本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種梨樹葉片氮素含量的無(wú)損測(cè)量方法。

背景技術(shù)：

氮素是梨樹生長(zhǎng)發(fā)育、產(chǎn)量形成和品質(zhì)提高的基礎(chǔ)。傳統(tǒng)的植物氮素營(yíng)養(yǎng)診斷方法是基于葉片的實(shí)驗(yàn)室分析，通過葉片礦質(zhì)營(yíng)養(yǎng)分析判斷果樹營(yíng)養(yǎng)狀況是指導(dǎo)果樹施肥的重要手段。而實(shí)驗(yàn)室內(nèi)葉營(yíng)養(yǎng)化學(xué)分析方法，普遍要求破壞植物樣本，從采集大量的樣本、烘干、稱重、研磨直到使用有潛在危害性藥品進(jìn)行測(cè)試，需耗費(fèi)大量的時(shí)間、人力和物力(Wang et al.,2012)。由于花費(fèi)時(shí)間過長(zhǎng)，以至于結(jié)果的適時(shí)性不強(qiáng)。實(shí)時(shí)、無(wú)損而準(zhǔn)確地了解作物生長(zhǎng)情況，是精確作物管理的基礎(chǔ)。建立作物氮素營(yíng)養(yǎng)的實(shí)時(shí)監(jiān)控技術(shù)，對(duì)于及時(shí)掌握作物生長(zhǎng)情況、合理指導(dǎo)生長(zhǎng)過程中的追肥調(diào)控、保障作物產(chǎn)量與品質(zhì)的具有重要的研究意義。近年來，隨著光譜技術(shù)的快速發(fā)展與不斷完善，尤其是利用可見和近紅外光譜(VIS/NIR)數(shù)據(jù)對(duì)多種植物生化組分含量進(jìn)行快速與準(zhǔn)確測(cè)定已成為現(xiàn)實(shí)。目前所建立的諸多預(yù)測(cè)模型適用范圍很狹窄，不同作物品種間不能通用。雖然現(xiàn)在果樹上的研究日漸增多(朱西存等，2010；劉燕德等，2008；Menesattia et al，2010；)，但是對(duì)梨樹葉片氮素的定量化預(yù)測(cè)還未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是，以梨樹鮮葉為研究對(duì)象，采用便攜式地物光譜儀測(cè)定其可見和近紅外反射光譜，建立梨樹鮮葉全氮素含量與可見和近紅外光譜之間的定量模型，為梨樹葉片氮素快速診斷和合理施用氮肥提供依據(jù)，解決了現(xiàn)有檢測(cè)方法費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，費(fèi)用高等問題。。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種梨樹葉片氮素含量的無(wú)損測(cè)量方法，包括以下步驟：

(1)選定健康的梨樹葉片樣本，使用便攜式地物光譜儀原位采集可見和近紅外光譜值；

(2)從梨樹上采下步驟(1)中所述樣本，測(cè)定氮素含量；

(3)對(duì)步驟(1)中得到的光譜值，采用主成分分析法剔除異常樣本，用偏最小二乘回歸建立校正模型并采用留一法交叉驗(yàn)證形式進(jìn)行檢驗(yàn)，從而得到步驟(1)所述光 譜值相對(duì)步驟(2)所述氮素含量的定量校正模型；

(4)使用便攜式地物光譜儀采集待測(cè)的梨樹葉片樣品的可見和近紅外光譜值，通過步驟(3)的優(yōu)化模型計(jì)算得到所述樣品的氮素含量。

步驟(1)中，所述原位采集的方法包括以下步驟：將便攜式地物光譜儀的光纖組裝進(jìn)植被探頭，植被探頭配合葉片夾持器的黑色參考板夾持葉片，所述植被探頭和葉片夾持器構(gòu)成一個(gè)自帶光源的暗室，植被探頭采集葉片光譜。

所述采集葉片光譜采集點(diǎn)為每片葉片的葉中、的葉脈對(duì)稱位置的取兩個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)采集5-10條，輸出波段數(shù)2151個(gè)。

為使植被探頭采集的光譜具有代表性，首先要確定能代表整張葉片光譜的葉表采集部位。本發(fā)明分別采集了葉尖、葉中、葉基三個(gè)部位，每個(gè)部位采集葉脈對(duì)稱的兩個(gè)點(diǎn)。采集的6個(gè)點(diǎn)范圍也基本上覆蓋了整張葉片，這6個(gè)點(diǎn)的光譜反射率平均值即為葉片光譜反射率。然后，通過對(duì)葉尖、葉中、葉基和平均光譜的反射率進(jìn)行方差分析，從分析結(jié)果可以看出，葉片三個(gè)部位中只有葉中的光譜反射率和整張葉片的平均光譜反射率在0.05水平上始終沒有差異，因此可以認(rèn)為葉中的光譜反射率最能代表整張葉片的反射率，如此便可大大減少采集光譜的時(shí)間，提高了光譜采集的精度。

步驟(1)中，所述樣本數(shù)量為100個(gè)以上，優(yōu)選的所述樣本數(shù)量為400～1000個(gè)。

步驟(1)中，所述光譜儀的測(cè)定波段值為350～2500nm，分辨率為3～10nm；優(yōu)選的，光譜掃描范圍為350-1000nm時(shí)的分辨率為3nm，光譜掃描范圍為1000-2500nm時(shí)的分辨率為10nm。

步驟(1)和(4)中，所述梨樹葉片為梨樹樹冠外圍當(dāng)年生枝條中下部的葉片。步驟(2)中，所述測(cè)定氮素含量包括以下步驟：(a)將采下的葉片于105～110℃恒溫殺青30min以上，再在60～70℃烘至恒重，粉碎、過篩，得到待測(cè)樣品；(b)使用元素分析儀測(cè)定每份步驟(a)中得到的待測(cè)樣品的氮素含量，每份樣品測(cè)定2次，取其平均值，所述測(cè)定樣品的有效數(shù)據(jù)為平行樣本之間的相對(duì)誤差不得高于5％，所述過篩的篩子為不低于100目，優(yōu)選為100～200目。

步驟(2)中，所述測(cè)定氮素含量還可以包括以下步驟：(c)以GBW10020柑橘葉作為標(biāo)樣，測(cè)定所述標(biāo)樣的氮素含量，對(duì)步驟(b)中得到的待測(cè)樣品氮素含量進(jìn)行校正，以確?；瘜W(xué)分析過程的準(zhǔn)確性。

步驟(1)和(4)中使用的光譜儀為便攜式地物光譜儀。為最大程度降低實(shí)驗(yàn)誤差， 步驟(1)和(4)中使用同一臺(tái)光譜儀，所述光譜儀的植被探頭直徑1.5cm，內(nèi)置鹵素光源。

可在梨樹膨大期采集樹葉，計(jì)算氮素含量，以指導(dǎo)后續(xù)施肥，所述膨大期包括膨大I期或膨大II期，所述膨大I期為花后50天，所述膨大II期為花后80天。

有益效果：本發(fā)明方法可以快速、無(wú)損、廉價(jià)地得到梨樹葉片氮素含量，并通過一定數(shù)量的葉片氮素含量評(píng)估樹體氮素營(yíng)養(yǎng)狀況，本發(fā)明方法不需要化學(xué)試劑、無(wú)損和操作簡(jiǎn)單。

附圖說明

圖1田間兩種不同光譜測(cè)量方式示意圖；

圖2三種不同光譜測(cè)量方法原始光譜曲線圖；

圖3三種不同光譜測(cè)量方法下原始光譜和氮素含量相關(guān)關(guān)系圖；

圖4建模集氮素含量擬合圖，其中樣本量為1000；

圖5外部驗(yàn)證集氮素含量結(jié)果，其中樣本量為400；

圖6葉片氮素含量和產(chǎn)量二次多項(xiàng)式擬合，其中，圖a和圖b分別是2014年花后50天與花后80天葉片氮素含量與當(dāng)年產(chǎn)量擬合曲線；圖c和圖d分別是2015年花后50天與花后80天葉片氮素含量與當(dāng)年產(chǎn)量擬合曲線。

具體實(shí)施方式

根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。然而，本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，實(shí)施例所描述的內(nèi)容僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制權(quán)利要求書中所詳細(xì)描述的本發(fā)明。

(1)梨樹葉片可見和近紅外光譜值的采集

利用美國(guó)ASD公司生產(chǎn)的3便攜式地物光譜儀測(cè)定葉片光譜。波段值為350～2500nm，輸出波段數(shù)為2151個(gè)。植被探頭直徑1.5cm，內(nèi)置鹵素光源。本實(shí)驗(yàn)探究了三種不同田間葉片光譜值測(cè)量方法(圖1和圖2)，分別是25°裸光纖、植被探頭配合葉片夾持器白色參考板以及植被探頭配合葉片夾持器黑色參考板。①25°裸光纖法：選擇天氣晴朗，無(wú)風(fēng)或風(fēng)速很小時(shí)進(jìn)行，測(cè)定時(shí)間為10:00-14:00，直接將光纖頭對(duì)準(zhǔn)葉片正面和葉脈中部?jī)啥藢?duì)稱的兩個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)采集5-10條光譜，每采集4-8個(gè)樣品后利用參考白板校正。②植被探頭配合葉片夾持器白色參考板，夾持葉片測(cè)量。由于具有內(nèi)置穩(wěn)定光源，一般采集10-20個(gè)樣品后利用參考白板校正(下同)。③植被探頭配合葉片 夾持器黑色參考板，夾持葉片測(cè)量(圖1)。使用植被探頭結(jié)合葉片夾持器時(shí)，植被探頭對(duì)準(zhǔn)葉片正面和葉脈中部?jī)啥藢?duì)稱的兩個(gè)點(diǎn)，每點(diǎn)采集5-10條光譜。結(jié)果表明植被探頭配合葉片夾持器(黑色參考板)具有較高的信噪比(圖3)，該方法下的葉片氮素含量和原始光譜之間具有較好的相關(guān)性，整個(gè)波段的相關(guān)系數(shù)大于前兩種方法。

為使植被探頭采集的光譜具有代表性，首先要確定能代表整張葉片光譜的葉表采集部位。本發(fā)明分別采集了葉尖、葉中、葉基三個(gè)部位，每個(gè)部位采集葉脈對(duì)稱的兩個(gè)點(diǎn)。采集的6個(gè)點(diǎn)范圍也基本上覆蓋了整張葉片，這6個(gè)點(diǎn)的光譜反射率平均值即為葉片光譜反射率。然后，通過對(duì)葉尖、葉中、葉基和平均光譜的反射率進(jìn)行方差分析，選取反射率差別大小不等的10個(gè)波長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)見表1，方差采用DUNCAN、LSD在0.05水平下(Spss)，波長(zhǎng)在所述的2151個(gè)輸出波段數(shù)中隨機(jī)選取。

可以看出，葉片三個(gè)部位中只有葉中的光譜反射率和整張葉片的平均光譜反射率在0.05水平上始終沒有差異。因此可以認(rèn)為葉中的光譜反射率最能代表整張葉片的反射率，如此便可大大減少采集光譜的時(shí)間，提高了光譜采集的精度。

表1葉片不同部位光譜反射率差異性分析

注：表1中小寫字母表示不同反射率之間的比較結(jié)果，凡有相同字母的表示差異不顯著(p<0.05)

(2)采集的葉片為梨樹樹冠外圍當(dāng)年生枝條中下部，采集時(shí)期為花后50天和花后80天，見圖6。

(3)梨樹葉片氮素含量測(cè)定

葉片可見和近紅外光譜值測(cè)定后，將葉片采下帶回室內(nèi)，于105℃恒溫殺青30min后70℃烘至恒重，用不銹鋼料理機(jī)粉碎后過篩(100目)。使用元素分析儀測(cè)定氮素含量，每份樣品測(cè)定2次，取其平均值，平行樣本之間的相對(duì)誤差不得高于5％，分析的過程中同時(shí)加入GBW10020柑橘葉測(cè)定，以確保化學(xué)分析過程的準(zhǔn)確性。

(4)梨樹葉片氮素含量無(wú)損診斷模型構(gòu)建

將每個(gè)樣品測(cè)定的原始光譜值用ViewSpecPro軟件求得平均值后導(dǎo)出。將所有樣本隨機(jī)劃分為建模集(樣本量1000)和驗(yàn)證集(420)。以光譜值為X，氮素含量為Y運(yùn)用Unscrambler 9.7(CAMO公司，挪威)中偏最小二乘法(PLS)功能構(gòu)建模型，默認(rèn)最大主成分?jǐn)?shù)為20，避免出現(xiàn)模型過擬合或擬合不足的情況。再通過留一法交叉驗(yàn)證，自動(dòng)輸出最優(yōu)主成分下的PLS模型。對(duì)于所建立的定量校正模型，利用主成分分析法剔除偏離度較大樣本，最后建立優(yōu)化模型。定量分析模型需要具有較低的內(nèi)部交叉驗(yàn)證均方根差(RMSE)和較高的決定系數(shù)(R²)。0.66≤R²≤0.80表明模型只能起到近似定量預(yù)測(cè)的效果，0.81≤R²≤0.90表明模型的預(yù)測(cè)效果不錯(cuò)，R²≥0.90表明模型的預(yù)測(cè)效果很好。

優(yōu)化模型對(duì)葉片氮素含量的建模和外部驗(yàn)證結(jié)果如圖4和圖5所示，建模樣本量1000，R²為0.86，外部驗(yàn)證樣本量為420，R²為0.85，表明該方法準(zhǔn)確度和穩(wěn)定性較優(yōu)。