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水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標(biāo)記及應(yīng)用

文檔序號(hào):10715769閱讀:1088來源:國知局
水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標(biāo)記及應(yīng)用
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個(gè)水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標(biāo)記及應(yīng)用,它以廣譜高抗稻瘟病常規(guī)水稻品種:自選2號(hào)為供體,稻瘟病敏感水稻品種:麗江新團(tuán)黑谷LTH為受體,通過二者正反雜交,構(gòu)建F2群體,通過圖位克隆的方法定位到一個(gè)含NB?ARC結(jié)構(gòu)域的抗稻瘟病目標(biāo)基因,該目標(biāo)基因在抗感親本之間僅存在1個(gè)氨基酸的差異,且差異位于NB?ARC結(jié)構(gòu)域的磷酸結(jié)合環(huán)P?loop上,確定該基因?yàn)樗究沟疚敛』騊itb,最后根據(jù)抗感基因的差異開發(fā)出相應(yīng)的分子標(biāo)記。將水稻抗稻瘟病基因Pitb轉(zhuǎn)入感稻瘟病的水稻品種中,有助于產(chǎn)生新的抗稻瘟病病水稻新品種。水稻抗稻瘟病基因Pitb的分子標(biāo)記可大大提高該基因應(yīng)用于育種選擇效率,縮短育種時(shí)間。
【專利說明】
水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標(biāo)記及應(yīng)用
技術(shù)領(lǐng)域
[0001]本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)及育種領(lǐng)域,尤其是涉及一個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb、分離克隆方法、分子標(biāo)記及其在水稻改良中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]由稻痕病菌(Magnaporthe grisea)引起的稻痕病是水稻種植中最具毀滅性的真 菌病害之一,也是世界性的真菌病害(Okuyama et al · ,2011; Inoue et al · ,2013)。至今已 有80余個(gè)國家有稻瘟病發(fā)生的報(bào)道,其中以亞洲和非洲發(fā)病最為嚴(yán)重,據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),全球 每年因稻瘟病造成水稻減產(chǎn)達(dá)11%~30%,年平均超過一千萬噸,嚴(yán)重威脅著世界的糧食 生產(chǎn)(Wilson et al.,2009;Zhai et al· ,2011 ;Xu et al· ,2014)。目前培育和推廣應(yīng)用抗 性品種是防治稻痕病最經(jīng)濟(jì)有效且環(huán)保安全的措施(Ashikawa et al.,2008;Takahashi et al.,2010)。常規(guī)育種囿于抗源缺乏、遠(yuǎn)緣雜交的生殖隔離和效率低下,在培育抗稻瘟病 新品種上很難滿足生產(chǎn)要求(Hayashi et al.,2009;Yuan et &1.,2011)。實(shí)踐證明,利用 分子標(biāo)記輔助選擇(marker-assisted selection,MAS)育種實(shí)現(xiàn)抗病基因的定向轉(zhuǎn)移和聚 合,在培育持久抗稻瘟病新品種上顯示出常規(guī)育種無法比擬的優(yōu)勢(李彬等,2014)。水稻抗 稻瘟病新基因的克隆則是有效地開展水稻抗病分子標(biāo)記輔助選擇育種的重要前提和基礎(chǔ)。
[0003] 抗稻瘟病基因的定位和克隆是進(jìn)行水稻抗病分子作用機(jī)制研究的基礎(chǔ),有助于揭 示寄主與病原菌互作機(jī)理,隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,定位和克隆抗性基因已成為當(dāng)今分子 病理學(xué)的熱門課題(Lee et al.,2009;Lei et al.,2013)。在過去的數(shù)十年,科學(xué)家對(duì)稻瘟 病抗性進(jìn)行了廣泛的分子遺傳研究,截至2015年3月,已至少報(bào)道了69個(gè)抗稻瘟病位點(diǎn),84 個(gè)主效基因,已成功克隆的有24個(gè)主效基因,其中Pik(Pik-l和Pik-2)、Pit、Pita、Piz-t、 卩1(12、?1(13/?125、?121、?136和?137等基因的抗病等位基因與感病等位基因之間的基因編 碼區(qū)存在堿基替換;其他基因的抗病等位基因與感病等位基因序列或片段長度也存在多態(tài) 性(國家水稻數(shù)據(jù)中心http: //www.ricedata. cn/gene)。
[0004] 在這些報(bào)道中,除?11、?12、?19、?1-20、?1-33、?1-40、卩11111、?11^-11^^54等少數(shù)幾 個(gè)具有廣譜抗性外,其余大都表現(xiàn)為生理小種特異抗性(Qu et al.,2006;Xu et al., 2008;Zhu et al.,2012)。同時(shí),所定位或克隆的抗稻瘟病基因多源于野生稻資源,而從具 有優(yōu)良農(nóng)藝性狀的水稻材料中定位和克隆抗性基因的報(bào)道不多見,由于野生稻的種質(zhì)資源 本身農(nóng)藝性狀較差,在育種實(shí)踐中容易出現(xiàn)不利基因的連鎖累贅,導(dǎo)致這些抗性基因難以 被直接利用,難以滿足抗稻瘟病育種的要求(Chen et al.,2006;Xu et al.,2014)。然而, 如果從農(nóng)藝性狀優(yōu)良的廣譜抗稻瘟病品種中挖掘新的抗病基因,將有利于縮短抗病品種的 育種周期從而提高育種效率。
[0005] 水稻抗稻瘟病基因有著類似的保守結(jié)構(gòu)域,根據(jù)這一特點(diǎn),可將抗稻瘟病性基因 分成三類:NBS_LRR(nucleotide binding site-leucine rich repeat motif)類、凝集素 受體類和脯氨酸受體類。目前已報(bào)道的抗稻瘟病基因除Pid2(Chen et al.,2006)和pi21 (Fukuoka et al. ,2009)外都屬于NBS-LRR類,NBS-LRR蛋白質(zhì)含有2個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域:核苷 酸結(jié)合位點(diǎn)(NBS)及富亮氨酸重復(fù)序列(LRR)(劉浩等,2014) JBS結(jié)構(gòu)域具有ATP或GTP結(jié)合 水解功能,通過獲得能量來抵御病原菌入侵,并能夠改變ATP的構(gòu)象從而傳遞信號(hào)分子 (McHale et al.JOOehLRR結(jié)構(gòu)域趨向高度可變,該區(qū)域內(nèi)含有一系列的β折疊,基因片段 的插入與缺失會(huì)導(dǎo)致β折疊的方向改變,其易于改變的結(jié)構(gòu)可能與其能夠特異性識(shí)別病原 物效應(yīng)蛋白質(zhì)有關(guān)(Joshi et al.,2013)。
[0006] NB-ARC結(jié)構(gòu)域是NBS的擴(kuò)大結(jié)構(gòu)域(Takken ET AL.,2009)。咄41?(:結(jié)構(gòu)域中,NB指 核苷酸結(jié)合序列(Nucleotide binging site),ARC分別指凋亡蛋白酶激活因子1 (Apoptotic protease-activating factor-1)、抗病蛋白(Resistance protein)和線蟲死 亡蛋白4(Caenorhabditis elegans death_4protein) (Schmutz et al ·,2010) 〇 已有石開究 表明蛋白質(zhì)的NB-ARC結(jié)構(gòu)域在細(xì)胞凋亡、超敏反應(yīng)及抗病反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,特定氨基 酸的變異會(huì)導(dǎo)致功能的改變,例如,Tameling等(2006)將番茄含有NB-ARC結(jié)構(gòu)域的抗性蛋 白1-2,P-loop基序第495位氨基酸由天冬氨酸變?yōu)槔i氨酸,導(dǎo)致該植株發(fā)生自激活的超敏 反應(yīng)。Tang等(2011)將水稻含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的NLS1蛋白,NB結(jié)構(gòu)域GLPL基序附近第366位由 絲氨酸變?yōu)樘K氨酸,第367位氨基酸由絲氨酸變?yōu)樘於彼?,分別導(dǎo)致植株產(chǎn)生持續(xù)激活的 防衛(wèi)反應(yīng)。迄今,在水稻的抗稻瘟病基因研究中還未見含NB-ARC結(jié)構(gòu)域基因的報(bào)道。
[0007] 傳統(tǒng)選育方法依賴于抗性鑒定和表型選擇,不僅周期長、效率低而且受許多條件 的限制,在培育抗稻瘟病新品種上難以滿足生產(chǎn)要求(陳德西等,2010)。隨著DNA分子標(biāo)記 技術(shù)的迅猛發(fā)展,利用抗病基因相應(yīng)的分子標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇,可大大提高育種選擇效率 (楊勤忠等,2009;王惠梅等,2012)。作物育種實(shí)踐中已開發(fā)了許多種分子標(biāo)記,如馬建等 (2015)根據(jù)抗感品種中Pi35等位基因序列差異特性,開發(fā)了功能性分子標(biāo)記Pi35-dCAPS, 利用該標(biāo)記成功的鑒定確認(rèn)了 5份藤系138衍生品種及2份微核心種質(zhì)品種攜帶Pi35基因。 劉洋等(2008)利用抗稻瘟病基因 Pib自身序列及其等位的感病基因序列建立的分子標(biāo)記結(jié) 合運(yùn)用,可有效地從水稻種質(zhì)資源中快速而準(zhǔn)確地選擇出抗稻瘟病基因 Pib,并能在分離世 代群體中選擇出含抗稻瘟病基因 Pib的純合單株。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb,以增加水稻抗稻瘟病基 因的儲(chǔ)備。
[0009] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供一種水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分離克隆方法。
[0010]本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供一個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記。
[0011] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育種中的應(yīng)用。
[0012] 本發(fā)明的第一個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0013] 一個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb,特征是:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因組序列如SEQ ID NO: 1所示。
[0014] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0015] 一種水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分離克隆方法,特征是:
[0016] A、以廣譜高抗稻瘟病常規(guī)水稻品種:自選2號(hào),為抗稻瘟病基因的供體材料,并與 稻瘟病敏感水稻品種:麗江新團(tuán)黑谷LTH為試驗(yàn)材料,通過二者正反雜交,構(gòu)建F2群體;其 中:廣譜高抗稻瘟病常規(guī)水稻品種:自選2號(hào)是在水稻常規(guī)品種lemont與廣西普通野生稻雜 交的后代中,篩選得到的水稻抗稻瘟病水稻材料,目前已進(jìn)行了6代連續(xù)自交,抗病性狀穩(wěn) 定;通過來自全國ZA、ZB和ZC三個(gè)種群的15個(gè)菌株接種鑒定試驗(yàn),確認(rèn)其為廣譜高抗水稻材 料;
[0017] B、通過圖位克隆的方法定位到一個(gè)抗稻瘟病目標(biāo)基因,三個(gè)步驟如下:
[0018] (1)、首先利用BSA技術(shù)進(jìn)行初步定位,將抗稻瘟病目標(biāo)基因鎖定在水稻基因組第 12號(hào)染色體短臂上;
[0019] (2)、然后利用染色體步移的方法進(jìn)行抗稻瘟病目標(biāo)基因的精細(xì)定位,將抗稻瘟病 目標(biāo)基因鎖定在了 143kb的區(qū)間內(nèi);
[0020] (3)、最后通過生物信息學(xué)分析和測序比對(duì),該區(qū)間內(nèi)有一個(gè)含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的基 因(0sl2g0270300),該基因總長3454bp,包含1個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,編碼899個(gè)氨基酸序 列;將含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的基因(0sl2g0270300)確定為抗稻瘟病目標(biāo)基因;
[0021]編碼899個(gè)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示,或該序列替換、缺失、或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽;
[0022] C、經(jīng)測序分析:該抗稻瘟病目標(biāo)基因在抗感親本之間僅存在1個(gè)氨基酸的差異,即 第189位抗病產(chǎn)物為組氨酸,而感病產(chǎn)物為谷氨酰胺,且該差異位于NB-ARC結(jié)構(gòu)域的磷酸 結(jié)合環(huán)P-loop上,因此確定該基因?yàn)樗究沟疚敛』?Pitb;
[0023] D、通過抗性鑒定和遺傳分析發(fā)現(xiàn):F1代的個(gè)體都表現(xiàn)為稻瘟病抗性,F(xiàn)2代植株呈 現(xiàn)明顯的抗感分離,在正交群體中,抗、感稻瘟病植株數(shù)分別為158、42,分離比為3:1(x 2 = 0.9<乂2(0.05)=3.8);在反交群體中,抗、感稻瘟病植株數(shù)分別為143、57,分離比為3:1(乂 2 =0.63<x2(0.05) = 3.8),結(jié)果說明:自選2號(hào)對(duì)稻瘟病菌的抗性由1對(duì)顯性主效基因控制, 該顯性主效基因?yàn)樗究沟疚敛』?Pitb。
[0024] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0025] 一個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記,特征是:根據(jù)序列差異,利用BioEdit軟 件搜索酶切位點(diǎn),再利用Primer 5.0設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物,得到適合水稻抗稻瘟病基因 Pitb的 分子標(biāo)記(CAPS): GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT,Bsp 12861。
[0026] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是這樣實(shí)現(xiàn)的:
[0027] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育種中的應(yīng)用,得到抗稻瘟病的水稻。
[0028] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用,得到抗稻瘟病的水稻。 [0029]本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0030] 將本發(fā)明提供的水稻抗稻瘟病基因 Pitb轉(zhuǎn)入感稻瘟病的水稻品種中,有助于產(chǎn)生 新的抗稻瘟病水稻新品種。本發(fā)明提供的水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記可大大提高該 基因應(yīng)用于育種選擇效率,縮短育種時(shí)間。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0032] 實(shí)施例1:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的遺傳分析
[0033] 以廣譜高抗稻瘟病常規(guī)水稻品種:自選2號(hào)為水稻抗稻瘟病基因的供體,稻瘟病敏 感水稻品種:麗江新團(tuán)黑谷LTH為水稻抗稻瘟病基因的受體,通過二者正反雜交,構(gòu)建F2群 體,通過抗性鑒定和遺傳分析發(fā)現(xiàn):F1代的單株都表現(xiàn)為稻瘟病抗性,F(xiàn)2代植株出現(xiàn)了抗感 分離,且符合3:1的分離比,即:自選2號(hào)對(duì)稻瘟病菌的抗性由1對(duì)顯性主效基因控制,該顯性 主效基因?yàn)樗究沟疚敛』?Pitb。
[0034] 實(shí)施例2:水稻抗稻瘟病基因 Pi tb的定位
[0035] 采用圖位克隆的方法定位水稻抗稻瘟病基因 Pitb,分為三個(gè)步驟:
[0036] (1)、首先利用BSA技術(shù)進(jìn)行初步定位,將抗稻瘟病目標(biāo)基因鎖定在水稻基因組第 12號(hào)染色體短臂上;
[0037] (2)、然后利用染色體步移的方法進(jìn)行抗稻瘟病目標(biāo)基因的精細(xì)定位,將抗稻瘟病 目標(biāo)基因鎖定在了 143kb的區(qū)間內(nèi);
[0038] (3)、最后通過生物信息學(xué)分析和測序比對(duì),該區(qū)間內(nèi)有一個(gè)含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的基 因(0sl2g0270300),該基因總長3454bp,包含1個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,編碼899個(gè)氨基酸序 列;將含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的基因(0sl2g0270300)確定為抗稻瘟病目標(biāo)基因;
[0039]編碼899個(gè)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示,或該序列替換、缺失、或添加一個(gè)或 幾個(gè)氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽。
[0040]經(jīng)測序分析:該抗稻瘟病目標(biāo)基因在抗感親本之間僅存在1個(gè)氨基酸的差異,即第 189位抗病產(chǎn)物為組氨酸,而感病產(chǎn)物為谷氨酰胺,且該差異位于NB-ARC結(jié)構(gòu)域的磷酸結(jié)合 環(huán)P-loop上,因此確定該基因?yàn)槟繕?biāo)基因:水稻抗稻瘟病基因 Pitb。
[0041 ] 實(shí)施例3:水稻抗稻痕病基因 Pitb的分子標(biāo)記(CAPS)的開發(fā)
[0042]水稻抗稻瘟病基因 Pitb在抗感親本之間僅存在1個(gè)氨基酸的差異,即:第189位抗 病產(chǎn)物為組氨酸,而感病產(chǎn)物為谷氨酰胺,該差異也是由1個(gè)堿基變異引起(C/A)。
[0043]
【申請(qǐng)人】根據(jù)這一特點(diǎn),利用BioEdit和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)和開發(fā)了分子標(biāo)記 (GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT,Bsp 12861),分子標(biāo)記在群體中未檢測到重組 體,表現(xiàn)為共分離。
[0044] 實(shí)施例4:
[0045] 水稻抗稻瘟病基因 Pitb用在水稻育種中,得到抗稻瘟病的水稻。
[0046] 實(shí)施例5:
[0047]水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記用在水稻育種中,得到抗稻瘟病的水稻。
[0048] 附錄:
[0049] 序列表獨(dú)立文本:
[0050] A、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因組序列:SEQ ID NO: 1;
[0051 ] 〈110>井岡山大學(xué)
[0052] 〈120>水稻抗稻瘟病基因、分離克隆方法、分子標(biāo)記及應(yīng)用
[0053] <160>3
[0054] <210>1
[0055] <211>3454
[0056] <212>DNA
[0057] 〈213>水稻(Oryza sativa L.)
[0058] <400>1
[0060]
[0061 ] B、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的編碼區(qū)序列:SEQ ID N0:2;
[0062] <210>2
[0063] <211>2700
[0064] <212>DNA
[0065] 〈213>水稻(Oryza sativa L.)
[0066] <220>
[0067] <221>CDS
[0068] <222>(1)...(2700)
[0069] <400>2
[0071]
[0072] C、水稻抗稻瘟病基因 Pitb的編碼氨基酸序列:SEQ ID N0:3;
[0073] <210>2
[0074] <211>899
[0075] <212>PRT
[0076] 〈213>水稻(Oryza sativa L.)
[0077] <400>3
[0078]
[0079]
[0080]
[0081]
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb,其特征在于:水稻抗稻瘟病基因 Pitb的基因組序列如 SEQ ID N0:1 所示。2. -種水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分離克隆方法,其特征在于: A、 以廣譜高抗稻瘟病常規(guī)水稻品種:自選2號(hào)為抗稻瘟病基因的供體材料,并與稻瘟病 敏感水稻品種:麗江新團(tuán)黑谷LTH為試驗(yàn)材料,通過二者正反雜交,構(gòu)建F2群體; B、 通過圖位克隆的方法定位到一個(gè)抗稻瘟病目標(biāo)基因,三個(gè)步驟如下: (1) 、首先利用BSA技術(shù)進(jìn)行初步定位,將抗稻瘟病目標(biāo)基因鎖定在水稻基因組第12號(hào) 染色體短臂上; (2) 、然后利用染色體步移的方法進(jìn)行抗稻瘟病目標(biāo)基因的精細(xì)定位,將抗稻瘟病目標(biāo) 基因鎖定在了 143kb的區(qū)間內(nèi); (3) 、最后通過生物信息學(xué)分析和測序比對(duì),該區(qū)間內(nèi)有一個(gè)含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的基因: 0sl2g0270300,該基因總長3454bp,包含1個(gè)外顯子和2個(gè)內(nèi)含子,編碼899個(gè)氨基酸序列;將 含NB-ARC結(jié)構(gòu)域的基因:0sl2g0270300確定為抗稻瘟病目標(biāo)基因; 編碼899個(gè)的氨基酸序列如SEQ ID N0:3所示,或該序列替換、缺失、或添加一個(gè)或幾個(gè) 氨基酸殘基而形成的具有相同功能的氨基酸多肽; C、 經(jīng)測序分析:該抗稻瘟病目標(biāo)基因在抗感親本之間僅存在1個(gè)氨基酸的差異,即第 189位抗病產(chǎn)物為組氨酸,而感病產(chǎn)物為谷氨酰胺,且該差異位于NB-ARC結(jié)構(gòu)域的磷酸結(jié)合 環(huán)P-loop上,因此確定該基因?yàn)樗究沟疚敛』?Pitb; D、 通過抗性鑒定和遺傳分析發(fā)現(xiàn):F1代的個(gè)體都表現(xiàn)為稻瘟病抗性,F(xiàn)2代植株呈現(xiàn)明 顯的抗感分尚,在正交群體中,抗、感稻痕病植株數(shù)分別為158、42,分尚比為3:1,x 2 = 0.9< 7(0.05)=3.8;在反交群體中,抗、感稻瘟病植株數(shù)分別為143、57,分離比為3:132 = 0.63 <x2(0.05) = 3.8,結(jié)果說明:自選2號(hào)對(duì)稻瘟病菌的抗性由1對(duì)顯性主效基因控制,該顯性 主效基因?yàn)樗究沟疚敛』?Pitb。3. -個(gè)水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記,其特征在于:根據(jù)序列差異,利用BioEdit 軟件搜索酶切位點(diǎn),再利用Primer 5.0設(shè)計(jì)的擴(kuò)增引物,得到適合水稻抗稻瘟病基因 Pitb 的分子標(biāo)記:GGGATTGATGGTCCAAGG/CTTTTATCTTTCAAGAAT,Bsp 12861。4. 水稻抗稻瘟病基因 Pitb在水稻育種中的應(yīng)用。5. 水稻抗稻瘟病基因 Pitb的分子標(biāo)記在水稻育種中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK106086032SQ201610414870
【公開日】2016年11月9日
【申請(qǐng)日】2016年6月15日 公開號(hào)201610414870.2, CN 106086032 A, CN 106086032A, CN 201610414870, CN-A-106086032, CN106086032 A, CN106086032A, CN201610414870, CN201610414870.2
【發(fā)明人】孫惠敏, 鄭卓, 吳麗花
【申請(qǐng)人】井岡山大學(xué)
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