堿基對(duì)PCR片段，對(duì)堿基調(diào)用的特異性的評(píng)價(jià)?？?3堿基對(duì)片段，為每個(gè)堿基計(jì)算辨別評(píng)分，并相對(duì)于2類發(fā)夾構(gòu)型繪圖；1)雙(OLO) 和2)單(OLl)酶特異性。在每類中，對(duì)比了幾個(gè)莖和環(huán)序列。沒(méi)有發(fā)夾(N0_HP)的對(duì)照 探針集合具有最低的辨別，而雙酶發(fā)夾構(gòu)型具有最高的辨別。圖12顯示了使用不同發(fā)夾構(gòu)型，跨83堿基對(duì)PCR片段，對(duì)堿基調(diào)用的特異性的評(píng) 價(jià)?？?3堿基對(duì)片段，為每個(gè)堿基計(jì)算辨別評(píng)分，并相對(duì)于2類發(fā)夾構(gòu)型繪圖；1)雙(OLO) (SEQ ID NO: 20-25)和 2)單(OLl) (SEQ ID NO: 26-31)酶特異性。在每類中，對(duì)比了幾 個(gè)莖和環(huán)序列。發(fā)明詳述
本發(fā)明提供了使用帽緣內(nèi)切核酸酶和連接酶的方法和測(cè)定，它們用于在固體基質(zhì)上和 在溶液中靶向捕獲核酸的方法和測(cè)定中。下面描述了本發(fā)明的某些例證性的實(shí)施方案。本 發(fā)明不限于這些實(shí)施方案。

帽緣內(nèi)切核酸酶(FEN)(也稱作切割酶)是能以序列特異性的方式切割核酸的結(jié)構(gòu) 特異性的酶。所述酶已經(jīng)用作來(lái)自Third Wave Technologies的Invader 基因分型和核 酸檢測(cè)技術(shù)的開(kāi)發(fā)中的組分，參見(jiàn)例如美國(guó)專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)5，843，669,5, 888，780、 6，090，606,6，562，611,7，122，364,2007/0003942,2007/0292856,2006/0292580, 2006/0183207,2006/0177835,2006/0154269 和 2006/0040294，它們都通過(guò)援引整體并入 本文。帽緣內(nèi)切核酸酶組成和方法的其它實(shí)例參見(jiàn)美國(guó)專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)6，255，081、 6，251，649,6，979，725,5，874，283,2007/0292934,2007/0292864,2007/0231815 禾口 2007/0105138，它們都通過(guò)援引整體并入本文。FEN的內(nèi)切核酸酶活性包括，識(shí)別具有在 一條鏈上的5’突出端(帽緣)的DNA雙鏈體，其稱作侵入性復(fù)合物(如圖1和2所示)。 FEN會(huì)催化在單鏈和雙鏈DNA的接頭處的磷酸二酯鍵的水解切割(Harrington，J. J.，和 Lieber, Μ. R. , EMBOJ 13(5) (1994) 1235-46; Harrington, J. J.，和 Lieber, Μ. R. , J Biol Chem 270(9) (1995) 4503-8;通過(guò)援引整體并入本文)。FEN的識(shí)別和切割特定二 級(jí)結(jié)構(gòu)的能力，允許在沒(méi)有核酸的具體序列的現(xiàn)有知識(shí)的情況下，將這些酶用于檢測(cè)核酸 內(nèi)部序列差異。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，當(dāng)探針的3’末端核苷酸存在于靶核酸樣品中 時(shí)，產(chǎn)生由FEN識(shí)別的特定結(jié)構(gòu)，并發(fā)生FEN切割。但是，當(dāng)探針中的序列與靶序列不互補(bǔ) 時(shí)，不會(huì)形成結(jié)構(gòu)，也不會(huì)發(fā)生FEN切割。這樣，實(shí)現(xiàn)靶核酸的序列特異性識(shí)別。另外預(yù)見(jiàn)到連接酶(尤其是熱穩(wěn)定的連接酶)用于本發(fā)明的方法和測(cè)定中。如果 FEN識(shí)別的結(jié)構(gòu)存在，在FEN切割靶分子之后，進(jìn)行探針3’末端與靶分子5’末端的連接。 如熟練的技術(shù)人員已知的，連接酶會(huì)催化雙鏈體DNA或RNA中并置的3’羥基和5’磷酸酯 末端之間共價(jià)磷酸二酯鍵的形成(如圖1和2所示)。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，預(yù)見(jiàn)到 熱穩(wěn)定的連接酶。熱不穩(wěn)定的連接酶，諸如T4 DNA連接酶，在室溫表現(xiàn)出最佳酶活性。熱 穩(wěn)定的連接酶，例如在細(xì)菌嗜熱水生菌(Thermus aquaticus)和激烈熱球菌(Pyrococcus furiosus)中發(fā)現(xiàn)的那些，在高得多的溫度、例如大于45°C表現(xiàn)出最佳酶活性，當(dāng)應(yīng)用于 本文所述的本發(fā)明的方法和測(cè)定中時(shí)，允許溫度條件的更大柔性。熱穩(wěn)定的連接酶的實(shí) 例參見(jiàn)，例如，美國(guó)專利和公開(kāi)的專利申請(qǐng)6，949，370,6, 576，453,6, 280，998,6, 444，429、 5，700, 672,2007/0037190,2005/0266487 和歐洲專利公開(kāi) WO 07/035439,它們都通過(guò)援引 整體并入本文。一旦FEN已經(jīng)切割靶核酸，通過(guò)連接酶的連接會(huì)將靶序列共價(jià)連接至探針 上，其中所述探針是固定在固體支持物(例如微陣列載玻片)上，或保持在溶液中。這樣，實(shí)現(xiàn)靶核酸的序列特異性的捕獲。 另外預(yù)見(jiàn)到，一旦所述雜交反應(yīng)中的侵入性復(fù)合物被切割酶識(shí)別，在有或沒(méi)有 ssDNA結(jié)合蛋白(SSBP)的情況下，包含RecJ，會(huì)增強(qiáng)切割酶的功效。Rec J外切核酸酶 (RecJ)會(huì)以5’ -3’方向降解單鏈DNA，并另外參與錯(cuò)配修復(fù)和同源重組(Lovett，S. Τ.， 禾口Kolodner, R. D. , Proc Natl Acad Sci 86 (1989) 2627—2631; Yamagata, Α.,等人， Nucl Acids Res 29(22) (2001) 4617-4624; Han, E. S.,等人，Nucl Acids Res 34(4) (2006) 1084-1091;通過(guò)援引整體并入本文)。Rec J會(huì)以同等的親和力降解磷酸化的 和未磷酸化的DNA末端，但是要求單鏈末端的長(zhǎng)度是至少7個(gè)核苷酸。Rec J是一種漸進(jìn) 的外切核酸酶，在它結(jié)合單鏈末端后，會(huì)降解大約1000個(gè)核苷酸，通常在它到達(dá)雙鏈DNA 接頭時(shí)停止。但是，RecJ核酸酶活性不是精確的，它可能在接頭之前幾個(gè)核苷酸或在接頭 之后幾個(gè)堿基對(duì)停止降解活性。已經(jīng)提出，通過(guò)將單鏈DNA結(jié)合蛋白加入降解反應(yīng)物中， 可以增強(qiáng) Rec J 向單鏈 DNA 的募集(Han, Ε. S.,等人，Nucl Acids Res 34(4) (2006) 1084-1091)。這樣，預(yù)見(jiàn)到包含RecJ外切核酸酶和SSBP中的一種或更多種，以增強(qiáng)切割酶 活性，在本文所述的靶核酸的序列特異性捕獲中實(shí)現(xiàn)更高的效率。在某些實(shí)施方案中，將寡核苷酸探針在它們的5’末端或5’側(cè)或5’臂處連接到固 體支持物(諸如微陣列載玻片)上，其中所述探針包含單鏈的、且與靶序列互補(bǔ)的中樞部分， 和包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)(其包含被互補(bǔ)核酸的雙鏈區(qū)域結(jié)合的單核苷酸環(huán))的3’末端區(qū)域，且在末 端是對(duì)目標(biāo)靶序列特異性的3’末端堿基(例如，用于測(cè)定基因組突變諸如單核苷酸多態(tài)性 的查詢核苷酸)。在某些實(shí)施方案中，所述對(duì)靶序列特異性的堿基(例如，用于測(cè)定突變或 多態(tài)性)的位置緊挨著探針5’ -側(cè)的發(fā)夾環(huán)結(jié)構(gòu)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈發(fā)夾區(qū)域是 至少3個(gè)堿基對(duì)、至少5個(gè)堿基對(duì)、至少6個(gè)堿基對(duì)、至少8個(gè)堿基對(duì)、至少10個(gè)堿基對(duì)、至 少16個(gè)堿基對(duì)。在有利于互補(bǔ)DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、 cDNA、gDNA、RNA、mRNA、tRNA等)的復(fù)合靶群體、例如人基因組DNA (gDNA)(例如，完整的 或碎裂的)一起溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分和探針3’末端堿基互補(bǔ)的核酸 序列與探針特異性地雜交。在某些實(shí)施方案中，用例如可檢測(cè)的部分(例如，熒光團(tuán)、生色 團(tuán)、放射性同位素等)在3’末端標(biāo)記靶核酸。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在它們的5’末端連接到固體支持物(諸如微陣 列載玻片)上的寡核苷酸探針，其中所述探針包含單鏈的、且與靶序列部分互補(bǔ)的中樞部 分，和包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)(其包含被互補(bǔ)核酸的雙鏈區(qū)域結(jié)合的單核苷酸環(huán))的3’末端區(qū)域，且 在末端是與靶序列互補(bǔ)的3’末端堿基，其中在包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的互補(bǔ)核酸的雙鏈區(qū)域的5’ 末端近端的核苷酸包括與目標(biāo)靶序列互補(bǔ)的序列(例如，用于測(cè)定基因組突變諸如單核苷 酸多態(tài)性的查詢核苷酸)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，近端核苷酸緊鄰雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)。在某些實(shí) 施方案中，近端核苷酸是在5’側(cè)雙鏈發(fā)夾結(jié)構(gòu)上游1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)堿基。在 優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈發(fā)夾區(qū)域是至少3個(gè)堿基對(duì)、至少10個(gè)堿基對(duì)、至少16個(gè)堿基對(duì)。 在有利于互補(bǔ)DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA, mRNA、tRNA等)的復(fù)合靶群體、例如人基因組DNA (gDNA)(例如，完整的或碎裂的)一起 溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分和探針3’末端堿基互補(bǔ)的核酸序列與探針特異 性地雜交。在某些實(shí)施方案中，用例如可檢測(cè)的部分(例如，熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素 等)在3’末端標(biāo)記靶核酸。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在它們的5’末端連接到固體支持物(諸如微陣 列載玻片)上的寡核苷酸探針，其中所述探針包含單鏈的、且與靶序列互補(bǔ)的中樞部分，和 包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)(其包含被互補(bǔ)核酸的雙鏈區(qū)域結(jié)合的單核苷酸環(huán))的3’末端區(qū)域，且在末端 是與靶序列互補(bǔ)的3’末端堿基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙鏈發(fā)夾區(qū)域是至少3個(gè)堿基對(duì)、 至少10個(gè)堿基對(duì)、至少16個(gè)堿基對(duì)。在有利于互補(bǔ)DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針 與核酸鏈(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA, mRNA、tRNA等)的復(fù)合靶群體、例如人基因組DNA (gDNA)(例如，完整的或碎裂的)一起溫育，使得與核酸探針5’末端的單鏈部分和探針3’ 末端堿基互補(bǔ)的核酸序列與探針特異性地雜交。在某些實(shí)施方案中，用例如可檢測(cè)的部分 (例如，熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素等)在3’末端標(biāo)記靶核酸。在某些實(shí)施方案中，寡核 苷酸探針可以用于雜交測(cè)定中，用于測(cè)定基因異常諸如缺失、易位等，所述寡核苷酸探針包 含單鏈的、且與靶序列互補(bǔ)的中樞部分，和包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)(其包含被互補(bǔ)核酸的雙鏈區(qū)域結(jié) 合的單核苷酸環(huán))的3’末端區(qū)域，且在末端是與靶序列互補(bǔ)的3’末端堿基。在某些實(shí)施方案中，如在 DNA Microarrays: A Molecular Cloning Manual, 2003, Bowtell 禾口 Sambrook 編,Cold Spring Harbor Laboratory Press (通過(guò)援 引整體并入本文)中所述，合成寡核苷酸探針，并固定在基質(zhì)(例如微陣列載玻片或芯 片)上。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用例如在美國(guó)專利和專利公開(kāi)7，157, 229,7,083,975, 6，444，175,6,375，903,6,315，958,6,295，153,5,143，854、2007/0037274、2007/0140906、 2004/0126757,2004/0110212,2004/0110211,2003/0143550,2003/0003032 禾口 2002/0041420 (它們都通過(guò)援引整體并入本文)中所述的無(wú)掩膜陣列合成儀(MAS)，直接在 基質(zhì)(諸如微陣列載玻片)上合成捕獲寡核苷酸探針。當(dāng)使用MAS儀器來(lái)印跡微陣列時(shí)，在 軟件控制下，直接在微陣列載玻片上原位構(gòu)建寡核苷酸探針序列的選擇，從而建立基于研 究人員的特定需要的個(gè)別地定制的陣列。這樣的陣列包含數(shù)百、數(shù)千和數(shù)百萬(wàn)的探針。通常從3’至5’合成寡核苷酸探針，無(wú)論是在基質(zhì)(例如，微陣列載玻片)上原位 合成(例如，MAS合成)，還是先合成再印跡到基質(zhì)上。但是，由于大多數(shù)核酸酶(例如，限 制性內(nèi)切核酸酶、聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、連接酶、激酶、磷酸酶等)具有從5’至3’的活性，酶 促反應(yīng)要求使用反向化學(xué)方法(例如，從5’至3’ )合成探針。這樣，本發(fā)明的方法和測(cè)定 實(shí)施方案包含使用在例如Albert, Τ. J.，等人，Nucl Acids Res 31 (7) (2003) e35 (其 通過(guò)援引整體并入本文)中所述的MAS儀器原位合成優(yōu)先從5’至3’合成的寡核苷酸探針。本發(fā)明提供了用于檢測(cè)核酸序列中的差異(例如單核苷酸多態(tài)性、基因組拷貝數(shù) 變體、甲基化狀態(tài)等)的方法和測(cè)定。在本發(fā)明的方法和測(cè)定中，使靶核酸與探針雜交，其中 所述探針固定在基質(zhì)上(例如，通過(guò)原位合成或其它方法)或在溶液中。在某些實(shí)施方案 中，探針的長(zhǎng)度是至少15個(gè)核苷酸(nts)、至少20 nts、至少25 nts、至少30 nts、至 少35 nts、至少40 nts、至少45 nts、至少50 nts、至少55 nts、至少60個(gè)核苷酸。在某些實(shí)施 方案中，在基質(zhì)(例如微陣列載玻片、微陣列芯片、珠子、平板等)上原位合成本發(fā)明的探針。 在優(yōu)選的實(shí)施方案中，使用MAS儀器原位合成探針，其中探針的5’末端固定在基質(zhì)上。在 某些實(shí)施方案中，在溶液中合成探針，并保持在溶液中。本發(fā)明的探針包含與靶序列互補(bǔ)的單鏈5’末端，包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)(其包含一系列產(chǎn) 生雙鏈區(qū)域的互補(bǔ)堿基和在雙鏈區(qū)域中產(chǎn)生單鏈區(qū)域(例如，發(fā)夾結(jié)構(gòu))的不互補(bǔ)的序列) 的3’末端，和與特定靶序列互補(bǔ)的3’末端堿基。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度是至少5個(gè)堿基、10個(gè)堿基、至少12個(gè)堿基、至少14個(gè)堿基、至少16個(gè)堿基、至少18個(gè)堿 基。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)優(yōu)選是16個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)夾結(jié) 構(gòu)包含如圖3所示的SEQ ID NO: 1。但是，本發(fā)明不受發(fā)夾結(jié)構(gòu)序列的限制，發(fā)夾結(jié)構(gòu)的 其它實(shí)例和它們的設(shè)計(jì)參見(jiàn)，Varani, G.，Ann Rev Biophys Biomol Struct 24 (1995) 379-404 和 Antao，V. P.,等人，Nucl Acids Res 19(21) (1991) 5901-5，它們二者通過(guò) 援引整體并入本文。如圖1和2所示，探針上與探針發(fā)夾的3’末端堿基互補(bǔ)的核苷酸堿基 決定了測(cè)定特異性，且有時(shí)稱作“等位基因特異性的堿基”。如圖10所示，在發(fā)夾結(jié)構(gòu)近端 的探針5’-側(cè)或臂上的核苷酸堿基也決定了測(cè)定特異性。當(dāng)?shù)任换蛱禺愋缘膲A基與靶鏈 的對(duì)應(yīng)堿基互補(bǔ)時(shí)，發(fā)夾和靶分子形成特定結(jié)構(gòu)，稱作“侵入性復(fù)合物”，其被FEN酶識(shí)別。 當(dāng)堿基特異性的核苷酸存在于靶鏈中時(shí)，F(xiàn)EN會(huì)在該堿基的3’側(cè)切割靶鏈，從而釋放未雜 交的或帽緣的靶鏈5’末端。如果堿基不與等位基因特異性的堿基互補(bǔ)，則侵入性復(fù)合物不 會(huì)形成，F(xiàn)EN也不會(huì)切割靶分子。在某些實(shí)施方案中，在探針與靶核酸雜交后，將探針/靶物復(fù)合物與混合液一起 溫育，所述混合液包含下述的一種或更多種帽緣內(nèi)切核酸酶(FEN)、連接酶、RecJ, ssDNA 結(jié)合蛋白和發(fā)生酶促反應(yīng)所需的適當(dāng)緩沖液和輔因子(ATP或NAD+)。FEN會(huì)切割形成侵 入性復(fù)合物的靶分子，在核酸探針發(fā)夾和靶核酸分子之間產(chǎn)生間隙。預(yù)見(jiàn)到，在有或沒(méi)有 ssDNA結(jié)合蛋白的情況下，包含RecJ，會(huì)提高切割酶反應(yīng)的效率，從而提高在侵入性復(fù)合物 的切割中的敏感性。連接酶會(huì)修復(fù)間隙，將靶分子共價(jià)連接到探針上。如果侵入性復(fù)合物 沒(méi)有形成，則FEN不會(huì)切割，靶分子也不會(huì)連接到探針上。隨后通過(guò)洗滌，將未結(jié)合的分子 與結(jié)合的靶物分離。由于靶分子共價(jià)結(jié)合到在基質(zhì)上的探針上，可以用比應(yīng)用于非共價(jià)結(jié) 合的雜交方法的那些高得多的嚴(yán)格性進(jìn)行洗滌，從而增強(qiáng)非特異性地結(jié)合的非靶分子的去 除，并極大提高捕獲特異性和信噪比。在某些實(shí)施方案中，使用本文所述的和熟練的技術(shù)人員已知的數(shù)據(jù)分析儀器和軟 件，通過(guò)可檢測(cè)的方式(例如比色法、放射測(cè)量術(shù)、熒光分析法、凝膠電泳等)，鑒別結(jié)合探 針的靶分子。由于靶分子共價(jià)結(jié)合到探針上，陣列能夠用高嚴(yán)格性洗滌，以去除未結(jié)合的非靶 分子，從而更大地減少背景信號(hào)，并提高測(cè)定的信噪比。本發(fā)明的用途包括、但不限于比較 基因組雜交(CGH)、單核苷酸多態(tài)性基因分型、基因轉(zhuǎn)錄描繪、基因組甲基化分析、染色質(zhì)免 疫沉淀繪圖等。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于DNA的靶物捕獲的測(cè)定和方法，例如，用于 高流通量測(cè)序應(yīng)用和其它下游應(yīng)用。 在某些實(shí)施方案中，核酸探針是在溶液中，且在它們的5’末端結(jié)合到可捕獲的部 分(例如生物素部分)上(圖2)。核酸探針另外包含如前所述的單鏈的、且與靶序列互補(bǔ)的 5’區(qū)域，和包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)(其包含被互補(bǔ)核酸的雙鏈區(qū)域結(jié)合的單核苷酸環(huán))的3’末端區(qū) 域。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度是至少5個(gè)堿基、10個(gè)堿基、至少12個(gè)堿基、 至少14個(gè)堿基、至少16個(gè)堿基、至少18個(gè)堿基。在某些實(shí)施方案中，所述探針的長(zhǎng)度是至 少15個(gè)核苷酸(nts)、至少20 nts、至少25 nts、至少30 nts、至少35 nts、至少40 nts、至 少45 nts、至少50 nts、至少55 nts、至少60個(gè)核苷酸。預(yù)見(jiàn)到，所述探針優(yōu)選小于100個(gè) 堿基。在某些實(shí)施方案中，所述發(fā)夾序列包含可切割的序列，用于在連接后從探針釋放結(jié)合的靶序列。例如，所述發(fā)夾 序列包含限制性內(nèi)切核酸酶(RE)位點(diǎn)或一個(gè)或更多個(gè)尿嘧啶。 在有利于互補(bǔ)DNA鏈的雜交的條件下，將核酸探針與核酸鏈(例如，DNA、cDNA、gDNA、RNA, mRNA、tRNA等)的復(fù)合靶群體、例如碎裂的人基因組DNA (gDNA) 一起溫育，使得與核酸探 針5’末端的單鏈部分互補(bǔ)的基因組片段與探針特異性地雜交。在某些實(shí)施方案中，用例如 可檢測(cè)的部分(例如，熒光團(tuán)、生色團(tuán)、放射性同位素等)在3’末端標(biāo)記靶核酸。當(dāng)?shù)任换蛱禺愋缘膲A基與靶鏈的對(duì)應(yīng)堿基互補(bǔ)時(shí)，如圖2所示，發(fā)夾和靶分子 雜交，并形成被FEN酶識(shí)別的特定結(jié)構(gòu)。當(dāng)堿基特異性的核苷酸存在于靶鏈中時(shí)(圖2)， FEN會(huì)在該堿基的3’側(cè)切割靶鏈，從而釋放未雜交的或帽緣，靶鏈5’末端。如果堿基不與 等位基因特異性的堿基互補(bǔ)，則侵入性復(fù)合物不會(huì)形成，F(xiàn)EN也不會(huì)切割靶分子。預(yù)見(jiàn)到， 在有或沒(méi)有ssDNA結(jié)合蛋白的情況下，與FEN組合地包含RecJ，會(huì)提高切割酶的效率。在某些實(shí)施方案中，在雜交后，將探針復(fù)合物與混合液一起溫育，所述混合液包含 下述的一種或更多種FEN酶、連接酶、RecJ、ssDNA結(jié)合蛋白、發(fā)生需要的酶促反應(yīng)所需的 適當(dāng)緩沖液和輔因子(ATP或NAD+)。FEN會(huì)切割形成侵入性復(fù)合物的靶分子，在核酸探針 發(fā)夾和靶核酸分子之間產(chǎn)生間隙。如前所述，通過(guò)將靶分子共價(jià)連接到探針上，連接酶會(huì)修 復(fù)間隙。如果侵入性復(fù)合物沒(méi)有形成，則FEN不會(huì)切割，靶分子也不會(huì)連接到探針上。在某 些實(shí)施方案中，如圖2B所示，共價(jià)結(jié)合到在溶液中的標(biāo)記的探針(在該情況下，生物素標(biāo)記 的探針)上的靶分子，被抗生蛋白鏈菌素(SA)包被的珠子捕獲(例如，結(jié)合)，其中抗生蛋白 鏈菌素結(jié)合標(biāo)記的探針的生物素，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。在抗生蛋白鏈菌素結(jié)合后， 從溶液中取出珠子，并洗滌，從而從捕獲珠子上的結(jié)合的靶分子去除未結(jié)合的、未靶向的分 子，并從不希望的反應(yīng)組分將靶分子/探針復(fù)合物純化出來(lái)。由于靶分子共價(jià)結(jié)合到SA結(jié) 合的生物素標(biāo)記的探針上，可以用比應(yīng)用于非共價(jià)結(jié)合的雜交方法的那些高得多的嚴(yán)格性 進(jìn)行洗滌，從而增強(qiáng)非特異性地結(jié)合的非靶分子的去除，并極大提高捕獲特異性和信噪比。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)將包含靶分子的珠子暴露于限制性內(nèi)切核酸酶，從SA 結(jié)合的探針釋放靶分子，例如當(dāng)RE的識(shí)別位點(diǎn)在合成過(guò)程中摻入探針的發(fā)夾序列中 時(shí)。在某些實(shí)施方案中，如果一個(gè)或更多個(gè)尿嘧啶在合成過(guò)程中摻入發(fā)夾中，通過(guò)與尿嘧 啶-DNA-轉(zhuǎn)葡糖基酶(UDG) —起溫育，隨后用內(nèi)切核酸酶VIII消化受損的位點(diǎn)，從SA結(jié)合 的探針釋放靶分子。本發(fā)明不限于從結(jié)合的探針釋放靶分子的方法，預(yù)見(jiàn)到本領(lǐng)域已知的 切割DNA的其它方法用于本發(fā)明的方法和測(cè)定中。釋放后，將靶向的分子應(yīng)用于下游用途，諸如使用例如高流通量測(cè)序儀測(cè)序。本發(fā) 明的方法和測(cè)定另外為研究人員提供了精確確定每個(gè)捕獲的靶核酸分子的終點(diǎn)和方向性 的能力，且作為結(jié)果，每次測(cè)序都讀出。預(yù)見(jiàn)到，使用本文所述的酶方法釋放靶序列，適合從 探針釋放靶序列，其中所述探針如本文所述在固體支持物(諸如微陣列載玻片)上合成。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法和測(cè)定提供了單核苷酸多態(tài)性(SNP)的分析。 在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于分析DNA樣品(例如基因組DNA樣品)中的拷貝數(shù)變 化(CNV)的方法和測(cè)定。SNP和CNV分析可用于關(guān)聯(lián)研究中，例如在不同物種之間和在與疾 病和病癥有關(guān)的SNP和CNV之間。這樣，本發(fā)明的方法和測(cè)定提供了基因組變化和它們與 特定受試者(例如人受試者)中的疾病的關(guān)聯(lián)的分析。但是，預(yù)見(jiàn)到，本發(fā)明不限于來(lái)自任何 特定屬和/或種的基因組序列的分析，例如認(rèn)為任意原核生物或真核生物序列適合使用本 發(fā)明，用于研究、診斷或治療用途。
在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明不限于雜交條件的特定集合。但是，優(yōu)選采用本領(lǐng)域技 術(shù)人員已知的嚴(yán)格雜交條件。本發(fā)明使用的雜交溶液包括、但不限于在MmbleGen雜交 試劑盒(Roche NimbleGen, Madison WI)中發(fā)現(xiàn)的那些。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了 在酶切割和連接反應(yīng)后洗滌探針/靶物復(fù)合物，從而去除未結(jié)合的和非特異性地結(jié)合的核 酸分子。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了差別嚴(yán)格性的洗滌，例如包含0. 2x SSC、0. 2%(ν/ v)SDS和0. 1 mM DTT的洗滌緩沖液I，包含0. 2x SSC和0.1 mM DTT的洗滌緩沖液II，和包 含0. 5x SSC和0. 1 mM DTT的洗滌緩沖液III。在某些實(shí)施方案中，用于洗滌、雜交和酶促 反應(yīng)的溶液和緩沖液包含鋰。本發(fā)明不受雜交和/或洗滌緩沖液的組成的限制。在某些實(shí) 施方案中，在例如RE消化后，使用例如水或本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的類似的低溶質(zhì)溶液，從 探針洗脫靶序列。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了靶核酸序列的捕獲，其隨后用于靶向的基于陣 列的、基于鳥(niǎo)槍法的、基于毛細(xì)管的或本領(lǐng)域已知的其它測(cè)序方法中。如熟練的技術(shù)人員已 知的，通過(guò)合成的測(cè)序被理解為一種測(cè)序方法，其監(jiān)視特定脫氧核苷-三磷酸在測(cè)序反應(yīng) 中摻入后副產(chǎn)物的產(chǎn)生(Ronaghi，Μ.，等人，Science 281 (1998) 363-65，其通過(guò)援引 整體并入本文)。例如，一個(gè)或更突出的通過(guò)合成反應(yīng)測(cè)序的實(shí)施方案是焦磷酸測(cè)序方法。 在焦磷酸測(cè)序中，通過(guò)導(dǎo)致化學(xué)發(fā)光信號(hào)產(chǎn)生的酶級(jí)聯(lián)，監(jiān)視在核苷酸摻入過(guò)程中焦磷酸 的產(chǎn)生。454基因組測(cè)序儀系統(tǒng)(Roche Applied Science目錄號(hào)04760085001)是基于 焦磷酸測(cè)序技術(shù)。為了在454 GS20或454 FLX儀器上測(cè)序，平均基因組DNA片段大小優(yōu)選 地分別是200或600堿基對(duì)。通過(guò)合成反應(yīng)的測(cè)序，也可以包含終止子染料類型測(cè)序反應(yīng)。 在該情況下，摻入的dNTP構(gòu)件塊包含可檢測(cè)的標(biāo)記諸如熒光標(biāo)記，其阻止新生DNA鏈的進(jìn) 一步延伸。在dNTP構(gòu)件塊摻入模板/引 物延伸雜合體后，通過(guò)例如使用具有3’-5’外切核 酸酶或校正活性的DNA聚合酶，去除并檢測(cè)標(biāo)記。但是，本發(fā)明不受可與本發(fā)明組合使用的 下游用途的類型的限制。在某些實(shí)施方案中，通過(guò)酶消化(例如，限制性內(nèi)切核酸酶、UDG和Endo VIII 等)，從寡核苷酸探針釋放靶序列，從探針洗脫，并測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，使用454 Life Sciences Corporation測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了根據(jù)生產(chǎn)商的 方案，通過(guò)乳狀液PCR (emPCR)洗脫后，進(jìn)行靶序列擴(kuò)增。根據(jù)生產(chǎn)商的方案，將包含來(lái)自 emPCR的克隆地?cái)U(kuò)增的靶核酸的珠子轉(zhuǎn)移進(jìn)picotiter平板，并進(jìn)行焦磷酸測(cè)序反應(yīng)，用于 序列測(cè)定。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了方法和測(cè)定，其中預(yù)見(jiàn)到復(fù)數(shù)種不同靶序列用 于在一個(gè)陣列上或在一種溶液中的檢測(cè)，例如用于同時(shí)捕獲和檢測(cè)多種靶序列。在這樣的 實(shí)施方案中，預(yù)見(jiàn)到雙色標(biāo)記(例如，雙通道熒光、熒光/非熒光等)。例如，一種靶序列用 一種可檢測(cè)的部分標(biāo)記，另一種靶序列用第二種可檢測(cè)的部分標(biāo)記。例如，一種靶序列用熒 光素部分(例如，熒光素、Cy-3、Cy_5等)標(biāo)記，第二種靶序列用非熒光部分(例如，生物素、 地高辛配基)或波長(zhǎng)檢測(cè)不同于第一種熒光部分的熒光部分標(biāo)記。末端轉(zhuǎn)移酶可以用于3’ 末端標(biāo)記靶序列，其中使用例如，熒光團(tuán)(例如，熒光素-12-ddCTP)和第二種部分(例如， 生物素-11-ddCTP)的ddCTP綴合物。這樣，雙通道檢測(cè)或差別部分檢測(cè)允許區(qū)分2種不同 的捕獲靶序列。在某些實(shí)施方案中，進(jìn)一步放大實(shí)踐本文所述的本發(fā)明的方法和測(cè)定結(jié)束后檢測(cè)到的信號(hào)。信號(hào)放大 方法的實(shí)例包括、但不限于在通過(guò)例如NEN Life Sciences Products, Inc. (Boston MA)可商業(yè)得到的Tyramide信號(hào)放大試劑盒中發(fā)現(xiàn)的那些。在某些實(shí)施方案中，在結(jié)合的靶序列上進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，例如，以鑒 別在捕獲的靶序列中發(fā)現(xiàn)的SNP或CNV。使用任意陣列掃描儀，例如Axon GenePix 4000B 熒光掃描儀，進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。通過(guò)掃描儀捕獲到數(shù)據(jù)后，使用生物信息學(xué)程序分析捕獲的數(shù) 據(jù)?？捎糜趤?lái)自熒光微陣列形式的數(shù)據(jù)分析的生物信息學(xué)程序包括、但不限于，SignalMap (NimbleGen)和NimbleScan (NimbleGen)。但是，能捕獲和分析通過(guò)本發(fā)明方法產(chǎn)生的數(shù) 據(jù)的任意掃描儀和生物信息學(xué)程序同樣適用。數(shù)據(jù)輸出顯示在例如任意計(jì)算機(jī)屏幕或能顯 示實(shí)踐本發(fā)明時(shí)產(chǎn)生的數(shù)據(jù)的其它裝置上。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于實(shí)踐本文所述的方法和測(cè)定的試劑盒。在 某些實(shí)施方案中，所述試劑盒包含試劑和/或其它組分(例如，緩沖液、說(shuō)明書、固體表面、 容器、軟件等)，它們足以執(zhí)行本文所述的靶核酸分子的靶核酸捕獲，或是執(zhí)行本文所述的 靶核酸分子的靶核酸捕獲所必需的。試劑盒在一個(gè)或更多個(gè)容器(另外包含一個(gè)或更多個(gè) 試管、包裝等)中提供給使用者，所述容器可能需要差別儲(chǔ)存，例如由于每種試劑盒組分/ 試劑對(duì)光、溫度等的具體要求，將試劑盒組分/試劑差別儲(chǔ)存。在某些實(shí)施方案中，試劑盒 包含一種或更多種固體支持物，其中所述固體支持物是微陣列載玻片或復(fù)數(shù)個(gè)珠子，它們 上面固定有復(fù)數(shù)種寡核苷酸捕獲探針。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含在溶液中的寡核苷 酸探針(其中所述探針包含捕獲部分)和珠子，其中所述珠子設(shè)計(jì)成結(jié)合固定在寡核苷酸探 針上的捕獲部分。例如，這樣的部分是生物素標(biāo)記，其可以用于固定到抗生蛋白鏈菌素包被 的固體支持物上?；蛘?，這樣的修飾是半抗原如地高辛配基，其可以用于固定到用半抗原識(shí) 別抗體包被的固體支持物上。在某些實(shí)施方案中，本發(fā)明的試劑盒包含至少一種或更多種用于執(zhí)行酶促反應(yīng)的 化合物和試劑，例如下述的一種或更多種帽緣內(nèi)切核酸酶、DNA連接酶、RecJ外切核酸酶、 ssDNA結(jié)合蛋白、T4多核苷酸激酶、限制性內(nèi)切核酸酶、DNA聚合酶、末端轉(zhuǎn)移酶、克列諾酶 等。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含雜交溶液、洗滌溶液和/或洗脫試劑中的一種或更多 種。在試劑盒中發(fā)現(xiàn)的洗滌溶液的實(shí)例包括、但不限于洗滌緩沖液I (0.2x SSC, 0.2% (v/v) SDS, 0. 1 mM DTT)和 / 或洗滌緩沖液 II (0. 2x SSC, 0. 1 mM DTT)和 / 或洗滌緩沖 液III (0. 5x SSC, 0.1 mM DTT)。在某些實(shí)施方案中，在試劑盒中發(fā)現(xiàn)的一種或更多種緩 沖液或溶液包含鋰。在某些實(shí)施方案中，試劑盒包含一種或更多種洗脫溶液，其中所述洗脫 溶液包含純水和/或含有TRIS緩沖液和/或EDTA的溶液或其它低溶質(zhì)溶液。提供下面的實(shí)施例來(lái)證實(shí)和進(jìn)一步解釋本發(fā)明的某些實(shí)施方案和方面，不應(yīng)理解 為限制其范圍。實(shí)施例1
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和限制酶切碎的PCR擴(kuò)增子的靶物捕獲 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試在本發(fā)明的方法和測(cè)定中的連接效率。利用3’標(biāo)記的CPK6寡核苷酸 (Integrated DNA Technologies (IDT), Coralville ΙΑ)和從大腸桿菌基因組DNA (ATCC 號(hào)700926D-5)擴(kuò)增的PCR片段設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，得到從約1100至約1500堿基對(duì)的擴(kuò)增子(SEQ ID Ν0: 2，3和4)。設(shè)計(jì)了 50和60聚體的寡核苷酸探針，其包含16堿基對(duì)發(fā)夾。使用 的發(fā)夾序列是5，-CCGGAGGATACTCCG G_3，(SEQ ID N0: 1)，如圖3所示。合成了對(duì)照探針，其不含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)了探針的四集體，其代表每條鏈的所有4種堿基，這樣為查詢 序列內(nèi)的靶核苷酸設(shè)計(jì)了共8個(gè)探針(例如，4個(gè)/DNA靶物的每條鏈)。除了在50/60聚 體探針的3’末端上的末端堿基以外，每條鏈的每個(gè)四集體含有相同的探針序列。在Roche NimbleGen (Madison, WI)在陣列上原位合成探針，密度是210萬(wàn)探針/陣列(HD2)。使用PCR引物，從大腸桿菌基因組DNA擴(kuò)增了 3個(gè)PCR片段；
1277-f s^atgagcaacaatgaaitcca-s' (seq id no； 5)
1277-R 5*ATGGTCAGCGGATACAGGAA-3T (SEQ ID NO: 6}
2205-F 5'ATGAATGACACCAGCTTCG{SEQ ID NO: 7) 2205-R 5 GCCAGTAGCGTAATCGGATG-3' (SEQ ID NO; 8) 2825-F 5*-ATCiTCTGAACAACACGCACA-3' (SEQ ID NO; 9)
2825-R 5'ACAOAATAACGTCGCGGATG-3'. (SEQ ID NO: 10)
PCR擴(kuò)增條件包括，在94°C初期變性2 min,然后是30個(gè)94°C /30秒、55°C /60秒、 72°C/60秒的循環(huán)，最后在72°C延伸7分鐘。用2種限制酶(HhaI和NlaIII)消化片段， 得到具有3’突出端的不同大小的片段。以等摩爾濃度合并限制酶切碎的擴(kuò)增子，并用南極 磷酸酶(antarctic phosphatase) (NEB)進(jìn)一步處理，將5’末端脫磷酸。這會(huì)防止自身-自 身連接，并指導(dǎo)與在陣列上合成的探針的非特異性連接。使用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT，Roche), 用Cy3-ddCTP在它們的3’末端標(biāo)記碎裂的和脫磷酸的擴(kuò)增子，并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知 的方法，例如參見(jiàn) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人編，Cold Spring Harbor Press (通過(guò)援引整體并入本文)，從未標(biāo)記的片段中沉淀出來(lái)。將標(biāo)記的 片段與在3’末端用Cy3 (IDT)標(biāo)記的磷酸化的CPK6寡核苷酸相組合。用NimbleChip HX3 混合器(Roche NimbleGen, Madison WI)密封微陣列載玻片。 將變性的和標(biāo)記的靶擴(kuò)增子應(yīng)用于微陣列。在微陣列上發(fā)現(xiàn)的探針包括含有和沒(méi)有發(fā)夾 的探針。在MAUI雜交系統(tǒng)(BioMicro)中，在嚴(yán)格的條件下，使微陣列載玻片與靶序列一 起在42°C雜交過(guò)夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。使用在適當(dāng)緩沖液中的Ampligase (Epicentre, Madison WI)進(jìn)行連接，并在45°C溫育4小時(shí)。將載玻片洗滌3次，在恒定攪 拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，洗滌微陣列載玻片，并掃描。使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀進(jìn)行掃描。為每次掃描捕獲數(shù)據(jù)，并使用SignalMap (NimbleGen)和 NimbleScan (NimbleGen)軟件應(yīng)用程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，對(duì)于沒(méi)有發(fā)夾的探針(CPK6對(duì)照)，沒(méi)有靶物捕獲(圖4)。但是，當(dāng)探 針包含發(fā)夾且靶片段序列包含互補(bǔ)的靶堿基時(shí)，連接酶會(huì)將靶序列連接到探針上。靶序列 捕獲對(duì)于每個(gè)限制片段5’末端的末端堿基的身份是特異性的，使得對(duì)于代表序列的部分片 段的查詢堿基的每個(gè)探針?biāo)募w，4個(gè)探針中僅有一個(gè)具有連接的標(biāo)記的片段。這導(dǎo)致與每 條鏈的四集體中的其它3個(gè)堿基的背景強(qiáng)度相比正確連接探針的高信號(hào)強(qiáng)度。與含有正確 堿基的探針有關(guān)的信號(hào)強(qiáng)度，完美地鑒別出了 HhaI和NlaIII的限制位點(diǎn)位置的基于序列 的預(yù)測(cè)。
實(shí)施例2
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和PCR 擴(kuò)增子的靶物捕獲
設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)試帽緣內(nèi)切核酸酶和在本發(fā)明的方法和測(cè)定中的連接效率。如實(shí)施例1 所述，利用3’標(biāo)記的CPK6寡核苷酸(IDT)和從大腸桿菌基因組DNA擴(kuò)增的PCR片段設(shè)計(jì)實(shí) 驗(yàn)。設(shè)計(jì)了 50和60聚體的寡核苷酸探針，其包含在末端3’末端的16堿基對(duì)發(fā)夾和互補(bǔ)堿 基。使用的發(fā)夾序列是fTCCGGAGGATACTCCCJGSISEQ ID NO:〗>。合成了對(duì)照探針， 其不含有發(fā)夾結(jié)構(gòu)。設(shè)計(jì)了探針的四集體，如圖IA所示，其代表每條鏈的所有4種堿基，這 樣為查詢序列內(nèi)的靶核苷酸設(shè)計(jì)了共8個(gè)探針(例如，4個(gè)/DNA靶物的每條鏈)。在Roche NimbleGen (Madison, WI)在陣列上原位合成探針，密度是210萬(wàn)探針/陣列(HD2)。使用如前所述的PCR引物和條件，從大腸桿菌基因組DNA擴(kuò)增了 3個(gè)PCR片段。用 2種限制酶(HhaI和NlaIII)消化片段，得到具有3’突出端的不同大小的片段。以等摩爾 濃度合并限制酶切碎的擴(kuò)增子，并用南極磷酸酶(NEB)進(jìn)一步處理，將5’末端脫磷酸。這 會(huì)防止自身-自身連接，并指導(dǎo)與在陣列上合成的探針的非特異性連接。使用末端轉(zhuǎn)移酶 (TdT, Roche)，用Cy3-ddCTP在它們的3’末端標(biāo)記碎裂的和脫磷酸的擴(kuò)增子，并使用本領(lǐng) 域技術(shù)人員已知的方法，例如參見(jiàn) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人編，Cold Spring Harbor Press (通過(guò)援引整體并入本文)，從未標(biāo)記的片段中沉淀 出來(lái)。將標(biāo)記的片段與在3’末端用Cy3 (IDT)標(biāo)記的脫磷酸化的CPK6寡核苷酸相組合。用NimbleChip HX3 混合器(Roche NimbleGen, Madison WI)密封微陣列載玻片， 并將變性的、標(biāo)記的靶擴(kuò)增子應(yīng)用于微陣列。在微陣列上發(fā)現(xiàn)的探針包括含有和沒(méi)有發(fā)夾 的探針。在MAUI雜交系統(tǒng)(BioMicro)中，在嚴(yán)格的條件下，使微陣列載玻片與靶序列一起 在42°C雜交過(guò)夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。將在適當(dāng)緩沖液(10 mM MOPs: pH 7.5， 100 mM LiCl, 4 mM MgCl2 )中的切割酶加到含有結(jié)合的靶序列的微陣列載玻片上，將反應(yīng) 物在45°C溫育1小時(shí)，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。使用在適當(dāng)緩沖液中的Ampligase (Epicentre, Madison WI)進(jìn)行連接，并在45°C溫育4小時(shí)。將載玻片洗滌3次，在恒定攪 拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，洗滌微陣列載玻片，并掃描。使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀進(jìn)行掃描。為每次掃描捕獲數(shù)據(jù)，并使用SignalMap (NimbleGen)和 NimbleScan (NimbleGen)軟件應(yīng)用程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。結(jié)果表明，對(duì)于沒(méi)有發(fā)夾的探針(CPK6對(duì)照)，沒(méi)有靶物捕獲。但是，當(dāng)探針包含發(fā) 夾(其含有與靶序列互補(bǔ)的堿基)且靶序列包含靶堿基時(shí)，F(xiàn)EN和連接酶會(huì)切割靶序列，并將 靶物連接到探針上(分別地)。靶序列捕獲對(duì)于互補(bǔ)堿基的身份是特異性的，使得對(duì)于代表 序列的部分片段的查詢堿基的探針?biāo)募w，在切割酶反應(yīng)后，4個(gè)探針中僅有一個(gè)具有連接 的標(biāo)記的片段。這導(dǎo)致與每條鏈的四集體中的其它3個(gè)堿基的背景強(qiáng)度相比正確堿基調(diào)用 的高信號(hào)強(qiáng)度(圖5)。將四集體內(nèi)正確的和不正確的堿基之間的差異倍數(shù)計(jì)算為正確堿基 調(diào)用的信號(hào)強(qiáng)度除以3個(gè)不正確的堿基的平均值的比率。如圖5所示，在探針之間檢測(cè)到 高達(dá)35倍的變化倍數(shù)，所述探針在陣列上合成，用于查詢PCR擴(kuò)增子的所有片段。實(shí)施例3
肌酸磷酸激酶6 (CPK6)和隨機(jī)碎裂的基因組DNA的靶物捕獲 利用人和大腸桿菌基因組DNA (gDNA)設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)。如實(shí)施例1所述，設(shè)計(jì)寡核苷酸探 針，從而在Roche NimbleGen (Madison, WI)上原位合成探針，密度是210萬(wàn)探針/陣列(HD2)。通過(guò)超聲處理碎裂基因組DNA (gDNA)，或使用不同長(zhǎng)度的隨機(jī)引物(9聚體、10聚 體、12聚體和15聚體)，使用克列諾片段，隨機(jī)擴(kuò)增基因組DNA (gDNA)，得到不同長(zhǎng)度的擴(kuò) 增的靶序列。用南極磷酸酶處理片段，使用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)，用Cy3-ddCTP在它們的3’末 端進(jìn)行標(biāo)記，并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，從未標(biāo)記的片段中沉淀出來(lái)。用HX3混合 器(NimbleGen Roche)密封微陣列載玻片，并將變性的、標(biāo)記的靶序列應(yīng)用于微陣列(5_30 Pg樣品/子陣列)。在微陣列上發(fā)現(xiàn)的探針包括含有和沒(méi)有在它們的3’末端發(fā)夾之后且緊 鄰的互補(bǔ)堿基的探針，以及沒(méi)有發(fā)夾的探針。使微陣列載玻片與靶序列一起在42°C雜交過(guò) 夜，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。將在適當(dāng)緩沖液中的切割酶加到含有結(jié)合的靶序列的 微陣列載玻片上，將反應(yīng)物在42°C溫育1-2小時(shí)，用洗滌緩沖液洗滌3次，并掃描。使用在 適當(dāng)緩沖液中的Ampligase (Epicentre, Madison WI)進(jìn)行連接，并在45°C溫育4小時(shí)。 將載玻片洗滌3次，在恒定攪拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，洗滌微陣列載玻 片，并使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀掃描。通過(guò)掃描儀捕獲數(shù)據(jù)，使用SignalMap (Roche NimbleGen Inc.)和NimbleScan (Roche NimbleGen Inc.)軟件應(yīng)用程序進(jìn)行數(shù) 據(jù)分析。結(jié)果表明，對(duì)于沒(méi)有發(fā)夾的探針(對(duì)照)，沒(méi)有靶物捕獲。但是，當(dāng)探針包含發(fā)夾 (其含有互補(bǔ)堿基)且靶序列包含靶堿基時(shí)，F(xiàn)EN和連接酶會(huì)在鑒定靶物捕獲的序列中提供 測(cè)定特異性，正如通過(guò)熒光檢測(cè)方法所測(cè)得的。實(shí)施例4
具有遞增ssDNA帽緣長(zhǎng)度的切割酶的評(píng)價(jià)
評(píng)價(jià)了 20種切割酶在切割酶反應(yīng)中的功效；任意地命名為C1-C5、P1-P3和F1-F12。切 割酶由 Third Wave Technologies (Madison, WI 53719)提供。Ampligase (Epicentre, Madison WI)。每個(gè)實(shí)驗(yàn)使用2個(gè)微陣列載玻片(各自含有12個(gè)相同的子陣列)，以覆蓋測(cè) 定的所有20種切割酶，使用反向化學(xué)方法(在探針5’末端是在基質(zhì)近端時(shí)，5’ -3’合成)， 通過(guò)MAS合成它們的探針，12個(gè)子陣列中的每一個(gè)含有大約120，0000個(gè)探針。將探針設(shè)計(jì) 成代表3種不同的PCR片段，3種片段中每一種的有義和反義鏈。將每個(gè)探針設(shè)計(jì)成具有與 靴擴(kuò)增子序列和16堿基對(duì)發(fā)夾(序列5，-CCGGAG GATACTCCGG-3，(SEQ ID NO: 1，如圖3 所示)相關(guān)的序列特異性，3’突出端代表查詢序列內(nèi)靶核苷酸的有義和反義鏈(因此，8個(gè) 探針/ PCR片段)的A、C、T或G。合成了不包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)的對(duì)照探針。擴(kuò)增了大腸桿菌的3種不同的片段，得到1277、2205和2825堿基對(duì)擴(kuò)增子。通 過(guò)限制酶切消化，進(jìn)一步碎裂每個(gè)擴(kuò)增子；用NlaIII消化1277堿基對(duì)和2825堿基對(duì)擴(kuò)增 子，并用MboI消化2205堿基對(duì)擴(kuò)增子，得到不同長(zhǎng)度的消化的片段(圖6)。用南極磷酸 酶(NEB)處理片段，以將5’末端脫磷酸。這會(huì)防止自身-自身連接，并指導(dǎo)與在陣列上合 成的探針的非特異性連接。使用末端轉(zhuǎn)移酶(TdT，Roche)，用Cy3-ddCTP在它們的3，末 端標(biāo)記碎裂的和脫磷酸的擴(kuò)增子，并使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法，例如參見(jiàn)Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Sambrook 等人編，Cold Spring Harbor Press (通過(guò) 援引整體并入本文)，從未標(biāo)記的片段中沉淀出來(lái)。將標(biāo)記的靶核酸變性，并應(yīng)用到微陣列載玻片上的子陣列上。在MAUI雜交系統(tǒng) (BioMicro)中，在嚴(yán)格的條件下，使微陣列載玻片與靶序列一起在42°C雜交過(guò)夜，用洗滌 緩沖液洗滌3次，并掃描。將在切割酶緩沖液(10 mM MOPs的終濃度pH 7.4，100 mMLiCl, 4 mM MgC12, IX NAD)中的20種實(shí) 驗(yàn)切割酶和Ampligase 之一加入含有結(jié)合的靶 序列的微陣列載玻片上的每個(gè)子陣列，在45°C溫育反應(yīng)物2小時(shí)，用洗滌緩沖液洗滌3次， 并掃描。將另一輪Ampligase (這次在它的適當(dāng)緩沖液中)加入每個(gè)子陣列，在45°C溫育另 外4小時(shí)。將載玻片洗滌3次，在恒定攪拌下在水中煮沸陣列大約2分鐘。煮沸后，再次洗 滌微陣列載玻片，并掃描。使用Axon GenePix 4000B熒光掃描儀進(jìn)行掃描。為每次掃描捕 獲數(shù)據(jù)，并使用 SignalMap (Roche NimbleGen Inc.)和 NimbleScan (Roche NimbleGen Inc.)軟件應(yīng)用程序進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。圖7證實(shí)了切割酶/連接酶組合在測(cè)定遺傳序列(在該情況下，PCR片段，其中靶序 列在查詢位置具有“C”)中的功效。過(guò)夜雜交后，探針序列的結(jié)合的靶物之間沒(méi)有差別，而 切割酶和連接酶的摻入急劇增加了差別，導(dǎo)致在該位置的正確堿基調(diào)用。此外，圖8證實(shí)， 隨著結(jié)合的靶片段的5’末端長(zhǎng)度的增加(例如，帽緣長(zhǎng)度增加)，不正確堿基調(diào)用增加。堿 基調(diào)用或在單核苷酸處的辨別，可以通過(guò)計(jì)算來(lái)確定
權(quán)利要求
1.捕獲靶核酸序列的方法，其包含a)提供i)核酸樣品，其中所述核酸樣品可以包含或不包含靶序列，ii)至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶和至少一種連接酶，和iii)復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，b)在允許靶序列和探針之間發(fā)生雜交的條件下，將所述核酸樣品應(yīng)用于所述寡核苷 酸探針，和c)在允許發(fā)生酶促反應(yīng)的條件下，將至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶和至少一種連接酶應(yīng) 用于雜交的核酸/探針復(fù)合物，從而捕獲核酸靶序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品另外包含檢測(cè)部分。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述檢測(cè)部分包含熒光部分。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述熒光檢測(cè)部分是Cy3。
5.權(quán)利要求2的方法，其中使用熒光掃描儀檢測(cè)檢測(cè)部分。
6.權(quán)利要求5的方法，另外包含檢測(cè)的靶核酸的數(shù)據(jù)分析。
7.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品包含基因組DNA或其衍生物。
8.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品是來(lái)自哺乳動(dòng)物。
9.權(quán)利要求1的方法，其中所述核酸樣品是來(lái)自人。
10.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種所述靶序列包含單核苷酸多態(tài)性。
11.權(quán)利要求1的方法，其中至少一種所述靶序列包含基因組拷貝數(shù)變體。
12.權(quán)利要求1的方法，其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu)包含SEQID NO: 1。
13.權(quán)利要求1的方法，其中所述連接酶是熱穩(wěn)定的連接酶。
14.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針固定在基質(zhì)上。
15.權(quán)利要求14的方法，其中所述基質(zhì)是微陣列載玻片。
16.權(quán)利要求1的方法，其中所述復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針包含查詢核苷酸。
17.權(quán)利要求16的方法，其中所述查詢核苷酸放置在探針的末端3’末端處。
18.權(quán)利要求16的方法，其中所述查詢核苷酸放置在探針5’-側(cè)上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的近端。
19.權(quán)利要求16的方法，其中所述查詢核苷酸放置在探針5’-側(cè)上的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的上游 約2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)堿基處。
20.權(quán)利要求1的方法，另外包含，提供選自RecJ和單鏈結(jié)合蛋白的組分。
21.權(quán)利要求1的方法，其中所述探針提供雙特異性。
22.捕獲靶核酸的方法，其包含a)提供i)核酸樣品，其中所述核酸樣品包含檢測(cè)部分，且可以包含或不包含靶序列，和 )至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶、至少一種連接酶，和iii)復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針，其中所述探針包含靶序列和發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中所述發(fā)夾結(jié)構(gòu) 包含至少一種可切割的序列，b)在允許靶序列和探針之間發(fā)生雜交的條件下，將所述核酸樣品應(yīng)用于所述寡核苷 酸探針，和c)在允許發(fā)生酶促反應(yīng)的條件下，將至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶和至少一種連接酶應(yīng)用于雜交的核酸/探針復(fù)合物，從而捕獲核酸靶序列。
23.權(quán)利要求22的方法，其中所述至少一種可切割的序列包含限制性內(nèi)切核酸酶位點(diǎn)ο
24.權(quán)利要求22的方法，另外包含，通過(guò)限制性內(nèi)切核酸酶消化，從探針釋放核酸靶序列。
25.權(quán)利要求24的方法，另外包含，通過(guò)測(cè)序，檢測(cè)所述釋放的靶核酸序列。
26.用于序列特異性的核酸捕獲的組合物，其包含帽緣內(nèi)切核酸酶、連接酶和寡核苷酸 探針，其中所述探針包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)和互補(bǔ)的靶核酸序列。
27.用于捕獲和檢測(cè)核酸序列的試劑盒，其包含a)至少一種帽緣內(nèi)切核酸酶，b)至少一種熱穩(wěn)定的連接酶，c)固定在基質(zhì)上的復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針，和d)至少一種緩沖液。
28.權(quán)利要求27的試劑盒，另外包含，選自RecJ和單鏈結(jié)合蛋白的組分。
全文摘要
本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容提供了用于序列特異性的核酸靶物捕獲的方法和系統(tǒng)，其包含酶促反應(yīng)。本發(fā)明的公開(kāi)內(nèi)容涉及使用帽緣內(nèi)切核酸酶、連接酶和/或其它酶、蛋白或化合物，捕獲和隨后檢測(cè)靶核酸序列的基質(zhì)(例如微陣列載玻片)上和溶液形式中的復(fù)數(shù)種寡核苷酸探針。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK102046811SQ200980119976
公開(kāi)日2011年5月4日 申請(qǐng)日期2009年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2008年4月1日
發(fā)明者J·帕特爾, T·艾伯特, V·拉米徹夫 申請(qǐng)人:霍夫曼-拉羅奇有限公司