專利名稱：棘孢木霉及在合成(r)-[3,5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物催化技術(shù)領(lǐng)域，涉及一株新的菌種——棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，及其在微生物催化不對(duì)稱合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
含芳香基的手性醇是多種手性藥物合成的關(guān)鍵手性中間體。阿瑞吡坦(Aprepitant)，商品名Emend

，化學(xué)名稱5-[[(2R，3S)-2-[(1R)-1-[3，5-二(三氟甲基)苯基]乙氧基]-3-(4-氟苯基)-4-嗎啉基-]甲基]-1，2-二氫-3H-1，2，4-三氮唑-3-酮基。2003年美國(guó)食品和藥物管理局(FDA)批準(zhǔn)阿瑞吡坦用于高度致吐化療方案所致惡心、嘔吐的藥物，它是一個(gè)全新機(jī)制的鎮(zhèn)吐藥物-NK-1受體拮抗劑。NK-1受體拮抗劑對(duì)各種致吐刺激具有廣泛的鎮(zhèn)吐作用，且在遲發(fā)性嘔吐中作用突出。阿瑞吡坦是目前唯一應(yīng)用于臨床的NK-1受體拮抗劑。此外，阿瑞吡坦還具有治療抑郁及其他精神疾病的作用。阿瑞吡坦與5-HT3受體拮抗劑、地塞米松合用被列為高致吐化療和延遲性嘔吐的標(biāo)準(zhǔn)藥物治療方案。目前，阿瑞吡坦被認(rèn)為是效果最好的化療后止吐藥之一。(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇是阿瑞吡坦合成的關(guān)鍵手性中間體，獲得對(duì)映體純的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇是合成阿瑞吡坦的關(guān)鍵步驟之一。
采用傳統(tǒng)的化學(xué)法制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇，需要使用價(jià)格昂貴的金屬催化劑，如銠、釕等，而且會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染。利用生物法制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇具有反應(yīng)條件溫和、立體選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。
目前，文獻(xiàn)報(bào)道的生物法催化合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇主要有以下幾種 法國(guó)羅地亞有限公司的Gelo-Puji等(Microbial and homogenousasymmetric catalysis in the reduction of 1-[3，5-bis(trifluoromethyl)phenyl]ethanone[J].TetrahedronAsymmetry，2006，172000-2005)報(bào)道了采用開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)和黑曲霉(Aspergillusniger)可還原[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮得到(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇，其中以開(kāi)菲爾乳桿菌(Lactobacillus kefir)轉(zhuǎn)化[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮時(shí)，底物初始濃度為5mmol/L，反應(yīng)16小時(shí)的產(chǎn)率為100％，ee值大于99％；當(dāng)?shù)孜餄舛忍岣叩?0mmol/L，反應(yīng)16小時(shí)后產(chǎn)率僅為13％；底物濃度增至200mmol/L時(shí)，反應(yīng)16小時(shí)的產(chǎn)率為2％，延長(zhǎng)反應(yīng)時(shí)間到96小時(shí)后，產(chǎn)率為31％。因該菌種只在底物濃度偏低時(shí)才能獲得較高的產(chǎn)率，不適合工業(yè)化應(yīng)用。
印度Vankawala 等(Efficient Synthesis of(1R)-[3，5-Bis(trifluoromethyl)phenyl]Ethanol，a Key Intermediate forAprepitant，an NK-1 Receptor Antagonist[J].Synthetic Communications，2007，373439-3446)報(bào)道了以外消旋的[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇為底物，乙烯醋酸酯作為?；荏w，通過(guò)南極假絲酵母脂肪酶(Candidaantarctica lipase-B，CAL-B)催化(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇生成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酸乙酯，而外消旋體中的S-型醇不發(fā)生反應(yīng)，繼而再用鹽酸水解(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酸乙酯可得到(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇，產(chǎn)率為84％，ee值大于99％，反應(yīng)式如下

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一株新的菌種——棘孢木霉(Trichodermaasperellum)ZJPH0810，及其在微生物催化不對(duì)稱合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
本發(fā)明采用的技術(shù)方案是 棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年12月16日，保藏編號(hào)CCTCC NOM 209307。
菌種來(lái)源棘孢木霉ZJPH0810是從采自杭州浙江工業(yè)大學(xué)校園(朝暉校區(qū))的土樣中分離篩選獲得。經(jīng)過(guò)如下流程的篩選獲得目的菌株。
土樣采集→平板培養(yǎng)→菌種分離→斜面培養(yǎng)→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)→氣相色譜檢測(cè)產(chǎn)物→獲得目的菌株 該新菌株的特征如下 菌落形態(tài)在PDA平板上菌落初呈白色絨狀，致密，圓形，向四周擴(kuò)展，后期出現(xiàn)輪狀的菌絲密實(shí)產(chǎn)孢區(qū)，顏色為綠色至深綠色，菌落周圍有白色菌絲的生長(zhǎng)帶，最后整個(gè)菌落全部變成綠色。
細(xì)胞形態(tài)分生孢子梗有隔膜，垂直對(duì)生分枝，頂枝尖端細(xì)削，微彎，尖端生分生孢子團(tuán)，含孢子4～12個(gè)；分生孢子無(wú)色，球形至卵形，2.5～4.5×2～4μm。
生理生化特征見(jiàn)表1所示 表1棘孢木霉ZJPH0810生理生化特征(表中-表示陰性；+表示陽(yáng)性) 菌種的ITS序列特性利用PCR擴(kuò)增真菌核糖體ITS(InternalTranscribedSpacer)基因區(qū)段可快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便的鑒定真菌。采用通用引物ITS1和ITS4，對(duì)ZJPH0810菌株rDNA的ITS區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生一個(gè)大小為602bp的DNA片段，對(duì)上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了序列測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，所述棘孢木霉ZJPH0810菌株的真菌核糖體ITS(InternalTranscribed Spacer)基因序列如下 TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。
該序列已提交GenBank(GenBank登錄號(hào)為No.GU318216)。
將ZJPH0810菌株的ITS序列在NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)進(jìn)行同源性比對(duì)(BLAST)，發(fā)現(xiàn)ZJPH0810菌株與木霉菌屬(Tsukamurella)的部分菌株序列同源性較高。菌株ZJPH0810與Trichoderma asperellum CPK2722(GenBank登錄號(hào)NO.FJ412053，序列同源性100％/596bp，基于ITS序列)、Trichodermaasperellum CPK2724(GenBank登錄號(hào)NO.FJ412054，序列同源性100％/591bp，基于ITS序列)、Trichoderma asperellum GJS 99-6(GenBank登錄號(hào)NO.DQ109538，序列同源性100％/576bp，基于ITS序列)的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系最近。
根據(jù)生理生化特征并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定，該菌種被鑒定為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)。
通過(guò)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，得到該菌株較佳的培養(yǎng)基組成為葡萄糖20.0～25.0g/L，蛋白胨20.0～27.5g/L，(NH4)2SO43.0～4.0g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO40.5～1.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.008～0.02g/L。
搖瓶培養(yǎng)條件為初始pH4.0～7.5，搖瓶裝液量20％～40％，培養(yǎng)溫度30℃、搖床轉(zhuǎn)速180～240r/min，接種量1％～13％，培養(yǎng)時(shí)間17～24小時(shí)。
本發(fā)明所涉及的ZJPH0810菌株通過(guò)以下的程序篩選得到 1)平板培養(yǎng)取1g土樣分別稀釋至10-3和10-4，取1μL接種以底物1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮為唯一碳源的平板培養(yǎng)基，30℃培養(yǎng)7d，之后挑取單菌落轉(zhuǎn)接斜面培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基配方如下1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮60mmol/L，(NH4)2SO42g/L，KH2PO42g/L，NaCl 1g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，瓊脂20g/L，以蒸餾水配制，pH 6.0。
2)斜面培養(yǎng)(PDA培養(yǎng)基)馬鈴薯200g/L，葡萄糖20g/L，瓊脂20g/L。30℃培養(yǎng)2～3d，4℃冰箱保存。
3)種子培養(yǎng)將培養(yǎng)成熟的斜面菌種接入裝有75mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200r/min培養(yǎng)16～24小時(shí)。種子培養(yǎng)基配方如下葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41g/L，MgSO41.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.008g/L，蒸餾水配制，pH 6.0。
4)發(fā)酵培養(yǎng)以5％～10％的接種量將種子液接種到裝有70mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200r/min培養(yǎng)18～48小時(shí)。發(fā)酵培養(yǎng)基配方如下葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41g/L，MgSO41.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.008g/L，自來(lái)水配制，pH 6.0。
5)生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)將離心得到的濕菌絲體懸浮于磷酸鹽緩沖液中，加入一定量的[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮底物和葡萄糖，置于搖床中30℃反應(yīng)一定時(shí)間。反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用乙酸乙酯萃取，離心得到的上清液采用氣相色譜分析。
6)分析檢測(cè) 反應(yīng)萃取液中的產(chǎn)物和殘留底物的濃度采用氣相色譜分析，用內(nèi)標(biāo)法定量。內(nèi)標(biāo)物是十二烷。取1mL萃取液加入2μL十二烷進(jìn)行分析。氣相色譜條件采用日本島津GC-2014氣相色譜儀，手性色譜柱CP-Chirasil-Dex CB(25m×0.25mm×0.25μm)，檢測(cè)器為FID，進(jìn)樣器溫度250℃，檢測(cè)器溫度250℃，柱溫80℃保留2min，以4～8℃/min升溫至180℃維持10min，載氣為氮?dú)?，流量?.5～2.0mL/min，分流比1∶15～1∶20，進(jìn)樣量為1μL，標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖見(jiàn)圖1，棘孢木霉ZJPH0810菌株生物還原反應(yīng)萃取液氣相色譜圖見(jiàn)圖2。
用相對(duì)校正因子分別計(jì)算出反應(yīng)液中的底物和產(chǎn)物的濃度。進(jìn)而求出反應(yīng)的產(chǎn)率(Yield)。計(jì)算式為 產(chǎn)率＝Ci/C0×100％ 式中C0、Ci分別為反應(yīng)起始底物的摩爾濃度和反應(yīng)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物的摩爾濃度。
產(chǎn)物的光學(xué)純度由對(duì)映體過(guò)量值(enantiomeric excess，ee)來(lái)表示。
定義式為 式中CR和CS分別為R型和S型3，5-雙三氟甲基苯乙醇的摩爾濃度。
本發(fā)明還涉及所述的棘孢木霉ZJPH0810在微生物催化不對(duì)稱合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
具體的，所述應(yīng)用為以棘孢木霉ZJPH0810培養(yǎng)獲得的濕菌絲體為酶源，以1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮為底物，30℃，于pH 4.0～8.0的轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)10～45小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇。所述分離純化可按常規(guī)方法進(jìn)行。
所述轉(zhuǎn)化體系中，底物[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮的初始濃度為10～150mmol/L緩沖液，棘孢木霉ZJPH0810的濕菌絲體投入量以菌絲體干重計(jì)為35～70g/L緩沖液。
為提高反應(yīng)效率，所述轉(zhuǎn)化體系中還可添加輔助底物，所述輔助底物為下列之一①葡萄糖、②蔗糖、③麥芽糖、④甘油、⑤甲醇、⑥乙醇、⑦正丁醇。輔助底物為葡萄糖、蔗糖或麥芽糖時(shí)，加入量為10～100g/L緩沖液，輔助底物為甲醇、乙醇或正丁醇時(shí)，加入體積為緩沖液體積的2～10％。優(yōu)選的，所述反應(yīng)在以乙醇為輔助底物時(shí)，所得產(chǎn)物的光學(xué)純度和產(chǎn)率最高。
優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH 5.7～8.0的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。或者，所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH4.0～6.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中進(jìn)行。
所述濕菌絲體由如下方法制備得到將棘孢木霉ZJPH0810接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30～35℃、180～240r/min振蕩培養(yǎng)17～24小時(shí)，發(fā)酵液離心、洗滌沉淀，收集得到濕菌絲體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖20.0～25.0g/L，蛋白胨20.0～27.5g/L，(NH4)2SO43.0～4.0g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO40.5～1.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.008～0.02g/L，pH 4.0～7.5。
具體的，所述方法如下 (1)將棘孢木霉ZJPH0810接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180～240r/min振蕩培養(yǎng)21小時(shí)，發(fā)酵液離心、洗滌沉淀，收集得到濕菌絲體； 所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41g/L，MgSO41.25g/L，ZnSO4·7H2O0.008g/L，pH 4.0～7.5； (2)取20mM pH5.7的磷酸緩沖液，加入步驟(1)所得濕菌絲體，濕菌絲體以干重濃度為50g/L，加入底物1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮至底物濃度為50mmol/L，并加入體積為緩沖液體積6.5％的乙醇作為輔助底物，30℃搖床振蕩反應(yīng)30小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液離心，取上清液，加入等體積的乙酸乙酯萃取兩次，得到(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇。
本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在提供了一株可用于生物不對(duì)稱還原1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的微生物新菌種，具有立體選擇性好，產(chǎn)物光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mmol/L時(shí)，產(chǎn)率最高可達(dá)53.4％。本發(fā)明從土樣中篩選獲得了與以往同類研究報(bào)道不同的微生物新菌種，并且可在相同的底物濃度下獲得高于文獻(xiàn)報(bào)道的(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇產(chǎn)物的產(chǎn)率，從而在研究微生物法制備阿瑞吡坦藥物關(guān)鍵手性中間體方面提供了有益的參考。


圖1為標(biāo)準(zhǔn)品氣相色譜圖； 圖2為棘孢木霉ZJPH0810菌株生物還原反應(yīng)萃取液氣相色譜圖。
具體實(shí)施例方式 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此 實(shí)施例1濕菌絲體的獲得 種子培養(yǎng)基配方如下葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41g/L，MgSO41.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.008g/L，蒸餾水配制，pH 6.0。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基，采用自來(lái)水配制； 將培養(yǎng)成熟的斜面菌種接入裝有70mL種子培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200r/min培養(yǎng)19小時(shí)，再以體積比5％的接種量將種子液轉(zhuǎn)接到裝有70mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250mL搖瓶中，30℃，200r/min培養(yǎng)21小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束后發(fā)酵液離心，并用磷酸緩沖液洗滌，收集濕菌絲體，備用。
實(shí)施例2產(chǎn)物濃度的檢測(cè)方法 生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)結(jié)束后，反應(yīng)液用等體積的乙酸乙酯(10mL)萃取，萃取液中的產(chǎn)物和未反應(yīng)底物的濃度采用氣相色譜分析，用內(nèi)標(biāo)法定量。內(nèi)標(biāo)物是十二烷。取1mL萃取液加入2μL十二烷進(jìn)行分析。氣相色譜具體操作條件為進(jìn)樣器溫度250℃，檢測(cè)器溫度250℃，柱溫80℃保留2min，以4℃/min升溫至180℃維持10min，載氣為氮?dú)猓髁繛?.5mL/min，分流比1∶20，進(jìn)樣量為1μL。根據(jù)氣相色譜得到的譜圖，用相對(duì)校正因子法計(jì)算出反應(yīng)液中產(chǎn)物的濃度，進(jìn)而計(jì)算出產(chǎn)率(Yield)和產(chǎn)物的ee值。
實(shí)施例3 將實(shí)施例1所得的濕菌絲體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為35g/L；加入10mmol/L的[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入50g/L的葡萄糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)10h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為4.2mmol/L，光學(xué)純度ee值94.7％，產(chǎn)率42.2％(棘孢木霉ZJPH0810菌株生物還原反應(yīng)萃取液氣相色譜圖見(jiàn)圖2)。
實(shí)施例4 將實(shí)施例1所得的濕菌絲體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入50g/L的麥芽糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)31h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為26.2mmol/L，光學(xué)純度ee值96.1％，產(chǎn)率524％。
實(shí)施例5 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入80mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入50g/L的蔗糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)45h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為42.7mmol/L，光學(xué)純度ee值96.6％，產(chǎn)率53.4％。
實(shí)施例6 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH6.0)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入50g/L的葡萄糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)36h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為21.0mmol/L，光學(xué)純度ee值96.2％，產(chǎn)率42.0％。
實(shí)施例7 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入50g/L的葡萄糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)32h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為29.1mmol/L，光學(xué)純度ee值96.2％，產(chǎn)率58.2％。
實(shí)施例8 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入50g/L的蔗糖作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)32h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為25.0mmol/L，光學(xué)純度ee值96.4％，產(chǎn)率50.0％。
實(shí)施例9 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的甲醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)32h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為23.2mmol/L，光學(xué)純度ee值97.5％，產(chǎn)率46.4％。
實(shí)施例10 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)34h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為28.7mmol/L，光學(xué)純度ee值92％，產(chǎn)率57.4％。
實(shí)施例11 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入100mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)30h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為42.9mmol/L，光學(xué)純度ee值96.2％，產(chǎn)率42.9％。
實(shí)施例12 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入150mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)35h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為45.9mmol/L，光學(xué)純度ee值97.4％，產(chǎn)率30.6％。
實(shí)施例13 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入80mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)34h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為34.3mmol/L，光學(xué)純度ee值95.2％，產(chǎn)率42.9％。
實(shí)施例14 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液(pH4.0)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)24h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為19.1mmol/L，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的光學(xué)純度ee值95.1％，產(chǎn)率38.2％。
實(shí)施例15 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液(pH6.0)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)30h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為20.1mmol/L，光學(xué)純度ee值95.1％，產(chǎn)率40.2％。
實(shí)施例16 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH8.0)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)45h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為15.9mmol/L，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的光學(xué)純度ee值96.2％，產(chǎn)率31.8％。
實(shí)施例17 將實(shí)施例1所得的濕菌體懸浮于10mL磷酸鹽緩沖液(pH5.7)中，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L；加入50mmol/L的1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮作為底物，再加入0.65mL(6.5％，v/v)的乙醇作為輔助底物，置于30℃，200r/min的搖床中反應(yīng)30h。采用實(shí)施例2的檢測(cè)方法，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的濃度為29.7mmol/L，產(chǎn)物(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇的光學(xué)純度ee值96.5％，產(chǎn)率59.4％。
SEQUENCE LISTING
<110>浙江工業(yè)大學(xué)
<120>棘孢木霉及在合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>602
<2l2>DNA
<213>Trichoderma asperellum
<400>1
tccgtaggtg aacctgcgga gggatcatta ccgagtttac aactcccaaa cccaatgtga 60
acgttaccaa actgttgcct cggcggggtc acgccccggg tgcgtcgcag ccccggaacc 120
aggcgcccgc cggaggaacc aaccaaactc tttctgtagt cccctcgcgg acgtatttct 180
tacagctctg agcaaaaatt caaaatgaat caaaactttc aacaacggat ctcttggttc 240
tggcatcgat gaagaacgca gcgaaatgcg ataagtaatg tgaattgcag aattcagtga 300
atcatcgaat ctttgaacgc acattgcgcc cgccagtatt ctggcgggca tgcctgtccg 360
agcgtcattt caaccctcga acccctccgg gggatcggcg ttggggatcg ggacccctca 420
cacgggtgcc ggccccgaaa tacagtggcg gtctcgccgc agcctctcct gcgcagtagt 480
ttgcacaact cgcaccggga gcgcggcgcg tccacgtccg taaaacaccc aactttctga 540
aatgttgacc tcggatcagg taggaatacc cgctgaactt aagcatatca ataagcggag 600
ga60權(quán)利要求
1.棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年12月16日，保藏編號(hào)CCTCC NOM 209307。
2.如權(quán)利要求1所述的棘孢木霉ZJPH0810，其特征在于所述棘孢木霉ZJPH0810菌株的真菌核糖體ITS(Internal Transcribed Spacer)基因序列如下TCCGTAGGTGAACCTGCGGAGGGATCATTACCGAGTTTACAACTCCCAAACCCAATGTGAACGTTACCAAACTGTTGCCTCGGCGGGGTCACGCCCCGGGTGCGTCGCAGCCCCGGAACCAGGCGCCCGCCGGAGGAACCAACCAAACTCTTTCTGTAGTCCCCTCGCGGACGTATTTCTTACAGCTCTGAGCAAAAATTCAAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAACCCCTCCGGGGGATCGGCGTTGGGGATCGGGACCCCTCACACGGGTGCCGGCCCCGAAATACAGTGGCGGTCTCGCCGCAGCCTCTCCTGCGCAGTAGTTTGCACAACTCGCACCGGGAGCGCGGCGCGTCCACGTCCGTAAAACACCCAACTTTCTGAAATGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。
3.如權(quán)利要求1所述的棘孢木霉ZJPH0810在微生物催化不對(duì)稱合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用為以棘孢木霉ZJPH0810培養(yǎng)獲得的濕菌絲體為酶源，以1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮為底物，在30℃下，于pH 4.0～8.0的轉(zhuǎn)化體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)10～45小時(shí)，反應(yīng)液經(jīng)分離純化得到所述(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體系中，底物[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮的初始濃度為10～150mmol/L，棘孢木霉ZJPH0810的濕菌絲體投入量以菌絲體干重計(jì)為35～70g/L。
6.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化體系中還添加有輔助底物，所述輔助底物為下列之一①葡萄糖、②蔗糖、③麥芽糖、④甘油、⑤甲醇、⑥乙醇、⑦正丁醇，輔助底物為葡萄糖、蔗糖或麥芽糖時(shí)，加入量為10～100g/L緩沖液，輔助底物為甲醇、乙醇或正丁醇時(shí)，加入體積為緩沖液體積的2～10％。
7.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH 5.7～8.0的磷酸鹽緩沖液中進(jìn)行。
8.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述轉(zhuǎn)化反應(yīng)在pH4.0～6.0的磷酸二氫鈉-檸檬酸緩沖液中進(jìn)行。
9.如權(quán)利要求4或5所述的應(yīng)用，其特征在于所述濕菌絲體由如下方法制備得到將棘孢木霉ZJPH0810接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30～35℃、180～240r/min振蕩培養(yǎng)17～24小時(shí)，發(fā)酵液離心、洗滌沉淀，收集得到濕菌絲體；所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖20.0～25.0g/L，蛋白胨20.0～27.5g/L，(NH4)2SO43.0～4.0g/L，KH2PO41.0～2.0g/L，MgSO40.5～1.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.008～0.02g/L，pH 4.0～7.5。
10.如權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述方法如下
(1)將棘孢木霉ZJPH0810接種至發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃、180～240r/min振蕩培養(yǎng)21小時(shí)，發(fā)酵液離心、洗滌沉淀，收集得到濕菌絲體；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基終濃度組成如下葡萄糖25g/L，蛋白胨27.5g/L，(NH4)2SO43g/L，KH2PO41g/L，MgSO41.25g/L，ZnSO4·7H2O0.008g/L，pH 4.0～7.5；
(2)取20mM pH 5.7的磷酸緩沖液，加入步驟(1)所得濕菌絲體，濕菌絲體以干重計(jì)濃度為50g/L，加入底物1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮至底物濃度為50mmol/L，并加入體積為緩沖液體積6.5％的乙醇作為輔助底物，30℃搖床振蕩反應(yīng)30小時(shí)，反應(yīng)結(jié)束后將反應(yīng)液離心，取上清液，加入等體積的乙酸乙酯萃取兩次，得到(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇。
全文摘要
本發(fā)明提供了一株新的菌種——棘孢木霉ZJPH0810，及其在微生物催化不對(duì)稱合成(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇中的應(yīng)用。棘孢木霉(Trichoderma asperellum)ZJPH0810，保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址中國(guó)武漢武漢大學(xué)，430072，保藏日期2009年12月16日，保藏編號(hào)CCTCC NoM209307。本發(fā)明菌株用于生物不對(duì)稱還原1-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙酮制備(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇，具有立體選擇性好，光學(xué)純度高等優(yōu)點(diǎn)。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?0mmol/L時(shí)，產(chǎn)率最高可達(dá)53.4％。本發(fā)明篩選獲得了與以往同類研究報(bào)道不同的微生物新菌種，并且可在相同的底物濃度下獲得高于文獻(xiàn)報(bào)道的(R)-[3，5-雙(三氟甲基)苯基]乙醇產(chǎn)物的產(chǎn)率，從而在研究微生物法制備阿瑞吡坦藥物關(guān)鍵手性中間體方面提供了有益的參考。
文檔編號(hào)C12N1/14GK101724568SQ20091015577
公開(kāi)日2010年6月9日 申請(qǐng)日期2009年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月25日
發(fā)明者王普, 何軍邀, 唐俊 申請(qǐng)人:浙江工業(yè)大學(xué)