專利名稱：：動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及動物華支睪吸蟲病的基因學鑒定，特別是涉及動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒。
背景技術：
：華支睪吸蟲病是由后睪科支睪屬的華支睪吸蟲(ao"orc/^w'"era/s)寄生于犬、貓、豬等動物及人膽管內所引起的一種重要的人獸共患寄生蟲病，俗稱肝吸蟲病。華支睪吸蟲寄生在淡水螺、淡水魚、淡水蝦、犬、豬、牛、鼠、家兔、豚鼠、狐貍和家禽等動物，人為終末宿主，本病可使肝臟腫大并導致其他肝病變，病情多呈慢性經過，臨床上可見精神沉郁，食欲減退和下痢等癥狀，重者可致肝硬化甚至癌變，少數兒童和青少年患者可致侏儒癥，并發(fā)癥多達21種，對人類健康的影響不容忽視。華支睪吸蟲病呈地方性流行，在東南亞國家較常見，該病在我國已有很長的歷史，流行廣泛，目前華支睪吸蟲病有逐年上升的趨勢，其發(fā)生和流行除了跟人們的一些不良飲食習慣如生食魚蝦等有關系外，其中間宿主(淡水螺、淡水蝦等)以及保蟲宿主(保蟲宿主有貓、犬、豬、牛、鼠、狐貍和家禽等動物)在其流行過程中是十分重要和關鍵的環(huán)節(jié)。分子生物學方法已開始應用于華支睪吸蟲的分子鑒定上。PCR以其高度的特異性和敏感性，已廣泛應用于分子生物學研究的各個領域，尤其對各種病原體的檢測和疾病的診斷中。目前，在寄生蟲學領域，用于疾病診斷和蟲體檢測的PCR方法很多，如常規(guī)PCR、反轉錄PCR、套式PCR、免疫磁性捕獲PCR、熒光定量PCR(FQ-PCR)等。Le(LeTH，VanDeN，BlairD,etal.ClonorchissinensisandOpisthorchisviverrini:developmentofamitochondrial-basedmultiplexPCRfortheiridentificationanddiscrimination.ExpParasitol.2006,112(2):109-14)通過設i十兩對線粒體DNA引物，用多重PCR方法成功對華支睪吸蟲和麝貓后睪吸蟲進行鑒別診斷，能檢測到最低樣品DNA量為0.78ng;Parvathi等(ParvathiA,JieyuanL，IddyaK,etal.C7o"wr/^w'"e脂、Developmentandevaluationofanestedpolymerasechainreaction(PCR)assay.ExpParasitol,2007,115(3):291-295)首先對華支睪吸蟲的基因組用隨機引物進行擴增測序，選擇合適的部位設計兩對引物進行巢式PCR，結果表明，該方法具有很好的敏感性和特異性，能檢測到魚肉中最低華支睪吸蟲囊呦的DNA為10'5ng，有望在華支睪吸蟲魚的流行情況調查以及動物的糞便檢査中得到應用。人體華支睪吸蟲病診斷技術的研究一直是醫(yī)學研究中的一個熱點，已建立了多種診斷檢測方法，包括蟲卵檢查、皮內試驗(IT)、B超、CT、間接血凝免疫吸附試驗(ELISA)、單克隆抗體ELISA(McAb-ELISA)以及免疫膠體金方法等，但在獸醫(yī)領域，均未見應用于動物華支睪吸蟲病的診斷，目前動物華支睪吸蟲病主要還是依靠糞檢患畜蟲卵的方法進行流行病學調查，因為此種方法敏感性不高，極易漏檢，也易誤診。從糞便中提取DNA—直是個難點，糞便的成分復雜，含有各種各樣抑制PCR的物質，如膽鹽、多糖等。目前能從糞便中提取DNA的方法要么就是需要繁瑣的步驟，如免疫磁性分離法、梯度離心法、熒光激活細胞分選術等，要么就是需要用到昂貴的DNA提取試劑盒。如能用快速、簡便的方法從糞便中提取到寄生蟲的DNA，將會有重大的意義，能對疾病進行及早的診斷，預防疾病的發(fā)生。PCR檢測方法敏感性高、一次檢測大量樣品、避免主觀偏差等優(yōu)越性預示著它在特異性診斷、流行病學調查和藥物治療監(jiān)控等方面有著廣闊的應用前景。內轉錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer,ITS)是核糖體DNA中介于18S和28S之間的內轉錄間隔區(qū)，包括第一、第二內轉錄間隔區(qū)(ITS-l和ITS-2)兩段序列，ITS序列存在于高度重復的核糖體中，進化速度快且長度不大，加上協(xié)同進化使該片段在基因組不同單元間十分一致，因而十分適合進行各種分子操作。
發(fā)明內容本發(fā)明的目的在于針對現有技術的不足，提供一種通過對動物華支睪吸蟲病ITS序列進行分析，設計得到的能專一性鑒別動物華支睪吸蟲病的動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物。本發(fā)明的另一個目的是提供一種運用上述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物對動物華支睪吸蟲病進行簡便、高效的特異性檢測的方法。本發(fā)明的另一個目的是提供含有上述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物的試劑盒。本發(fā)明的上述目的是通過如下方案予以實現的本發(fā)明人根據華南農業(yè)大學獸醫(yī)寄生蟲研究室已測得的華支睪吸蟲ITS序列，還有來自GenbankTM的貓后睪吸蟲和部分麝貓后睪吸蟲ITS序列，以及其它一些寄生于肝臟的吸蟲的ITS序列進行比對，設計出能專一性鑒別動物華支睪吸蟲病的特異性引物，通過PCR擴增來鑒定動物華支睪吸蟲病。上述特異性引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。采用上述特異性引物，用常規(guī)的PCR方法即可實現動物華支睪吸蟲病的特異性檢測。一種動物華支睪吸蟲病特異性檢測方法，包括如下步驟(1)華支睪吸蟲囊呦DNA的提取或蟲卵DNA的提??；(2)以步驟(1)提取的DNA為模板，采用上述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)進行常規(guī)PCR擴增；(3)PCR擴增反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，紫外光下觀察特異性擴增條帶，陽性結果會出現特異性擴增條帶，陰性結果則不會出現；上述步驟(2)中，PCR擴增條件采用常規(guī)操作即可實現本發(fā)明；實際應用時還可選擇如下PCR擴增體系總體系為2.5ml，含有上述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物，終濃度各為0.5pmol4d;pH8.3的Tris-HCl,終濃度為10mM;KC1，終濃度為50mM，4個dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，終濃度各200iaM，MgCl2，終濃度為2.5mM;TaqDNA聚合酶按每個PCR反應含0.625U加入。上述步驟(3)中，PCR擴增反應結束后，瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果，紫外光下觀察特異性擴增條帶，以華支睪吸蟲陽性DNA作為陽性對照品，以無DNA超純水作為陰性對照，待檢樣品若觀察到一條與華支睪吸蟲陽性對照同一位置出現的400bp的片段，而該位置處陰性對照沒有條帶，則說明該待測樣品感染有華支睪吸蟲病。針對上述檢測方法，本發(fā)明人從MgCl2的濃度和退火溫度兩方面進行調整來優(yōu)化PCR擴增條件，MgCl2的濃度梯度分別為1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM和3.5mM、4.0mM，退火溫度梯度分別為50°C、54°C、58°C、61。C和68°C，以期獲得本發(fā)明特異性引物進行PCR擴增獲得特異性片段的最佳Mg^濃度和最佳退火溫度，經試驗確定，最佳退火溫度為61°C，MgCl2的濃度為2.5mM，循環(huán)數選擇為30個循環(huán)。上述PCR擴增的最佳反應條件為94'C預變性5分鐘；94。C變性30秒、61'C退火30秒、72t延伸30秒，30個循環(huán)；72'C后延伸5分鐘。采用上述動物華支睪吸蟲病特異性引物，制備檢測試劑盒，可使得動物華支睪吸蟲病的檢測更加快速、便利。一種動物華支睪吸蟲病特異性，包括如下部分a.PCR反應液總體系為2.5ml，含有上述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物，終濃度各為0.5pmol4d，終濃度為10mM的pH8.3的Tris-HCl，終濃度為50mM的KC1，4個dNTP(dATP、dTTP、dGTP和dCTP)，終濃度各200pM和終濃度為2.5mM的MgCl2;b.陽性對照品華支睪吸蟲陽性DNA，lOOpl;c.陰性對照品無DNA超純水，100pl。上述檢測試劑盒還包括TaqDNA聚合酶5U/)il，每個PCR反應含0.625U加入(12.5jil)。上述檢測試劑盒還可以包括DNA裂解液含有100mM的NaCl、10mM的Tris-Cl(pH8.0)、25mM的EDTA(pH8.0)、1%(質量/體積，W/V)的十二烷基磺酸鈉(SDS)和1.7pg/pL的蛋白酶K。與現有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.本發(fā)明根據動物華支睪吸蟲病的ITS區(qū)序列數據庫設計的高度特異性檢測引物，可以準確地鑒定動物華支睪吸蟲?。?.本發(fā)明采用特異性檢測引物配制成的檢測試劑盒，其成本低、準確性高，操作簡便快速，有利于大規(guī)模推廣；3.本發(fā)明提供的檢測方法簡單高效，通過特異性檢測引物，通過簡單的PCR，可方便地檢測動物華支睪吸蟲??；4.本發(fā)明對PCR擴增條件進行了優(yōu)化，選擇退火溫度為6rC，MgCl2的濃度為2.5mM，循環(huán)數選擇為30個循環(huán)，從而可提高整個PCR反應的特異性，取得更好的檢測效果；5.本發(fā)明應用華支睪吸蟲的ITS重復DNA片段作為遺傳標記，建立了用于動物華支睪吸蟲病診斷的快速、特異、敏感的PCR方法；6.本發(fā)明試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強，敏感性高，結果判定客觀，可用于動物華支睪吸蟲病的診斷和流行病學調査。具體實施例方式下面結合具體實施例對本發(fā)明作進一步的解釋，但具體實施例并不對本發(fā)明作任何限定。實施例1動物華支睪吸蟲病特異性引物的特異性試驗本實施例選擇經過DNA有效性驗證的11陰性對照寄生蟲樣品日本血吸蟲、大片吸蟲、肝片吸蟲、東畢吸蟲、犬弓首蛔蟲、犬鉤口線蟲、貓弓首蛔蟲、豬毛首線蟲、食道口線蟲、豬蛔蟲和麝貓后睪吸蟲。本實施例的陽性對照是華支睪吸蟲陽性DNA。以上述11個對照寄生蟲樣品DNA各lpL為模板，采用本發(fā)明的動物華支睪吸蟲病特異性引物(上游引物核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，按照如下PCR反應條件進行特異PCR擴增，同時設空白對照(超純水)和陽性對照。PCR擴增條件為94"C預變性5分鐘；94'C變性30秒，61"C復性30秒，72'C延伸30秒，30個循環(huán)；72'C后延伸5分鐘。PCR產物在P/。TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。結果顯示華支睪吸蟲DNA陽性對照擴增出約400bp的條帶，而上述ll種陰性對照樣品除麝貓后睪吸蟲外，其他10種對照寄生蟲樣品和空白對照均無條帶出現。當擴增條件改為退火溫度為68"C、MgCl2的濃度為1.0mM時，結果顯示僅有試劑盒華支睪吸蟲DNA陽性對照擴增出約400bp的條帶，而擴增不出麝貓后睪吸蟲，其它10個對照樣品也無條帶出現。麝貓后睪吸蟲主要分布在泰國、老撾、越南、馬來西亞和印度，貓后睪吸蟲主要流行于俄羅斯及東歐等地區(qū)。由此說明，本發(fā)明所設計的華支睪吸蟲病特異性檢測引物能擴增出華支睪吸蟲病，條帶明亮清晰，與其它蟲種無交反應，可用于我國華支睪吸蟲的PCR流行病學調查。實施例2試劑盒的制備本實施例的試劑盒由如下組分組成a.DNA裂解液30ml:含有l(wèi)OOmM的NaCl、pH8.0的lOmM的Tris-Cl、pH8.0的25mM的EDTA、1%(W/V)的SDS和1.7昭/pL的蛋白酶K;b.PCR反應液(100個反應，25pL/反應)，2.5ml:含有動物華支睪吸蟲病特異性引物(上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:l所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示)，終濃度各為0.5pmol/nl;終濃度10mM的Tris-HCl(pH8.3)，終濃度50mM的KC1，終濃度各200pM的dATP、dTTP、dGTP、dCTP，終濃度2.5mM的MgCl2;c.陽性對照品華支睪吸蟲陽性DNAlO(Hil;d.陰性對照品無DNA超純水lOOpl;e.TaqDNA聚合酶，5U/pl，12.5^1。實施例3試劑盒的敏感性試驗用核酸蛋白測定儀測定華支睪吸蟲代表性成蟲樣品的DNA濃度，然后將DNA原液等倍稀釋成10"、l(T2、10'3、10—4、l(T5、10_6、10—7和10'8八個稀釋度。分別取各稀釋度的模板DNAlpl，采用實施例2制備所得試劑盒，PCR總反應體系為25pl，具體組分如表l所示，94'C預變性5分鐘；94"C變性30秒，61'C復性30秒，72'C延伸30秒，30個循環(huán)；72"C后延伸5分鐘。同時設空白對照，確定特異弓I物能檢測到的最低DNA濃度。表lPCR擴增體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，以確定其敏感性。試驗結果表明該PCR檢測方法敏感性高，最低能檢測到1.03pgDNA的華支睪吸蟲。實施例4試劑盒的保存期試驗取實施例2制備所得試劑盒，將其分別在4'C和-2(TC保存1個月、3個月、6個月、9個月，然后用保存條件不同的試劑盒對已知樣品進行檢測，擴增條件同實施例3，結果表明實施例1制備所得試劑盒可在4°C(Taq酶除外，須-20'C保存)和-2(TC長期保存，在試驗周期的9個月內，在合適保存條件下陽性樣品均能擴增出目的亮帶，而陰性對照無條帶出現。實施例5試劑盒在華支睪吸蟲病糞便樣品診斷中的應用1.樣品26份華支睪吸蟲陽性的貓糞。2.DNA的提取取0.1克待檢糞便于1.5mlEppendorf管中，加入含有2%的TritonX-100和0.1M的氫氧化鉀的溶液lml室溫下作用10min，其間不斷搖勻；然后10000rpm離心2min，去上清，重復前面的步驟清洗兩次；離心去上清后加入1.2ml飽和硫代硫化鈉溶液，混勻，14000rpm離心5min;此時蟲卵主要分布于液面，小部分分布于液體中；分別吸取200pl上清到另一個1.5mlEppendorf管中，加入1.21111雙蒸水，12000rpm離心2min;去上清，保留100^1左右液體，用移液器吹打使沉淀與液體混勻；然后把各管的液體都移到同一管中，離心管內加滿雙蒸水，12000rpm離心2min;去上清，再加入1.2ml雙蒸水，如此重復35次。最后離心去上清，保留30pl液體，加入液體體積一半的玻璃珠，旋渦震蕩1min后瞬時離心，沸水中煮5min，最后10000rpm離心lmin，取3pl上清PCR擴增。3.PCR擴增應用實施例2制備所得試劑盒對上述樣品進行PCR擴增，PCR總反應體系為25pl，具體組分如表l所示，94"C預變性5分鐘；94'C變性30秒，61°C復性30秒，72'C延伸30秒，30個循環(huán)；72。C后延伸5分鐘。同時做陰性對照和陽性對照。4.瓊脂糖電泳分析PCR產物在in/。TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。5.擴增產物的DNA序列測定取與試劑盒陽性對照帶形一致的代表性PCR產物送上海博尚生物技術有限公司，用相應的種特異引物進行雙向測序。測序結果用DNAstar軟件進行分析，用BLAST進行序列比對。6.結果與分析26份陽性貓糞樣品用以上的方法進行處理后的結果顯示，全部都能擴增出400bp大小的特異性條帶，證明了所建立的動物華支睪吸蟲病診斷的PCR檢測方法可用于動物華支睪吸蟲病糞便樣品的診斷與流行病學調查。實施例6試劑盒在華支睪吸蟲病魚肉樣品診斷中的應用1.樣品對經鏡檢確認的12份陽性魚肉樣品和3份陰性樣品進行特異PCR鑒定。2.DNA的提取取0.03g待檢魚肉，然后把魚肉放進1.5mlEppendorf管中，剪碎，加入300^1的DNA裂解液，混勻，置于恒溫培養(yǎng)箱中，37'C作用半小時，其間不時搖動離心管，提取DNA;消化好的蟲體懸液按Promega試劑盒WizardDNAClean-UpSystem使用說明提取蟲體DNA，直接使用或于-2(TC冰箱保存?zhèn)溆谩?.PCR擴增應用實施例2制備所得試劑盒對上述樣品進行PCR擴增，PCR總反應體系為25jnl，具體組分如表l所示，94"C預變性5分鐘；94"C變性30秒，61°C復性30秒，72"C延伸30秒，30個循環(huán)；72'C后延伸5分鐘。4.瓊脂糖電泳分析PCR產物在"/。TBE瓊脂糖凝膠中電泳后，紫外透射儀下觀察結果，凝膠成像系統(tǒng)攝像。5.擴增產物的DNA序列測定取與試劑盒陽性對照帶形一致的的代表性PCR產物送上海博尚生物技術有限公司，用相應的種特異引物進行雙向測序。測序結果用DNAstar軟件進行分析，用BLAST進行序列比對。6.結果與分析12份陽性樣品全部都能擴增出400bp大小的特異性條帶，證明了所建立的動物華支睪吸蟲病診斷的PCR檢測方法可用于動物華支睪吸蟲病魚肉樣品的診斷與流行病學調查。動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒序列表SEQUENCELISTING<110〉華南農業(yè)大學-<120>動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒<130〉<160>2<170>Patentlnversion3.5<210〉1<211>20<212〉腿<213>人工序列<400〉1tggcctgactggctggccgg20<210>2<211>20<212>腿<213〉人工序列<400>2cggcaccccacacacataca201權利要求1、一種動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物，其上游引物的核苷酸序列如SEQIDNO1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQIDNO2所示。2、一種動物華支睪吸蟲病特異性檢測方法，其特征在于該方法包括如下步驟(1)華支睪吸蟲囊呦DNA的提取或蟲卵DNA的提??；(2)用權利要求1所述特異性檢測引物采用常規(guī)PCR技術進行擴增；(3)擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳后，紫外光下觀察特異性擴增條帶，即可判斷樣品中是否含有動物華支睪吸蟲病。3、根據權利要求2所述特異性檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR擴增條件為94T:預變性5分鐘；94'C變性30秒、61。C退火30秒、72°C延伸30秒，30個循環(huán)；72"C后延伸5分鐘。4、根據權利要求2所述特異性檢測方法，其特征在于，所述步驟(2)中，PCR擴增體系為總體系2.5ml，含有權利要求1所述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物各0.5pmol/pl、10mM的pH8.3的Tris-HCl、50mM的KC1、4個dNTP各200pM、2.5mM的MgCl2和0.625U的TaqDNA聚合酶。5、一種動物華支睪吸蟲病特異性檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒包括如下部分a.PCR反應液總2.5ml，含有權利要求1所述動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物各0.5pmol4d、10mM的pH8.3的Tris-HCl、50mM的KC1、4個dNTP各200pM和2.5mM的MgCl2;b.陽性對照品華支睪吸蟲陽性DNA，lOOpl;c.陰性對照品無DNA超純水，100|il。6、根據權利要求5所述檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括TaqDNA聚合酶，5U/pl，12.5pl。7、根據權利要求5所述檢測試劑盒，其特征在于該試劑盒還包括如下部分DNA裂解液30ml:含有100mM的NaCl、10mM的pH8.0的Tris-Cl、25mM的pH8.0的EDTA、1%W/V的十二烷基磺酸鈉和1.7pg4iL的蛋白酶K。全文摘要本發(fā)明公開一種動物華支睪吸蟲病特異性檢測引物、檢測方法和檢測試劑盒，該特異性引物其上游引物核苷酸序列如SEQIDNO1所示，下游引物核苷酸序列如SEQIDNO2所示。本發(fā)明用上述特異性檢測引物對待測模板DNA進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外光下觀察，陽性結果會出現特異性擴增條帶，陰性結果則不會出現。本發(fā)明根據動物華支睪吸蟲病的ITS區(qū)序列數據庫設計特異性檢測引物，建立了用于動物華支睪吸蟲病診斷的快速、特異、敏感的PCR方法，可準確地鑒定動物華支睪吸蟲病。本發(fā)明的試劑盒操作簡單程序化，方法特異性強，敏感性高，結果判定客觀，可用于動物華支睪吸蟲病的診斷和流行病學調查。文檔編號C12N15/11GK101586161SQ20091004039公開日2009年11月25日申請日期2009年6月19日優(yōu)先權日2009年6月19日發(fā)明者唐劍棟,宋慧群,朱興全,林瑞慶,袁子國,艷鄧申請人:華南農業(yè)大學