專利名稱：一株棘孢木霉及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物防治植物病害領(lǐng)域。具體而言，本發(fā)明涉及一種能夠高效防治植物病害的棘孢木霉菌及其用途，以及采用該棘孢木霉菌制備的生物防治制劑。
背景技術(shù)：
木霉(Trichoderma spp.)屬于半知菌類的絲孢綱、叢梗孢目、叢梗孢科,是一類廣泛分布于土壤、空氣、枯枝落葉及各種發(fā)酵物上的真菌，從植物根圈、葉片及種子、球莖表面均可以分離到。木霉是自然界普遍存在并有豐富資源的拮抗微生物。木霉菌生長繁殖速度快，能夠迅速占領(lǐng)營養(yǎng)空間，可分泌產(chǎn)生抗生素抑制其他病原菌生長，還可以通過營養(yǎng)競爭、重寄生、細(xì)胞壁降解酶以及誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗性等作用機(jī)制，達(dá)到抑制病害的目的，是生防菌株中研究最為廣泛的菌株之一。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的木霉菌30多個種中的許多具有生防潛力，如哈茨木霉、綠木霉、康氏木霉、鉤木霉和長枝木霉等，對18個屬29種植物病原菌表現(xiàn)出拮抗活性。木霉對植物病原菌的生物防治機(jī)制是多樣而復(fù)雜的，常常是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果，不同的菌株生防機(jī)制的側(cè)重點不同，其生防作用效果與菌株類型、病原真菌的類型、作物類型和環(huán)境條件密切相關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種用于高效防治多種植物病害的新的木霉菌株——棘孢木霉WSTr03。本發(fā)明的棘孢木霉菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、作用譜廣、抗逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明所提供的菌株為棘孢木霉(Trichoderma asperellum) WS Tr03,是從山東省濰坊市濰北地區(qū)沿海灘涂地塊的土壤中分離獲得的，已于2013年4月22日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCCJia:北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學(xué)院微生物研究`所)，保藏號為CGMCC N0.7503。其具有以下生物學(xué)特性:在PDA培養(yǎng)基上，25 °C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑擴(kuò)展80mm，初期白色稀疏，后變?yōu)榛揖G色，絮狀。反面無色。菌絲具隔，分枝。分生孢子梗便形成松柏式的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，6-10X 3-4.5 μ m。分生孢子橢球形、單個、近無色，聚集時呈淡黃綠色，壁光滑或稍粗糙，4-5.5 X 3-4 μ m。本發(fā)明棘孢木霉菌株WS Tr03的培養(yǎng)方法或繁殖方法包括:(I)普通培養(yǎng)保存采用PDA培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂12g，蒸餾水 IOOOmL ；(2)實驗室液體培養(yǎng)采用PDB培養(yǎng)基，配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水IOOOmL0(3)固體培養(yǎng)基配方:固料和無機(jī)鹽溶液，按質(zhì)量比1:1.8的比例配制。其中所述固料由質(zhì)量比為50:40:10的玉米芯、麩皮和稻殼組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包括3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。
( 4 )大量發(fā)酵培養(yǎng)配方:同(3 )中固體培養(yǎng)基配方。本發(fā)明還提供一種用于防治植物土傳病害的生物防治制劑，所述生物防治制劑包括所述的棘孢木霉菌株WS Tr03。并且，本發(fā)明還提供了一種用于防治植物土傳病害的生物防治方法，所述生物防治方法包括向具有土傳病害的植物施用上述棘孢木霉菌株WS Tr03或者上述生物防治制劑。本發(fā)明也提供了上述棘孢木霉菌株WS Tr03或者上述生物防治制劑在防治植物土傳病害中的用途。就上述生物防治制劑、生物防治方法以及用途而言，所述植物病害可以選自棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黃瓜炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病等一種或幾種。

本發(fā)明所述的生物防治制劑的制備方法，包括以下步驟:(I)制備棘孢木霉菌株WS Tr03的種子液；(2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，28_30°C下恒溫培養(yǎng)；(3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按質(zhì)量比1:15的比例混合，過濾，將濾液接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。其中，步驟(2 )中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，所述固料和無機(jī)鹽溶液的比例為質(zhì)量比1:1.8 ;所述固料由質(zhì)量比為50:40:10的玉米芯、麩皮和稻殼組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包含3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水。并且，步驟(3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同固體培養(yǎng)基在本發(fā)明的一個具體實施方案中，所述制備方法包括以下步驟: (I)將棘孢木霉菌株WS Tr03的孢子移植到PDB液體培養(yǎng)基中，28_30°C搖床振蕩培養(yǎng)3 5天得到種子液；(2)將步驟(I)制備的種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28_30°C下振蕩培養(yǎng)3 5天；(3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按質(zhì)量比1:15的比例混合，過濾，將濾液按體積比1:6的比例接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中發(fā)酵培養(yǎng)8 9天。其中，步驟(I)中的所述TOB液體培養(yǎng)基同上；步驟(2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，所述固料和無機(jī)鹽溶液的比例為質(zhì)量比1:1.8 ;所述固料由質(zhì)量比為50:40:10的玉米芯、麩皮和稻殼組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包含3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水；步驟(3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同步驟(2)的固體培養(yǎng)基。實驗表明，本發(fā)明的棘孢木霉菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、作用譜廣、抗逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。由該棘孢木霉制備的生物防治制劑，不僅能夠高效的防治植物土傳病害，還能有效提高作物產(chǎn)量，是一種極具應(yīng)用前景的生物防治制劑。該微生物制劑可以作為生物農(nóng)藥或生物肥料，防治多種土傳植物病害，包括棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黃瓜炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病等一種或幾種。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是示例性的，并不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。實施例11、棘孢木霉菌株WS Tr03的分離與純化本發(fā)明的棘孢木霉菌株WS Tr03的分離方法為:(I)本發(fā)明的棘孢木霉菌株WS Tr03是從是從土壤中采用稀釋平板法和平板劃線法分離獲得的，分離方法為:⑴分離:土樣的采集，山東省濰坊市濰北地區(qū)沿海灘涂土壤(表層以下10 15cm)。采集樣品均保存在無菌瓶中，標(biāo)明采集地點、時間和采集人。稱取Ig 土樣于IOOmL無菌水中，置于30°C搖床中150rpm震蕩lOmin，然后置于60°C水浴鍋中孵育30min，取100yL10_2、10_3、10_4稀釋液涂布于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上，每個梯度涂布三個平行，在30°C培養(yǎng)3天后挑取孟加拉紅培養(yǎng)基上的不同形態(tài)的微生物菌落于孟加拉紅培養(yǎng)基平板上進(jìn)行劃線，定時觀察菌落生長情況。然后采用平板劃線法，純化木霉菌株，分別編號保存。⑵棉花枯萎病高效拮抗木霉菌株的篩選①初篩:采用對峙培養(yǎng)法，制備PDA平板，用打孔器在木霉菌、棉花枯萎病菌邊緣打取直徑為5_的菌餅，分別移植在平板相對的兩側(cè)中央，25°C恒溫培養(yǎng)，逐日觀察木霉菌對病原菌的抑制作用。

②復(fù)篩:將篩選到的具有高效拮抗活性的木霉菌株進(jìn)行復(fù)篩，主要是經(jīng)過耐溫性、耐酸堿性、耐藥性試驗，篩選到耐性較好的木霉菌株，進(jìn)行盆栽防治試驗和田間試驗。本發(fā)明人通過大量篩選工作得到一株能夠高效防治多種植物病害的棘孢木霉菌(T.asperellum)菌株WS Tr03。實驗證明，該棘孢木霉原粉在防治棉花枯萎病都顯示出非常高效的防治效果，使得農(nóng)作物顯著增產(chǎn)。因而，本發(fā)明的棘孢木霉是具有廣泛應(yīng)用前景的棘抱木霉新囷株，可以用于制備防治多種植物病咅的生物防治制劑。2、菌株鑒定(I)微生物學(xué)特性:在PDA培養(yǎng)基上，25 °C黑暗條件下培養(yǎng)7天，菌落直徑擴(kuò)展80mm，初期白色稀疏，后變?yōu)榛揖G色，絮狀。反面無色。菌絲具隔，分枝。分生孢子梗便形成松柏式的分枝輪廓，分枝末端的小梗束生、對生、互生或單生，瓶形，6-10X 3-4.5 μ m。分生孢子橢球形、單個、近無色，聚集時呈淡黃綠色，壁光滑或稍粗糙，4-5.5 X 3-4 μ m。(2)分子生物學(xué)特性該菌株的rRNA基因序列測定結(jié)果(ITS-5.8S-1TS2區(qū))如下(SEQ-1):CATCGGGCTTCTACTGATCCGAGGTCACATTTCAGAAAGTTGGGTGTTTTACGGACGT GGACGCGCCGCGCTCCGGTGCGGAGTTGCGCAAACTACTGCGCAGGAGAGGCTGCG GCGAGACCGCCACTGTATTTCGGGGCCGGCACCCGTGTGAGGGGTCCCGATCCCCAA CGCCGATCCCCCGGAGGGGTTCGAGGGTTGAAATGACGCTCGGACAGGCATGCCCGC CAGAATACTGGCGGGCGGAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCA ATTCACATTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCC GTTGTTGAAAGTTTTGATTCATTTTGAATTTTTGCTCAGAGCTGTAAGAAATACGTCCG CGAGGGGATACAGAAAGAGTTTGGTTGGTTCCTCCGGCGGGCGCCTGGTTCCGGGGC TGCGACGCACCCGGGGCGTGACCCCGCCGAGGCAACAGTTTGGTAACGTTCACATT GGGTTTGGGAGTTGTAAACTCGGTAATGATCCCTCCGCTGGTTCACCAACGGAGACCT TGTTACGACTTTTTACTTCCC其中，PDA培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g(去皮)，葡萄糖20g，瓊脂14g，蒸餾水1000mL。孟加拉紅培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，l%孟加拉紅溶液3.3mL，丙酸鈉3.5g，鏈霉素 0.03g，水 IOOOmL, pH 自然。實施例21、棘孢木霉菌株WS Tr03發(fā)酵過程PDB培養(yǎng)基配方:馬鈴薯200g (去皮)，葡萄糖20g，蒸餾水lOOOmL。大量固體發(fā)酵培養(yǎng)基配方(質(zhì)量百分含量):固料:玉米芯50%，麩皮40%，稻殼10%無機(jī)鹽溶液:磷酸二氫鉀3.5%，硫酸鎂0.04%,硫酸銨4%，剩余為水。固液比為1:1.8 (質(zhì)量比)棘孢木霉菌株WS Tr03大量固體發(fā)酵過程:①菌種種子液培養(yǎng):將棘孢木霉菌株WS Tr03從試管斜面中挑取少量孢子，移至PDB液體培養(yǎng)基中，28°C搖床振蕩培養(yǎng)3 5天，此為種子液。②固體生產(chǎn)菌種的培養(yǎng):將種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基(500mL三角瓶)中，28°C恒溫培養(yǎng)3 5天，中間多次振蕩。
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③大量固體發(fā)酵:將②中固體培養(yǎng)的培養(yǎng)物用無菌水按1:15比例稀釋，并用滅菌紗布過濾，出去粗渣，即為生產(chǎn)菌液，將過濾后的菌液按體積比1:6接種于大量發(fā)酵培養(yǎng)基。將接種的原料置于發(fā)酵室(28°C和相對濕度85%以上)中發(fā)酵培養(yǎng)8 9天，即可得到木霉菌原粉?；钚跃_(dá)到25億/克。實施例3本實施例提供了棘孢木霉WS Tr03可濕性粉劑對棉花枯萎病防治效果的相關(guān)實驗。I)供試藥劑棘孢木霉WS Tr03可濕性粉劑；50%多菌靈可濕性粉劑(市售)。棘孢木霉WS Tr03可濕性粉劑的配方(重量比):實施例2的原菌粉20%，CMC0.5%，拉開粉3%，十二烷基磺酸鈉8%，葡萄糖2%，白炭黑1%，其余為凹凸棒土。該可濕性粉劑的菌活為5億/克。2)供試作物與防治對象:供試作物為棉花；品種為中棉I號防治對象:枯萎病。3)試驗地情況、試驗設(shè)計及安排試驗地設(shè)在山東省東營市棉花地，土壤為砂土地，往年枯萎病發(fā)生較重。試驗地栽培條件均勻一致。本試驗設(shè)棘孢木霉菌WS TR03可濕性粉劑藥種比為1:150、1:300、1:450 ;50%多菌靈可濕性粉劑1:450;清水作對照共5個處理，重復(fù)4次。各小區(qū)隨機(jī)區(qū)組排列。施藥采用濕拌種,每個小區(qū)安排營養(yǎng)缽300個，每缽點2粒棉籽。
4)試驗調(diào)查及計算方法(I)氣象條件施藥當(dāng)日晴，微風(fēng)，最高氣溫為30°C，最低氣溫為26°C，相對濕度為65%(2)藥效及安全性調(diào)查藥效調(diào)查:調(diào)查總共I次，在出苗30天進(jìn)行，記載300個營養(yǎng)缽種棉花枯萎病發(fā)病數(shù)，計算病株率及防治效果。(3)藥效計算方法藥效按式(I)、(2)計算:
權(quán)利要求
1.棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株WS Tr03,所述菌株的保藏編號為CGMCCN0.7503。
2.權(quán)利要求1所述的棘孢木霉(Trichodermaasperellum)菌株WS Tr03在防治植物土傳病害中的用途。
3.如權(quán)利要求2所述的用途，其特征是，所述植物土傳病害為棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黃瓜炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病中的一種或幾種。
4.一種生物防治制劑,包括權(quán)利要求1所述的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株 WS Tr03o
5.一種制備權(quán)利要求4所述的生物防治制劑的方法，其特征是，包括以下步驟: Cl)制備棘孢木霉菌株WS Tr03的種子液； (2)將步驟(I)制備的種子液接種到固體培養(yǎng)基中，28-30°C下恒溫培養(yǎng)； (3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入無菌水混合，過濾，將濾液接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，在室溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)。
6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征是， (1)將棘孢木霉菌株WSTr03的孢子移植到PDB液體培養(yǎng)基中，28_30°C搖床振蕩培養(yǎng)3 5天得到種子液； (2)將步驟(I)制備的種子液按質(zhì)量比10%的比例接種到固體培養(yǎng)基中，28-30°C下振蕩培養(yǎng)3 5天；` (3)將步驟(2)培養(yǎng)的培養(yǎng)物加入其質(zhì)量15倍的無菌水混合，過濾，將濾液按體積比I:6的比例接種至大量發(fā)酵培養(yǎng)基，恒溫28-30°C、相對濕度85%以上的發(fā)酵室中發(fā)酵培養(yǎng)8 9天； 所述步驟(I)中的PDB液體培養(yǎng)基為:馬鈴薯200g，葡萄糖20g，蒸餾水IOOOmL ； 所述步驟(2)中的固體培養(yǎng)基由固料和無機(jī)鹽溶液組成，所述固料和無機(jī)鹽溶液的比例為質(zhì)量比1:1.8 ;所述固料由質(zhì)量比為50:40:10的玉米芯、麩皮和稻殼組成；按質(zhì)量百分比計，所述無機(jī)鹽溶液包含3.5%磷酸二氫鉀，0.04%硫酸鎂，4%硫酸銨，剩余為水； 所述步驟(3)中的大量發(fā)酵培養(yǎng)基同步驟(2)中的固體培養(yǎng)基。
7.權(quán)利要求4所述的生物防治制劑在防治植物土傳病害中的用途。
8.如權(quán)利要求7所述的用途，其特征是，所述植物土傳病害為棉花枯萎病、板栗枝枯病、石榴干腐病、黃瓜炭疽病、蘋果炭疽病、葡萄炭疽病、葡萄白腐病、西瓜炭疽病、冬棗黑斑病中的一種或幾種。
9.一種植物土傳病害的生物防治方法，其特征是，向具有土傳病害的植物施用權(quán)利要求I的棘孢木霉(Trichoderma asperellum)菌株WS Tr03或者權(quán)利要求4的生物防治制劑。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株棘孢木霉及其應(yīng)用，屬于生物防治植物病害領(lǐng)域。該菌株為棘孢木霉(Trichoderma asperellum)WSTr03，保藏編號為CGMCC No.7503。本發(fā)明還公開了含有上述菌株的生物防治制劑及其制備方法。本發(fā)明的棘孢木霉菌株具有生長速度快、產(chǎn)孢量大、作用譜廣、抗逆性強(qiáng)，在植物根際能夠快速大量定殖等特點，因此具有良好的應(yīng)用前景。由該棘孢木霉制備的生物防治制劑，不僅能夠高效的防治植物土傳病害，還能有效提高作物產(chǎn)量，是一種極具應(yīng)用前景的生物防治制劑。該微生物制劑可以作為生物農(nóng)藥或生物肥料，防治多種土傳植物病害，包括棉花枯萎病等。
文檔編號C12N1/14GK103184162SQ20131014407
公開日2013年7月3日 申請日期2013年4月24日 優(yōu)先權(quán)日2013年4月24日
發(fā)明者王清海, 李鵬, 劉幸紅, 李泉涌, 李紅梅, 牛贍光 申請人:牛贍光, 李鵬