專利名稱：提高水稻磷吸收效率的基因及用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種提高水稻磷吸收效率的基因 0sa-miR399k,同時(shí)涉及該基因在轉(zhuǎn)基因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明采用反向遺傳學(xué)的方法，分 離克隆了提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399k，通過(guò)超量表達(dá)0sa-miR399k基因，使轉(zhuǎn)基 因水稻出現(xiàn)磷吸收效率提高的表型，證實(shí)了該基因具有提高水稻磷營(yíng)養(yǎng)吸收的功能。本發(fā) 明還涉及該基因家族0sa-miR399的其它成員例如0sa_miR399a-—0sa_miR399k，以及含有 其核心序列5’ tgccaaaggaaatttgccccg 3’的其它DNA片段或與其核心序列對(duì)比不超過(guò)5 個(gè)堿基變異的其它DNA片段或其它物種的同源基因的載體或涉及利用該基因或其功能類 似物提高植物磷吸收效率，從而減少磷肥的施用量，促進(jìn)植物在低磷土地上生長(zhǎng)。
背景技術(shù)：
水稻作為重要的糧食作物，世界上三分之一以上的人口以其為主食。同時(shí)，由于水 稻具有基因組小、精細(xì)的遺傳和物理圖譜、相對(duì)容易的轉(zhuǎn)基因技術(shù)及與其它禾本科作物的 共線性，而被視做模式植物。為解決人口增長(zhǎng)與耕地面積減少的矛盾，提高水稻單位面積 產(chǎn)量仍是人們面臨的挑戰(zhàn)。土壤中部分營(yíng)養(yǎng)元素的缺乏是限制水稻產(chǎn)量提高的因素之一。 磷是作物生長(zhǎng)發(fā)育所必需三大營(yíng)養(yǎng)元素之一，是繼氮之后為植物體所吸收的第二大營(yíng)養(yǎng)元 素，在植物光合作用、呼吸作用和生理生化的調(diào)節(jié)中具有重大作用。但由于土壤中的磷大部 分被其中的鎂、鐵、鋁氫氧化物及鈣鹽所固定或被土壤膠體吸附而成為無(wú)效態(tài)(難溶性)， 以及磷有機(jī)復(fù)合體的形成，使得世界上30% -40%耕地的有效磷含量不能滿足植物體正常 生長(zhǎng)發(fā)育的需要。即使施以磷肥，磷肥的當(dāng)季利用率也只有10% 25%。因此，磷缺乏成為 限制作物產(chǎn)量重要的因素之一。大量施用磷肥是解決土壤缺磷問(wèn)題、維持和提高產(chǎn)量的傳 統(tǒng)途徑，然而卻造成了資源浪費(fèi)、環(huán)境污染、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本增加等系列問(wèn)題。更為嚴(yán)峻的是， 磷肥的主要來(lái)源磷礦石，是一種不可再生資源。據(jù)估計(jì)我國(guó)高品質(zhì)磷礦資源可用年度不足 10年。因此，發(fā)掘作物自身磷高效利用的潛力、選育磷高效作物品種、提高磷肥利用率，是改 善作物磷素營(yíng)養(yǎng)狀況、減少磷肥施用、生物修復(fù)土壤污染、提高作物產(chǎn)量的更為經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、 長(zhǎng)遠(yuǎn)的途徑。植物對(duì)磷吸收利用是一個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，為了提高植物對(duì)土壤中磷的利用效率，植 物在進(jìn)化過(guò)程中形成了許多適應(yīng)機(jī)制如擴(kuò)大根系面積來(lái)增加對(duì)土壤磷的利用；通過(guò)和菌 根形成共生關(guān)系獲取磷元素；植物還通過(guò)調(diào)節(jié)新陳代謝來(lái)保持磷的動(dòng)態(tài)平衡，如把老葉中 磷轉(zhuǎn)運(yùn)到新葉中等方式重復(fù)利用植物體內(nèi)的磷元素，從而保持植物體內(nèi)和細(xì)胞內(nèi)磷的動(dòng)態(tài) 平衡；同時(shí)植物為了適應(yīng)低磷條件還通過(guò)調(diào)控基因的表達(dá)水平，包括上調(diào)磷饑餓誘導(dǎo)基因 以及下調(diào)新陳代謝相關(guān)的基因，如一些光合作用相關(guān)基因來(lái)維持生長(zhǎng)發(fā)育；植物甚至通過(guò) 分泌磷酸酶、核酸酶以及有機(jī)酸促進(jìn)吸收土壤中的磷。高等植物在吸收磷酸鹽的時(shí)候，磷酸鹽首先進(jìn)入表皮和皮層的質(zhì)外體，然后在 磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子的作用下跨膜進(jìn)入共質(zhì)體，再經(jīng)木質(zhì)部輸送到地上部分，從而分配到不 同器官。高等植物同時(shí)具有兩種吸收系統(tǒng)一類是組成型表達(dá)的低親和力系統(tǒng)(Pi LowAffinity Transporter)，生長(zhǎng)環(huán)境中磷供應(yīng)充足時(shí)，磷的吸收就靠這一吸收轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)， 同時(shí)它可能也參與植物體內(nèi)磷元素的傳導(dǎo)；另一類是高親和力系統(tǒng)(Pi High Affinity Transporter)，是磷饑餓誘導(dǎo)表達(dá)的系統(tǒng)，以便有效吸收低濃度的有效磷。(劉芳，2010，水 稻中0sPHR2調(diào)控磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子0SPT2的分子和遺傳分析。博士論文，華中農(nóng)業(yè)大學(xué))。第一個(gè)編碼植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(PTs)的基因(AtPTl和AtPT2)是從擬南芥中 分離出Jfe白勺(Muchhal et al. 1996, Phosphate transporters from the higher plant Arabidopsis thaliana. Proc Natl Acad SciUSA 93:10519—10523)。 ；tM，^Cfi白勺 PTs — 因從各種各樣的植物家族中被鑒定出，包括禾本科，豆科以及茄科。根據(jù)其不同的特征分為 Phtl、Pht2和Pht3三個(gè)家族。迄今為止，克隆到的植物磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因基本上歸屬于 Phtl和Pht2兩大家族。其中，絕大部分屬于H2P047nH+共運(yùn)體的Phtl家族。到目前為止，在水稻中已鑒定了 13個(gè)磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白0sPTl-0sPT13。這些蛋白在 水稻植株中對(duì)磷素的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)起著至關(guān)重要的作用，其中大部分的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因 主要或者只在根部，受低磷環(huán)境或叢枝菌根真菌的侵染強(qiáng)烈誘導(dǎo)表達(dá)。OsPTl是組成型表 達(dá)，0sPT2和0sPT6是受低磷脅迫誘導(dǎo)在根部表達(dá)最強(qiáng)的兩個(gè)Phtl家族蛋白，同時(shí)在葉中 也有較弱表達(dá)。0sPT6是高親和力轉(zhuǎn)運(yùn)子，在植物的磷吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)方面起著較為廣泛的作 用，而0sPT2是一個(gè)低親和力轉(zhuǎn)運(yùn)子，負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)植物植物體內(nèi)儲(chǔ)存的磷。OsPTll和0sPT13 的表達(dá)受菌根誘導(dǎo)。到目前為止，對(duì)0sPT3、0sPT4、0sPT5、0sPT7、0sPT8、0sPT9、OsPTlO和 0sPT12的報(bào)道還非常少。其中0sPT4、0sPT7、0sPT8和0sPT12也是受低磷脅迫的誘導(dǎo)在根 部表達(dá)，而0sPT3和0sPT5的表達(dá)不受外界磷環(huán)境的影響，在水稻根和葉中都無(wú)表達(dá)(高佳 等，水稻磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Phtl家族研究進(jìn)展。中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2009，25 (15) :31_34)。磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)受上游基因的調(diào)控，AtPHRl在擬南芥的磷信號(hào)系統(tǒng)中起著 關(guān)鍵作用。AtPHRl的功能缺失體導(dǎo)致幾個(gè)磷饑餓誘導(dǎo)基因如AtlPSl，AtRNSl和At4的 表達(dá)量的降低，并在葉部積累花青素，這是擬南芥缺磷的明顯癥狀(Ragh0thama，1999， Phosphate Acquisition. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol 50 :665_693)。而超表 達(dá)AtPHRl導(dǎo)致擬南芥中過(guò)量積累磷。已有人提出存在于擬南芥磷饑餓信號(hào)路徑的調(diào)節(jié)系 統(tǒng)(Schachtman and Shin,2007,Nutrient sensing and signaling :NPKS. Annu Rev Plant Biol, 2007, 58 47-69)。在這個(gè)調(diào)節(jié)系統(tǒng)中，AtPHRl被一個(gè)依賴AtSIZl的過(guò)程SUMO化修 飾。AtSIZl是一個(gè)植物小類泛素修飾(SUMO)E3連接酶，主要控制磷饑餓反應(yīng)。AtPHRl調(diào) 控下游Mt/TPSIl家族或PH02基因，再通過(guò)它們調(diào)控下游的磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因。同時(shí)AtPHRl 還可以直接調(diào)控磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)基因。(劉芳，2010，水稻中0sPHR2調(diào)控磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)子0SPT2的 分子和遺傳分析。博士論文，華中農(nóng)業(yè)大學(xué))。磷的吸收和體內(nèi)代謝是一個(gè)復(fù)雜的生化過(guò)程，對(duì)植物磷酸鹽吸收以及運(yùn)輸?shù)臋C(jī)制 還有待進(jìn)一步的認(rèn)識(shí)，才能為生產(chǎn)上選育耐磷脅迫、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的品種奠定基礎(chǔ)。本發(fā)明采 用反向遺傳學(xué)的方法，分離克隆了提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399k，通過(guò)超量表達(dá) 0sa-miR399k基因，使轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)提高磷吸收效率的表型，證實(shí)了該基因的功能。本 基因的克隆和轉(zhuǎn)基因運(yùn)用，有望應(yīng)用于水稻磷高效育種中，減少磷肥施用、降低農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成 本，提高作物產(chǎn)量，還有利于生態(tài)保護(hù)環(huán)境。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是在于提供了一種提高水稻磷高效利用基因0sa-miR399k(基因登 錄號(hào):MI0001063, http //www. mirbase. org/)，其核苷酸序列如 SEQ. ID. NO 1 所示的核苷 酸序列，或該基因家族0sa-miR399其它成員0sa_miR399a-—0sa_miR399k，以及含有其核 心序列5’ tgccaaaggaaatttgccccg 3’的其它DNA片段或包含有與其核心序列對(duì)比不超過(guò) 5個(gè)堿基變異的其它DNA片段。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399在轉(zhuǎn)基 因水稻中的應(yīng)用。本發(fā)明的再一個(gè)目的在于提供一種提高水稻磷吸收效率基因0sa-miR399在轉(zhuǎn)基 因水稻植株培育中的應(yīng)用。通過(guò)提高0sa-miR399基因或其功能類似基因在水稻中的表達(dá) 量來(lái)提高水稻磷吸收效率，也可以通過(guò)0sa-miR399基因在特定時(shí)空的表達(dá)提高水稻磷吸 收效率。本基因的克隆還對(duì)闡明0sa-miR399基因家族的生物學(xué)功能有重要意義以及植物 對(duì)磷吸收的分子機(jī)理研究有重要的推動(dòng)作用。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的簡(jiǎn)要過(guò)程如下1.超表達(dá)載體構(gòu)建水稻中0sa-miR399家族共有11個(gè)成員，即0sa-miR399a-0sa_miR399k，其剪切出 的成熟miRNA序列基本相同。選其中的一個(gè)成員0sa-miR399k來(lái)構(gòu)建超表達(dá)載體，研究其 功能。0sa-miR399k編碼的小分子RNA序列如下0sa_miR399k 5' ugccaaaggaaauuugccccg 3'采用用PCR方法，直接從水稻基因組中擴(kuò)增0sa-miR399k的前體基因組序列，其核 苷酸序列如SEQ. ID. NO 1所示。設(shè)計(jì)的PCR引物序列是miR399k_F(BamHI)5， CAAGGATCCacattctccttcaacaatRR 3，miR399k-R (KpnI) 5，AGAGGTACCRaaaRtctRaaaccaRtRRa 3，按PCR反應(yīng)-酶切-連接反應(yīng)-電轉(zhuǎn)化-挑單克隆-酶切驗(yàn)證-PCR驗(yàn)證-測(cè)序 驗(yàn)證的程序構(gòu)建至轉(zhuǎn)化載體PU1301上(圖1)。 經(jīng)過(guò)測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒命名為pUmiR399k，經(jīng)電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，抽提質(zhì)粒， PCR驗(yàn)證，取750μ 1含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌菌液加等體積的50%甘油混勻，于-70°C保存。2.遺傳轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Wu等，Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J, 2003, 35 :418_427)將超 表達(dá)載體pUmiR399k導(dǎo)入中花11號(hào)水稻品種中，轉(zhuǎn)基因植株命名為0sa-miR399_0X。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果共得到轉(zhuǎn)化苗40株。轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR陽(yáng)性檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果40株轉(zhuǎn)化苗35棵陽(yáng)性，5棵陰性，陽(yáng)性率為87. 5% (圖2)。3. TO代轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率提高與轉(zhuǎn)基因共分離在40株TO代轉(zhuǎn)化苗中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株出現(xiàn)磷吸收效率提高，葉片末端出現(xiàn)磷累 積的表型。而轉(zhuǎn)基因陰性單株沒(méi)有出現(xiàn)磷累積的表型(圖3，圖4)。4. Southern雜交檢測(cè)TO代拷貝數(shù)
采用Southern雜交的方法檢測(cè)轉(zhuǎn)基因的拷貝數(shù)，結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中第3、9、16、19泳 道為轉(zhuǎn)基因單拷貝。5. Tl代轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率提高與轉(zhuǎn)基因共分離選其中的1個(gè)單拷貝種植下一代(Tl代)，出現(xiàn)3 1分離，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株中P 含量高，葉片末端出現(xiàn)磷累積的表型。陰性單株P(guān)含量正常，表型無(wú)變化。說(shuō)明Tl代轉(zhuǎn)基 因植株與P含量提高是共分離的(圖6)。6.不同P濃度脅迫處理，轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率提高水培肥料采用國(guó)際水稻研究所(IRRI)配方?？偣苍O(shè)置8種P濃度梯度(正常P的濃度為1\朽，分別是3XP、2XP、1XP、 1/2 XP、1/4XP、1/8 XP、1/10 XP和1/50 XP培養(yǎng)轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照中花11號(hào)，采用連續(xù)流 動(dòng)注射法測(cè)定植物樣品中的全磷(見(jiàn)附錄2)。試驗(yàn)結(jié)果表明在3XP、2XP、1XP的條件 下，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株磷吸收效率提高，葉片末端出現(xiàn)磷累積的表型。但在1/2XP、1/4XP、1/8XP、1/10XP和1/50XP培養(yǎng)條件下，轉(zhuǎn)基因植株與對(duì)照 品種中花11號(hào)沒(méi)有明顯的表型差異。說(shuō)明在高磷濃度中轉(zhuǎn)miR399k基因的植株磷吸收效 率比對(duì)照品種提高(圖7，圖8)。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和效果1.本基因的克隆對(duì)闡明0sa-miR399基因家族的生物學(xué)功能有重要意義以及植物 對(duì)磷吸收的分子機(jī)理研究有重要的推動(dòng)作用。2.通過(guò)提高0sa-miR399基因或其功能類似基因在水稻中的表達(dá)量來(lái)提高水稻磷 吸收效率。3.同時(shí)還可以通過(guò)特異表達(dá)啟動(dòng)子調(diào)控0sa-miR399的不同時(shí)空表達(dá)模式(如只 在根中表達(dá)等)更加有效的吸收利用磷。4. 0sa-miR399基因的克隆有望在水稻磷高效育種中應(yīng)用，減少磷肥施用、降低農(nóng) 業(yè)生產(chǎn)成本，提高作物產(chǎn)量，還有利于保護(hù)環(huán)境。


圖1. pU1301載體圖，攜帶具有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動(dòng)子。圖2. TO代陽(yáng)性檢測(cè)膠圖，40株轉(zhuǎn)化苗35棵陽(yáng)性，5棵陰性(紅色箭頭表示)， 87. 5%陽(yáng)性率。圖3.為TO代轉(zhuǎn)化植株表型，第1個(gè)為陰性植株，第2至6號(hào)單株為轉(zhuǎn)pUmiR399k 的陽(yáng)性單株，表現(xiàn)為葉片中不同程度的磷累積。圖4.為TO代轉(zhuǎn)化子葉片出現(xiàn)磷累積，左邊為陰性對(duì)照，右邊為陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因植株。圖5Southern檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株拷貝數(shù)，圖中第3、9、16、19泳道為單拷貝。圖6. Tl代表型共分離，選1個(gè)TO代單拷貝種植下一代(Tl)，出現(xiàn)3 1分離，陽(yáng) 性單株為1，3，4，6，8，9，10的P含量高，葉片出現(xiàn)磷積累表型。陰性單株2，5，8的P含量正 常，表型正常。說(shuō)明Tl代也是共分離。圖7.連續(xù)流動(dòng)注射法測(cè)定植物樣品中的全磷在2XP和IXP脅迫時(shí)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株葉片出現(xiàn)磷積累表型。2XP脅迫時(shí)，超表 達(dá)單株與對(duì)照比，在根中的P含量沒(méi)有差異，在老葉和新葉中超表達(dá)單株都比對(duì)照高，說(shuō)明超表達(dá)單株吸收P的能力比對(duì)照強(qiáng)。1X P脅迫時(shí)，超表達(dá)單株與對(duì)照比，在根中的P含量沒(méi) 有差異，在老葉和新葉中超表達(dá)單株都比對(duì)照高，說(shuō)明超表達(dá)單株吸收P的能力比對(duì)照強(qiáng)。 超表達(dá)單株老葉中P含量比對(duì)照高出近10倍，P在老葉中聚集。在1/10XP和1/50XP脅迫時(shí)超表達(dá)單株與對(duì)照比沒(méi)有明顯差異，根、老葉和新葉 P含量都低，都出現(xiàn)缺P癥狀。圖8. 5 種 P 脅迫處理 3XP、1XP、1/2XP、1/4XP、1/8XP。對(duì)照中花 11 號(hào)(左邊) 轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株(右邊)。試驗(yàn)結(jié)果可以看出在3XP和IXP脅迫中，轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效 率提高，葉尖出現(xiàn)磷累積，在1/2XP，1/4XP和1/8XP脅迫條件下轉(zhuǎn)基因植株和對(duì)照中花 11號(hào)沒(méi)有明顯差別。
圖9. Alliance-Futura—流動(dòng)分析儀全磷模塊的分析流程示意圖(括號(hào)內(nèi)數(shù)字是流 速ml/min)。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1 分離克隆0sa-miR399基因及遺傳轉(zhuǎn)化載體構(gòu)建在已知的水稻miRNA家族(http://www. mirbase. org/)中選取了 52個(gè)家族，每個(gè) 家族選其中的一個(gè)成員構(gòu)建超表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化水稻品種中花11號(hào)(ZHll)，獲得了 52個(gè)超 表達(dá)水稻 miRNA群體。0sa-miR399k (基因登錄號(hào)MI0001063，http //www. mirbase. org/)， 是其中一個(gè)。水稻中0sa-miR399家族共有11個(gè)成員，即0sa_miR399a-—0sa_miR399k，其 剪切出的成熟miRNA序列基本相同，它們的核苷酸序列如下所示0sa_miR399a 5' ugccaaaggagaauugcccug 3'0sa_miR399b 5' ugccaaaggagaauugcccug 3'0sa_miR399c 5' ugccaaaggagaauugcccug 3'0sa_miR399d 5' ugccaaaggagaguugcccug 3'0sa_miR399e 5' ugccaaaggagauuugcccag 3'0sa-miR399f 5' ugccaaaggagauuugcccag 3'0sa_miR399g 5' ugccaaaggagauuugcccag 3'0sa_miR399h 5' ugccaaaggagacuugcccag 3'0sa_miR399i 5' ugccaaaggagagcugcccug 3'0sa_miR399j 5' ugccaaaggagaguugcccua 3'0sa_miR399k 5' ugccaaaggaaauuugccccg 3'選其中的一個(gè)成員0sa_miR399k構(gòu)建超表達(dá)載體，0sa_miR399k前體序列為5’ AGCUGCAUUGCUGGGCAA⑶UGUCCUUUGGCAGAU⑶UGCAGUUCAUCAUCGAUGCCUGGGG⑶UAC CAGACUACUGCCAAAGGAAAUUUGCCCCGGAAUUCAUCU 3’。
列
0sa-miR399k前體序列形成的徑環(huán)結(jié)構(gòu)如下下劃線部分為成熟0sa-miR399k序
ccgugauguugcaguucaucaucg
5' ag ug auu c gggcaaguu uccuuuggcaga
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3， uc ac uaa r CCCRuuuaa aRRaaaccRUcg
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uu g c-aucagaccauugggggucc所用轉(zhuǎn)化載體是本申請(qǐng)人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的 pU1301。pU1301是在國(guó)際上常用的植物遺傳轉(zhuǎn)化載體pCAMBIA1301(Sun等，2004，Xa26，a gene conferring resistance to Xanthomonas oryzae pv.oryzae in rice, encoding a LRR receptor kinase-like protein. Plant Journal. 37 :517_527)基礎(chǔ)上改建的，攜帶具 有組成型和超量表達(dá)特征的玉米泛素啟動(dòng)子的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化載體(圖1)。pCAMBIA1301 載體由澳大利亞 CAMBIA 實(shí)驗(yàn)室(Center for the Application of Molecular Biology to International Agriculture) ； 貝曾。ffi PCR 力夕去，M巾# 11 號(hào)基因組DNA為模板，從水稻基因組中擴(kuò)增得到如序列表SEQ. ID. NO 1所示的目標(biāo)基因 0sa-miR399k，擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為591bp。PCR擴(kuò)增采用的引物序列為miR399k-F(BamHI)5' CAAGGATCCacattctccttcaacaatgg 3，miR399k-R (KpnI) 5' AGAGGTACCgaaagtctgaaaccagtgga 3，PCR反應(yīng)反應(yīng)體系的總體積為20 μ 1，水稻基因組DNA模板1 μ 1 (約50ng)、 IXTaq 酶反應(yīng)緩沖液、25mM MgCL2 1. 2μ l,2mM dNTP 1. 5 μ 1、IOuM 引物各 0. 2 μ 1、50% 甘 油2μ 1、0. 3單位rTaq酶(Takara公司)，加ddH20至20 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4°C變性5min， 94°C 45s,55°C 45s,72°C lmin、35cycles，72°C 延伸 5min，擴(kuò) 10 管，收集 PCR 產(chǎn)物于 1. 5ml 離心管純化，加等體積24 1氯仿異戊醇，輕搖5分鐘，12000rpm離心15分鐘，吸上清，加 2倍體積95%乙醇，1/10體積3M醋酸鈉(PH5. 2)，_20°C放置30分鐘，12000rpm離心20分 鐘，棄上清，加500 μ 1 75%乙醇放置5min, 12000rpm離心5分鐘，棄上清，晾干，加75 μ 1 ddH20溶解。酶切把純化的PCR產(chǎn)物及pU1301載體酶切，體系總體積100 μ 1，PCR產(chǎn)物或 載體質(zhì)粒75 μ 1，限制性內(nèi)切酶BamHl 30U，限制性內(nèi)切酶Kpnl 30U, 10ΧΚ buffer 5μ 1, ddH20 16μ1，37 酶切5小時(shí)。純化酶切產(chǎn)物，方法同上，最后加10 μ 1 ddH20溶解。連接反應(yīng)10μ1 PCR產(chǎn)物全部用于連接反應(yīng)，載體0. 5μ1，2υ Τ4 ligase, 5Xbuffer 3 μ 1，總15 μ 1體積，連接24小時(shí)。電轉(zhuǎn)取1μ 1連接產(chǎn)物，電壓1800V，電轉(zhuǎn)到大腸桿菌DH10B，加800μ 1 LB，復(fù)蘇 45分鐘，取200 μ 1涂于含卡那霉素(工作濃度為50微克/毫升)的LA平板，37 °C，過(guò)夜。 挑單克隆，擴(kuò)大培養(yǎng)抽質(zhì)粒，酶切驗(yàn)證，酶切方法同上。PCR驗(yàn)證，體系程序與從水稻基因組 擴(kuò)目標(biāo)基因相同。挑陽(yáng)性克隆，抽質(zhì)粒測(cè)序驗(yàn)證。測(cè)序驗(yàn)證測(cè)序引物為TEV 5，cgaatc tcaagc aatcaa gcat 3，。測(cè)序結(jié)果完全 正確。把測(cè)序驗(yàn)證正確的質(zhì)粒載體電轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌EHA105，抽質(zhì)粒，PCR驗(yàn)證，取750 μ 1含 構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌菌液加等體積的50%甘油混勻，-70°C保存。將構(gòu)建好的載體命名為 pUmiR399k。實(shí)施例2 :0sa-miR399基因的功能驗(yàn)證和應(yīng)用1.轉(zhuǎn)基因植株的獲得采用農(nóng)桿菌EHA105介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法(Wu et al. ,Development of enhancer trap lines for functional analysis of the rice genome. Plant J, 2003,35 418-427)將超表達(dá)載體導(dǎo)入正常中花11水稻品種，將轉(zhuǎn)化苗命名為0sa-miR399-0X。具體遺傳轉(zhuǎn)化 的試劑及培養(yǎng)基配方見(jiàn)附錄1，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化步驟如下1)愈傷誘導(dǎo)(1)將成熟的水稻種子去殼，然后依次用70%的乙醇處理1分鐘，0. 15%氯化汞 (HgCl2) 15 分鐘；(2)滅菌水洗種子4-5次；(3)將種子放在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上；(4)置于黑暗處培養(yǎng)5周，溫度25-27°C。2)愈傷繼代挑選亮黃色、緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫 度 25-27 0C ο3)預(yù)培養(yǎng)挑選緊實(shí)且相對(duì)干燥的胚性愈傷，放于預(yù)培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4天，溫度 25-27 °C。4)農(nóng)桿菌培養(yǎng)(1)在帶有卡那霉素的LA培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)含構(gòu)建好載體的農(nóng)桿菌EHA105兩天，溫 度 28 0C ；(2)將農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)移至懸浮培養(yǎng)基里，28°C搖床上培養(yǎng)2-3小時(shí)。5)農(nóng)桿菌侵染(1)將預(yù)培養(yǎng)的愈傷轉(zhuǎn)移至滅菌好的瓶子內(nèi)；(2)調(diào)節(jié)農(nóng)桿菌的懸浮液至OD6tltl 0. 8-1. 0 ；(3)將愈傷在農(nóng)桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；然后放置在共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度 19-20 "C。6)愈傷洗滌和選擇培養(yǎng)(1)滅菌水洗滌愈傷至看不見(jiàn)農(nóng)桿菌；(2)浸泡在含400ppm頭孢霉素的滅菌水中30分鐘；(3)轉(zhuǎn)移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干；(4)轉(zhuǎn)移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇2-3次，每次2周。篩選標(biāo)記為潮霉素。(抑制 農(nóng)桿菌用頭孢霉素，第一次頭孢霉素篩選濃度為400ppm，第二次以后為250ppm)7)分化(1)將抗性愈傷轉(zhuǎn)移至預(yù)分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天；(2)轉(zhuǎn)移預(yù)分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照(20001x)下培養(yǎng)，溫度26°C， 5-7 周。8)生根(1)拔出分化好的苗子，剪掉分化時(shí)產(chǎn)生的根；(2)然后將其轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2-3周，溫度26°C。9)移栽洗掉根上的殘留培養(yǎng)基，將具有良好根系的幼苗轉(zhuǎn)入溫室，同時(shí)在最初的幾天保
9持水分濕潤(rùn)。遺傳轉(zhuǎn)化結(jié)果共得到轉(zhuǎn)化苗40株。遺傳轉(zhuǎn)化植株P(guān)CR陽(yáng)性檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果40株轉(zhuǎn)化苗35棵陽(yáng)性，5棵陰性，87. 5%陽(yáng)性(圖2)。針對(duì)轉(zhuǎn)化載體上⑶S基因設(shè)計(jì)的PCR引物為GUSF :5，ACGACTCGTCCGTCCTGTAGAA 3，GUSR :5，CGGTTCGTTGGCAATACTCC 3，反應(yīng)體系的總體積為20 μ 1，水稻基因組DNA模板1 μ 1 (約50ng)、1 X Taq酶反 應(yīng)緩沖液、25mM MgCL2 1. 2μ l,2mM dNTP 1. 5 μ 1、IOuM 引物各 0. 2 μ 1、0. 3 單位 rTaq 酶 (Takara 公司)，加 ddH20 至 20 μ 1。反應(yīng)程序?yàn)?4 °C 變性 3min，94 °C 45s、55 °C 45s、 72°C lmin、35CyCles，72°C延伸5min。0. 8%瓊脂糖膠電泳，EB染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照。2. TO代轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率提高與轉(zhuǎn)基因共分離在40株TO代轉(zhuǎn)化苗中，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株磷吸收效率提高，葉片末端出現(xiàn)磷累積的 表型。而轉(zhuǎn)基因陰性單株沒(méi)有出現(xiàn)磷累積的表型(圖3，圖4)。圖3為TO代轉(zhuǎn)化植株表型，第1個(gè)為陰性植株，第2至6號(hào)單株為轉(zhuǎn)pUmiR399k 的陽(yáng)性單株，葉片表現(xiàn)出不同程度的磷累積，從弱到強(qiáng)。圖4顯示轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株葉片(右 邊)末端出現(xiàn)磷積累，而陰性對(duì)照單株葉片(左邊)表現(xiàn)正常。3. Southern雜交檢測(cè)轉(zhuǎn)基因拷貝數(shù)取每個(gè)TO代單株的新鮮葉片抽屜基因組DNA，采用CTAB法抽提(Murray MG等 1980, Rapid isolation of high molecular weight plant DNA. Nucleic Acids Res 8 4321-4325)。Southern雜交的方法參照劉克德等的方法(Liu K等，1997，A genome-wide analysis of wide compatibility in rice and the precise location of the S5 locus in the molecular map. Theory Appl Genet 95:809-814)。用陽(yáng)性檢測(cè)的引物(GUSF 和 ⑶SR)PCR擴(kuò)增片段為探針。結(jié)果見(jiàn)圖5，圖中第3、9、16、19泳道為單拷貝。4. Tl代轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率提高與轉(zhuǎn)基因共分離選其中的1個(gè)單拷貝種植下一代(Tl)，出現(xiàn)3 1分離，轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株P(guān)含量 高，葉片末端出現(xiàn)磷累積的表型。轉(zhuǎn)基因陰性單株P(guān)含量正常，表型正常。見(jiàn)圖6陽(yáng)性單株 為1，3，4，6，8，9，10，P含量高，葉片出現(xiàn)磷積累表型。陰性單株2，5，8，P含量正常，表型正 常。說(shuō)明Tl代轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性單株與植物體內(nèi)磷含量升高也呈共分離。5.不同P濃度脅迫處理，轉(zhuǎn)基因植株磷吸收效率提高表1顯示了本實(shí)施例所用的水培肥料的配方(參照國(guó)際水稻研究所公開的配方)表1水稻水培液的配方
權(quán)利要求
1.水稻0sa-miR399k基因在提高磷吸收方面的應(yīng)用，所述的0sa-miR399k基因的核苷 酸序列如SEQ ID NO 1所示。
全文摘要
本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域。具體涉及一種促進(jìn)水稻磷吸收基因Osa-miR399k的分離克隆、功能驗(yàn)證及應(yīng)用。所述的Osa-miR399k的核苷酸序列如SEQ ID NO1所示。本發(fā)明克隆的Osa-miR399k是基因家族Osa-miR399的11個(gè)成員之一，該基因家族在水稻基因組中有多個(gè)同源基因Osa-miR399a---Osa-miR399k，其與擬南芥ath-miR399基因?qū)儆谕换蚣易錷iR399。Osa-miR399家族基因具有提高水稻磷吸收功能，通過(guò)基因工程技術(shù)提高Osa-miR399家族基因在水稻中的表達(dá)量來(lái)促進(jìn)植物對(duì)磷的吸收，從而減少磷肥的施用量，有利于植物在低磷土地上生長(zhǎng)。
文檔編號(hào)C12N15/29GK102002502SQ20101026381
公開日2011年4月6日 申請(qǐng)日期2010年8月25日 優(yōu)先權(quán)日2010年8月25日
發(fā)明者吳昌銀, 練興明, 陳志輝 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)