一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株y4及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物保護(hù)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Υ4 及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 稻瘟病是一種在水稻上發(fā)生的世界性真菌病害，嚴(yán)重影響水稻生產(chǎn)和糧食安全。 據(jù)報(bào)道，全球每年因稻瘟病造成的水稻產(chǎn)量損失約占總產(chǎn)量的10~15%，經(jīng)濟(jì)損失達(dá)數(shù)十 億美元；在我國(guó)，稻瘟病每年都有不同程度發(fā)生，特別是近幾年，在西南、長(zhǎng)江中游和東北等 稻作區(qū)持續(xù)大發(fā)生，年發(fā)病面積達(dá)330~570萬(wàn)公頃，損失稻谷數(shù)億公斤，給我國(guó)水稻安全 生產(chǎn)帶來(lái)了巨大隱患（劉占領(lǐng)等，2007;鄭釗等，2009)。目前在大多數(shù)情況，仍然依靠傳統(tǒng) 的化學(xué)藥劑和種植抗病品種來(lái)控制該病害，但效果并不是很理想。加之人們對(duì)食品安全的 日益重視及環(huán)保意識(shí)的逐漸加強(qiáng)，化學(xué)藥劑的使用已不再是現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上首推的防治措 施；受病原菌小種遺傳的復(fù)雜性、致病多樣性及極易變異性三方面因素影響，導(dǎo)致新的抗病 品種常常推廣數(shù)年后便失去抗性（Skamni〇ti&Gurr，2009)。因此，發(fā)展稻瘟病持續(xù)、環(huán)境友 好的防治措施需要對(duì)稻瘟病的病害侵染、發(fā)生和成災(zāi)過程有一個(gè)更加深入系統(tǒng)的了解。
[0003] 稻痕病菌（Magnaportheoryzae)作為一種傳統(tǒng)的"氣傳"病原真菌，被劃歸于巨 座殼科（Magnaporthaceae)，而巨座殼科真菌除稻痕菌外還包括典型的土傳病原真菌，如小 麥全蝕病菌Gaeumannomycesgraminis、草坪夏季斑枯病菌M.poae和小麥根部侵染病原 M.rhizophila(Cannon，1994)。18S和28SrDNA等聚類分析結(jié)果表明，稻瘟病菌與以上土傳 病菌均可聚為一類，親緣關(guān)系較為接近（Cannon, 1994;Thongkanthaetal.，2009)。Sesma 和Osbourn(2004)報(bào)道稻瘟病菌可在菌絲上形成簡(jiǎn)單的膨大附著枝侵入水稻根部，2~4周 后在根、莖、葉、穗部位可觀察到典型的稻瘟病斑，雖然癥狀出現(xiàn)時(shí)間與分生孢子侵入地上 組織相比較慢，但這已說(shuō)明M.oryzae可通過根部系統(tǒng)侵染水稻引起全株發(fā)病。因此稻瘟菌 除經(jīng)氣傳侵染外，在田間還可能由水稻根部侵染，在植株地上部分引起典型的稻瘟病癥狀。 由此，推測(cè)稻瘟病可能在田間也兼顧土傳病害的侵染、流行特點(diǎn)。盡管如此，在已有研究中， 研究者在室內(nèi)對(duì)稻瘟病菌根部接種發(fā)病率很低，平均發(fā)病率僅10%左右，這極大的限制了 關(guān)于稻瘟病菌對(duì)水稻根部侵染機(jī)制的深入研究。鑒于此，有必要弄清不同條件對(duì)稻瘟病根 部侵染發(fā)病的影響，建立稻痕病菌根部接種體系，打破制約稻痕病致病機(jī)制深入研究的技 術(shù)瓶頸。
[0004] 因此在室內(nèi)完善稻瘟病的人工接種條件，建立起一套穩(wěn)定高效的稻瘟病根部接種 技術(shù)體系，已成為現(xiàn)今研究的一項(xiàng)重要任務(wù)。而植物病原真菌侵染寄主的關(guān)鍵在于其本身 的致病力以及侵染的環(huán)境條件，所以本發(fā)明以一株強(qiáng)致病力的稻瘟菌株作為出發(fā)菌株，構(gòu) 建穩(wěn)定地稻瘟菌綠色熒光標(biāo)記菌株作為研究對(duì)象；圍繞這個(gè)菌株研究并建立了一套高效穩(wěn) 定的稻瘟菌根部接種體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供了一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌 株Y4,該菌株已于2015年10月8號(hào)送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：稻瘟菌 (Magnaportheoryzae)Y4,保藏編號(hào)：CCTCCN0:M2015592,地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0006] 本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Y4的應(yīng) 用，利用該病菌選擇合適的環(huán)境參數(shù)對(duì)水稻進(jìn)行侵染，解決了目前稻瘟病根部接種發(fā)病率 不穩(wěn)定這一難題。
[0007] 為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施：
[0008] -種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Y4的獲得：
[0009] 將稻瘟菌野生型菌株和含有質(zhì)粒pCAMsgfp農(nóng)桿菌的頂培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，挑取單 菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28 °C下培養(yǎng)5d(重復(fù)3次），對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生理生 化特性的鑒定，最終獲得了一株高效穩(wěn)定的稻瘟病菌Y4,在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡 下觀測(cè)分生孢子形態(tài)，分生孢子發(fā)綠色熒光，洋梨形或倒棍棒形，頂端鈍尖，基部鈍圓，有腳 胞，與野生型菌株相比，在孢子形態(tài)上沒有差異，呈典型稻瘟病菌分生孢子特征。每平方厘 米的產(chǎn)孢量可達(dá)到9. 43X105個(gè)/ml，孢子萌發(fā)率為98 %。
[0010] 該菌株已于2015年10月8號(hào)送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：稻瘟 菌（Magnaportheoryzae)Y4,保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2015592,地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。一 種適用于根部接種的稻瘟病菌菌株Y4的應(yīng)用，包括利用該菌株侵染水稻，具體包括以下步 驟：
[0011] 采用菌絲塊根部接種法，水稻種子置于〇. 7%的水瓊脂培養(yǎng)基上，黑暗28°C保濕 催芽生長(zhǎng)，直至幼根生長(zhǎng)至5-6cm，將幼根生長(zhǎng)健壯的幼苗移至裝有35ml蛭石的玻璃管中， 4個(gè)菌塊放在幼根上，其上用15ml的蛭石覆蓋，再加水至蛭石水勢(shì)為-2Kp，接種后的水稻植 株放置在32°C、16h光照/8h黑暗條件的培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具備以下優(yōu)點(diǎn)：
[0013] 1.通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)（ATMT)遺傳轉(zhuǎn)化方法，獲得攜帶GFP標(biāo)記的抗潮霉素轉(zhuǎn)化子。 對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行致病力、熒光強(qiáng)度以及熒光穩(wěn)定性的篩選，得到一株致病力強(qiáng)、熒光信號(hào)強(qiáng)且 穩(wěn)定的熒光標(biāo)記菌株。由于轉(zhuǎn)化子可發(fā)綠色熒光，便于跟蹤稻瘟菌的侵染過程。
[0014] 2.提供了一種適用于稻痕病菌（Magnaportheoryzae)Y4的穩(wěn)定高效的稻痕菌根 部侵染方法，為進(jìn)一步研究稻瘟菌根部侵染機(jī)制提供條件，在理論上可在病害循環(huán)、發(fā)病因 素方面深入認(rèn)識(shí)稻瘟病，在實(shí)踐應(yīng)用上，可為稻瘟病防控措施的正確實(shí)施提供指導(dǎo)。
【附圖說(shuō)明】
[0015] 圖1為培養(yǎng)7天的稻瘟病菌菌株Y4菌落形態(tài)示意圖；
[0016] 其中圖1中a為菌落形態(tài)反面，圖1中b為菌落形態(tài)正面。
[0017] 圖2為培養(yǎng)7天的稻瘟菌菌株Y4分生孢子；
[0018] 其中圖2中a為明場(chǎng)下觀察形態(tài)，圖2中b為熒光下觀察形態(tài)。
[0019] 圖3為菌絲塊接種根部方法示意圖。
[0020] 圖4為稻痕病菌根部侵染發(fā)病不意圖；
[0021] 其中圖4中a為發(fā)病植株整體形態(tài)，b為葉部發(fā)病部位在明場(chǎng)、熒光條件下觀察侵 染情況，c為莖部發(fā)病部位在明場(chǎng)、熒光條件下觀察侵染情況，d為根部發(fā)病部位在明場(chǎng)、熒 光條件下觀察侵染情況。
【具體實(shí)施方式】
[0022] 本發(fā)明所述技術(shù)方案，如未特別說(shuō)明，均為本領(lǐng)域的常規(guī)方案，所用試劑或材料， 如未特別說(shuō)明均為公眾可獲得的。
[0023] 實(shí)施例1:
[0024] 稻痕病菌（Magnaportheoryzae)Y4的獲得及鑒定：
[0025] 將稻瘟菌野生型菌株和含有質(zhì)粒pCAMsgfp農(nóng)桿菌的頂培養(yǎng)液混合培養(yǎng)，挑取單 菌落于含潮霉素50μg/ml的PDA平板上，28 °C下培養(yǎng)5d(重復(fù)3次），共篩選出243個(gè)轉(zhuǎn)化 子，對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行生理生化特性的鑒定，最終獲得了一株高效穩(wěn)定的稻瘟病菌Y4。將稻瘟 病菌Y4菌絲塊，置于PDA平板上，28°C光照條件下培養(yǎng)7天，觀察其菌落形態(tài)，菌落從中間 到邊緣依次是褐色、淡褐色、黑褐色、白色，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，呈典型稻瘟病菌菌落特征（圖 1)。在普通光學(xué)顯微鏡和熒光顯微鏡下觀測(cè)分生孢子形態(tài)，分生孢子發(fā)綠色熒光，洋梨形或 倒棍棒形，頂端鈍尖，基部鈍圓，有腳胞，與野生型菌株相比，在孢子形態(tài)上沒有差異，呈典 型稻瘟病菌分生孢子特征（圖2)。每平方厘米的產(chǎn)孢量可達(dá)到9. 43X105個(gè)/ml，孢子萌 發(fā)率為98%。
[0026] 該菌株已于2015年10月8號(hào)送至中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏，分類命名：稻瘟 菌（Magnaportheoryzae)Y4,保藏編號(hào)：CCTCCNO:M2015592,地址：中國(guó)武漢武漢大學(xué)。
[0027] 稻瘟病菌GFP熒光菌株Y4分子鑒定：采用CTAB法