專利名稱：干細(xì)胞及胚胎來源的心肌細(xì)胞及推定的心肌細(xì)胞的純化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及從千細(xì)胞及胚胎來源的細(xì)胞群中純化心肌細(xì)胞的方法 和利用方法。
背景技術(shù)：
成人體內(nèi)心肌細(xì)胞喪失增殖活性，在諸如重癥心肌梗塞、心肌癥 等病癥中，必須依賴心臟移植手術(shù)。但現(xiàn)狀的心臟捐贈(zèng)者不足至今仍 是一 個(gè)難以克服的問題，因此尋找心臟移植以外的治療方法是當(dāng)務(wù)之急。
針對(duì)此情況，在體外制備、純化心肌細(xì)胞，對(duì)心肌細(xì)胞進(jìn)行補(bǔ)充， 成為挽救必須依賴心臟移植的患者的最有希望的方法。因此，為了荻 得心肌細(xì)胞，對(duì)使干細(xì)胞(胚胎干細(xì)胞或各種成體干細(xì)胞)進(jìn)行分化 的方法、從胎盤獲得等方法進(jìn)行了大量研究。
可以通過分別在小鼠胎干細(xì)胞中，將抑制分化的因子(滋養(yǎng)細(xì)胞、
白血病抑制因子LIF等)、在人胚胎干細(xì)胞中將抑制分化的因子(滋 養(yǎng)細(xì)胞、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子bFGF、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子TGF等) 從培養(yǎng)液中除去，形成細(xì)胞塊(類胚體)從而積極的引發(fā)分化。
在體外進(jìn)行分化的模式一部分沿襲了生理的發(fā)育，特別是發(fā)育初 期的事件，在受精卵中發(fā)生的生理發(fā)育與體外的分化模式有著眾多的 共同點(diǎn)。體外向心肌細(xì)胞分化的語系，與生理發(fā)育相同都要先形成未 分化的中胚葉細(xì)胞，其一部分經(jīng)過推定心肌細(xì)胞(presumptive cardiac myocyte)(前心臟中胚葉)后，分化為心肌細(xì)胞。但是，由 于胚胎性干細(xì)胞可以分化為構(gòu)成臟器的所有細(xì)胞，使其只分化為一種 細(xì)胞在技術(shù)上還存在困難。
另外，在體外非生理?xiàng)l件下(in vitro),引發(fā)所有細(xì)胞發(fā)生分 化較難，有可能存在一部分未分化的細(xì)胞。另外，可以分化為心肌細(xì) 胞的成體干細(xì)胞為存在于骨髓或臍帶中的間葉干細(xì)胞、存在于各組織 中的組織干細(xì)胞(神經(jīng)管細(xì)胞、脂肪肝細(xì)胞、骨骼肌干細(xì)胞等)，它 們可分化為多種細(xì)胞，而非心肌細(xì)胞一種。任何一種成體干細(xì)胞，其 分化為心肌細(xì)胞的詳細(xì)機(jī)制過程均未被充分的探明，它們都經(jīng)歷一定 時(shí)期的遷移狀態(tài)后形成含有心肌細(xì)胞或其它分化細(xì)胞、未分化細(xì)胞的 細(xì)胞集群。
概括地說，所有的干細(xì)胞都有共同的缺點(diǎn)，即產(chǎn)生心肌細(xì)胞以外 的其它細(xì)胞的副產(chǎn)物，或殘留有未分化的細(xì)胞等對(duì)臨床應(yīng)用有害的性 質(zhì)。未分化細(xì)胞具有增殖活性，并可以分化為多種細(xì)胞，因此難以直 接將含有分化誘導(dǎo)后的心肌細(xì)胞的細(xì)胞集群原狀移植至生物體內(nèi)，用 于治療。
因此，為了安全的實(shí)施使用干細(xì)胞進(jìn)行治療，獲得理想的治療效 果，有必要尋找將心肌細(xì)胞本身從細(xì)胞集群中純化分離出來的方法。
目前，多采用使心肌細(xì)胞特異性表達(dá)GFP等熒光標(biāo)記，使用流式 細(xì)胞分選儀純化表達(dá)熒光標(biāo)記的細(xì)胞的方法(非專利文獻(xiàn)1)，或使 心肌細(xì)胞特異性表達(dá)耐抗生素蛋白質(zhì)，使用抗生素物質(zhì)進(jìn)行選擇的純 化方法(非專利文獻(xiàn)2)，進(jìn)行心肌細(xì)胞的純化。但是在這些方法中， 必須進(jìn)行遺傳基因的改變存在由此引起的安全性問題，因而無法利用 于實(shí)際的移植當(dāng)中。另外，上述方法均為伴有基因改變的方法，不僅 基因組的改變本身存在著倫理上的問題，還存在細(xì)胞癌化率的改變等 無法預(yù)測(cè)的嚴(yán)重風(fēng)險(xiǎn)(非專利文獻(xiàn)3)。
雖然已知心臟可以利用來自骨骼肌等其它器官產(chǎn)生的乳酸作為能 量源(非專利文獻(xiàn)4),但利用該性質(zhì)純化心肌細(xì)胞的嘗試以前還從 未有過。
另外，心臟、肝臟、腎臟中，利用天門冬氨酸和谷氨酸向線粒體 內(nèi)運(yùn)送NADH，與其他器官有著不同的機(jī)制(非專利文獻(xiàn)5) 。 NADH向 線粒體內(nèi)的運(yùn)送對(duì)于在線粒體內(nèi)的能量生產(chǎn)的必不可少的。迄今為止， 根據(jù)該機(jī)理的不同之處嘗試心肌細(xì)胞的純化是沒有先例的。
非專利文獻(xiàn)l: MullerM， etal.， FASEB J. 2000; 14:2540-2548 非專利文獻(xiàn)2: Klug MG, et al.， J. CI in. Invest. 1996; 98: 216-224
非專利文獻(xiàn)3: Schroder AR， et al. ， Cell. 2002; 110:521-529 非專利文獻(xiàn)4: KhairallahM， etal.， Am J Physiol Heart Circ
Physiol 2004; 286， H1461-1470
非專利文獻(xiàn)5: Chatham JC， et al. ， J.Biol Chem 1995;
270:7999-8008

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
本發(fā)明的課題為，開發(fā)一種利用在目前以純化心肌細(xì)胞為目的研 究中從未想到過利用的諸多性質(zhì)、以及新發(fā)現(xiàn)的諸多性質(zhì)，可在不改 變遺傳基因，不添加特別的蛋白質(zhì)及生理活性物質(zhì)的情況下，從含有 來源于胚胎及干細(xì)胞的心肌細(xì)胞的細(xì)胞混合物中，高度且高收率的純 4匕心肌干細(xì)力包的方法。
解決問題所用的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的發(fā)明者們，為了構(gòu)建能有效生產(chǎn)胚胎干細(xì)胞來源的心肌 細(xì)胞的系統(tǒng)，對(duì)培養(yǎng)液進(jìn)行了系統(tǒng)研究。通過改變使用的培養(yǎng)液的組 成，進(jìn)行各種培養(yǎng)液組成成分的濃度研究、及應(yīng)當(dāng)適應(yīng)的時(shí)期的研究， 結(jié)果發(fā)現(xiàn)了以下現(xiàn)象
(1 )在低.無血清條件下引起對(duì)具有非心肌細(xì)胞分化傾向性的細(xì) 胞分化增殖抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象；
(2 )在弱酸性培養(yǎng)液中引起具有非心肌細(xì)胞分化傾向性的誘導(dǎo)細(xì) 胞凋亡的現(xiàn)象的現(xiàn)象；
(3) 在低鉤培養(yǎng)液中引起對(duì)具有非心肌細(xì)胞分化傾向性的細(xì)胞分 化增殖抑制及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的現(xiàn)象；
(4) 在低營養(yǎng)培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)的情況下非心肌細(xì)胞選擇性死亡
的現(xiàn)象；
(5 )在低釣環(huán)境下培養(yǎng)心肌細(xì)胞時(shí)心肌細(xì)胞的自律跳動(dòng)減弱，能
量消耗被抑制的現(xiàn)象。
(6)低.無血清化促進(jìn)心肌細(xì)胞自我集合塊形成的現(xiàn)象，和
(7 )心肌細(xì)胞細(xì)胞塊零亂分散的情況下心肌細(xì)胞的生存率顯著下
降的現(xiàn)象。
本發(fā)明的發(fā)明者們，通過組合針對(duì)上述現(xiàn)象的方法并進(jìn)行優(yōu)化， 發(fā)現(xiàn)可有效且高度地選擇純化胚胎干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞，從而完成 了本發(fā)明。另外還發(fā)現(xiàn)，胚胎干細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的方法，可應(yīng)用于胎盤來 源的心肌細(xì)胞的選擇和/或純化、及成體干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞的選擇 和/或純化，從而完成了本發(fā)明。
更具體而言，在本發(fā)明的一種方案為提供一種選擇心肌細(xì)胞的方 法，是從含有胚胎干細(xì)胞來源、成體干細(xì)胞來源或胎盤來源的心肌細(xì) 胞和非心肌細(xì)胞的細(xì)胞混合物中，選擇心肌細(xì)胞的方法，其特征為將
上述細(xì)胞混合物在具有選自(i)低糖條件；及(ii )低鉀條件、低營 養(yǎng)條件、添加乳酸條件、添加天門冬氨酸和/或谷氨酸的條件、及添加 丙酮酸的條件中的1個(gè)或多個(gè)條件的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，對(duì)心肌細(xì)胞 進(jìn)行選擇。在該方案中，對(duì)上述細(xì)胞混合物進(jìn)行胚胎干細(xì)胞方向的分 化誘導(dǎo)，形成含有推定心肌細(xì)胞(未分化中胚葉)的類胚體，將該類 胚體在低血清條件及/或弱酸性pH條件的培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)而進(jìn)行 制備。
在本發(fā)明另一個(gè)方案中，提供一種選擇來源于胚胎干細(xì)胞的心肌 細(xì)胞的方法，其特征為，在對(duì)胚胎干細(xì)胞進(jìn)行分化誘導(dǎo)以后，形成含 有未分化的中胚葉的類胚體以后，通過將該類胚體在低血清條件及/ 或弱酸性pH條件的培養(yǎng)液中培養(yǎng)，以制備含有推定心肌細(xì)胞的細(xì)胞混 合物，然后通過在同一培養(yǎng)液中繼續(xù)進(jìn)行該細(xì)胞混合物的培養(yǎng)的而獲 得心肌細(xì)胞。


圖1為表示附著培養(yǎng)的類胚體的心肌細(xì)胞的存在模式的圖。
圖2為表示無血清條件下培養(yǎng)的結(jié)合類胚體中的心肌細(xì)胞的存在 模式的圖。
圖3為表示通過無血清化選擇推定心肌細(xì)胞的圖。 圖4為表示低鈣環(huán)境影響的圖。
圖5為表示對(duì)于在胚胎干細(xì)胞中，通過無血清和/或弱酸性pH條 件選擇推定心肌細(xì)胞的圖。
圖6 - 1為表示在胚胎干細(xì)胞中，通過無血清和/或弱酸性pH條件 對(duì)推定心肌細(xì)胞進(jìn)行分析的圖。
圖6 - 2為表示在胚胎干細(xì)胞中，通過無血清和/或弱酸性pH條件 對(duì)推定心肌細(xì)胞進(jìn)行分析的圖。
圖7為表示對(duì)于胚胎千細(xì)胞，通過無血清和/或弱酸性pH條件選 擇的心肌細(xì)胞塊的圖。
圖8為表示對(duì)于在無糖和/或無血清和/或添加乳酸的培養(yǎng)條件下 選擇心肌細(xì)胞的圖。
圖9為表示對(duì)于在無糖和/或無血清，添加乳酸的培養(yǎng)條件下對(duì)于 已經(jīng)選擇和/或回收的心肌細(xì)胞的特異性染色的圖。
圖10為表示對(duì)于在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，并 添加乳酸的培養(yǎng)條件下剛剛選擇后的心肌細(xì)胞塊和死細(xì)胞塊的圖。
圖11為表示使用密度梯度離心除去死細(xì)胞塊構(gòu)成的高密度凝集 體的方法的圖。
圖12- 1為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鉀和/或無糖，并添 加乳酸的培養(yǎng)條件下選擇的心肌細(xì)胞塊的圖。
圖12- 2為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，并添 加乳酸的培養(yǎng)條件下選擇的心肌細(xì)胞塊的圖。
圖13為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，并添加 天門冬氨酸和/或谷氨酸的培養(yǎng)條件下純化的心肌細(xì)胞的圖。
圖14為表示純化骨髓干細(xì)胞來源的心肌細(xì)胞的圖。
圖15為表示純化胎盤來源的心肌細(xì)胞的圖。
圖16為表示在無血清和/或弱酸性和/或低鈣和/或無糖，并添加 丙酮酸的培養(yǎng)條件下，在培養(yǎng)時(shí)發(fā)生自律性搏動(dòng)的細(xì)胞區(qū)域的圖。
圖17為表示在無糖和/或無血清，并添加乳酸的培養(yǎng)條件下，在 15天培養(yǎng)后選擇的絨猴心肌細(xì)胞塊的圖。
圖18為表示在無糖和/或無血清，并添加乳酸的培養(yǎng)條件下，對(duì) 于選擇和/或回收的絨猴細(xì)胞的心肌細(xì)胞特異性染色的圖。
圖19為表示在無糖和/或無血清，并添加乳酸的培養(yǎng)條件下選擇 回收的絨猴細(xì)胞，在受供者心臟內(nèi)部生長(zhǎng)附著的圖。
圖20為表示在有糖(對(duì)照)條件下進(jìn)行培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞來源 的細(xì)胞塊(對(duì)照)、和無糖(心肌選擇)條件下進(jìn)行15天心肌細(xì)胞選 擇培養(yǎng)的人胚胎干細(xì)胞來源的細(xì)胞塊(心肌選擇條件)的狀態(tài)的圖。
圖21為表示在無糖(心肌選擇)條件下對(duì)人胚胎干細(xì)胞進(jìn)行15 天心肌細(xì)胞選擇培養(yǎng)后，變更培養(yǎng)液條件后，再次啟動(dòng)自律性搏動(dòng)的 心肌細(xì)胞形成的胚胎干細(xì)胞來源的各細(xì)胞塊的，抗肌動(dòng)蛋白抗體及抗 Nkx2. 5抗體的染色圖像的圖。
具體實(shí)施例方式
對(duì)于具有向心肌細(xì)胞分化能力的干細(xì)胞(胚胎千細(xì)胞、骨髓干細(xì) 胞等成體干細(xì)胞)，進(jìn)行適當(dāng)?shù)男募〖?xì)胞分化誘導(dǎo)后，發(fā)生向心肌細(xì) 胞的分化。即，例如通過從培養(yǎng)液中去除白血病抑制因子(LIF)進(jìn)行 懸浮培養(yǎng)，使形成細(xì)胞塊(類胚體)以懸滴法對(duì)小鼠胚胎干細(xì)胞進(jìn)行 處理，可誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞進(jìn)行分化?；蛘呤褂媒q猴胚胎干 細(xì)胞或人類胚胎干細(xì)胞，可同樣的誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞向心肌細(xì)胞進(jìn)行分 化。
本發(fā)明的方法可適用于來源于任意一種哺乳動(dòng)物的干細(xì)胞。例如， 本發(fā)明的方法可適用于來源于小鼠、牛、山羊、豬、貓、絨猴、獼猴、 人的干細(xì)胞，只要是來自于上述動(dòng)物的干細(xì)胞無其他限定。例如，作 為本發(fā)明中使用的干細(xì)胞，可例舉出目前已經(jīng)作為培養(yǎng)細(xì)胞廣泛使用 的小鼠、猴子、人等哺乳動(dòng)物的來源的ES細(xì)胞。
作為來源于小鼠的ES細(xì)胞的具體例子，可舉出EB3細(xì)胞、El4細(xì) 胞、D3細(xì)胞、CCE細(xì)胞、Rl細(xì)胞、129SV細(xì)胞、Jl細(xì)胞等。本發(fā)明中 使用的源于小鼠的ES細(xì)胞可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection, ATCC)或Chemicon公司、Cell & Molecular Technologies公司等購入。
源于猴子的ES細(xì)胞，有例如獼猴(rhesus monkey: Macaca mulatta ) ( Thomson et al.， Proc. Natl.Acad.Sci. USA 1995; 92: 7844 ) 或食蟹猴(cynomolgus monkey: Macaca fascicularis ) (Suemoriet al.， Dev. Dyn. 2001; 222: 273-279 )、普通絨猴(common marmoset: Callithrix jacchus ) ( Sasaki et al.， Stem Cells. 2005; 23: 1 304-1313 )等建立的報(bào)道，可以進(jìn)行使用。例如，可以從財(cái) 團(tuán)法人.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中央研究所處獲得絨猴的ES細(xì)胞。
來源于人的ES細(xì)胞，目前全世界已經(jīng)建立有數(shù)10種以上，例如 美國.國立衛(wèi)生研究所的清單(http:〃stemcells. nih.gov/ registry/index, asp)上登記了很多細(xì)胞林可供使用，同時(shí)還可以從 Cel lart is公司或ES Cell International公司、Wisconsin Alumni Research Foundation等處購入。另夕卜，曰本方面，可以從國立大學(xué) 法人 京都大學(xué)再生醫(yī)科學(xué)研究所附屬干細(xì)胞醫(yī)學(xué)研究中心處獲得 (Suemori et al., Biochem. Biophys. Res. Commun.， 2006; 345: 926-932 )
另外，也有確立牛(Mitalipova et al. ， Cloning 2001; 3:59-67 )、 鳥(Petitte et al.， Mech. Dev. 2004; 121: 1159-1168 )、斑馬魚 (Fishman， M. C. ， Science 2001; 294: 1290-1291 )的ES細(xì)胞的報(bào)道。
通常ES細(xì)胞通過培養(yǎng)初期胚胎進(jìn)行建立，從進(jìn)行了體細(xì)胞核的核 移植的初期胚胎可以制得ES細(xì)胞(Munsie et al.， Curr. Biol. 10: 989, 2000; Wakayama et al. ， Science 292:740, 2001; Hwang et al., Science 303:1669， 2004 )。另外，還有使孤雌胚胎在嚢胚期 同樣的階段發(fā)生，從其制備ES細(xì)胞的嘗試(美國專利公開第02/ 168763號(hào)；Vrana K et al. ， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 11911-6 );或還有通過ES細(xì)胞與體細(xì)胞的融合，制備具有體細(xì)胞核的遺傳基因的 ES細(xì)胞的方法等的報(bào)道(國際
發(fā)明者服部文幸, 福田惠一 申請(qǐng)人:阿斯比奧制藥株式會(huì)社;學(xué)校法人慶應(yīng)義塾