專利名稱：鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白及其編碼序列的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬于生物學領域，具體地說，本發(fā)明涉及新的編碼鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)耐鹽相關蛋白-硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸，以及此多核苷酸編碼的多肽。本發(fā)明還涉及此多核苷酸和多肽的用途和制備。具體地說，本發(fā)明的多肽是一種新的耐鹽相關蛋白。
背景技術：
目前，世界人口不斷增加，而可耕種土地卻不斷減少。然而，地球上還有許多因鹽堿化而無法有效利用的土地資源。為了有效地利用這些鹽堿化的土地資源，人們一直在尋找既適應生長而具有較高經濟價值的植物品種。然而，迄今為止沒有十分合適的植物品種。
另一種開發(fā)耐鹽堿植物的方法是對已有的植物品種，尤其是具有較高經濟價值的植物品種進行改良。然而，傳統(tǒng)的植物改良方法費時、費力、并且缺乏針對性。
為了有效地、針對性地改善植物品種的耐鹽性，本領域迫切需要開發(fā)與耐鹽性有關的基因和蛋白。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一個目的是提供一種新的鹽生杜氏藻耐鹽相關蛋白硝酸鹽轉運蛋白以及其片段、類似物和衍生物。
本發(fā)明的另一目的是提供編碼這些多肽的多核苷酸。
本發(fā)明的另一目的是提供生產這些多肽的方法以及該多肽和編碼序列的用途，尤其是在提高植物耐鹽性方面的用途。
鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)屬綠藻門、綠藻綱、團藻目、多毛藻科、杜氏藻屬，主要生長于高鹽度水體中。細胞形態(tài)通常為卵圓形，當外界滲透壓發(fā)生變化時，其形態(tài)可變?yōu)榍蛐沃良忓N形。它具有兩條等長的鞭毛和一個杯狀葉綠體，在葉綠體的外緣可積累大量的β-胡蘿卜素小滴，是細胞呈橙紅色。細胞無細胞壁，具有由糖蛋白形成的包被。鹽生杜氏藻與衣藻(Chlamydomonas)具有較近的親緣關系。本發(fā)明人通過多年對鹽生杜氏藻的研究，發(fā)現(xiàn)了鹽生杜氏藻中與耐鹽性有關的蛋白-硝酸鹽轉運蛋白，在此基礎上完成了本發(fā)明。
在本發(fā)明的第一方面，提供新穎的分離出的硝酸鹽轉運蛋白，該蛋白源自鹽生杜氏藻的，它包含具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽、或其保守性變異多肽、或其活性片段、或其活性衍生物。
較佳地，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有硝酸鹽轉運蛋白功能的由(a)衍生的多肽。
更佳地，該轉運蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
在本發(fā)明的第二方面，提供編碼分離的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸，該多核苷酸包含一核苷酸序列，該核苷酸序列與選自下組的一種核苷酸序列有至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％相同性(a)編碼上述鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸；和(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。較佳地，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的多肽。更佳地，該多核苷酸的序列是選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1617位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1620位的序列。
在本發(fā)明的第三方面，提供了含有上述多核苷酸的載體，以及被該載體轉化或轉導的宿主細胞或者被上述多核苷酸直接轉化或轉導的宿主細胞。
在本發(fā)明的第四方面，提供了制備鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的方法，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)上述被轉化或轉導的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白。
在本發(fā)明的第五方面，提供了與上述的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白特異性結合的抗體。還提供了可用于檢測的核酸分子，它含有上述的多核苷酸中連續(xù)的15-1620個核苷酸。
在本發(fā)明的第六方面，提供了模擬、促進、拮抗鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白活性的化合物，以及抑制鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的表達的化合物。還提供了篩選和/或制備這些化合物的方法。
在本發(fā)明的第七方面，提供了檢測樣品中是否存在硝酸鹽轉運蛋白的方法，它包括將樣品與硝酸鹽轉運蛋白的特異性抗體接觸，觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在硝酸鹽轉運蛋白。
在本發(fā)明的第八方面，提供了本發(fā)明多肽和編碼序列的用途。例如本發(fā)明多肽可被用于篩選促進鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白活性的激動劑，或者篩選抑制鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白活性的拮抗劑、或者被用于肽指紋圖譜鑒定。本發(fā)明的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的編碼序列或其片段，可被作為引物用于PCR擴增反應，或者作為探針用于雜交反應，或者用于制造基因芯片或微陣列。
在本發(fā)明的第九方面，提供了一種改善植物耐鹽性的方法，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有硝酸鹽轉運蛋白DNA編碼序列，所述的硝酸鹽轉運蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有硝酸鹽轉運蛋白功能的由(a)衍生的多肽。
(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使硝酸鹽轉運蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入硝酸鹽轉運蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
較佳地，該硝酸鹽轉運蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術的公開，對本領域的技術人員而言是顯而易見的。
具體實施例方式
在本發(fā)明中，術語“硝酸鹽轉運蛋白(nitrate transporter)”、“硝酸鹽轉運蛋白多肽”或“耐鹽相關蛋白硝酸鹽轉運蛋白”可互換使用，都指具有鹽生杜氏藻耐鹽相關蛋白硝酸鹽轉運蛋白氨基酸序列(SEQ ID NO2)的蛋白或多肽。它們包括含有或不含起始甲硫氨酸的耐鹽相關蛋白硝酸鹽轉運蛋白。
硝酸鹽轉運蛋白催化的反應如下將細胞外的硝酸根離子通過細胞膜轉運入細胞質中。
如本文所用，“分離的”是指物質從其原始環(huán)境中分離出來(如果是天然的物質，原始環(huán)境即是天然環(huán)境)。如活體細胞內的天然狀態(tài)下的多聚核苷酸和多肽是沒有分離純化的，但同樣的多聚核苷酸或多肽如從天然狀態(tài)中同存在的其他物質中分開，則為分離純化的。
如本文所用，“分離的硝酸鹽轉運蛋白或多肽”是指硝酸鹽轉運蛋白基本上不含天然與其相關的其它蛋白、脂類、糖類或其它物質。本領域的技術人員能用標準的蛋白質純化技術純化硝酸鹽轉運蛋白。基本上純的多肽在非還原聚丙烯酰胺凝膠上能產生單一的主帶。
本發(fā)明的多肽可以是重組多肽、天然多肽、合成多肽，優(yōu)選重組多肽。本發(fā)明的多肽可以是天然純化的產物，或是化學合成的產物，或使用重組技術從原核或真核宿主(例如，細菌、酵母、高等植物、昆蟲和哺乳動物細胞)中產生。根據(jù)重組生產方案所用的宿主，本發(fā)明的多肽可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本發(fā)明的多肽還可包括或不包括起始的甲硫氨酸殘基。
本發(fā)明還包括鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的片段、衍生物和類似物。如本文所用，術語“片段”、“衍生物”和“類似物”是指基本上保持本發(fā)明的天然鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白相同的生物學功能或活性的多肽。本發(fā)明的多肽片段、衍生物或類似物可以是(i)有一個或多個保守或非保守性氨基酸殘基(優(yōu)選保守性氨基酸殘基)被取代的多肽，而這樣的取代的氨基酸殘基可以是也可以不是由遺傳密碼編碼的，或(ii)在一個或多個氨基酸殘基中具有取代基團的多肽，或(iii)成熟多肽與另一個化合物(比如延長多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前導序列或分泌序列或用來純化此多肽的序列或蛋白原序列，或與抗原IgG片段的形成的融合蛋白)。根據(jù)本文的教導，這些片段、衍生物和類似物屬于本領域熟練技術人員公知的范圍。
在本發(fā)明中，術語“鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白”指具有鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白活性的SEQ ID NO.2序列的多肽。該術語還包括具有與鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白相同功能的、SEQ ID NO.2序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)一個或多個(通常為1-50個，較佳地1-30個，更佳地1-20個，最佳地1-10個)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個(通常為20個以內，較佳地為10個以內，更佳地為5個以內)氨基酸。例如，在本領域中，用性能相近或相似的氨基酸進行取代時，通常不會改變蛋白質的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個或數(shù)個氨基酸通常也不會改變蛋白質的功能。該術語還包括鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的活性片段和活性衍生物。
該多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴緊度條件下能與鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用抗鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的抗血清獲得的多肽或蛋白。本發(fā)明還提供了其他多肽，如包含鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白或其片段的融合蛋白。除了幾乎全長的多肽外，本發(fā)明還包括了鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的可溶性片段。通常，該片段具有鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白序列的至少約10個連續(xù)氨基酸，通常至少約30個連續(xù)氨基酸，較佳地至少約50個連續(xù)氨基酸，更佳地至少約80個連續(xù)氨基酸，最佳地至少約100個連續(xù)氨基酸。
發(fā)明還提供鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導的遺傳變異體。誘導變異體可以通過各種技術得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產生隨機誘變，還可通過定點誘變法或其他已知分子生物學的技術。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級結構)形式包括體內或體外的多肽的化學衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進一步加工步驟中進行糖基化修飾而產生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進行糖基化的酶(如哺乳動物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，“鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白保守性變異多肽”指與SEQ IDNO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進行氨基酸替換而產生。
表1


本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
術語“編碼多肽的多核苷酸”可以是包括編碼此多肽的多核苷酸，也可以是還包括附加編碼和/或非編碼序列的多核苷酸。
本發(fā)明還涉及上述多核苷酸的變異體，其編碼與本發(fā)明有相同的氨基酸序列的多肽或多肽的片段、類似物和衍生物。此多核苷酸的變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質上改變其編碼的多肽的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交且兩個序列之間具有至少50％，較佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本發(fā)明特別涉及在嚴格條件下與本發(fā)明所述多核苷酸可雜交的多核苷酸。在本發(fā)明中，“嚴格條件”是指(1)在較低離子強度和較高溫度下的雜交和洗脫，如0.2×SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)雜交時加有變性劑，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)僅在兩條序列之間的相同性至少在90％以上，更好是95％以上時才發(fā)生雜交。并且，可雜交的多核苷酸編碼的多肽與SEQ ID NO2所示的成熟多肽有相同的生物學功能和活性。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含15個核苷酸，較好是至少30個核苷酸，更好是至少50個核苷酸，最好是至少100個核苷酸以上。核酸片段可用于核酸的擴增技術(如PCR)以確定和/或分離編碼硝酸鹽轉運蛋白的多聚核苷酸。
本發(fā)明中的多肽和多核苷酸優(yōu)選以分離的形式提供，更佳地被純化至均質。
本發(fā)明的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設計引物，并用市售的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫作為模板，擴增而得有關序列。當序列較長時，常常需要進行兩次或多次PCR擴增，然后再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將其克隆入載體，再轉入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
目前，已經可以完全通過化學合成來得到編碼本發(fā)明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的載體，以及用本發(fā)明的載體或硝酸鹽轉運蛋白編碼序列經基因工程產生的宿主細胞，以及經重組技術產生本發(fā)明所述多肽的方法。
通過常規(guī)的重組DNA技術(Science，1984；2241431)，可利用本發(fā)明的多聚核苷酸序列可用來表達或生產重組的硝酸鹽轉運蛋白。一般來說有以下步驟(1).用本發(fā)明的編碼鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸(或變異體)，或用含有該多核苷酸的重組表達載體轉化或轉導合適的宿主細胞；(2).在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的宿主細胞；(3).從培養(yǎng)基或細胞中分離、純化蛋白質。
本發(fā)明中，鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白多核苷酸序列可插入到重組表達載體中。術語“重組表達載體”指本領域熟知的細菌質粒、噬菌體、酵母質粒、植物細胞病毒、哺乳動物細胞病毒或其他載體?？傊?，只要能在宿主體內復制和穩(wěn)定，任何質粒和載體都可以用。表達載體的一個重要特征是通常含有復制起點、啟動子、標記基因和翻譯控制元件。
本領域的技術人員熟知的方法能用于構建含鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白編碼DNA序列和合適的轉錄/翻譯控制信號的表達載體。這些方法包括體外重組DNA技術、DNA合成技術、體內重組技術等。所述的DNA序列可有效連接到表達載體中的適當啟動子上，以指導mRNA合成。表達載體還包括翻譯起始用的核糖體結合位點和轉錄終止子。
此外，表達載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標記基因，以提供用于選擇轉化的宿主細胞的表型性狀，如真核細胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質。
宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高等真核細胞，如植物細胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬、農桿菌；真菌細胞如酵母；植物細胞；昆蟲細胞等。
本發(fā)明的多核苷酸在高等真核細胞中表達時，如果在載體中插入增強子序列時將會使轉錄得到增強。增強子是DNA的順式作用因子，通常大約有10到300個堿基對，作用于啟動子以增強基因的轉錄。
本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當?shù)妮d體、啟動子、增強子和宿主細胞。
用重組DNA轉化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原核生物如大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaCl2法處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉化也可用電穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可選用如下的DNA轉染方法磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機械方法如顯微注射、電穿孔、脂質體包裝等。轉化植物也可使用農桿菌轉化或基因槍轉化等方法，例如葉盤法。對于轉化的植物細胞、組織或器官可以用常規(guī)方法再生成植株，從而獲得耐鹽性提高的植物。
獲得的轉化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本發(fā)明的基因所編碼的多肽。根據(jù)所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法(如溫度轉換或化學誘導)誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
在上面的方法中的重組多肽可在細胞內、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于常規(guī)的復性處理、用蛋白沉淀劑處理(鹽析方法)、離心、滲透破菌、超處理、超離心、分子篩層析(凝膠過濾)、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析(HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法的結合。
重組的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白或多肽有多方面的用途。例如用于篩選促進或對抗硝酸鹽轉運蛋白功能的抗體、多肽或其它配體。用表達的重組鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白篩選多肽庫可用于尋找有價值的能抑制或刺激鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白功能的多肽分子。
另一方面，本發(fā)明還包括對鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。較佳地，指那些能與鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因產物或片段結合但不識別和結合于其它非相關抗原分子的抗體。本發(fā)明中抗體包括那些能夠結合并抑制鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的分子，也包括那些并不影響鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白功能的抗體。本發(fā)明還包括那些能與修飾或未經修飾形式的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因產物結合的抗體。
本發(fā)明不僅包括完整的單克隆或多克隆抗體，而且還包括具有免疫活性的抗體片段、或嵌合抗體。
本發(fā)明的抗體可以通過本領域內技術人員已知的各種技術進行制備。例如，純化的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因產物或者其具有抗原性的片段，可被施用于動物以誘導多克隆抗體的產生。與之相似的，表達鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白或其具有抗原性的片段的細胞可用來免疫動物來生產抗體。此類單克隆抗體可以利用雜交瘤技術來制備。本發(fā)明的各類抗體可以利用鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因產物的片段或功能區(qū)，通過常規(guī)免疫技術獲得。這些片段或功能區(qū)可以利用重組方法制備或利用多肽合成儀合成。與鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因產物的未修飾形式結合的抗體可以用原核細胞(例如E.Coli)中生產的基因產物來免疫動物而產生；與翻譯后修飾形式結合的抗體(如糖基化或磷酸化的蛋白或多肽)，可以用真核細胞(例如酵母或昆蟲細胞)中產生的基因產物來免疫動物而獲得。
抗鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的抗體可用于檢測樣品中的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白。例如通過定量檢測鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白，并利用硝酸鹽轉運蛋白與鹽濃度的相關性，可以確定鹽生杜氏藻生產環(huán)境中鹽濃度。
多克隆抗體的生產可用鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白或多肽免疫動物，如家兔，小鼠，大鼠等。多種佐劑可用于增強免疫反應，包括但不限于弗氏佐劑等。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白水平的測試方法。這些試驗是本領域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白水平，可用于解釋鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白在耐鹽性方面重要性。
一種檢測檢測樣品中是否存在硝酸鹽轉運蛋白的方法是利用硝酸鹽轉運蛋白的特異性抗體進行檢測，它包括將樣品與硝酸鹽轉運蛋白特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復合物，形成了抗體復合物就表示樣品中存在硝酸鹽轉運蛋白。
本發(fā)明的多核苷酸的一部分或全部可作為探針固定在微陣列(microarray)或DNA芯片(又稱為“基因芯片”)上，用于分析組織中基因的差異表達分析。用硝酸鹽轉運蛋白特異的引物進行RNA-聚合酶鏈反應(RT-PCR)體外擴增也可檢測硝酸鹽轉運蛋白的轉錄產物。
在本發(fā)明的一個實例中，提供了一種分離的多核苷酸，它編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。本發(fā)明的多核苷酸是從鹽生杜氏藻cDNA文庫中分離出的。其序列如SEQ ID NO1所示，它包含的多核苷酸序列全長為1620個堿基，其開放讀框位于1-1617位，編碼全長為539個氨基酸的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白(SEQ ID NO2)。硝酸鹽轉運蛋白為改善植物的耐鹽性提供了新的途徑，因而具有巨大的應用前景。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因的克隆1.鹽生杜氏藻的采集(Collection)鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)購自武漢水生生物研究所藻種庫。
2.Poly A+RNA的分離(Poly A+RNA isolation)用Trizol試劑(Gibco，NY，USA)提取鹽生杜氏藻的總RNA。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質量。使用Oligotex mRNA Kits(Qiagen)提供的試劑盒操作說明書抽取鹽生杜氏藻的mRNA。
3.鹽生杜氏藻cDNA文庫的構建(Cloning of Full-length cDNA)使用Smart cDNA Library Construction Kit(ClonTech)提供的試劑盒說明書，以λTriplEX2為載體，構建鹽生杜氏藻的cDNA噬菌體文庫。
4.基因的全長克隆(Cloning of Full-length cDNA)通過對大量不同物種(包括衣藻、酵母、大腸桿菌等)的硝酸鹽轉運蛋白進行比較，確定了部分氨基酸保守序列。據(jù)此設計引物，采用RACE方法(Gibco試劑盒，NY，USA)進行cDNA全長克隆，分三個階段進行(1)使用引物，以Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增以寡核苷酸5’CAACATCATCGTGGCTTACA 3’(SEQ ID NO3)為正向引物；寡核苷酸5’TTCTTGGGTGGTCATCTTCA 3’(SEQ ID NO4)為反向引物，以Poly A+RNA為模板，進行RT-PCR擴增，擴增條件為94℃5分鐘，隨后94℃30秒、55℃30秒、72℃1分鐘進行35個循環(huán)，最后以72℃延伸5分鐘。電泳檢測PCR擴增產物，獲得的片段長度約為0.45kb，回收片段連接到購買的T-easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止熒光標記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI377測序儀(Perkin-Elmer，USA)上進行測序，測得一個436bp序列。
將該序列及其編碼蛋白質序列用BLAST程序在Non-redundantGenBank+EMBL+DDBJ+Swissprot+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)它與萊茵衣藻的硝酸鹽轉運蛋白基因有較高的同源性，證實了引物的正確。
(2).RACE根據(jù)以上序列分析設計5’RACE引物5’AATGGTGCCTCCCAGAGTCTCGTCC 3’(SEQ ID NO5)3’RACE引物5’CCGCCGATCATATGGAGTAGTGG 3’(SEQ ID NO6)使用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit(Clontech)，按照操作手冊進行，得到鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因的5’和3’端序列。
(3).PCR擴增得到硝酸鹽轉運蛋白基因編碼區(qū)(過程同(1))。
在拼接得到全長(包括完整的開放讀框)的基礎上，進一步設計引物以寡核苷酸CAGACAACATCCACTCCGCCATG(SEQ ID NO7)為正向引物；寡核苷酸CATGGCACGCAATCTACTCTACA(SEQ ID NO8)為反向引物，以用常規(guī)方法抽提的鹽生杜氏藻總RNA為模板，進行RT-PCR擴增，然后按常規(guī)方法以PCR擴增產物進行克隆、測序。結果驗證了鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的全長編碼序列的正確性。
鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因全長序列如SEQ ID NO1所示，其中讀框位置是1-1617位。
atggccacat cggccaaaga gtccctggag gtgcccctca acgcagccac cgctggcttc 60ggtgcgggca tgccgggtta cgacagggaa aagtggggct ttgacctgga tggagagaac 120aaggccaagg cgctcctgat gtggaagctg cagtctcccc atgtccgcgc ttttcatttg 180tcgtggatgt tcttcttttc cagcttcgtg gccgcctttg cgatggctgc gcttgtgcct 240gtagttaggc agaacctgga cttgaccaag gcagacctgg gtgcctctgg tatcacgact 300gtggtgggag ccatcggagc acgtgtggtc attggtgctg tctgtgacac tgttggccca 360cgcatggcca cctcgggcgt gctgctgctc atcgccccat gcgtgttctg tgcatccctg 420attgtggacc gaggaggcat cattgctgtg cgcttcttca tcggcgtcgg cctgtgcatt 480tttgtctgca accagttctg ggctggcact atgttcagcc ccaactgtgt gggcaccgtg 540aacgccacct gcggaggctg gggcaacctg ggcggtggtg ttacccagct catcatgccc 600ctaatttaca ccggcatcaa gcagagcggc gtgcctggct tcactgcttg gaggtggtcc 660ttcatggtcc ctggtgccat gttcctggtg ctcgcttttg gctgcctgtg cttctctcaa 720gacgccccca atggcagcta ccgtgacatc cgcaaagcca ggacagtgca agtggacggc 780aagaagacct tccttgctgg catcaggaac tacaggacct gggtgctcac cctgaattat 840ggttactgct ttggcgtgga gctcaccatc aacaacatca tcgtggctta catgtttgac 900cagttcggcc tgagcattga gattgcgggc attgtgggag ccgtgtttgg cctcatgaac 960atcttctgcc gctccatggg cggcattgcg tccgacgtgg ctggcaagta cttcggcatg1020cgcgggcgtc tgtggaccta cttctgcctg caactgctgg tgggcgtctt ttcaatcgtc1080ctgggcactg tggacgagac tctgggaggc accattgcag tcatgatcat cttctccgcg1140ttcgtacaga gtgctgaggg tgcctgctac ggcgtcgtgc cttttgtgtc ccgccgatca1200tatggagtag tggctgggtt ggtgggcgct ggaggcaaca ctgggtcggc tgtcacccaa1260gccctcttct ttgctgacaa tgagggtctg aagatgacca cccaagaagg tctgcagtgg1320atgggagtga tggtgatggc tgtgacctgc accatttctg tgctccactg gcctgcatgg1380ggcggcatgt tcacgcctgc caaggctggt gccactgagg aggactacta cctggcagag1440tgggatgctg aggaggtggc tgccaacctg cacatcccct ccctgcgctt tgccatggag1500agcagatcca tgcgcggcaa gaagttatta gagacgtact tggccaagga ggaggggctg1560gagtgctcct cgcaggatgc caagaagacc atagctagca tccgtgagga ctcaaactga1620(SEQ ID NO1)鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因編碼一個由539個氨基酸構成硝酸鹽轉運蛋白，其序列如SEQ ID NO2所示。
MATSAKESLE VPLNAATAGF GAGMPGYDRE KWGFDLDGEN KAKALLMWKL QSPHVRAFHL 60SWMFFFSSFV AAFAMAALVP VVRQNLDLTK ADLGASGITT VVGAIGARVV IGAVCDTVGP 120RMATSGVLLL IAPCVFCASL IVDRGGIIAV RFFIGVGLCI FVCNQFWAGT MFSPNCVGTV 180NATCGGWGNL GGGVTQLIMP LIYTGIKQSG VPGFTAWRWS FMVPGAMFLV LAFGCLCFSQ 240DAPNGSYRDI RKARTVQVDG KKTFLAGIRN YRTWVLTLNY GYCFGVELTI NNIIVAYMFD 300QFGLSIEIAG IVGAVFGLMN IFCRSMGGIA SDVAGKYFGM RGRLWTYFCL QLLVGVFSIV 360LGTVDETLGG TIAVMIIFSA FVQSAEGACY GVVPFVSRRS YGVVAGLVGA GGNTGSAVTQ 420ALFFADNEGL KMTTQEGLQW MGVMVMAVTC TISVLHWPAW GGMFTPAKAG ATEEDYYLAE 480WDAEEVAANL HIPSLRFAME SRSMRGKKLL ETYLAKEEGL ECSSQDAKKT IASIREDSN 539(SEQ ID N02)其氨基酸組成如下Ala(A)58 10.8％Arg(R)22 4.1％Asn(N)17 3.2％
Asp(D)18 3.3％Cys(C)15 2.8％Gln(Q)14 2.6％Glu(E)21 3.9％Gly(G)64 11.9％ His(H)40.7％Ile(I)30 5.6％Leu(L)46 8.5％Lys(K)18 3.3％Met(M)22 4.1％Phe(F)35 6.5％Pro(P)15 2.8％Ser(S)31 5.8％Thr(T)32 5.9％Trp(W)13 2.4％Tyr(Y)14 2.6％Val(V)50 9.3％疏水殘基約占43.04％，極性殘基約占22.8％，堿性氨基酸約占7.4％，酸性氨基酸約占7.2％。蛋白質分子量預測值為57.8Kd，等電點約為7.54。
實施例2鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的結構和功能將鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因全長序列及其編碼蛋白用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank cdstranslations+PDB+SwissProt+PIR數(shù)據(jù)庫進行核苷酸和蛋白質同源性檢索，結果發(fā)現(xiàn)它與萊茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的硝酸鹽轉運蛋白(GenPept Accession No.AJ223296.2)有45％的相同性和61％的相似性。
將鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的氨基酸在Conserved Domain Database數(shù)據(jù)庫中檢索結構域(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/cdd.shtml)，發(fā)現(xiàn)在氨基酸序列中最長讀框蛋白質保守結構域，在蛋白質序列49-401aa左右與硝酸鹽轉運蛋白的保守結構域相似，一般認為這個家族的膜蛋白含有十二個跨膜結構域。原核生物和真核生物的質膜上都有該家族成員分布，所以認為它們可能有共同的起源。
分值(bits) E值COG2223，NarK，Nitrate/nitrite transportergnl|CDD|119301245e-29[Inorganic ion tran...
COG2271，UhpC，Sugar phosphate permeasegnl|CDD|1197747.17e-06[Carbohydrate transpor...
pfam00083，sugar_tr，Sugar(and other)gnl|CDD|1661342.91e-04transporter蛋白質跨膜結構域分析將鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的氨基酸在blocks數(shù)據(jù)庫(http://www.blocks.fhcrc.org)中檢索結構域。該蛋白質可能有12個跨膜結構域，分別是
1 57-79 (23)2 97-113 (17)3 123-142 (20)4 147-167 (21)5 187-206 (20)6 219-235 (17)7 274-299 (26)8 304-323 (20)9 344-363 (20)10 367-385 (19)11 401-425 (25)12 437-455 (19)在該氨基酸序列中存在硝酸鹽轉運蛋白功能模塊，因此可預見其具有硝酸鹽轉運蛋白的相應功能。
實施例3鹽生杜氏藻cDNA文庫大規(guī)模測序和表達譜芯片的構建(High ThroughputSequencing of cDNA Library and Construction of Expression Microarray)對所得的鹽生杜氏藻cDNA文庫中的克隆進行序列測定，用所測得的靶序列構建表達譜芯片。將測序所得的克隆子溶解于3×SSC溶液中，使用Cartesian公司的Cartesian 7500點樣儀及TeleChem公司的硅烷化玻片，按公司提供的使用說明書操作。點樣后玻片經水合、干燥、UV交連，再分別用SDS、水處理10分鐘，晾干備用。
實施例4鹽生杜氏藻表達譜芯片的篩選(Screening of the Expression Microarry)使用0.5mol/l、1.5mol/l、4.5mol/l濃度的NaCl溶液分別處理鹽生杜氏藻2小時后，提取不同鹽濃度處理后的鹽生杜氏藻mRNA，分別用Cy3-dUTP和Cy5-dUTP標記，與表達譜芯片雜交，用General Scanning公司的ScanArray 3000掃描芯片，用Axon公司的Genepix 3.01軟件分析熒光信號強度。
表達譜芯片雜交結果顯示，有若干基因的表達量與鹽生杜氏藻的生長鹽濃度呈高度相關。其中，硝酸鹽轉運蛋白基因為其中一條。其具體數(shù)據(jù)分為三組第一組為cy5(4M)、cy3(1.5M)標記的；第二組為cy5(4M)、cy3(0.5M)標記的；第三組為cy5(1.5M)、cy3(0.5M)標記的。三組標記熒光信號強度的自然對數(shù)ln(cy5/cy3)的平均值為1.1，這說明隨著鹽濃度的變化，該基因的表達差異在3倍左右。
綜上所述，硝酸鹽轉運蛋白為一未見報道的新型耐鹽相關蛋白。
實施例5鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因表達載體的構建根據(jù)鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因的全長編碼序列，設計擴增出完整編碼閱讀框的引物(對應于SEQ ID NO1中最前20bp和最后20bp)，經PCR擴增后，將鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因cDNA克隆至中間載體pBluescript(購自Stratagene公司)，進一步克隆到雙元表達載體pBI 121(購自Clontech公司)，在保證閱讀框的前提下鑒定好的表達載體，在將其轉入農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)中，獲得陽性克隆，用于轉化模式植物煙草。
實施例6利用葉盤法轉化煙草按如下步驟轉化煙草(1)用無菌牙簽挑取YEB選擇平板上的實施例5中制備的農桿菌陽性克隆，接種于2M LYEB液體(Sm+，Kan+)，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24-36小時；(2)室溫下4,000g離心10分鐘；(3)棄上清，菌體用1/2MS液體培養(yǎng)基懸浮，稀釋到原體積的5-20倍，使菌液的OD600在0.5左右；(4)取生長兩周左右的煙草的無菌葉片，去掉其主葉脈，將其剪成約1cm2見方的小葉片；(5)將葉片放入制備好的菌液中，浸泡2-5分鐘，在無菌濾紙上吸干菌液；(6)把經侵染的葉片放于MS培養(yǎng)基上，28℃暗培養(yǎng)48小時；(7)將葉片轉到愈傷培養(yǎng)基(MS+6-BA 1.0mg/L+NAA 0.1mg/L+Kan 50mg/L+羧卞青霉素250mg/L)上，25-28℃光照下培養(yǎng)，7-15天可見愈傷組織的形成；(8)約20天后可見分化芽長出，帶芽長大后，切下，置于生根培養(yǎng)基(1/2MS+NAA 0.5mg/L+Kan 25mg/L)上進行生根培養(yǎng)，2-7天左右生根；待根系發(fā)達后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
初步結果表明，轉入鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因的煙草的耐鹽性高于對照煙草。
實施例7硝酸鹽轉運蛋白的表達(1)表達載體構建根據(jù)鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因的全長編碼序列(SEQ ID NO1)，設計擴增出完整編碼讀框的引物正向引物為5′CAGACAACATCCACTCCGCCATG3’(SEQ ID NO7)反向引物為5′CATGGCACGCAATCTACTCTACA3′(SEQ ID NO8)并在正反引物上分別引入BamH I以及Xho I限制性酶切位點。鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白基因的全長基因經PCR擴增后，克隆至表達載體pRS426-CUP(購自Clontech公司)，在保證閱讀框正確的前提下鑒定表達載體，將其轉入模式生物釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
(2)電轉化法轉化釀酒酵母A.用無菌牙簽挑取YEPD平板中釀酒酵母單菌落于2mL液體YEPD培養(yǎng)基中，28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)過夜。
B.次日轉入200mLYEPD培養(yǎng)基中28℃，200rpm振蕩培養(yǎng)直至OD600＝1.0～1.3之間。
C.將細胞轉移至50mL離心管中4000rpm，4℃離心10min，棄取上清。
D.將等體積的去離子水加入離心管中，重懸細胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
E.將一半體積的去離子水加入離心管中，重懸細胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
F.將一半體積的1M山梨醇加入離心管中，重懸細胞，4000rpm，4℃離心10min。棄取上清。
G.將500μL的1M山梨醇加入離心管。
H.將100μL感受態(tài)酵母細胞與100ng質粒DNA混勻，加入至0.1cm電擊杯中冰浴20min，放置于BioRed電穿孔儀中按25μF，1500V電擊。
I.然后迅速加入1mL 1M山梨醇，混勻后將部分細胞涂布于選擇平板上(無尿嘧啶培養(yǎng)基)30℃培養(yǎng)3～6天，從而獲得轉入硝酸鹽轉運蛋白的酵母菌株。
轉入硝酸鹽轉運蛋白的酵母菌株的細胞裂解物在對應于約58KDa處有一明顯的硝酸鹽轉運蛋白條帶。
實施例8
鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的分離、純化及活性測定1、蛋白的純化所有層析過程都于室溫(20℃左右)在Pharmacia公司的FPLC系統(tǒng)(III型)上進行。
1.1培養(yǎng)條件鹽生杜氏藻的培養(yǎng)分為三個階段0.17M NaCl連續(xù)的光照培養(yǎng)，1周；0.5M NaCl以5％或者10％的接種量將第一階段的鹽藻接種在新的培養(yǎng)基上，相同培養(yǎng)條件，1周；1.0M NaCl將二階段的鹽藻接在1.0M NaCl的培養(yǎng)基上連續(xù)培養(yǎng)5天，期間搖床培養(yǎng)，光照周期為light∶dark＝16∶8h，光照強度為150umol·m-2·s-1，培養(yǎng)的過程中要通5％的CO2。培養(yǎng)物總體積約6L。1.2蛋白的粗提取培養(yǎng)1周的藻在4500×g離心收集，得鮮重約6g。加100mL A液(TDG buffer(pH6.9)100mM Tris，1mM DTT，2.5％(v/v)甘油)。冰浴超聲破碎，超聲功率200W，每次作用時間8s，間隔30s，共作用10次。4℃40000×g離心30min，取上清液作為粗提液。
1.3PEG分級在不停攪拌的條件下緩緩加入50％的PEG8000儲液，至PEG終濃度為15％，靜置30min。40000×g離心30min，取上清，加入MgCl2至10mmol/L，再加入PEG儲液至終濃度為25％，靜置60min。以上所有操作都在冰浴下進行。4℃40000×g離心30min，取沉淀復溶于60mL A液，用于DEAE離子交換層析。
1.4DEAE離子交換層析DEAE Sepharose Fast Flow柱(10cm×1.6cm)經A液平衡后加提取液，流速1mL/min。上柱后先用40mL A液洗去未吸附的蛋白，然后以100mLA液對100mL B液(A液+1.0mol/L NaCl)進行0～1.0mol/L NaCl線性梯度洗脫，流速1.5mL/min。硝酸鹽轉運蛋白活性部分約在0.24～0.3mol/L的NaCl處洗脫。
1.5Blue Sepharose CL-6B擬親和層析收集DEAE Sepharose Fast Flow柱上洗脫的硝酸鹽轉運蛋白液在4℃不停攪拌的條件下加MgCl2至10mmol/L，再緩緩加入PEG 8000儲液，至PEG終濃度為25％，靜置60min。4℃40000×g離心30min，取沉淀復溶于6mLA液。提取液上至A液平衡過的Blue Sepharose CL-6B柱(2cm×0.8cm)，上樣流速為0。再用C液(A液+5mmol/L NADH)洗脫，洗脫流速0.2mL/min。收集洗脫下來的提取液。
1.6QHP柱層析上柱前所有溶液抽氣，過濾，以A液平衡QHP柱。Blue Sepharose層析收集的提取液10000×g離心以除去不溶物后上柱。先用2mL A液洗柱，然后用A液對B液進行0～1.0mol/L NaCl線性梯度結合階梯式地洗脫，流速0.5mL/min。硝酸鹽轉運蛋白約在0.33mol/L NaCl處洗脫下來。
2、活性的測定根據(jù)參考文獻(THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY，Vol.271(4)2088-2092，1996)中所述的方法進行酶活測定。結果表明，分離出的硝酸鹽轉運蛋白具有硝酸鹽轉運活性。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
序列表<110>四川川大光耀生物工程有限公司<120>鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白及其編碼序列<130>037215<160>8<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1620<212>DNA<213>鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)<400>1atggccacat cggccaaaga gtccctggag gtgcccctca acgcagccac cgctggcttc 60ggtgcgggca tgccgggtta cgacagggaa aagtggggct ttgacctgga tggagagaac 120aaggccaagg cgctcctgat gtggaagctg cagtctcccc atgtccgcgc ttttcatttg 180tcgtggatgt tcttcttttc cagcttcgtg gccgcctttg cgatggctgc gcttgtgcct 240gtagttaggc agaacctgga cttgaccaag gcagacctgg gtgcctctgg tatcacgact 300gtggtgggag ccatcggagc acgtgtggtc attggtgctg tctgtgacac tgttggccca 360cgcatggcca cctcgggcgt gctgctgctc atcgccccat gcgtgttctg tgcatccctg 420attgtggacc gaggaggcat cattgctgtg cgcttcttca tcggcgtcgg cctgtgcatt 480tttgtctgca accagttctg ggctggcact atgttcagcc ccaactgtgt gggcaccgtg 540aacgccacct gcggaggctg gggcaacctg ggcggtggtg ttacccagct catcatgccc 600ctaatttaca ccggcatcaa gcagagcggc gtgcctggct tcactgcttg gaggtggtcc 660ttcatggtcc ctggtgccat gttcctggtg ctcgcttttg gctgcctgtg cttctctcaa 720gacgccccca atggcagcta ccgtgacatc cgcaaagcca ggacagtgca agtggacggc 780aagaagacct tccttgctgg catcaggaac tacaggacct gggtgctcac cctgaattat 840ggttactgct ttggcgtgga gctcaccatc aacaacatca tcgtggctta catgtttgac 900cagttcggcc tgagcattga gattgcgggc attgtgggag ccgtgtttgg cctcatgaac 960
atcttctgcc gctccatggg cggcattgcg tccgacgtgg ctggcaagta cttcggcatg 1020cgcgggcgtc tgtggaccta cttctgcctg caactgctgg tgggcgtctt ttcaatcgtc 1080ctgggcactg tggacgagac tctgggaggc accattgcag tcatgatcat cttctccgcg 1140ttcgtacaga gtgctgaggg tgcctgctac ggcgtcgtgc cttttgtgtc ccgccgatca 1200tatggagtag tggctgggtt ggtgggcgct ggaggcaaca ctgggtcggc tgtcacccaa 1260gccctcttct ttgctgacaa tgagggtctg aagatgacca cccaagaagg tctgcagtgg 1320atgggagtga tggtgatggc tgtgacctgc accatttctg tgctccactg gcctgcatgg 1380ggcggcatgt tcacgcctgc caaggctggt gccactgagg aggactacta cctggcagag 1440tgggatgctg aggaggtggc tgccaacctg cacatcccct ccctgcgctt tgccatggag 1500agcagatcca tgcgcggcaa gaagttatta gagacgtact tggccaagga ggaggggctg 1560gagtgctcct cgcaggatgc caagaagacc atagctagca tccgtgagga ctcaaactga 1620<210>2<211>539<212>PRT<213>鹽生杜氏藻(Dunaliella salina)<400>2Met Ala Thr Ser Ala Lys Glu Ser Leu Glu Val Pro Leu Asn Ala Ala1 5 10 15Thr Ala Gly Phe Gly Ala Gly Met Pro Gly Tyr Asp Arg Glu Lys Trp20 25 30Gly Phe Asp Leu Asp Gly Glu Asn Lys Ala Lys Ala Leu Leu Met Trp35 40 45Lys Leu Gln Ser Pro His Val Arg Ala Phe His Leu Ser Trp Met Phe50 55 60Phe Phe Ser Ser Phe Val Ala Ala Phe Ala Met Ala Ala Leu Val Pro65 70 75 80Val Val Arg Gln Asn Leu Asp Leu Thr Lys Ala Asp Leu Gly Ala Ser85 90 95Gly Ile Thr Thr Val Val Gly Ala Ile Gly Ala Arg Val Val Ile Gly
100 105 110Ala Val Cys Asp Thr Val Gly Pro Arg Met Ala Thr Ser Gly Val Leu115 120 125Leu Leu Ile Ala Pro Cys Val Phe Cys Ala Ser Leu Ile Val Asp Arg130 135 140Gly Gly Ile Ile Ala Val Arg Phe Phe Ile Gly Val Gly Leu Cys Ile145 150 155 160Phe Val Cys Asn Gln Phe Trp Ala Gly Thr Met Phe Ser Pro Asn Cys165 170 175Val Gly Thr Val Asn Ala Thr Cys Gly Gly Trp Gly Asn Leu Gly Gly180 185 190Gly Val Thr Gln Leu Ile Met Pro Leu Ile Tyr Thr Gly Ile Lys Gln195 200 205Ser Gly Val Pro Gly Phe Thr Ala Trp Arg Trp Ser Phe Met Val Pro210 215 220Gly Ala Met Phe Leu Val Leu Ala Phe Gly Cys Leu Cys Phe Ser Gln225 230 235 240Asp Ala Pro Asn Gly Ser Tyr Arg Asp Ile Arg Lys Ala Arg Thr Val245 250 255Gln Val Asp Gly Lys Lys Thr Phe Leu Ala Gly Ile Arg Asn Tyr Arg260 265 270Thr Trp Val Leu Thr Leu Asn Tyr Gly Tyr Cys Phe Gly Val Glu Leu275 280 285Thr Ile Asn Asn Ile Ile Val Ala Tyr Met Phe Asp Gln Phe Gly Leu290 295 300Ser Ile Glu Ile Ala Gly Ile Val Gly Ala Val Phe Gly Leu Met Asn305 310 315 320Ile Phe Cys Arg Ser Met Gly Gly Ile Ala Ser Asp Val Ala Gly Lys325 330 335Tyr Phe Gly Met Arg Gly Arg Leu Trp Thr Tyr Phe Cys Leu Gln Leu340 345 350Leu Val Gly Val Phe Ser Ile Val Leu Gly Thr Val Asp Glu Thr Leu355 360 365
Gly Gly Thr Ile Ala Val Met Ile Ile Phe Ser Ala Phe Val Gln Ser370 375 380Ala Glu Gly Ala Cys Tyr Gly Val Val Pro Phe Val Ser Arg Arg Ser385 390 395 400Tyr Gly Val Val Ala Gly Leu Val Gly Ala Gly Gly Asn Thr Gly Ser405 410 415Ala Val Thr Gln Ala Leu Phe Phe Ala Asp Asn Glu Gly Leu Lys Met420 425 430Thr Thr Gln Glu Gly Leu Gln Trp Met Gly Val Met Val Met Ala Val435 440 445Thr Cys Thr Ile Ser Val Leu His Trp Pro Ala Trp Gly Gly Met Phe450 455 460Thr Pro Ala Lys Ala Gly Ala Thr Glu Glu Asp Tyr Tyr Leu Ala Glu465 470 475 480Trp Asp Ala Glu Glu Val Ala Ala Asn Leu His Ile Pro Ser Leu Arg485 490 495Phe Ala Met Glu Ser Arg Ser Met Arg Gly Lys Lys Leu Leu Glu Thr500 505 510Tyr Leu Ala Lys Glu Glu Gly Leu Glu Cys Ser Ser Gln Asp Ala Lys515 520 525Lys Thr Ile Ala Ser Ile Arg Glu Asp Ser Asn530 535<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>3caacatcatc gtggcttaca20<210>4<211>20<212>DNA
<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>4ttcttgggtg gtcatcttca20<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>5aatggtgcct cccagagtct cgtcc 25<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>6ccgccgatca tatggagtag tgg23<210>7<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>7cagacaacat ccactccgcc atg23<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列
<220>
<221>misc_feature<223>引物<400>8catggcacgc aatctactct aca2權利要求
1.一種分離的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有硝酸鹽轉運功能的由(a)衍生的多肽。
2.如權利要求1所述的硝酸鹽轉運蛋白，其特征在于，該硝酸鹽轉運蛋白是具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權利要求1所述的鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補的多核苷酸。
4.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ IDNO2所示氨基酸序列的多肽。
5.如權利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中1-1617位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1620位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權利要求3所述的多核苷酸。
7.一種遺傳工程化的宿主細胞，其特征在于，它含有權利要求6所述的載體。
8.一種多肽的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達的條件下，培養(yǎng)權利要求7所述的宿主細胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白。
9.一種改善植物耐鹽性的方法，其特征在于，它包括步驟(1)提供攜帶表達載體的農桿菌，所述的表達載體含有硝酸鹽轉運蛋白DNA編碼序列，所述的硝酸鹽轉運蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的多肽；(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有硝酸鹽轉運蛋白功能的由(a)衍生的多肽。(2)將植物細胞或組織或器官與步驟(1)中的農桿菌接觸，從而使硝酸鹽轉運蛋白DNA編碼序列轉入植物細胞，并且整合到植物細胞的染色體上；(3)選擇出轉入硝酸鹽轉運蛋白DNA編碼序列的植物細胞或組織或器官；(4)將步驟(3)中的植物細胞或組織或器官再生成植株。
10.如權利要求9所述的方法，其特征在于，該硝酸鹽轉運蛋白是具有SEQID NO2氨基酸序列的多肽。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種新的耐鹽相關蛋白－鹽生杜氏藻硝酸鹽轉運蛋白，編碼硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸和經重組技術產生這種硝酸鹽轉運蛋白的方法。本發(fā)明還公開了編碼這種硝酸鹽轉運蛋白的多核苷酸的用途。本發(fā)明還公開了此硝酸鹽轉運蛋白用于改善植物耐鹽性的方法。
文檔編號A01H1/00GK1623999SQ200310109020
公開日2005年6月8日 申請日期2003年12月3日 優(yōu)先權日2003年12月3日
發(fā)明者曹毅, 蔣彥, 唐克軒, 楊滔, 曾昌耀 申請人:四川川大光耀生物工程有限公司