專利名稱：用作bnp免疫診斷試劑標準品的重組蛋白及制備方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，尤其涉及一種用作BNP免疫診斷試劑標準品的重組蛋 白及制備方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
心臟病在許多國家已成為頭號殺手，因其早期癥狀隱蔽，患者往往被延誤治療。 近年的研究報告指出，病人心臟開始出現(xiàn)代償功能不全或衰竭時，人體血液中的一種激 素——促尿鈉排泄肽的濃度就會明顯升高。在心房、心室和血管里生成的促尿鈉排泄肽又 被分別稱為ANP、BNP和CNP。研究發(fā)現(xiàn)，心臟病患者左心房收縮無力會造成血液在心臟內(nèi)潴 留，使人體分泌更多的上述激素，該激素刺激腎臟排鈉排水量增加以減少血液潴留。所以， 促尿鈉排泄肽的濃度能夠相對可靠地顯示出人體心臟的狀況。BNP是一種在心室當(dāng)中合成的神經(jīng)激素，具有利鈉、利尿、舒血管、抑制腎素-血管 緊張素-醛固酮系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的作用。研究表明，當(dāng)心室肌細胞壓力增高時，前體蛋 白(pro-BNP，108個氨基酸)發(fā)生裂解，產(chǎn)生含32個氨基酸的BNP及76個氨基酸非活性的 N末端腦鈉尿肽原(NT-proBNP)。因而BNP和NT-proBNP在評估心臟事件時較其他鈉尿肽要 好，能夠單獨地預(yù)示左室(LV)舒張末期壓力增高的狀況，能更好地反映和分析慢性心衰病 人的狀況。此外，與肌鈣蛋白、CK-MB，和肌紅蛋白等由于心臟損傷而釋放的標志物不同，BNP 在損傷發(fā)生以前，心臟功能代償代償階段即可發(fā)生變化，有利于更早發(fā)現(xiàn)心功能的異常。目 前BNP與NT-ProBNP的檢測已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于急性冠脈綜合征、CHF患者危險及穩(wěn)定性冠 狀動脈疾病患者心臟事件危險的評價、監(jiān)控左心室功能不全患者的治療、探查輕度心功能 不全等方面。與NT-ProBNP相比，BNP具有受年齡和腎功能的影響小的特點，對心臟功能的 判斷更為特異，具有統(tǒng)一的cut-off值。除此之外，BNP檢測的主要優(yōu)勢還在于能夠快速、 準確、高質(zhì)量地對心臟衰竭進行診斷。與肌鈣蛋白、CK-MB，和肌紅蛋白等由于心臟損傷而釋 放的標志物不同，BNP在損傷發(fā)生以前，心臟功能代償代償階段即可發(fā)生變化，有利于更早 發(fā)現(xiàn)心功能的異常。眾所周知，心臟衰竭的眾多癥狀中，最常見且促使患者求醫(yī)的癥狀就是 呼吸困難，而引發(fā)此種癥狀的原因很多。因此面對患者，醫(yī)生如何以最快速的方法作出正確 判斷并給予有效的治療至關(guān)重要，BNP的應(yīng)用能夠大大提高心臟衰竭診斷的時效性和準確 性，是檢測心臟衰竭的最有效指標。另外，BNP是一個治療有效性的早期監(jiān)測指標，能夠判 斷治療是否有效，進而指導(dǎo)治療。如果沒有BNP的監(jiān)測，治療效果要等到幾周后通過體征的 改善才可以知道，而有了 BNP監(jiān)測，可以在2 3天就可以判斷治療效果。再次，除了用于 診斷之外，BNP也可以作為心臟衰竭患者預(yù)后的指標。在接受治療之后的患者，若其BNP血 中濃度還是居高不下，則其死亡率或是因心臟衰竭惡化的再住院率都相對較高。因此，利用 BNP，可以判斷心臟衰竭患者恢復(fù)的好壞。美國FDA在2000年11月22日首次批準了 Biosite Diagnostics公司用于幫助 診斷充血性心力衰竭的BNP試劑盒，Biosite Diagnostics Triage BNP。這是一種床旁檢驗(POCT)，使用六滴全血或血漿可在15分鐘完成此項檢測。瑞士羅氏醫(yī)療診斷部也開發(fā)了 類似產(chǎn)品。目前FDA批準其用于充血性心衰(CHF)的輔助診斷，標示急性冠脈綜合征和CHF 患者危險及評價穩(wěn)定性冠狀動脈疾病患者心臟事件危險。在歐洲，該檢測系統(tǒng)的適應(yīng)證還 包括監(jiān)控左心室功能不全患者的治療；探查輕度心功能不全；評價CHF確診患者心衰嚴重程度。根據(jù)SFDA相關(guān)數(shù)據(jù)，目前獲得國內(nèi)批文的BNP檢測產(chǎn)品共有14種，其中6種為 BNP質(zhì)控或標準品，這6種產(chǎn)品全為進口，分別由Biosite Incorporated, Abbott GmbH & Co. KG、Bayer HealthCare LLC、Siemens Medical SolutionsDiagnostics 四家公司把持。 如前所述，如同心肌肌鈣蛋白為心梗診斷的金標準標志物一樣，B型鈉尿肽(BNP)作為心衰 診斷的金標準標志物，已得到全球心血管界和檢驗醫(yī)學(xué)界的公認，在不遠的將來一定會在 我國得到普遍使用，然而由于目前的相關(guān)檢測試劑嚴重依賴進口，導(dǎo)致患者使用成本相對 較高，280元人民幣/次檢測。定量檢測人BNP常用的是免疫學(xué)方法，建立免疫學(xué)定量檢測方法除了需要特異性 良好的抗體之外，還需要相應(yīng)的檢測標準品與之配套。由于BNP的分子量僅由3. 5KD，在體 內(nèi)降解速度較快，在血液中半衰期約20分鐘。人體內(nèi)BNP極低，正常外周血濃度為IOOpg/ ml左右；因而無法從血漿(血清)中純化使得天然NT-ProBNP多肽制備十分困難。而直接 多肽合成成本過高，且多肽存在不穩(wěn)定、保存困難等問題。用基因工程制備低分子量多肽， 一般采用融合蛋白表達，能克服單獨表達低分子量多肽時出現(xiàn)的翻譯效率低表達產(chǎn)物易受 蛋白水解酶降解的缺陷，但較大的標簽蛋白對小分子蛋白的免疫原性有一定的影響。所以 通常使用一些蛋白酶切除標簽蛋白，切除標簽后的蛋白需要進一步純化和去除加入的蛋白 酶，操作比較麻煩并且蛋白酶十分昂貴。對檢測標準品要求主要為與天然存在的人BNP有 相同或相近的結(jié)構(gòu)，具有相同的免疫原性及高度的穩(wěn)定性。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的一個目的是提供一種BNP重組蛋白，以代替天然BNP多肽，用作BNP免疫 診斷試劑標準品。BNP重組蛋白具有選自于下列a)或b)的氨基酸序列a) SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后仍具有所述BNP重組蛋白活性 的氨基酸序列。本發(fā)明還提供一種編碼上述BNP重組蛋白的核苷酸序列，其具有選自下列c)、d) 或e)的核苷酸序列c) SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQ ID NO 2但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO 2所編碼的氨基酸序 列相同的核苷酸序列；e)按照堿基互補配對原則所有堿基能與上述C)或d)中的序列雜交，并且編碼具 有所述BNP重組蛋白活性的核苷酸序列。本發(fā)明的另一目的是提供一種上述BNP重組蛋白的制備方法的制備方法，以代替 天然BNP多肽，用作BNP免疫診斷試劑標準品。所述BNP重組蛋白的制備方法主要包含以下步驟1)根據(jù)GENEBANK中提供的BNP編碼序列，獲得BNP的編碼序列SEQID NO :3，將編 碼序列SEQ ID NO :3同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子獲得編碼序列SEQ ID N0:4，利用 2段由5個甘氨酸組成的Linker將3段經(jīng)改造的序列進行連接獲得重組BNP的編碼序列 SEQ ID NO 2,以全基因合成的方式獲得重組BNP基因；2)重組BNP基因與載體連接，構(gòu)建BNP重組質(zhì)粒，獲得BNP重組質(zhì)粒；3) BNP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行BNP重組蛋白的表達，獲得BNP重組蛋白；4) BNP重組蛋白的可溶性鑒定；5) BNP重組蛋白的純化；6)BNP重組蛋白的濃度、純度鑒定；7)BNP重組蛋白的活性鑒定。上述制備方法中，步驟1)包括將編碼序列SEQ ID NO 3中第2、3、13、14、30、31 位氨基酸同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，根據(jù)改造后的基因序列進行串聯(lián)拼接；其中 上述的大腸桿菌優(yōu)選為BL21。上述制備方法中，步驟2)中使用的載體為pET42a。上述制備方法中，步驟幻包括采用GST親和層析純化，其中采用的親和層析純化 介質(zhì)優(yōu)選為快流速GST標簽(GSTrap Fast Flow)。上述制備方法中，步驟幻還包括采用His親和層析純化，其中采用的親和層析純 化介質(zhì)優(yōu)選為快流速組氨酸標簽(Histrap Fast Flow)。上述制備方法中，步驟5)還包括脫鹽柱(Desalting)處理。上述的步驟5)具體包括以下步驟①將含目的BNP重組蛋白的破菌上清用快流速GST凝膠初純化，采用洗脫液 (50mmol/L Tris-HCl, 10mmol/L還原型谷胱苷肽，pH8. 0)連續(xù)洗脫并收集目的BNP重組蛋 白蛋白峰；②初純化的BNP重組蛋白用快流速組氨酸標簽親和層析柱再次純化，洗脫采用 40mM和500mM咪唑階段洗脫收集后者；③用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50mM Tris-HCl, pH 8. 0 ；④脫鹽后BNP重組蛋白內(nèi)加入帶有His標簽的重組EK酶，重組EK酶與BNP重組 蛋白量比為1 1000，置于4°C低速搖床對-48小時；⑤再次用快流速組氨酸標簽親和層析柱純化及去除重組EK酶，洗脫采用40mM和 500mM咪唑階段洗脫，40mM洗下蛋白即為所需BNP重組蛋白。上述制備方法中，步驟6)中采用Lowry法(Folin酚法)測定BNP重組蛋白濃度； 采用高效液相色譜法(HPLC)測定BNP重組蛋白純度。本發(fā)明還有一個目的是提供上述的BNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用，其可代替 天然BNP多肽用作BNP免疫診斷試劑標準品，或BNP重組蛋白用于制備BNP檢測試劑盒。本發(fā)明獲得的BNP重組蛋白為含106個氨基酸的多肽，與天然BNP的32個氨基酸 相比，為三段編碼天然BNP的氨基酸多肽經(jīng)2段linker (5個甘氨酸)連接而成。經(jīng)密碼 子改造的基因構(gòu)建的原核表達質(zhì)粒在大腸桿菌中實現(xiàn)了高效可溶性表達，大腸桿菌表達蛋 白制備工藝簡單，價格低廉，能大規(guī)模生產(chǎn)。發(fā)明獲得的BNP重組蛋白為含106個氨基酸的多肽在純化過程中發(fā)現(xiàn)，它在與融合蛋白切開后能非特異性的結(jié)合到HisTrap HP柱，經(jīng) (20mmol/L sodiumphosphate, 0. 5M NaCl，20-50mmol/L 咪唑 pH7. 4)可以將其洗脫，而未切 開的蛋白及切下的標簽蛋白與加入的EK酶(帶His標簽)不能洗脫，達到純化分離和去除 加入的蛋白酶的效果，制備的串聯(lián)重組BNP純度很高，方法簡單，所用的純化材料也是很常 見的純化填料。并且研究發(fā)現(xiàn)在相同的保存條件和測定條件下，串聯(lián)重組BNP在4°C保存 15天活性下降了 9. 3%，而BNP (合成含32個氨基酸的多肽)下降了 53. 6%，串聯(lián)重組BNP 的穩(wěn)定性明顯優(yōu)于天然BNP。由于串聯(lián)重組BNP切除了標簽蛋白，與天然存在的人BNP相比 具有相同或相近的結(jié)構(gòu)，能被現(xiàn)在的BNP的檢測試劑檢測，其具有與天然BNP相同的免疫原 性，而且純度高，有更好的穩(wěn)定性；而且上述的純化工藝簡單，成產(chǎn)成本低。為讓本發(fā)明的上述和其它目的、特征和優(yōu)點能更明顯易懂，下文特舉較佳實施例， 并配合附圖，作詳細說明如下。


圖1為串聯(lián)重組BNP結(jié)構(gòu)示意圖；圖2為BNP基因密碼子偏性分析圖，其中柱高值在50以下的部分為在大腸桿菌使 用頻率較低的密碼子；圖3為PE1Mh-BNP重組質(zhì)粒酶切鑒定電泳圖，其中M為Marker ；泳道1為 pET42a空未酶切；泳道2為ρΕΤ4Μ空雙酶切；泳道3為ρΕΤ4Μ-ΒΝΡ質(zhì)粒未酶切；泳道4為 pET42a-BNP質(zhì)粒雙酶切；圖4pET42a-BNP重組質(zhì)粒誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE電泳圖，其中M為Marker ；泳道1 為PEiT^a空誘導(dǎo)；泳道2為PEiT^a-BNP誘導(dǎo)；泳道3為pEI^h-BNP經(jīng)GSiTrap F. F.初純 化流穿蛋白；泳道4為pET4h-BNP經(jīng)GSTrap F. F.初純化洗脫蛋白；圖5為PE1Mh-BNP經(jīng)GS1Trap F. F.初純化產(chǎn)物進行EK酶切割后電泳鑒定結(jié)果， 其中M為Marker ；泳道1為上樣流穿峰蛋白；泳道2為切割流穿峰蛋白；泳道3為洗脫峰 蛋白。
具體實施例方式材料和來源菌種、質(zhì)粒、所用菌株E. coli BL21 (DE3)、DH5 α為本實驗室保存；pGEM-T 購自 promega 公司；pET32a (+)及 pET42a (+)購自 Novagen 公司。主要試劑Sal I、BamH I 購自 ToYoBo 公司；pfu DNA聚合酶、T4DNA連接酶購自promega公司；DL2000 DNA Marker，DNA膠回收試劑盒及質(zhì)粒抽提試劑盒購自Tiangen生物科技 有限公司；
BNP檢測試劑盒購自Roche公司；蛋白質(zhì)BCA法定量檢測試劑購自PIERCE公司；蛋白質(zhì)Marker為中科院生物制品研究所產(chǎn)品；
純化所用層析柱及填料購自Amersham公司；腸激酶(EK酶)為本室自制(帶HIS-Tag)，以質(zhì)量比1 1000 (EK酶目的融合 蛋白)，將二者混合于含ImM CaCl2的50mM pH 9. 0的Tris-HCl。全基因合成由hvitrogen公司完成；其它試劑均為中國產(chǎn)化學(xué)分析純。實施例一重組BNP基因的克隆根據(jù)GENEBANK提供的BNP基因序列(NM_002521. 2)得到BNP編碼序列為BNP基 因中編碼第77-108個氨基酸的共99個堿基(SEQ ID NO :3)。將此序列遞交于Graphical codon usage analyzer (http://guca. schoedl. del)分析發(fā)現(xiàn) i亥基因中第 2、3、13、14、 30,31位氨基酸編碼的密碼子在E. coli BL21中使用的頻率偏低(參照圖2的BNP基因 密碼子偏性分析圖，其中柱高值為50以下的部分為在大腸桿菌使用頻率偏低的密碼子)， 對其進行同義改造后獲得編碼序列SEQID NO 4,利用2段由5個甘氨酸組成的Linker 將3段經(jīng)改造的序列進行連接獲得重組BNP的編碼序列SEQ ID NO :2，將該編碼序列帶 上Ml I、BamH I酶切位點，其中BamH I酶切位點后加入GATGATGATGATAAG序列，其編碼 Asp-Asp-Asp-Asp-Lys序列為EK酶的識別位點后委托上海英駿生物工程有限公司進行合 成。實施例二 ρΕΤ4Μ-ΒΝΡ重組質(zhì)粒的構(gòu)建將PEI1^a載體和合成全基因經(jīng)BamH I/Sal I雙酶切消化4小時后用T4DNA連接 酶4°C過夜連接，取一無菌離心管，加入已制備好的感受態(tài)DH5 α菌200 μ 1，冰浴，吸取1 μ 1 連接產(chǎn)物加入管中，轉(zhuǎn)化DH5 α菌，輕拍管壁混勻，冰浴30分鐘，42°C水浴90秒，取出離心 管再冰浴2分鐘，加入800 μ 1室溫的2 X YT培養(yǎng)液混勻，37°C搖床220rpm振蕩培養(yǎng)1小時， 分別將50 μ 1,200 μ 1及剩下的全部轉(zhuǎn)化菌液涂于3個含卡那霉素抗性的2ΧΥΤ培養(yǎng)板上， 37°C恒溫培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)，用堿裂解法提取 質(zhì)粒，取質(zhì)粒用BamHI Sal I雙酶切4小時，酶切反應(yīng)體系為ρΕΤ4^ι-ΒΝΡ質(zhì)粒DNA 10 μ 1， BamHI 1 μ 1, Sal I 1 μ 1，IOX 緩沖液 K 2 μ 1，ddH20 6 μ 1，并取酶切產(chǎn)物 10 μ 1 行 1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定可見與設(shè)計值318bp —致的片斷(圖3)。實施例三BNP重組蛋白的誘導(dǎo)表達及鑒定1 轉(zhuǎn)化 BL21 菌取重組pET4h-BNP質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)菌，涂布于含卡那霉素抗性的LB固體培 養(yǎng)基，37 °C培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)，次日挑取白色菌落接種于LB培養(yǎng)基擴大培養(yǎng)。2BNP重組蛋白的誘導(dǎo)表達將轉(zhuǎn)化pET4h-BNP的細菌擴大培養(yǎng)，測細菌OD值達0. 6-0. 8時加入終濃度為 lmmol/L的IPTG誘導(dǎo)，按時間點2、4、6、8、10、12小時收集誘導(dǎo)的細菌。結(jié)果表明，IPTG誘 導(dǎo)的細菌出現(xiàn)分子量約為40kD的特異性蛋白條帶，與預(yù)期pET4h/BNP的分子量值相符，約 占細菌總蛋白的30%。再將IPTG誘導(dǎo)6小時的BL21重組菌用裂菌液破菌，離心后分別取 上清和沉淀電泳，未誘導(dǎo)的菌液和誘導(dǎo)6小時的菌液分別做陰性和陽性對照，結(jié)果在上清 中與陽性對照重組蛋白條帶相對應(yīng)的位置發(fā)現(xiàn)特異蛋白條帶，而沉淀無此蛋白條帶，證實 重組融合蛋白為可溶性表達(圖4)。實施例四BNP重組蛋白的純化
轉(zhuǎn)化ρΕΤ4Μ-ΒΝΡ重組質(zhì)粒的菌經(jīng)1. Ommol/L的IPTG誘導(dǎo)表達后使用GSTrapF. F.初純化，使用 GSTrap F. F.的結(jié)合緩沖液 O0mmol/L sodium phosphate,0. 15MNaCl, pH7. 3)重懸后冰上超聲破菌，4°C高速離心留上清經(jīng)過濾后用Amersham的AKTAprime上柱， 平衡后用洗脫液(50mmol/L Tris-HCl，lOmmol/L還原型谷胱苷肽，pH8. 0)洗脫，收集洗脫 蛋白(圖4)。將含目的蛋白的洗脫峰用His-結(jié)合緩沖液QOmmol/L sodium phosphate, 0. 5M NaCl，pH7. 4)按1 : 9的體積比稀釋后上HisTrap HP再次純化，His-結(jié)合緩沖液平衡 后用 His-洗脫緩沖液 QOmmol/Lsodium phosphate, 0. 5M NaCl,0. 5M 咪唑 PH7. 4)先 10% B洗脫去除非特異性結(jié)合的雜蛋白，平衡后用100% B將目的蛋白洗下。將獲得的純化重組 蛋白用HiTrapDesalting置換緩沖體系為EK切割緩沖液(50mmol/L Tris-HCl，pH8. 0)，按 EK酶與蛋白1 1000的質(zhì)量比加入EK酶，4°C低速搖床(60r/分鐘)切割12小時左右。 切割后用His-結(jié)合緩沖液稀釋后HisTrap HP純化，分別收集穿透、10% B和100% B的蛋 白，17. 5% SDS-PAGE電泳進行鑒定。PE1M^i-BNP表達的融合蛋白是以GST-BNP形式存在，經(jīng)EK酶切后得到106個氨基 酸的目的蛋白，其BNP氨基酸序列與天然完全相同。GST-BNP經(jīng)HPLC檢測純度為92.1%， 每升誘導(dǎo)菌獲得32. 4mg融合蛋白，經(jīng)切割后可以獲得5. 6mg左右的重組串聯(lián)BNP(圖5)。實施例五BNP重組蛋白的濃度、純度鑒定1 Lowry法(Folin酚法)測定BNP-83蛋白質(zhì)含量表1:制備標準曲線單位(ml)—W標準管 空白管 1標準管 2標準管 3標準管 4標準管 5標準蛋白液 蒸餾水0 0.2 1.0 0.80.4 0.60.6 0.40.8 0.21.0 0試劑甲5.0(室溫放置10分鐘)試劑乙_0.5(迅速混勻，反應(yīng)30分鐘)在650nm波長下，以空白管為對照調(diào)零，分別測定各管的吸光度，以蛋白濃度為橫 坐標，吸光度為縱坐標，只作標準曲線。將待測蛋白稀釋后，紫外分光光度計測定A26tl值和，A28tl值。根據(jù)公式，蛋白濃度C =(1.45ΧΑ28(Γ0.75ΧΑ26(Ι)Χ稀釋倍數(shù)，計算出待測蛋白的粗略濃度，然后將蛋白樣品用蒸 餾水稀釋至25-250 μ g范圍，按照上表的操作程序反應(yīng)，測定出650nm吸光度值，然后在標 準曲線上查出相應(yīng)的濃度，在乘以稀釋倍數(shù)計為待測蛋白的濃度，多管計算平均值，測得濃 度為 1. 362g/L。2純化產(chǎn)物用高效液相色譜法(HPLC)進行純度測定。重組串聯(lián)BNP經(jīng)HPLC檢測純度為98. 6%，每升誘導(dǎo)菌獲得32. ^ig該融合蛋白，經(jīng)切割后可以獲得5. 6mg左右的重組串聯(lián)BNP。實施例六重組串聯(lián)BNP特異免疫反應(yīng)性鑒定采用Roche公司BNP檢測試劑盒測定其特異免疫反應(yīng)性稀釋成合適的濃度后，將 1000倍稀釋后的蛋白1 μ 1加入到299 μ 1的人血清中，分別測定人血清和加了重組蛋白的 人血清中BNP含量。經(jīng)Roche電化學(xué)發(fā)光免疫測定試劑測定其特異免疫反應(yīng)性，結(jié)果如下(表幻。制 備的BNP重組蛋白具有較強的特異免疫反應(yīng)活性，表2 電化學(xué)發(fā)光免疫測定試劑測定重組BNP特異免疫反應(yīng)性(濃度單位pg/ml)
權(quán)利要求
1.一種BNP重組蛋白，其特征在于具有選自于下列a)或b)的氨基酸序列a)SEQ ID NO 1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后仍具有所述BNP重組蛋白活性的氨 基酸序列。
2.一種編碼權(quán)利要求1的BNP重組蛋白的核苷酸序列，其特征在于具有選自下列c)、 d)或e)的核苷酸序列c)SEQ ID NO 2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQID NO 2但編碼的氨基酸序列與SEQ ID NO :2所編碼的氨基酸序列相 同的核苷酸序列；e)按照堿基互補配對原則所有堿基能與上述c)或d)中的序列雜交，并且編碼具有所 述BNP重組蛋白活性的核苷酸序列。
3.—種權(quán)利要求1的BNP重組蛋白的制備方法，其特征在于包含以下步驟1)根據(jù)GENEBANK中提供的BNP編碼序列，獲得BNP的編碼序列SEQIDNO :3，將編碼序 列SEQ ID NO :3同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子獲得編碼序列SEQ ID NO :4，利用2段 由5個甘氨酸組成的Linker將3段經(jīng)改造的序列進行連接獲得重組BNP的編碼序列SEQ ID NO 2,以全基因合成的方式獲得重組BNP基因；2)BNP基因與載體連接，構(gòu)建BNP重組質(zhì)粒，獲得BNP重組質(zhì)粒；3)BNP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進行BNP重組蛋白的表達，獲得BNP重組蛋白；4)BNP重組蛋白的可溶性鑒定；5)BNP重組蛋白采用親和層析純化和脫鹽柱處理；6)BNP重組蛋白的濃度、純度鑒定；7)BNP重組蛋白的活性鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的BNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟1)包括將編碼 序列SEQ ID N0:3中第2、3、13、14、30、31位氨基酸同義置換為大腸桿菌偏愛的密碼子，根 據(jù)改造后的基因序列進行全基因合成。
5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的BNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟幻中使用的載體 為 pET42a。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的BNP重組蛋白的制備方法，其特征在于采用的親和層析純化 介質(zhì)為快流速GST標簽與快流速組氨酸標簽。
7.根據(jù)權(quán)利要求3、5、6所述的BNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟幻包括以下 步驟①將含目的BNP重組蛋白的破菌上清用快流速GST標簽親和層析柱初純化，采用連續(xù) 洗脫并收集目的BNP重組蛋白蛋白峰；②初純化的BNP重組蛋白用快流速組氨酸標簽親和層析柱再次純化，洗脫采用40mM和 500mM咪唑階段洗脫收集后者；③用脫鹽柱脫鹽和去除咪唑，流動相緩沖為50mMTris-HCl, pH 8. 0 ；④脫鹽后BNP重組蛋白內(nèi)加入帶有His標簽的重組EK酶，重組EK酶與BNP重組蛋白 量比為1 1000，置于4°C低速搖床24-48小時；⑤再次用快流速組氨酸標簽親和層析柱純化及去除重組EK酶，洗脫采用40mM和500mM咪唑階段洗脫，40mM洗下蛋白即為所需BNP重組蛋白。
8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的BNP重組蛋白的制備方法，其特征在于步驟6)中采用Lowry 法測定BNP重組蛋白濃度或高效液相色譜法測定BNP重組蛋白純度。
9.權(quán)利要求1所述的BNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的BNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用，其特征在于所述的BNP 重組蛋白用作BNP免疫診斷試劑標準品。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的BNP重組蛋白在免疫診斷中的應(yīng)用，其特征在于所述的BNP 重組蛋白用于制備BNP檢測試劑盒。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種BNP重組蛋白，其具有選自于下列a)或b)的氨基酸序列a)SEQ ID NO1所示的氨基酸序列；b)上述a)中缺失、替換或插入一個或多個氨基酸后仍具有所述BNP重組蛋白活性的氨基酸序列；本發(fā)明還涉及編碼上述BNP重組蛋白的核苷酸序列及上述BNP重組蛋白的制備方法。上述的BNP重組蛋白具有與天然BNP蛋白相同的免疫原性，而且純度高，有更好的穩(wěn)定性，可代替天然BNP多肽，用作BNP免疫診斷試劑標準品，并為下一步研究開發(fā)BNP檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ)。
文檔編號C12P21/02GK102040660SQ20091019113
公開日2011年5月4日 申請日期2009年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2009年10月16日
發(fā)明者姚靜, 張憲, 易維京, 李鵬, 石延賓, 胡川閩, 黃洪濤 申請人:重慶紫禾醫(yī)藥技術(shù)開發(fā)有限公司