專(zhuān)利名稱(chēng)：來(lái)自人胚胎干細(xì)胞的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明一般涉及胚胎細(xì)胞和間充質(zhì)祖細(xì)胞的細(xì)胞生物領(lǐng)域。更具體的，本發(fā)明涉 及人多能干細(xì)胞形成成骨細(xì)胞和其它細(xì)胞類(lèi)型的定向分化，使用特殊培養(yǎng)條件和選擇技 術(shù)。
背景技術(shù)：
再生性藥物是生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)的重要新開(kāi)端。開(kāi)發(fā)了方法來(lái)產(chǎn)生特殊細(xì)胞的培養(yǎng)
物，這些細(xì)胞計(jì)劃用于促進(jìn)組織修復(fù)和治愈以前藥物治療不滿(mǎn)意的疾病。 產(chǎn)生興趣的領(lǐng)域是使用培養(yǎng)的細(xì)胞來(lái)提高或修復(fù)骨組織。有一些出版的報(bào)導(dǎo)關(guān)于
正在研制中的成骨細(xì)胞祖細(xì)胞和間充質(zhì)干細(xì)胞。 美國(guó)專(zhuān)利5， 691， 175、5， 681， 701和5， 693， 511(Mayo基金會(huì))描述了無(wú)限增殖 的正常人胎兒成骨細(xì)胞，它們表達(dá)猿病毒40大T抗原的溫度-敏感突變體。美國(guó)專(zhuān)利 5， 972， 703 (Michigan)報(bào)導(dǎo)了不是造血的骨前體細(xì)胞組成，它們可在暴露于骨生長(zhǎng)因子的 時(shí)候分化成成骨細(xì)胞，使鈣沉積到胞外基質(zhì)中。美國(guó)專(zhuān)利6，200，602(Du Puy矯形學(xué))報(bào)導(dǎo) 了來(lái)自造血和非造血細(xì)胞的軟骨或骨前體細(xì)胞的分離以及建議它們用于骨和軟骨再生。
國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 95/22611 (Michigan)報(bào)導(dǎo)了將核酸原位轉(zhuǎn)移到骨細(xì)胞用于
剌激骨祖細(xì)胞的方法。研究了 n型膠原和親骨基因用于動(dòng)物模型中促進(jìn)骨生長(zhǎng)、修復(fù)和再
生。國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 99/30724(Oregon)建議用成骨細(xì)胞祖細(xì)胞治療骨缺陷?？赊D(zhuǎn)化細(xì) 胞以表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白，如BMP-2 。骨干細(xì)胞的主題由J. E. Aubin綜述(J. Cell Biochem. Suppl. 30/31 :73， 1998)。干
和原始骨原細(xì)胞和相關(guān)間充質(zhì)前體有助于在骨更新和骨折治愈中置換成骨細(xì)胞。文章提出 假設(shè)，成熟成骨細(xì)胞表型與表達(dá)已知成骨細(xì)胞標(biāo)記亞型的成骨細(xì)胞亞群異源，提高多種平 行分化途徑和不同祖細(xì)胞庫(kù)的可能性。 Joyner等(Bone 21 :1,1997)報(bào)導(dǎo)用分化階段_特異單克隆抗體鑒定和富集人骨 原細(xì)胞。特定抗原的選擇是根據(jù)其與骨髓培養(yǎng)物的反應(yīng)性和成骨細(xì)胞附近祖細(xì)胞區(qū)域的 胎兒組織中免疫組織化學(xué)定位。在免疫淘選(immunopanning)中，抗體選擇間質(zhì)成纖維細(xì) 胞集落形成單位(CFU-F) 。 Thies等(Endocrinology 130 :1318， 1992)報(bào)導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋 白_2誘導(dǎo)間質(zhì)細(xì)胞系中成骨細(xì)胞分化，以劑量-依賴(lài)方式增加堿性磷酸酶活性而不影響細(xì)
Liechty等(Nature Med. 6 :1282,2000)報(bào)導(dǎo)了人間充質(zhì)干細(xì)胞(MSC)移植并i正 明羊子宮移植后的位置_特異分化。通過(guò)髂嵴吸氣從正常人供體獲得MSC群，在產(chǎn)生免疫 活性前移植到羊中。移植的細(xì)胞在多組織中持續(xù)13個(gè)月。文章報(bào)導(dǎo)它們經(jīng)歷位置-特異 分化成軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨髓間質(zhì)細(xì)胞和胸腺間質(zhì)。
美國(guó)專(zhuān)利5， 908， 784(Case Western Reserve)涉及獲得人MSCs，這是通過(guò)取骨 髓細(xì)胞、使它們生長(zhǎng)在有胎牛血清的BGJb培養(yǎng)基中并用單克隆抗體鑒定它們。體外誘導(dǎo) 軟骨細(xì)胞包括使壓緊的細(xì)胞沉淀接觸軟骨誘導(dǎo)劑。美國(guó)專(zhuān)利5，486，359(0sirls療法) 報(bào)道了分離可分化成骨、軟骨、肌肉或骨髓間質(zhì)的人間充質(zhì)干細(xì)胞。國(guó)際專(zhuān)利出版物WO 97/40137 (Osiris)提出了一個(gè)使用間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)再生和增加骨的系統(tǒng)。組合物包括 MSCs或結(jié)合陶瓷材料或可再吸收生物聚合物的新鮮骨髓細(xì)胞。 不清楚這些出版物中作為例子的任何細(xì)胞制備是否可以足夠量產(chǎn)生作為骨修復(fù)
治療組合物大量上市。 胚胎來(lái)源的未分化多能干細(xì)胞 不同醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域涉及不產(chǎn)生任何具體類(lèi)譜系的后代的干細(xì)胞。近來(lái)許多發(fā)現(xiàn) 提高了胚胎細(xì)胞系可成為再生性藥物中有用細(xì)胞和組織來(lái)源的期望值，藥物用于多種退化 化情況。胚胎干細(xì)胞描述為多能，因?yàn)檎J(rèn)為它們能分化成多種細(xì)胞類(lèi)型(R.A.Pedersen， Scientif. Am. 280(4) :68,1999)。 早期胚胎干細(xì)胞的工作用近交小鼠呂系作為模型(Robertson, Meth. CellBiol. 75 :173， 1997 ;Pedersen，R印rod. Fertil. Dev. 6 :543， 1994綜述)。然而，與小鼠 ES細(xì)胞相比，猴和人多能細(xì)胞被證明更脆弱得多且對(duì)相同培養(yǎng)條件不起反應(yīng)。影響它們?cè)?培養(yǎng)中的持續(xù)性和隨后分化的因素顯著不同。不過(guò)近來(lái)發(fā)現(xiàn)使靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物胚胎細(xì)胞活體外培養(yǎng)。 Thomson等(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :7844， 1995)第一個(gè)用恒河猴和絨猴 作為模型成功地從靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物中培養(yǎng)了胚胎干細(xì)胞。他們隨后從人胚泡中獲得人胚胎干 (hES)細(xì)胞系(Science 282 :114， 1998)，與小鼠胚胎成纖維細(xì)胞共培養(yǎng)以支持它們的維持 和生長(zhǎng)。Gearhart和同事從胎兒性腺組織中獲得人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞系(Shamblott等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13726， 1998)，也支持飼養(yǎng)細(xì)胞。hES和hEG細(xì)胞有多能干細(xì) 胞的長(zhǎng)久尋找的特性它們能體外進(jìn)行增殖而不分化，它們保持正常染色體組型，它們保持 分化產(chǎn)生多種成熟細(xì)胞類(lèi)型的能力。 Geron公司開(kāi)發(fā)了新的組織培養(yǎng)環(huán)境，使多能干細(xì)胞在本質(zhì)上沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán) 境中連續(xù)增殖。參見(jiàn)澳大利亞專(zhuān)利AU 729377和國(guó)際專(zhuān)利出版物W0 01/51616。提供了能 在沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境中培養(yǎng)干細(xì)胞的系統(tǒng)，其中可產(chǎn)生與調(diào)節(jié)人治療需要相符的細(xì)胞組 合物。 為在人類(lèi)健康和疾病控制中了解多能干細(xì)胞的潛力，現(xiàn)在必須發(fā)展新范例以推動(dòng) 這些細(xì)胞成治療上重要組織類(lèi)型的群體。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一個(gè)系統(tǒng)用于有效產(chǎn)生靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物細(xì)胞，它們從多能細(xì)胞分化成間充
4質(zhì)譜系的細(xì)胞。 發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是體外培養(yǎng)中的分離細(xì)胞或細(xì)胞群，通過(guò)分化靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多 能干(pPS)細(xì)胞獲得。細(xì)胞群可包括至少 10%、 30%或 60%不同類(lèi)型的間充質(zhì)細(xì) 胞，具有此公開(kāi)中其它地方所列性質(zhì)。例如，成骨細(xì)胞和它們的前體可表達(dá)骨鈣蛋白、1型膠 原和堿性磷酸酶。成熟成骨細(xì)胞可表達(dá)骨鈣蛋白，且能形成含鈣的胞外基質(zhì)。
這些細(xì)胞可從人胚胎干(hES)細(xì)胞系中獲得，因此與它們從中獲得的細(xì)胞系共享 相同基因組，帶有任何誘導(dǎo)的遺傳改變。在發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，間充質(zhì)細(xì)胞通過(guò)在培養(yǎng) 基中分化pPS細(xì)胞獲得，培養(yǎng)基含骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)、人TGF-P受體的配體或人維生 素D受體的配體。培養(yǎng)基可進(jìn)一步包括地塞米松、抗壞血酸-2-磷酸和鈣及磷酸源。如果 需要，可遺傳改變本發(fā)明細(xì)胞以提高增殖能力例如，用于端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶的表達(dá)載體。也 可遺傳改變細(xì)胞以表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白。 發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案是篩選化合物用于間充質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞毒性或調(diào)節(jié)的 方法，其中化合物結(jié)合本發(fā)明細(xì)胞或細(xì)胞群，確定來(lái)自化合物的任何間充質(zhì)細(xì)胞毒性或調(diào) 節(jié)。 發(fā)明的進(jìn)一步實(shí)施方案是包括本發(fā)明細(xì)胞群的藥物用于治療人或動(dòng)物體。藥物可
任選地含有或伴隨附加成分，如基質(zhì)或陶瓷載體、鈣或骨形態(tài)發(fā)生蛋白。 本發(fā)明組合物可用于再生需要修復(fù)的組織。例如，骨組織可通過(guò)使骨組織接觸本
發(fā)明成骨細(xì)胞或前體細(xì)胞群來(lái)修復(fù)。以類(lèi)似的方式，組合物可用于在個(gè)體中再構(gòu)建或補(bǔ)充
肌骨骼細(xì)胞功能。組合物也可用于在人患者中提高活動(dòng)性，這是通過(guò)在病人中移植假體裝
置或結(jié)合本發(fā)明細(xì)胞群的夾板。 發(fā)明的這些和其它實(shí)施方案從下列描述中是顯而易見(jiàn)的。本公開(kāi)中所述組合物、 方法和技術(shù)可用于診斷、藥物篩選和治療應(yīng)用。



圖1是顯示用未分化人胚胎干(hES)細(xì)胞的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測(cè)的標(biāo)記表達(dá)的顯微 照片的復(fù)制。培養(yǎng)物根據(jù)小鼠胚胎飼養(yǎng)細(xì)胞的常規(guī)方法生長(zhǎng)，或者在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的環(huán)境中 生長(zhǎng)，此環(huán)境含胞外基質(zhì)Matrigel⑧或條件培養(yǎng)基中的層粘連蛋白。生長(zhǎng)在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)
中的hES細(xì)胞具有的表型標(biāo)記類(lèi)似于生長(zhǎng)在原代小鼠成纖維細(xì)胞飼養(yǎng)細(xì)胞層上的hES。
圖2顯示名為HEF1的人細(xì)胞系特征，它分化自hES細(xì)胞。A組是相差顯微照片的 復(fù)制，顯示HEF1細(xì)胞系有成纖維細(xì)胞的形態(tài)特征。B組(下面)是TRAP試驗(yàn)結(jié)果的復(fù)制， 顯示用端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEF1細(xì)胞獲得端粒酶活性。
圖3是顯示細(xì)胞系標(biāo)記表達(dá)的顯微照片的復(fù)制，細(xì)胞系經(jīng)受分化以產(chǎn)生骨前體細(xì) 胞和成骨細(xì)胞。培養(yǎng)物培養(yǎng)基用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OIM)替換，然后分化11天。OIM制備 自間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基，且添加有0. 1 ii M地塞米松、5 ii M抗壞血酸-2-磷酸、10mM 13 -甘 油磷酸和100ng/mL BMP_4。所用細(xì)胞是hES細(xì)胞系Hl、端?；痟ES-衍生的分化細(xì)胞系 HEF1、人間充質(zhì)干細(xì)胞和BJ5ta成纖維細(xì)胞。 A和B組顯示用于標(biāo)記骨f丐蛋白、膠原-1的免疫細(xì)胞化學(xué)。C組顯示用于堿性磷 酸酶活性的染色。這些特征是成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞特征，表明hES細(xì)胞和HEF1細(xì)胞體外經(jīng) 受適當(dāng)分化操作時(shí)，產(chǎn)生成骨細(xì)胞。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明提供的技術(shù)可用于制備和表征一些類(lèi)型的間充質(zhì)細(xì)胞，包括參與骨更新和 修復(fù)的細(xì)胞。 如果pPS細(xì)胞可以不定向方式分化，獲得的異源細(xì)胞群表達(dá)許多不同組織類(lèi)型的 標(biāo)記(WO 01/51616 ;Shamblott等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98:113,2001)。使用pPS細(xì)
胞用于治療目的或用于體外研究具體細(xì)胞類(lèi)型的重要問(wèn)題是獲得特征相對(duì)統(tǒng)一的包含大 量亞群的細(xì)胞群。本公開(kāi)背景部分的綜述文章沒(méi)有教授或提供方法用于從任何種類(lèi)的胚胎 干細(xì)胞中獲得成骨細(xì)胞或它們的前體。 現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)基本上同源的間充質(zhì)譜系的細(xì)胞群可通過(guò)在最優(yōu)化于此類(lèi)細(xì)胞的條件 中培養(yǎng)多能胚胎細(xì)胞來(lái)獲得。實(shí)施例2(下面)闡述了人胚胎干(hES)細(xì)胞可如何分化成 早期中胚層細(xì)胞系。引起HES細(xì)胞形成胚胎樣小體，它們隨后在適合選擇攜帶中胚層細(xì)胞 的表型特征細(xì)胞系的條件下平板培養(yǎng)。然后用端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)導(dǎo)分離的細(xì)胞系以提高增 殖能力。此細(xì)胞系有自身更新和形成不同成熟間充質(zhì)細(xì)胞類(lèi)型的后代的能力。
在實(shí)施例3中，依次引起間充質(zhì)細(xì)胞系分化成成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞，通過(guò)染色膠 原-1骨鈣蛋白和堿性磷酸酶活性來(lái)鑒定。實(shí)施例3也闡明了具有成骨細(xì)胞特征的細(xì)胞也 可通過(guò)在合適培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)人胚胎干(hES)細(xì)胞來(lái)直接獲得。具體是，細(xì)胞在可商業(yè)獲 得的間充質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)11天，添加有0. 1 M地塞米松、5 M抗壞血酸-2-磷 酸、10mMP-甘油磷酸和100ng/mL BMP_4。 根據(jù)本發(fā)明方法獲得的一些細(xì)胞群含有高比例成骨細(xì)胞和它們的前體。不知道培
養(yǎng)條件是否誘導(dǎo)hES細(xì)胞采用成骨細(xì)胞表型，它們是否促進(jìn)此類(lèi)細(xì)胞長(zhǎng)出或它們是否抑制
其它類(lèi)型細(xì)胞生長(zhǎng)_確實(shí)很可能一些這種機(jī)制協(xié)同作用以富集所需類(lèi)型細(xì)胞。當(dāng)然，引起
成骨細(xì)胞譜系的細(xì)胞富集的機(jī)制令人感興趣，但不需要理解機(jī)制以實(shí)踐發(fā)明。 根據(jù)此系統(tǒng)產(chǎn)生細(xì)胞的顯著統(tǒng)一性和功能性質(zhì)使它們有助于開(kāi)發(fā)新的治療形式
和作為體外研究間充質(zhì)組織的工具。 原型"靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干細(xì)胞"(pPS細(xì)胞)是獲得自任何種類(lèi)胚胎組織(胎兒或 胎兒前期組織)的多能細(xì)胞，具有能在合適條件下產(chǎn)生不同細(xì)胞類(lèi)型的后代的特征，細(xì)胞 類(lèi)型是所有3個(gè)胚層(內(nèi)胚層、中胚層和外胚層)的衍生物，這是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)上接受的 測(cè)試如在8-12周令SCID小鼠中形成畸胎瘤的能力或組織培養(yǎng)中形成所有三個(gè)胚層可鑒定 細(xì)胞的能力。 pPS細(xì)胞定義中包括不同類(lèi)型的胚胎細(xì)胞，例子是Thomson等(Science282 :1145， 1998)描述的人胚胎干(hES)細(xì)胞；來(lái)自其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的胚胎干細(xì)胞如恒河猴干細(xì)胞 (Thomson等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92 :7844， 1995)、絨猴干細(xì)胞(Thomson等，Biol. R印rod. 55 :254， 1996)和人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞(Shamblott等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13726,1998)。其它類(lèi)型多能細(xì)胞也包括再此術(shù)語(yǔ)中。包括任何能產(chǎn)生所有三個(gè)胚層衍 生物后代的靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物來(lái)源的細(xì)胞，無(wú)論它們是否獲得自胚胎組織、胎兒組織或其它來(lái)源。 pPS細(xì)胞不獲得自惡性來(lái)源。理想的是(但不總是必需的)細(xì)胞染色體組型正常。
當(dāng)群體中大部分干細(xì)胞群和它們的衍生物表現(xiàn)出未分化細(xì)胞的形態(tài)特征時(shí)，pPS 細(xì)胞培養(yǎng)描述為"未分化"，它們與胚胎或成熟來(lái)源的分化細(xì)胞明顯區(qū)分。未分化PPS細(xì)胞可容易地被本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別，它們通常出現(xiàn)在二維微觀觀察中有高核/細(xì)胞質(zhì)比例和 突出核仁的細(xì)胞集落中。要理解的是，群體內(nèi)未分化細(xì)胞集落通常度鄰近的分化細(xì)胞包圍。
為了本公開(kāi)的目的，"間充質(zhì)細(xì)胞"可以是末端分化細(xì)胞或定型形成間充質(zhì)組織細(xì) 胞的增殖性前體細(xì)胞，如骨、牙組織、軟骨、腱、骨髓間質(zhì)、造血譜系或肌肉。間充質(zhì)干細(xì)胞包 括在術(shù)語(yǔ)中，也包括末端分化(有絲分裂后)細(xì)胞和更定型的有復(fù)制能力的細(xì)胞如成骨細(xì) 胞前體細(xì)胞。間充質(zhì)細(xì)胞都具有的性質(zhì)是它們?cè)陂g充質(zhì)譜系中末端分化或者限制形成間充 質(zhì)譜系的后代或它們的前體。它們不形成內(nèi)胚層或外胚層細(xì)胞，除非經(jīng)受核轉(zhuǎn)移或其它重 編程序。 在細(xì)胞個(gè)體發(fā)育方面，形容詞"分化的"是一個(gè)相對(duì)術(shù)語(yǔ)。"分化細(xì)胞"是比較細(xì)胞 在發(fā)育途徑上更進(jìn)一步向下發(fā)展的細(xì)胞。因此，多能胚胎干細(xì)胞可分化成譜系_限制的前 體細(xì)胞(如間充質(zhì)干細(xì)胞)，前體細(xì)胞依次可分化成其它類(lèi)型途徑上更下面的前體細(xì)胞(如 成骨細(xì)胞前體)，然后成為在某些組織類(lèi)型中起特征性作用的最后階段分化細(xì)胞，它們可或 可不保持進(jìn)一步增殖的能力。 如本公開(kāi)所用，"分化劑"指本發(fā)明培養(yǎng)系統(tǒng)中所用的化合物的集合之一，用于產(chǎn) 生間充質(zhì)譜系的分化細(xì)胞(包括前體細(xì)胞和末端分化細(xì)胞)。對(duì)化合物作用方式?jīng)]有限制。 例如，試劑可協(xié)助分化過(guò)程，這是通過(guò)誘導(dǎo)或協(xié)助表型變化、促進(jìn)具有特定表型的細(xì)胞的生 長(zhǎng)或阻礙其它細(xì)胞的生長(zhǎng)、或與其它試劑通過(guò)未知機(jī)制協(xié)同作用。 除非另有明確說(shuō)明，本發(fā)明技術(shù)對(duì)能分化成骨的任何類(lèi)型的祖細(xì)胞沒(méi)有限制。
術(shù)語(yǔ)"飼養(yǎng)細(xì)胞"或"喂養(yǎng)細(xì)胞"用于描述一種類(lèi)型的細(xì)胞，它與另一類(lèi)型的細(xì)胞 共培養(yǎng)以提供第二種類(lèi)型的細(xì)胞可生長(zhǎng)的環(huán)境。如果細(xì)胞在分裂后生長(zhǎng)至少一輪，其中不 加入新鮮飼養(yǎng)細(xì)胞以支持pPs生長(zhǎng)，則pPs細(xì)胞群被稱(chēng)為"本質(zhì)上沒(méi)有"飼養(yǎng)細(xì)胞。
"生長(zhǎng)環(huán)境"是感興趣細(xì)胞體外增殖、分化或成熟的環(huán)境。環(huán)境特征包括培養(yǎng)細(xì)胞 的培養(yǎng)基、可存在的任何生長(zhǎng)因子或分化-誘導(dǎo)因子、支持結(jié)構(gòu)(如果存在，如固體表面上 的底物)。 當(dāng)多核苷酸通過(guò)任何適當(dāng)?shù)娜斯げ僮鞣椒ㄞD(zhuǎn)入細(xì)胞或細(xì)胞是遺傳多核苷酸的原 始改變的細(xì)胞后代時(shí)，細(xì)胞被稱(chēng)為"遺傳改變"。多核苷酸通常包括編碼感興趣蛋白質(zhì)的可 轉(zhuǎn)錄序列，使細(xì)胞能以提高水平表達(dá)蛋白質(zhì)。如果改變的細(xì)胞的后代有相同改變，遺傳改變 被稱(chēng)為"可遺傳"。 如本公開(kāi)所用，術(shù)語(yǔ)"抗體"指多克隆和單克隆抗體。術(shù)語(yǔ)范圍不僅包括完整免疫 球蛋白分子，也包括這些免疫球蛋白分子的片斷和衍生物(如單鏈Fv構(gòu)建物、雙體分子和 融合構(gòu)建物)，它們可用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備并保持所需抗體結(jié)合特異性。
一般技術(shù) 為進(jìn)一步闡述本發(fā)明實(shí)踐中有用的一般技術(shù)，操作者可參考細(xì)胞生物學(xué)、組織培 養(yǎng)和胚胎學(xué)的標(biāo)準(zhǔn)教科書(shū)和綜述。 關(guān)于組織培養(yǎng)和胚胎干細(xì)胞，讀者可參考《畸胎癌和胚胎干細(xì)胞一種實(shí)踐方法》 (Teratocarcinomas and embryonic stem cells :A practical approach)(E. J. Robertson 編，IRL Press Ltd. 1987);《小鼠發(fā)育中的技術(shù)指南》(Guide to Techniquesin Mouse Development) (P. M. Wasserman等編，Academic Press 1993);《胚月臺(tái)干細(xì)胞體夕卜分化》 (Embryonic Stem Cell Differentiation in Vitro)(M. V. Wiles，Meth. Enzymol. 225 :900，
71993);《胚胎干細(xì)胞的性質(zhì)和使用應(yīng)用于人類(lèi)生物學(xué)和基因治療的前景》(Properties and uses of Embryonic stem cells :Prospects for Application toHuman Biology and Gene Ther即y) (P. D. Rathjen等，R印rod. Fertil. Dev. 10 :31， 1998)。 制備和培養(yǎng)骨細(xì)胞的一般原理和骨損傷修復(fù)可發(fā)現(xiàn)于《骨成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞》 (Bone :The Osteoblast and 0steocyte) (B. K. Hall， CRC Press 1990);《骨的分化和形 態(tài)發(fā)生》(Differentiation and Morphogenesis of Bone) (B. K. Hall， CRC Press 1994); 《骨生物學(xué)的原理》(Principles of Bone Bidogy) (J. P. Bilezikian等編，Academic Pressl996);《骨形成和修復(fù)的細(xì)胞和分子基礎(chǔ)》(The Cellular and Molecular Basis ofBone Formation and Repair) (V. Rosen&S. Thies， R. G丄andes Co. 1995)。 其它感興 趣的讀物包括《骨家族》(The Bone People) (K. Hulme， Viking Press 1986);《骨需求》 (BoneAppetit)(B. E. Romano, West Coast Media Group 1998)。 分子遺傳和遺傳工程方法描述于《分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(Molecular Cloing :ALaboratory Manual), 第2版(Sambrook等，1989);《寡核苷酸合成》 (OlionucleotideSynthesis) (M. J. Gait編，1984);《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture) (R. I. Freshney編，1987);《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)系列 (Academic Press);《用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移載體》(Gene Transfer Vector for MammalianCell) (J. M. Miller&M. P. Calos編，1987);《新編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》和《精編 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(Current Protocols in Molecular Biology and Short Protocols inMolecular Biology 1)，第3版(F. M. Ausubel等編，1987&1995);《重組DNA方法I1》 (Recombinant DNA Methodology II) (R. Wu編，1995)。本公開(kāi)參考的遺傳操作試劑、克隆載 體禾口i式劑盒來(lái)自商業(yè)供應(yīng)商如BioRad、 Stratagene、 Invitrogen禾口 ClonTech。
干細(xì)胞來(lái)源 本發(fā)明可用不同類(lèi)型的多能干細(xì)胞進(jìn)行，具體是如上所述獲得自胚胎組織并有能 產(chǎn)生所有三個(gè)胚層后代特征的干細(xì)胞。 范例是胚胎干細(xì)胞或胚胎生殖細(xì)胞用作現(xiàn)有細(xì)胞系或建立自靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物包括人
的原代胚胎組織。 胚胎干細(xì)胞 胚胎干細(xì)胞分離自靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物成員的胚泡(Thomson等Proc. Natl. Acad. Sci. USA92 :7844， 1995)。人胚胎干(hES)細(xì)胞可用Thomson等(美國(guó)專(zhuān)利5， 843， 780 ; Science282 :1145， 1998 ;Curr. Top. Dev. Biol. 38 :133 ff. ， 1998)禾P Reubinoff等， NatureBiotech. 18 :399-2000所述技術(shù)從人胚泡細(xì)胞中制備。與hES細(xì)胞相當(dāng)?shù)募?xì)胞類(lèi)型 包括它們的多能衍生物，如概括于WO 01/51610 (Bresagen)的原始外胚層樣(EPL)細(xì)胞。
簡(jiǎn)要地，人胚泡細(xì)胞獲得自人體內(nèi)植入前胚胎。另外，可使用體外受精(IVF)胚 胎，或單細(xì)胞人胚胎可擴(kuò)大至胚泡階段(Bongso等，Hum R印rod 4 :706， 1989)。胚胎在Gl. 2 和G2. 2培養(yǎng)基中培養(yǎng)成胚泡階段(Gardner等，F(xiàn)ertil. Steril. 69 :84,1998)。透明帶通過(guò) 短暫暴露于鏈霉蛋白酶(Sigma)從發(fā)育胚泡中取出。內(nèi)部細(xì)胞塊通過(guò)免疫手術(shù)分離，其中 胚泡暴露于l : 50稀釋的兔抗人脾細(xì)胞抗血清30分鐘，然后在DMEM中洗5分鐘3次，暴露 于1 : 5稀釋的豚鼠補(bǔ)體(Gibco) 3分鐘(Solter等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72 :5099， 1975)。在DMEM中進(jìn)一步洗2次后，裂解的滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞通過(guò)溫和的用移液管吸移從完整內(nèi)部細(xì)胞塊(ICM)中去除，ICM平板培養(yǎng)于mEF飼養(yǎng)細(xì)胞層上。 9到15天后，從完整內(nèi)部細(xì)胞塊獲得的長(zhǎng)出分離成塊，這是通過(guò)暴露于沒(méi)有鈣和 鎂的含lmM EDTA的磷酸緩沖鹽水(PBS)、或暴露于分散酶或胰蛋白酶、或用微量移液管機(jī) 械分離；然后在mEF上以新鮮培養(yǎng)基再平板培養(yǎng)。有未分化形態(tài)的生長(zhǎng)集落由微量移液管 單獨(dú)選擇，機(jī)械分離成塊并再平板培養(yǎng)。ES-樣形態(tài)特征是致密集落有明顯高的核對(duì)細(xì)胞 質(zhì)比例和突出核仁。所得ES細(xì)胞然后每l-2周常規(guī)分裂，通過(guò)短暫胰蛋白酶消化，暴露于 Dulbecco的PBS (含2mM EDTA)，暴露于IV型膠原酶( 200U/mL ;Gibco)或者通過(guò)微量移 液管選擇單獨(dú)集落。約50到100個(gè)細(xì)胞的塊大小最佳。
胚胎生殖細(xì)胞 人胚胎生殖(hEG)細(xì)胞可制備自存在于人胎兒物質(zhì)中的原始生殖細(xì)胞，胎兒物質(zhì) 在最后一次月經(jīng)期后約8-11周取出。合適制備方法描述于Shamblott等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95 :13726， 1998和美國(guó)專(zhuān)利6， 090， 622。 簡(jiǎn)要地，生殖嵴用等滲緩沖液沖洗，然后置于0. lmL 0. 05 %胰蛋白酶 /0. 53mMEDTA鈉溶液(BRL)并切成< 1mm3的塊。然后組織用100 y L槍頭吸移以進(jìn)一步分 離細(xì)胞。細(xì)胞在37t:培養(yǎng) 5分鐘，然后加入 3.5mL EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基。EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基是 DMEM、4500mg/L D_葡萄糖、2200mg/L mM NaHC03 ;15% ES合格的胎牛血清(BRL) ;2mM谷氨 酰胺(BRL) ;lmM丙酮酸鈉(BRL) ;1000-2000U/mL人重組白血病抑制因子(LIF， Genzyme); l-2ng/mL人重組bFGF(Genzyme) ;10iiM毛喉素(在10XDMS0中)。在另一種方法中，EG 細(xì)胞用透明質(zhì)酸酶/膠原酶/DNA酶分離。性腺原基或具有腸系膜的生殖嵴從胎兒物質(zhì)中切 離，生殖嵴在PBS中沖洗，然后置于O. lmL HCD消化溶液(0. 01 % V型透明質(zhì)酸酶、0. 002% DNA酶I、0. 1 % IV型膠原酶，都來(lái)自Sigma， EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基中制備)。切碎組織，培養(yǎng)1小 時(shí)或37t:過(guò)夜，重懸浮于l-3mL的EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基中并平板培養(yǎng)于飼養(yǎng)細(xì)胞層上。
96孔組織培養(yǎng)板用飼養(yǎng)細(xì)胞(如STO細(xì)胞，ATCC No. CRL1503)的亞匯合層制備， 飼養(yǎng)細(xì)胞在沒(méi)有LIF、bFGF或毛喉素的修飾EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)3天，用5000拉德y -輻 射滅活。 0.2mL原代生殖細(xì)胞(PGC)懸浮液加入各個(gè)孔。EG生長(zhǎng)培養(yǎng)基中7-10天后進(jìn) 行第一次傳代，將各孔轉(zhuǎn)移到先前用照射的STO小鼠成纖維細(xì)胞制備的24孔培養(yǎng)皿的孔 中。細(xì)胞每天替換培養(yǎng)基培養(yǎng)直到觀察到與EG細(xì)胞一致的細(xì)胞形態(tài)，通常是在7-30天或 l-4次傳代后。 繁殖未分化狀態(tài)的pPS細(xì)胞 pPS細(xì)胞可在培養(yǎng)中連續(xù)繁殖，使用的培養(yǎng)條件促進(jìn)增殖而不促進(jìn)分化。范例含 血清ES培養(yǎng)基用80% DMEM(如剔除DMEM，Gibco) 、20%確定成分胎牛血清(FBS，Hyclone) 或血清取代物(WO 98/30679) 、1%非必需氨基酸、1慮L-谷氨酰胺和O. lmMI3-巰基乙醇制 成。使用前，加入人bFGF到4ng/mL(W0 99/20741， GeronCorp.)。 按常規(guī)，ES細(xì)胞在飼養(yǎng)細(xì)胞層上培養(yǎng)，通常成纖維細(xì)胞獲得自胚胎或胎兒組織。胚 胎收集自懷孕13天的CF1小鼠，轉(zhuǎn)移到2mL胰蛋白酶/EDTA，精細(xì)切碎并在37。C培養(yǎng)5分 鐘。加入10% FBS，使碎片沉淀，細(xì)胞繁殖于90X DMEM、10% FBS和2mM谷氨酰胺中。為制 備飼養(yǎng)細(xì)胞層，照射細(xì)胞以抑制增殖但允許支持ES細(xì)胞的因子合成( 4000拉德y -福 射)。培養(yǎng)平板用0. 5%明膠包被過(guò)夜，用每孔375， 000個(gè)照射mEFs平板培養(yǎng)，平板培養(yǎng)后 5小時(shí)到4天使用。接種pPS細(xì)胞前培養(yǎng)基用新鮮hES培養(yǎng)基置換。
Geron的科學(xué)家發(fā)現(xiàn)pPS細(xì)胞即使沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞可維持在未分化狀態(tài) (W001/51616)。沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)物的環(huán)境包括合適的培養(yǎng)底物，具體是胞外基質(zhì)如 Matrigel⑧或?qū)诱尺B蛋白。pPS細(xì)胞以> 15， 000個(gè)細(xì)胞cm—2 (90， 000—2到170， 000—2最佳) 平板培養(yǎng)。通常，酶消化在細(xì)胞完全分散前停止(比如，用膠原酶IV 5到20分鐘)。然 后 10-2000個(gè)細(xì)胞的塊直接在沒(méi)有進(jìn)一步分散的底物上平板培養(yǎng)。 沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)物由營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基支持，通常條件培養(yǎng)照射的原代小鼠胚胎成 纖維細(xì)胞、端?；男∈蟪衫w維細(xì)胞或衍生自pPS細(xì)胞的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞。培養(yǎng)基可在 無(wú)血清培養(yǎng)基如K0 DMEM中以 5-6 X 104cm—2密度平板條件培養(yǎng)飼養(yǎng)細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基 添加有20%血清取代物和4ng/mL bFGF。處于正常狀態(tài)24小時(shí)的培養(yǎng)基濾過(guò)0. 2 y m膜， 進(jìn)一步添加 8ng/mL bFGF并用于支持pPS細(xì)胞培養(yǎng)1_2天。 在顯微鏡下，ES細(xì)胞具有高核/細(xì)胞質(zhì)比例、突出核仁和有較差分辨細(xì)胞連接的 致密集落形成。靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物ES細(xì)胞可表達(dá)一種或多種階段-特異性胚胎抗原(SSEA)3和4， 以及用名為T(mén)ra+60和Tra+81的抗體可檢測(cè)的標(biāo)記(Thomsom等，Science 282 :1145， 1998)。未分化hES細(xì)胞也通常表達(dá)RT-PCR檢測(cè)的0ct_4和TERT。 hES細(xì)胞體外分化通常 導(dǎo)致這些標(biāo)記(如果存在)損失和增加SSEA-1表達(dá)。
制備間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞的材料和步驟 本發(fā)明的細(xì)胞可通過(guò)在特殊生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)、分化或重編程干細(xì)胞來(lái)獲得，此環(huán) 境富集具有所需表型的細(xì)胞(通過(guò)長(zhǎng)出所需細(xì)胞或者通過(guò)抑制或殺死其它細(xì)胞類(lèi)型)。這 些方法可應(yīng)用于許多類(lèi)型的干細(xì)胞，包括前面部分所述靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物多能干(pPS)細(xì)胞。
分化可任選地通過(guò)形成胚胎樣小體或聚集體來(lái)起始例如，通過(guò)過(guò)度生長(zhǎng)供體 pPS細(xì)胞培養(yǎng)物或在培養(yǎng)容器中的懸浮液中培養(yǎng)pPS細(xì)胞，培養(yǎng)容器有允許EB形成的低粘 附性質(zhì)的底物。pPS細(xì)胞通過(guò)短暫膠原酶消化收集，分離成塊，平板培養(yǎng)于非粘附細(xì)胞培養(yǎng) 板中。聚集體每幾天喂給，然后在適當(dāng)時(shí)間段后收集，通常4-8天。另外或此外，分化過(guò)程可 通過(guò)培養(yǎng)非特異分化范例來(lái)起始通過(guò)在培養(yǎng)基中包括視黃酸(RA)或二甲基亞砜(DMSO); 或通過(guò)從常見(jiàn)的胞外基質(zhì)中取出，細(xì)胞在胞外基質(zhì)上培養(yǎng)。參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)60/213， 740 和國(guó)際專(zhuān)利出版物WOO 1/51616 。 產(chǎn)生相對(duì)同源的間充質(zhì)細(xì)胞群，具體是可通過(guò)在生長(zhǎng)環(huán)境中培養(yǎng)pPS細(xì)胞(未分
化，或分化起始后)獲得的成骨細(xì)胞譜系，生長(zhǎng)環(huán)境含有益于這些細(xì)胞的因子，如一種或多 種下列因子 骨形態(tài)發(fā)生蛋白，例子是BMP-2、 BMP-3、 BMP_4、 BMP-6和BMP_7。 *TGF- P ，例子是TGF- P 1、TGF_ P 2和TGF- P 3和它們的類(lèi)似物，以及結(jié)合TGF- P
受體的TGF-P超家族的其它成員 維生素D受體的配體。例子是1，25_ 二羥基維生素D3。其它類(lèi)似物是已知的 (參見(jiàn)例如Tsugawa等，Biol. Pharm. Bull. 23 :66， 2000) 認(rèn)識(shí)到對(duì)任何這些因子的受體的特異抗體是可用于取代(或除了 )所列因子的功 能相當(dāng)配體。其它可使用的添加物包括 其它形態(tài)發(fā)生素，如成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子像堿性FGF
*糖皮質(zhì)激素 地塞米松或其它小分子成骨細(xì)胞成熟因子
抗壞血酸(或其類(lèi)似物，如抗壞血酸_2-磷酸)，它是膠原合成過(guò)程中發(fā)生脯氨 酸羥基化的輔因子。
13 _甘油磷酸或礦化過(guò)程中堿性磷酸酶的其它底物
f丐源(可或可不以足夠濃度存在于堿性培養(yǎng)基中) 細(xì)胞也可支持在包被有助于所需細(xì)胞表型生長(zhǎng)的適當(dāng)物質(zhì)的底物上，或培養(yǎng)在含 這種物質(zhì)成分的培養(yǎng)基中。Matrigel⑧、層粘連蛋白、膠原(特別是i型膠原)、糖胺聚糖、骨鈣蛋白和骨粘連
蛋白本身或以不同組合都適合作為胞外基質(zhì)。同樣適合生長(zhǎng)的成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞是凝膠衍
生的玻璃、硅膠和溶膠衍生的二氧化鈦(Saravan即avan等，J. BiomedMater. Res. 54 :608， 2001 ;Dieudonne等，Biomaterials 34 :3041,2002)。 根據(jù)本發(fā)明獲得的細(xì)胞可按一些表型標(biāo)準(zhǔn)表現(xiàn)特征。相對(duì)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞 可通過(guò)它們的特征性單核卵形物、星形或紡錘形來(lái)識(shí)別，有圓到橢圓的核以及較差確定 的細(xì)胞邊界。橢圓伸長(zhǎng)核通常有突出核及異和常染色質(zhì)的混合物。這些細(xì)胞有少的細(xì) 胞質(zhì)但有許多似乎延伸自核的薄突起。它們通常染色一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或多個(gè)下列標(biāo)記 CD106 (VCAM) 、 CD166 (ALCAM) 、 CD29、 CD44、 GATA-4和堿性磷酸酶，而對(duì)于造血譜系細(xì)胞標(biāo)記 (CD14或CD45)是陰性的。間充質(zhì)干細(xì)胞也可表達(dá)STR0-1。 在合適條件下，早期間充質(zhì)細(xì)胞可進(jìn)一步分化成許多成熟結(jié)締組織細(xì)胞類(lèi)型，如 成纖維細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成牙本質(zhì)細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞或脂肪細(xì)胞。因此，間充質(zhì)干 細(xì)胞可通過(guò)它們形成一個(gè)或多個(gè)特殊間充質(zhì)譜系的能力來(lái)鑒定。 成骨細(xì)胞和骨前體細(xì)胞通常有下列的至少一個(gè)特征( 一般至少三或五個(gè)特征) 1. 050和 1. 090g cm—3之間的密度 骨粘連蛋白陽(yáng)性(成骨細(xì)胞和前體中陽(yáng)性) 骨鈣蛋白陽(yáng)性(對(duì)成熟成骨細(xì)胞特異) 8至lj 70 ii m的細(xì)胞直徑 立方形形狀 正調(diào)節(jié)產(chǎn)生堿性磷酸酶，尤其是對(duì)BMP存在的反應(yīng) [OO97] I型膠原(前膠原)或波形蛋白陽(yáng)性 成骨細(xì)胞特異標(biāo)記陽(yáng)性，如BMP受體、PTH受體或CD105 (內(nèi)皮糖蛋白)
礦物化外部環(huán)境或合成含鈣胞外基質(zhì)的能力 技術(shù)人員知道軟骨細(xì)胞通常表達(dá)II型膠原、聚集蛋白聚糖或用艾西藍(lán)染色的蛋 白聚糖。在成熟形式中，軟骨細(xì)胞對(duì)于彈性蛋白、I型膠原、X型膠原或成鈣蛋白陽(yáng)性小于 1 % 。造血細(xì)胞群和它們的前體攜帶這種標(biāo)記如re CD45、CD34、CD13、AC133、血紅蛋白、表面 抗體和II類(lèi)組織相容性抗原。在合適情況下，復(fù)制性造血細(xì)胞在造血集落形成單位(CFU) 試驗(yàn)中形成集落。心肌細(xì)胞和它們的前體通常表達(dá)心臟肌鈣蛋白1(cTnl)、心臟肌鈣蛋白 T(cTnT)、心鈉素(ANF)和a心臟肌球蛋白重鏈(MHC)。成纖維細(xì)胞有易鑒定的形態(tài)且通 常表達(dá)膠原酶I和金屬蛋白酶I的組織抑制劑(TIMP-1)。橫紋肌細(xì)胞通常表達(dá)收縮蛋白 如骨骼a-肌動(dòng)蛋白、骨骼肌球蛋白重鏈和輕鏈以及原肌球蛋白。早期生肌標(biāo)記是myoD和 成肌素。腱和韌帶組織以單向纖維排列染色I(xiàn)型膠原。早期腱和軟骨細(xì)胞祖細(xì)胞通常表達(dá) scleraxis。脂肪細(xì)胞通常用顯示脂質(zhì)積聚的油紅0染色，且表達(dá)過(guò)氧化物酶體增殖_活化
11受體Y2(PPARY2)、月旨蛋白脂肪酶(LPL)和脂肪酸結(jié)合蛋白(aP2)。 組織-特異標(biāo)記可用任何合適的免疫學(xué)技術(shù)檢測(cè)-如流式免疫細(xì)胞化學(xué)或親和吸
收細(xì)胞表面標(biāo)記、用于胞內(nèi)或細(xì)胞表面標(biāo)記的免疫細(xì)胞化學(xué)(例如固定細(xì)胞或組織切片)、 細(xì)胞提取物的蛋白質(zhì)印跡分析和用于細(xì)胞提取物或分泌入培養(yǎng)基的產(chǎn)物的酶聯(lián)免疫測(cè)定。 如果明顯可檢測(cè)量的抗體在標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)或流式細(xì)胞儀測(cè)定中結(jié)合抗原，細(xì)胞的抗原 表達(dá)被稱(chēng)為"抗體-可檢測(cè)"，任選地在細(xì)胞固定后且任選使用標(biāo)記的第二抗體或其它綴合 物(如生物素_抗生物素蛋白綴合物)以擴(kuò)大標(biāo)記。 組織-特異基因產(chǎn)物的表達(dá)也可通過(guò)RNA印跡分析、斑點(diǎn)雜交分析或反轉(zhuǎn)錄酶起 始的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)在mRNA水平檢測(cè)，使用標(biāo)準(zhǔn)擴(kuò)增方法中的序列-特異引物。 參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利5， 843， 780的一般技術(shù)細(xì)節(jié)和國(guó)際專(zhuān)利出版物W099/339724的成骨細(xì)胞-特 異PCR引物。本公開(kāi)所列其它標(biāo)記的序列數(shù)據(jù)可獲得自公共數(shù)據(jù)庫(kù)如GenBank(URL麗w. ncbi. nlm. nih. gov :80/entrez)。如果在典型控制實(shí)驗(yàn)中根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟在細(xì)胞樣品上試驗(yàn) 產(chǎn)生可清楚分辨的雜交或擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)本公開(kāi)所述試驗(yàn)之一的mRNA水平表達(dá)被稱(chēng)為"可 檢測(cè)"。如果水平比對(duì)照細(xì)胞如未分化pPS細(xì)胞或其它不相關(guān)細(xì)胞類(lèi)型至少高2倍，優(yōu)選高 10或50倍，在蛋白質(zhì)或mRNA水平檢測(cè)的組織-特異標(biāo)記表達(dá)被認(rèn)為是陽(yáng)性。
如廠商所述(Vector Laboratories, Burlingame CA)，檢測(cè)堿性磷酸酶活性的存 在可通過(guò)用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，然后用Vector Red作為底物顯現(xiàn)。細(xì)胞內(nèi)鈣積聚和基 質(zhì)蛋白內(nèi)沉積的測(cè)量可通過(guò)在45Ca++培養(yǎng)、洗滌和再培養(yǎng)，然后確定細(xì)胞內(nèi)存在任何放射性 或沉積入胞外基質(zhì)內(nèi)(美國(guó)專(zhuān)利5，972，703);或通過(guò)用&++測(cè)試試劑盒(Sigma Kit#587) 測(cè)定用于礦化的培養(yǎng)底物。 —旦標(biāo)記在所需表型的細(xì)胞表面上鑒定，它們可用于免疫選擇以通過(guò)技術(shù)如免疫 淘選或抗體_倡導(dǎo)的熒光_活化細(xì)胞分選來(lái)進(jìn)一步富集細(xì)胞群。 由于現(xiàn)已證明間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞可從pPS細(xì)胞產(chǎn)生，調(diào)節(jié)本公開(kāi)所述分化范 例以適合他們自己的目的在讀者的范圍內(nèi)。讀者可試驗(yàn)一些培養(yǎng)條件的適宜性，例如通過(guò) 在與根據(jù)本公開(kāi)所述獲得的細(xì)胞和其它對(duì)照細(xì)胞類(lèi)型(如原代人間充質(zhì)干細(xì)胞、肝細(xì)胞或 成纖維細(xì)胞)平行的試驗(yàn)條件下培養(yǎng)PPS細(xì)胞或它們的衍生物，然后比較根據(jù)上面所列標(biāo) 記獲得的細(xì)胞表型。調(diào)節(jié)培養(yǎng)和細(xì)胞分離條件以包括、去除或替換具體成分是本發(fā)明正常 預(yù)期的常規(guī)最佳化的事情，且不背離權(quán)利要求的發(fā)明精神。
分化細(xì)胞的遺傳改變 需要細(xì)胞具有在一些藥物篩選和治療應(yīng)用中復(fù)制及提供用于產(chǎn)生間充質(zhì)細(xì)胞和 成骨細(xì)胞貯備的能力。本發(fā)明的細(xì)胞在它們進(jìn)展成限制發(fā)育譜系細(xì)胞或末端分化細(xì)胞之前 或之后，可任選地端粒化以提高它們的復(fù)制能力。端?；膒PS細(xì)胞可從上述分化途徑下 部取出或分化細(xì)胞可直接端?；?細(xì)胞通過(guò)遺傳改變來(lái)端?；?，用合適的載體、同源重組或其它合適技術(shù)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn) 導(dǎo)，這樣它們表達(dá)端粒酶催化成分(TERT)，通常在異源啟動(dòng)子下使端粒酶表達(dá)超過(guò)內(nèi)源啟 動(dòng)子下所產(chǎn)生的表達(dá)。具體合適的是國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W0 98/14592提供的人端粒酶催化成分 (hTERT)。對(duì)于一些應(yīng)用，種同系物像小鼠TERT(W099/27113)也可使用。人細(xì)胞中端粒酶 的轉(zhuǎn)染和表達(dá)描述于Bodnar等，Science279 :349， 1998和Jiang等，Nat. Genet. 21 :111， 1999。在另一個(gè)例子中，hTERT克隆(W098/14592)用作hTERT編碼序列的來(lái)源，剪接成MPSV啟動(dòng)子控制下的PBBS212載體的EcoRI位點(diǎn)或剪接成LRT啟動(dòng)子控制下的市場(chǎng)上可買(mǎi)到的 pBABE反轉(zhuǎn)錄病毒載體的EcoRI位點(diǎn)。 分化或未分化pPS細(xì)胞用含上清液的載體遺傳改變超過(guò)8-16小時(shí)，然后交換到生 長(zhǎng)培養(yǎng)基中1-2天。遺傳改變的細(xì)胞用0. 5-2. 5 g/mL嘌呤霉素選擇并再培養(yǎng)。然后可通 過(guò)RT-PCR評(píng)估它們的hTERT表達(dá)、端粒酶活性(TRAP試驗(yàn))、免疫細(xì)胞化學(xué)染色hTERT或 復(fù)制能力。下列測(cè)試試劑盒可商業(yè)購(gòu)買(mǎi)用于研究目的TRAPeze⑧.XL端粒酶檢測(cè)試劑盒 (目錄號(hào)s7707 ;Intergen Co. ， Purchase NY);和TeloTAGGG端粒酶PCR ELISAplus(目 錄號(hào)2，013，89 ;Roche Diagnostics, Indian即olisIN)。商業(yè)購(gòu)買(mǎi)用于研究目的的是 LightCycler TeloTAGGG hTERT定量試劑盒(目錄號(hào)3，012，344 ;Roche Diagnostics)。連 續(xù)復(fù)制的集落通過(guò)在支持增殖的條件下進(jìn)一步培養(yǎng)來(lái)富集，且具有所需表型的細(xì)胞可任選 通過(guò)有限稀釋來(lái)克隆。 在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，pPS細(xì)胞分化成多能或定型間充質(zhì)細(xì)胞，然后遺傳改 變以表達(dá)TERT。在本發(fā)明的其它實(shí)施方案中，遺傳改變pPS細(xì)胞以表達(dá)TERT，然后分化成 成骨細(xì)胞前體或末端分化細(xì)胞。增加TERT表達(dá)的成功修飾可通過(guò)TRAP試驗(yàn)確定，或通過(guò) 確定細(xì)胞的復(fù)制能力是否改進(jìn)。 視應(yīng)用而定，也可使用其它無(wú)限增殖方法，如用編碼myc、 SV40大T抗原或M0T-2 的DNA轉(zhuǎn)化細(xì)胞(美國(guó)專(zhuān)利5，869，243、國(guó)際專(zhuān)利申請(qǐng)W0 97/32972和W001/23555)。當(dāng)細(xì) 胞用于治療目的時(shí)，用癌基因或致癌病毒產(chǎn)物轉(zhuǎn)染不太合適。本發(fā)明應(yīng)用中對(duì)端粒化細(xì)胞 特別感興趣，其中有可增殖和維持它們?nèi)旧w組型的細(xì)胞有優(yōu)勢(shì)_例如在藥物篩選和治療 方案中，施用分化細(xì)胞給個(gè)體以增強(qiáng)肌骨骼功能。 也可遺傳改變本發(fā)明的細(xì)胞以提高它們參與組織再生或傳遞治療基因給施用部 位的能力。用已知用于所需基因的編碼序列設(shè)計(jì)載體，操作性地連接于分化細(xì)胞類(lèi)型中 pan-特異或?qū)Ｒ换钚缘膯?dòng)子。特別感興趣的是遺傳改變以表達(dá)骨形態(tài)發(fā)生蛋白如BMP-2 或BMP-4的細(xì)胞。參見(jiàn)W0 99/39724。在施用部位產(chǎn)生這些或其它生長(zhǎng)因子可提高被施用 細(xì)胞的有益作用，或者增加鄰近治療部位的宿主細(xì)胞的增殖或活性。
間充質(zhì)干細(xì)胞、成骨細(xì)胞前體和末端分化細(xì)胞的使用 本發(fā)明提供產(chǎn)生大量前體細(xì)胞和成熟細(xì)胞的方法。這些細(xì)胞群可用于一些重要研 究、發(fā)展和商業(yè)目的。 本發(fā)明的細(xì)胞可用于制備cDNA文庫(kù)，此文庫(kù)相對(duì)未污染在來(lái)自其它譜系的細(xì)胞 中優(yōu)先表達(dá)的cDNA。例如，間充質(zhì)祖細(xì)胞或成骨細(xì)胞通過(guò)以1000rpm離心5分鐘收集，然后 通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法從沉淀中制備mRNA(Sambrook等，同上)。反轉(zhuǎn)錄入cDNA后，制備可扣除來(lái)自 未分化pPS細(xì)胞的cDNA、其它祖細(xì)胞、或來(lái)自成骨細(xì)胞或任何其它發(fā)育途徑的終末期細(xì)胞。
本發(fā)明的分化細(xì)胞也可用于制備對(duì)間充質(zhì)細(xì)胞、成骨細(xì)胞和中間前體特異的抗 體。多克隆抗體可通過(guò)將本發(fā)明細(xì)胞以免疫原性形式注射給脊椎動(dòng)物來(lái)制備。單克隆抗 體的產(chǎn)生描述于標(biāo)準(zhǔn)參考文獻(xiàn)如美國(guó)專(zhuān)利4， 491， 632、4， 472， 500和4， 444， 887以及《酶學(xué) 方法》(Methods in Enzymology) 73B :3 (1981)。也可通過(guò)使免疫活性細(xì)胞文庫(kù)或病毒顆粒 接觸耙抗原并長(zhǎng)出陽(yáng)性選擇克隆產(chǎn)生特異抗體分子。參見(jiàn)Marks等，New Eng. J. Med. 335 : 730， 1996和McGuiness等，NatureBiotechnol. 14 :1449,1996。另一種選擇是如EP專(zhuān)利申 請(qǐng)1， 094， 108A所述，將隨機(jī)DNA片斷重新裝配入抗體編碼區(qū)域。
通過(guò)用本發(fā)明pPS陽(yáng)性選擇和用攜帶更廣泛分布的抗原(如分化胚胎細(xì)胞)或成熟來(lái)源的干細(xì)胞陰性選擇，可獲得所需專(zhuān)一性。抗體可依次用于鑒定或從混合細(xì)胞群中援救有所需表型的間充質(zhì)細(xì)胞，用于目的如在免疫診斷中用組織樣品共染色以及分離來(lái)自末端分化成骨細(xì)胞的前體細(xì)胞和其它譜系的細(xì)胞。 本發(fā)明的細(xì)胞在鑒定轉(zhuǎn)錄物的表達(dá)模式和新合成的間充質(zhì)細(xì)胞特有蛋白中也感興趣，且可協(xié)助指導(dǎo)分化途徑或促進(jìn)細(xì)胞間的相互作用。獲得分化細(xì)胞的表達(dá)模式并與對(duì)照細(xì)胞系相比，如未分化pPS細(xì)胞、其它類(lèi)型的定型前體細(xì)胞(如向其它譜系分化的pPS細(xì)胞)或末端分化細(xì)胞。 在分析基因表達(dá)中使用微陣列由Firtz等Science 288 :316,2000 ;"微陣列生物芯片技術(shù)，，(Microarray Biochip Technology) ， L Shi ， www. Gene-Chips, com綜述。不范方法是用遺傳微系統(tǒng)陣列發(fā)生器和Axon GenePixTM掃描器進(jìn)行。制備微陣列首先擴(kuò)增編碼待分析標(biāo)記序列的cDNA片斷并直接點(diǎn)到載玻片上。為比較來(lái)自?xún)煞N感興趣細(xì)胞的mRNA制備， 一種制備轉(zhuǎn)變成Cy3-標(biāo)記cDNA，而另一種轉(zhuǎn)變成Cy5_標(biāo)記cDNA。兩種cDNA制備同時(shí)雜交到微陣列玻片，然后洗滌以去除非特異結(jié)合。玻片然后以適合各標(biāo)記的波長(zhǎng)掃描，量化所得熒光，排列結(jié)果以指示用于陣列上各標(biāo)記的mRNA的相對(duì)豐度。
藥物篩選 本發(fā)明的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞可用于篩選影響這些細(xì)胞和它們不同后代的因
子(如溶劑、小分子藥物、肽、寡核苷酸)或環(huán)境條件(如培養(yǎng)環(huán)境或操作)。 在一些應(yīng)用中，pPS細(xì)胞(未分化或分化)用于篩選促進(jìn)成熟為稍后階段的間充質(zhì)
細(xì)胞前體或末端分化細(xì)胞、或促進(jìn)長(zhǎng)期培養(yǎng)中這些細(xì)胞的增殖和維持的因子。例如，候選成
熟因子或生長(zhǎng)因子的測(cè)試是通過(guò)將它們加入不同孔中的細(xì)胞，然后根據(jù)進(jìn)一步培養(yǎng)和使用
細(xì)胞的所需標(biāo)準(zhǔn)，確定導(dǎo)致的任何表型變化。在一個(gè)例子中，有早期間充質(zhì)細(xì)胞表型的PPS
來(lái)源的細(xì)胞用于篩選因子指導(dǎo)向具體細(xì)胞類(lèi)型分化的能力，如肌細(xì)胞、軟骨或脂肪細(xì)胞。 本發(fā)明的其它篩選應(yīng)用涉及試驗(yàn)藥物化合物對(duì)肌骨骼組織維持或修復(fù)的效果。在
一個(gè)例子中，具有成骨細(xì)胞特征的pPS來(lái)源的細(xì)胞用于篩選因子影響鈣沉積的能力?？蛇M(jìn)
行篩選是因?yàn)樵O(shè)計(jì)的化合物為對(duì)細(xì)胞有藥理學(xué)作用，或因?yàn)樵O(shè)計(jì)有其它作用的化合物可對(duì)
此組織類(lèi)型的細(xì)胞有未想到的副作用?？捎帽景l(fā)明的任何前體細(xì)胞或末端分化細(xì)胞進(jìn)行篩選。 讀者 一 般參考標(biāo)準(zhǔn)教課書(shū)《藥物研究的體外方法》(In vitro MethodsinPharmaceutical Research) ，Academic Press, 1997禾口美國(guó)專(zhuān)利5， 030， 015。評(píng)估候選藥物化合物的活性一般包括結(jié)合本發(fā)明分化細(xì)胞和單獨(dú)或與其它藥物組合的候選化合物。研究者確定了歸因于化合物的細(xì)胞形態(tài)、標(biāo)記表型或功能活性的任何變化(與未處理細(xì)胞或用惰性化合物處理的細(xì)胞相比)，然后使化合物效果與觀察到的變化相關(guān)。
細(xì)胞毒性可在第一個(gè)例子中通過(guò)對(duì)細(xì)胞生存力、存活、形態(tài)和一些標(biāo)記和受體表達(dá)的作用確定。藥物對(duì)染色體DNA的效果可通過(guò)測(cè)量DNA合成和修復(fù)確定。[3扣-胸苷或BrdU摻入，尤其在細(xì)胞周期外中的末預(yù)定時(shí)間或高于細(xì)胞復(fù)制所需水平，與藥物效果一致。不需要的效果也可包括通過(guò)中期擴(kuò)展確定的姐妹染色單體交換的不正常比率。讀者可參考A.Vickers(《藥物研究的體外方法》，375-440頁(yè)，Academic Press, 1997)的進(jìn)一步闡明。
可用任何標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)評(píng)估細(xì)胞功能的效果以觀察間充質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的表型或活性，如受體結(jié)合、基質(zhì)沉積或鈣加工_在細(xì)胞培養(yǎng)中或合適動(dòng)物模型中。
治療用途 本發(fā)明也提供間充質(zhì)細(xì)胞或成骨細(xì)胞的使用以提高組織維持或肌骨骼系統(tǒng)的修 復(fù)用于任何感覺(jué)需要，如代謝功能中的先天性缺陷、疾病情況的效果或顯著損傷的結(jié)果。
為確定用于治療施用的細(xì)胞組合物的適宜性，細(xì)胞可首先在合適動(dòng)物模型中試 驗(yàn)?？稍谝粋€(gè)水平評(píng)估細(xì)胞體內(nèi)存活和維持它們表型的能力。細(xì)胞組合物施用給免疫缺陷 動(dòng)物(如裸鼠，或表現(xiàn)出化學(xué)上免疫缺陷的動(dòng)物或通過(guò)輻射)。再生長(zhǎng)一段時(shí)間后收集組 織，評(píng)估PPS來(lái)源的細(xì)胞是否仍存在。 這可通過(guò)施用表達(dá)可檢測(cè)標(biāo)記(如綠色熒光蛋白或13半乳苷酶)和預(yù)標(biāo)記(例如 用BrdU或[3H]_胸苷)的細(xì)胞，或通過(guò)隨后檢測(cè)組成型細(xì)胞標(biāo)記(例如用人_特異抗體) 來(lái)進(jìn)行。評(píng)估被施用細(xì)胞的存在和表型可通過(guò)免疫組織化學(xué)或用人-特異抗體的ELISA，或 者通過(guò)用引物的RT-PCR和根據(jù)公開(kāi)的序列數(shù)據(jù)引起特異于人多核苷酸擴(kuò)增的雜交條件。
也可通過(guò)評(píng)估用間充質(zhì)細(xì)胞群處理產(chǎn)生的恢復(fù)程度來(lái)確定適宜性。例如，骨和軟 骨的再生能力可用大鼠顱蓋缺陷模型確定(美國(guó)專(zhuān)利6， 200， 606)。有確立的動(dòng)物模型用于 治療兔、狗和猴中的下頜缺陷、上頜牙槽裂和骨切除裂(W0 99/39724)。可用X-射線分析 和其它技術(shù)監(jiān)控骨沉積到模型損傷中。重構(gòu)建的骨組織可用標(biāo)準(zhǔn)生物機(jī)械試驗(yàn)評(píng)估功能。 參見(jiàn)Mi謹(jǐn)ide等，Spine 24 :1863， 1999 ;Takahashi等，J. Neurosurg. 90 (4suppl.) :224， 1999 ;Helm等，J. Neurosurg. 88 :354， 1997。 適當(dāng)試驗(yàn)后，本發(fā)明的分化細(xì)胞可用于人患者或需要這種治療的其它對(duì)象中的組 織重構(gòu)建或再生。細(xì)胞施用方式使它們移植或移到預(yù)期的組織部位并重構(gòu)建或再生功能缺 陷區(qū)域。這種治療的醫(yī)學(xué)指示包括再生肌骨骼缺陷、骨折修復(fù)、脊髓復(fù)原、安裝假體和修復(fù) 骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的損傷。 組合物施用取決于修復(fù)的肌骨骼部位。例如，骨生成可促進(jìn)與手術(shù)過(guò)程重塑組織 或插入裂片或者假體裝置如髖取代物一致。在其它情況中，不需侵入的手術(shù)，可通過(guò)注射或 (為修復(fù)脊柱)用可引導(dǎo)內(nèi)診鏡施用組合物。 本發(fā)明的間充質(zhì)細(xì)胞和成骨細(xì)胞可以藥物組合物形式提供，包括在充分無(wú)菌條 件下制備的等滲賦形劑用于人類(lèi)施用。對(duì)于藥用制劑的一般原理，讀者可參考《細(xì)胞治 療干細(xì)胞移植、基因治療和細(xì)胞免疫治療》(Cell Ther即y :Stem CellTransplantation， Gene Therapy, and Cellular Immunotherapy), G.Morstyn&W. Sheridan編，Cambridge University Press, 1996 ;《造血干細(xì)胞細(xì)胞治療》(Hematopoietic StemCell Therapy), E. D. Ball, J. Lister&P. Law, Churchill Livingstone, 2000。選擇細(xì)胞賦形劑和任何伴隨的 組合物成分根據(jù)用于施用的裝置改變。 如果需要，細(xì)胞制備可進(jìn)一步包括或與補(bǔ)充生物活性因子共施用，如合成糖皮質(zhì) 激素像地塞米松、或骨形態(tài)發(fā)生蛋白如BMP-2或BMP-4。其它可能的伴隨成分包括適合協(xié)助 骨再生的鈣或磷酸的無(wú)機(jī)源(W0 00/07639)。如果需要，細(xì)胞制備可施用在載體基質(zhì)或材料 上以提供改進(jìn)的組織再生。例如，材料可以是粒狀陶瓷或生物聚合物如明膠、膠原、骨粘連 蛋白、血纖蛋白原或骨鈣蛋白。多孔基質(zhì)可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)合成(如Mikos等，Biomaterials 14 :323， 1993 ;Mikos等，Polymer 35 :1068， 1994 ;Cook等，J. BioMed. Mater. Res. 35 :513， 1997)。
組合物可任選地包裝在合適的容器中，根據(jù)書(shū)面說(shuō)明用于所需目的，如再構(gòu)建間 充質(zhì)細(xì)胞功能以改進(jìn)一些肌骨骼畸形。 提供下列例子作為發(fā)明具體實(shí)施方案的進(jìn)一步非限制闡明。
實(shí)施例 實(shí)施例1 :沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的胚胎干細(xì)胞繁殖 未分化人胚胎干(hES)細(xì)胞的確立系維持在本質(zhì)上沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境中。
沒(méi)有飼養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)用條件培養(yǎng)基維持，條件培養(yǎng)基用根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)步驟 (W001/51616)分離的原代小鼠胚胎成纖維細(xì)胞制備。成纖維細(xì)胞通過(guò)用沒(méi)有&++/1%++的 PBS洗滌一次和在1. 5-2mL胰蛋白酶/EDTA(Gibco)中培養(yǎng) 5分鐘從T150燒瓶中收集。 成纖維細(xì)胞從燒瓶中分離后，它們?cè)趍EF培養(yǎng)基(DMEM+10% FBS)中收集。細(xì)胞以4000拉 德照射，計(jì)數(shù)并以 55， 000個(gè)細(xì)胞cm-2接種于mEF培養(yǎng)基(525， 000個(gè)細(xì)胞/孔的6孔平 板)。 至少4小時(shí)后，培養(yǎng)基用SR交換，SR含ES培養(yǎng)基(80 %剔除DMEM(GibcoBRL， Rockville MD)、20X剔除血清取代物(Gibco) 、 1 %非必需氨基酸(Gibco) 、 ImML-谷氨酰胺 (Gibco)和0. ImM P -巰基乙醇(Sigma, St. Louis, M0)，添加有4ng/mL重組人堿性成纖維 細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF ;Gibco)。約0. 3-0. 4mL培養(yǎng)基以每cm2平板表面積為條件。加入hES 培養(yǎng)物前，條件培養(yǎng)基添加有4ng/mL人bFGF。 培養(yǎng)ES細(xì)胞的平板包被Matrige1⑧(Becton-Dickinson， Bedford MA)，這是通過(guò) 在冷K0 DMEM中稀釋儲(chǔ)存液 1 : 30、以0. 75-1. 0mL每9. 6cm2孔分散，且室溫培養(yǎng)4小時(shí)
或4t:過(guò)夜。 HES培養(yǎng)物傳代是通過(guò)在 200U/mL膠原酶IV中37。C培養(yǎng)約5_10分鐘。通過(guò)用 PipetmanTM在顯微鏡下取出單獨(dú)集落或刮擦來(lái)收集細(xì)胞，接著在條件培養(yǎng)基中溫和分離成 小塊，然后接種到Matrigel⑧'包被的平板上。接種后約1周培養(yǎng)物匯合并可傳代。培養(yǎng)物在 這些條件下維持超過(guò)180天連續(xù)表現(xiàn)出ES樣形態(tài)。 通過(guò)用SSEA-4(1 : 20) 、 Tra+60(1 : 40)和Tra+81 (1 : 80)的第一抗體培 養(yǎng)樣品孔進(jìn)行免疫細(xì)胞化學(xué)，在剔除DMEM中37t:稀釋30分鐘。細(xì)胞用溫和剔除DMEM洗 滌并在2%多聚甲醛中固定15分鐘，然后用PBS。細(xì)胞用PBS中的5%山羊血清室溫培養(yǎng) 30分鐘，接著用FITC-結(jié)合的山羊抗小鼠IgG(1 : 25) (Sigma)培養(yǎng)30分鐘。洗滌細(xì)胞，用 DAPI染色并封固。 也檢測(cè)細(xì)胞的堿性磷酸酶表達(dá)，堿性磷酸酶是未分化ES細(xì)胞的標(biāo)記。這是通過(guò)在 腔式載玻片上培養(yǎng)細(xì)胞，4%多聚甲醛中固定15分鐘然后用PBS洗滌進(jìn)行的。細(xì)胞然后用 堿性磷酸酶底物(Vector Laboratories, Inc. ， Burlingame CA)室溫黑暗培養(yǎng)1小時(shí)。載 玻片封固前在100%乙醇中漂洗2-5分鐘。 圖1顯示組織化學(xué)檢測(cè)的hES細(xì)胞上標(biāo)記表達(dá)。如飼養(yǎng)細(xì)胞上的細(xì)胞所見(jiàn)， SSEA-4、 Tra-1-60和Tra-l_81和堿性磷酸酶由hES集落表達(dá)-但不由集落之間的分化細(xì) 胞表達(dá)。 未分化hES細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶PCR擴(kuò)增分析。為放射性相對(duì)定量 單獨(dú)基因產(chǎn)物，根據(jù)廠商說(shuō)明使用QuantumRNA Alternate 18S內(nèi)部標(biāo)準(zhǔn)引物(Ambion， Austin TX，USA)。簡(jiǎn)要地，確定具體引物對(duì)擴(kuò)增的線性范圍，然后用合適的alternate18S引物競(jìng)爭(zhēng)物(competimer)的混合物共擴(kuò)增以產(chǎn)生具有一致線性范圍的PCR產(chǎn)物。 AmpllTaq (Roche)加入到PCR反應(yīng)前，根據(jù)廠商說(shuō)明酶用TaqStartTM(Pr0Mega)預(yù)培養(yǎng)。 放射性PCR反應(yīng)在5%非變性聚丙烯酰胺凝膠上分析、干燥和暴露于phosphoimage屏 (Molecular Dynamics) 1小時(shí)。屏用Molecular Dyn咖icsStorm 860掃描且用ImageQimnt 軟件量化帶強(qiáng)度。結(jié)果表示為摻入到hTERT或0ct-4帶的放射性比例，按摻入到18s帶的 放射性標(biāo)準(zhǔn)化。此實(shí)驗(yàn)所用引物序列可在PCT出版物WO 01/51616中找到。
轉(zhuǎn)錄因子0ct-4通常在未分化hES細(xì)胞中表達(dá)且對(duì)分化負(fù)調(diào)節(jié)。維持在條件培養(yǎng) 基中的Matrigel⑧上21天的細(xì)胞表達(dá)hTERT和0ct-4。端粒酶活性通過(guò)TRAP試驗(yàn)測(cè)量(Kim 等，Science 266 :2011， 1997 ;Weinrich等，Nature Genetics 17:498,1997)。維持在無(wú)飼 養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中的細(xì)胞培養(yǎng)超過(guò)40天后顯示陽(yáng)性端粒酶活性。 無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的未分化細(xì)胞的多能性確定是通過(guò)在懸浮培養(yǎng)中4天形成胚胎 樣小體，然后在聚鳥(niǎo)氨酸包被的平板上培養(yǎng)7天。免疫細(xì)胞化學(xué)顯示與神經(jīng)元和心肌細(xì)胞 譜系一致的染色模式，以及染色a-胎蛋白的細(xì)胞，a-胎蛋白是內(nèi)胚層譜系的標(biāo)記。也測(cè) 試未分化細(xì)胞通過(guò)肌肉內(nèi)注射到SCID小鼠形成畸胎瘤的能力。所得腫瘤78-84天后切除。 來(lái)自所有三個(gè)胚層的細(xì)胞類(lèi)型用組織學(xué)分析鑒定。
實(shí)施例2 :分化細(xì)胞系的確立 胚胎樣小體如下產(chǎn)生。通過(guò)在lmg/mL膠原酶中培養(yǎng)5_20分鐘收集匯合的hES細(xì) 胞單層培養(yǎng)物，細(xì)胞從平板上刮下。然后細(xì)胞分離成塊并平板培養(yǎng)于非粘附細(xì)胞培養(yǎng)平板 (Costar)，培養(yǎng)基包括80X K0("剔除")DMEM(Gibco)和20%非熱滅活FBS (Hyclone)，添 加有1%非必需氨基酸、1慮L-谷氨酰胺和O. ImM P-巰基乙醇。細(xì)胞以l : l或l : 2 比例接種于2mL培養(yǎng)基每孔中(6孔平板)。通過(guò)添加2mL培養(yǎng)基/孔每隔一天喂飼Ebs當(dāng) 培養(yǎng)基體積超過(guò)4mL/孔時(shí)，收集EBs并重懸浮于新鮮培養(yǎng)基中。懸浮4_8天后，EBs平板 培養(yǎng)在底物上。 分化細(xì)胞系通過(guò)收集胚胎樣小體來(lái)源的細(xì)胞并使它們進(jìn)一步分化來(lái)確立。通過(guò)在 PBS中的2mg/mL II型膠原酶中37"C培養(yǎng)30分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞分離、離心、重懸浮于分 化培養(yǎng)基中并平板培養(yǎng)于6孔平板。增殖細(xì)胞傳代于hEF培養(yǎng)基中(90% DMEM、10X熱滅 活FBS、0. lmM非必需氨基酸和2mM L-谷氨酰胺)，每2_3天喂飼。兩次傳代后，細(xì)胞群與成 纖維細(xì)胞的形態(tài)特征相似。此細(xì)胞系命名為HEF1。 轉(zhuǎn)導(dǎo)亞細(xì)胞群用于表達(dá)人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)。這伴隨著用反轉(zhuǎn)錄病毒構(gòu)建 物pBABEpuro hTERT感染，構(gòu)建物含由MoLV LTR驅(qū)動(dòng)的hTERT編碼序列和由SV40早期啟 動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的嘌呤霉素-抗性基因。生長(zhǎng)培養(yǎng)基用含5mL反轉(zhuǎn)錄病毒儲(chǔ)存液(lX106pfu/mL) 和4iig/mL polybrene(l，5-二甲基-l，5-二氮i^一亞甲基聚甲溴化物)的混合物替換， 37t:培養(yǎng)。8小時(shí)后，加入另外的5mL反轉(zhuǎn)錄病毒/polybrene混合物，細(xì)胞37。C培養(yǎng)。第 二天，去除反轉(zhuǎn)錄病毒/polybrene混合物并用新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。下一天，培養(yǎng)基用添 加有0.5微克/mL嘌呤霉素的生長(zhǎng)培養(yǎng)基替換。細(xì)胞以l : 4的比例在令嘌呤霉素培養(yǎng)基 中約一周一次分裂8周，然后測(cè)試細(xì)胞的端粒酶活性。 圖2 (A組)顯示端?；疕EF1細(xì)胞系的形態(tài)。B組(下面)顯示TRAP試驗(yàn)中測(cè)量 的端粒酶活性。用hTERT表達(dá)盒轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)后20天或65天顯示陽(yáng)性端粒酶活性。未 轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系或用對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞沒(méi)有顯示端粒酶活性。HTERT-轉(zhuǎn)導(dǎo)的HEF1細(xì)胞和
17用對(duì)照載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞約每2天一次加倍直到第38天對(duì)照細(xì)胞停止分裂。HTERT-轉(zhuǎn)染細(xì) 胞以恒定生長(zhǎng)速率連續(xù)增殖超過(guò)60天(30次加倍)。 ES細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基用實(shí)施例8中的條件，使用6000拉德照射的HEF1細(xì)胞并以 4. 1到5. 5X 104個(gè)細(xì)胞cm—2接種。測(cè)試培養(yǎng)基支持培養(yǎng)于Matrigel⑧底物上的H9hES細(xì)胞 系生長(zhǎng)的能力。用HEF1條件培養(yǎng)基維持hES細(xì)胞超過(guò)4次傳代，表現(xiàn)出未分化ES細(xì)胞形 態(tài)，且維持HTERT和0ct-4的表達(dá)。
實(shí)施例3 :成骨細(xì)胞樣細(xì)胞的進(jìn)一步分化 如上所述，人ES細(xì)胞(Hl細(xì)胞系，傳代30次)維持在無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞的條件中。為用 于此實(shí)驗(yàn)，hES細(xì)胞以 1X 105cm—2接種于mEF條件培養(yǎng)基中的Matrigel⑧上。端?；疕EF1 細(xì)胞以3. lX103cm—2平板培養(yǎng)于含10% FBS、1X非必需氨基酸和2mML_谷氨酰胺的DMEM 中。正常人間充質(zhì)干細(xì)胞(hMSC)獲得自BioWhittakerlnc. ，MD(Cambrex公司的子公司)。 根據(jù)廠商說(shuō)明它們維持在MSC生長(zhǎng)培養(yǎng)基(BioWhittaker Part#PT_3001)中。BJ5ta成纖 維細(xì)胞系(Bodnar等，Science 279 :349， 1998)維持在從1 : 3M199/DMEM中的10% FBS制 成的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中。 最后一次傳代后兩天，各培養(yǎng)基用成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基(OIM)置換以誘導(dǎo)分化。 OM以MSC生長(zhǎng)培養(yǎng)基(ClonTech目錄號(hào)ftPT-3238)(美國(guó)專(zhuān)利5，486， 359)為基礎(chǔ)，培養(yǎng)基 添加有0. 1 ii M地塞米松、5 ii M抗壞血酸-2-磷酸、10mMP -甘油磷酸和100ng/mL BMP_4。 細(xì)胞每2-3天喂飼新鮮OIM。 在OM中l(wèi)l天后，所有細(xì)胞顯示細(xì)胞形態(tài)的變化。HEF1細(xì)胞、hMSC和BJ細(xì)胞從 紡錘形狀變成立方形，一些細(xì)胞變得更扁平。hES細(xì)胞顯示混合分化群的不同形態(tài)。
細(xì)胞在含2X多聚甲醛的PBS中中固定20分鐘，用PBS洗滌并分析成骨細(xì)胞標(biāo)記。 堿性磷酸酶(AP)用Vector底物(Vector Laboratories, Inc. ， Burlingame， CA)檢測(cè)。AP 的表達(dá)明顯定位于分化HI細(xì)胞以及HEF1、 BJ和hMSC細(xì)胞的細(xì)胞簇。 通過(guò)成骨細(xì)胞、膠原-1和骨鈣蛋白產(chǎn)生基質(zhì)蛋白，通過(guò)免疫染色檢測(cè)。用100 %乙 醇處理2分鐘使培養(yǎng)物通透性增加。PBS洗滌后，培養(yǎng)物用含5%正常山羊血清的PBS培養(yǎng) 2小時(shí)，然后用第一兔抗體抗膠原-l(1 : 10，Monosa目錄號(hào)ftP5041)或骨鈣蛋白(1 : 50， Biomedical Technologies Inc.目錄號(hào)ftl3T593)。染色用FITC-標(biāo)記的第二山羊抗兔免 疫球蛋白(1 : 100， Southern Biotechnology Associate Inc.目錄號(hào)#4050-02)顯現(xiàn)。
圖3顯示結(jié)果。A和B組顯示標(biāo)記骨f丐蛋白和膠原-1的免疫細(xì)胞化學(xué)。C組顯示 堿性磷酸酶活性染色。這些特征是成骨細(xì)胞譜系細(xì)胞的特征。 這些數(shù)據(jù)與體外經(jīng)受合適分化操作時(shí)hES細(xì)胞和HEF1細(xì)胞具有產(chǎn)生成骨細(xì)胞能 力的假設(shè)一致。 要理解的是本公開(kāi)所述發(fā)明的一些改變對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)最佳化的事情， 且可不級(jí)離發(fā)明精神或所附權(quán)利要求書(shū)范圍完成。
權(quán)利要求
1. 一種含有間充質(zhì)譜系細(xì)胞的細(xì)胞群，其中，所述間充質(zhì)譜系細(xì)胞是已確立的人胚胎 干細(xì)胞系的體外培養(yǎng)后代。
2. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)骨鈣蛋白。
3. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)膠原-1。
4. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)堿性磷酸酶。
5. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞呈紡錘形。
6. 如權(quán)利要求1所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞表達(dá)一種或多種下列標(biāo)記 CD 106、 CD 166、 CD29、 CD44、和GATA-4。
7. 如權(quán)利要求6所述的細(xì)胞群，其特征在于，所述細(xì)胞不表達(dá)CD14或CD45。
8. —種將已確立的人胚胎干細(xì)胞系分化成間充質(zhì)譜系細(xì)胞的方法，其特征在于，該方 法包括獲得已確立的人胚胎干細(xì)胞系，和在含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白的培養(yǎng)基中分化該人胚胎 干細(xì)胞系。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白是NMP-4。
10. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有地塞米松。
11. 如權(quán)利要求8所述方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有抗壞血酸。
12. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基還含有P-甘油磷酸。
全文摘要
文檔編號(hào)C12N5/0775GK101696397SQ20091015213
公開(kāi)日2010年4月21日 申請(qǐng)日期2002年7月3日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月6日
發(fā)明者C·徐, R·S·希斯 申請(qǐng)人:杰龍公司;