專(zhuān)利名稱(chēng)：產(chǎn)生流感病毒粒子的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體的制作方法
產(chǎn)生流感病毒粒子的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體 本發(fā)明領(lǐng)域涉及表達(dá)病毒(優(yōu)選流感病毒)RNA節(jié)段的新線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其不含 任何擴(kuò)增和/或選擇序列，含有插在RNA聚合酶II (polll)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間 的RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)。本發(fā)明還涉及該表達(dá)構(gòu)建體制備病毒粒 子的用途。背景負(fù)鏈RNA病毒是一組動(dòng)物病毒，其中有數(shù)種重要的對(duì)人致病的病原體，包括流感 病毒，麻疹病毒，風(fēng)疹病毒，狂犬病病毒，呼吸道合胞病毒，埃博拉病毒(Ebola)和漢坦病毒 (hantaviruse) 0這些RNA病毒的基因組可以是單分子的或分節(jié)段的單鏈負(fù)(-)鏈。這些 病毒都必需滿(mǎn)足兩點(diǎn)基因組RNA必需有效拷貝成病毒RNA，后者可摻入子代病毒粒子，轉(zhuǎn) 錄成mRNA，再翻譯成病毒蛋白。真核宿主細(xì)胞通常不具有復(fù)制RNA模板或從負(fù)鏈RNA模板 翻譯出多肽的機(jī)制。因此，負(fù)鏈RNA病毒編碼并攜帶RNA依賴(lài)型RNA聚合酶，以催化合成新 的基因組RNA裝配到子代中，并催化合成mRNA再翻譯成病毒蛋白。為傳播病毒，病毒基因組RNA需包裹到病毒粒子中。在RNA病毒內(nèi)，子代病毒粒子 裝配過(guò)程以及裝配期間發(fā)生的蛋白/蛋白相互作用都是相似的。病毒粒子的形成確保在單 個(gè)宿主內(nèi)或在不同宿主生物之間將RNA基因組從一個(gè)宿主細(xì)胞有效傳播到另一個(gè)。含有單鏈負(fù)鏈RNA基因組的包膜病毒分為有非分節(jié)段基因組的病毒(副粘病毒 科、彈狀病毒科(Rhabdoviridae)、黃病毒科(Filoviridae)和Borna病病毒，披膜病毒科 (Togaviridae))，或有分節(jié)段基因組的病毒(正粘病毒科、布尼亞病毒科(Bunyaviridae) 和沙粒病毒科(Arenaviridae))。正粘病毒科包括，甲、乙、和丙型流感病毒，以及Thogoto 禾口 Dhori 病毒禾口傳染性娃貧血病毒(infectious salmon anemia virus)。流感病毒體由包容負(fù)鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心(螺旋型核衣殼)、以 及被內(nèi)側(cè)基質(zhì)蛋白(Ml)分隔的外部脂蛋白包膜組成。甲型流感病毒分節(jié)段的基因組由8 個(gè)線(xiàn)性負(fù)鏈單鏈RNA分子組成，其編碼11種(有些甲流病毒株編碼10種)多肽，包括 RNA依賴(lài)型RNA聚合酶蛋白(PB2，PB1和PA)和核蛋白(NP)，它們形成核衣殼；基質(zhì)膜蛋白 (M1，M2)；兩種表面糖蛋白，它們從含脂質(zhì)的包膜表面向外突出血凝素(HA)和神經(jīng)氨酸酶 (NA)；非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl)和核轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NEP)。更多的甲流株也編碼11種被認(rèn)為有凋亡前 (proapoptotic)特性的蛋白(PB1-F2)?；蚪M的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制發(fā)生在核中，裝配通過(guò)從胞質(zhì)膜出芽而發(fā)生?；旌细腥酒陂g， 多個(gè)病毒可以重配基因。流感病毒通過(guò)HA吸附至細(xì)胞膜糖蛋白和糖脂中的唾液酸化寡糖。 內(nèi)吞病毒體之后，HA在細(xì)胞的內(nèi)體中發(fā)生構(gòu)象改變，這有利于膜融合，從而觸發(fā)脫殼。核衣 殼遷移到核中，在那里，病毒mRNA貝轉(zhuǎn)錄。病毒mRNA通過(guò)一種獨(dú)特機(jī)制進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，在該機(jī) 制中，病毒內(nèi)切核酸酶從細(xì)胞性異源mRNA切下帶帽5'-端，再以其為引物，通過(guò)病毒轉(zhuǎn)錄 酶轉(zhuǎn)錄病毒RNA模板。轉(zhuǎn)錄止于距離模板末端15-22個(gè)堿基的位置，在這里，oligo (U)序列 作為信號(hào)導(dǎo)致添加Poly(A)尾。在如此產(chǎn)生的8種病毒RNA分子中，6種為單順?lè)醋有畔ⅲ?被直接翻譯成代表HA，NA, NP和病毒聚合酶蛋白，PB2，PBl和PA的蛋白。另兩個(gè)轉(zhuǎn)錄物進(jìn) 行剪接，每個(gè)都產(chǎn)生兩種mRNA，它們按不同的讀框進(jìn)行翻譯，產(chǎn)生Ml，M2，NSl和NEP。換而言之，這8種病毒RNA節(jié)段編碼11種蛋白9種結(jié)構(gòu)蛋白和2種非結(jié)構(gòu)蛋白(NSl和最近鑒 別出的PB1-F2)。針對(duì)流感病毒尤其高致病性禽流感病毒制備流行株疫苗(modernvaccine)，靠的 是反遺傳學(xué)(reverse genetics)的應(yīng)用，其允許從DNA產(chǎn)生流感病毒。反遺傳系統(tǒng)在構(gòu)建 負(fù)鏈RNA流感病毒方面的第一個(gè)進(jìn)展涉及，與體外重建的核糖核蛋白(RNP)復(fù)合物混合的 單個(gè)病毒基因的轉(zhuǎn)染，以及隨后與流感病毒輔助病毒一起感染。RNP復(fù)合物是這樣制得的， 將合成的RNA轉(zhuǎn)錄物與來(lái)自流感病毒的純化NP和聚合酶蛋白(PB1，PB2和PA)混合，用輔助 病毒作為病毒蛋白和其它vRNA的胞內(nèi)來(lái)源(Luytjes et al.，1989，Cell，59，1107-1113)。Neumann 等(1994，Virology，202，477-479)從鼠 RNA 聚合酶 I 啟動(dòng)子應(yīng)答型質(zhì)粒 表達(dá)RNA，成功地在流感病毒感染的細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了病毒模型RNA的RNP形成。Pleschka等(1996，J. Virol.，4188-4192)描述了一種方法，其從基于質(zhì)粒的表達(dá) 載體重建了 RNP復(fù)合物。病毒RNA樣轉(zhuǎn)錄物從含有截短型人聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和經(jīng)自 催化切割產(chǎn)生3'端的核酶序列的質(zhì)粒來(lái)表達(dá)。這種由poll驅(qū)動(dòng)的質(zhì)粒與應(yīng)答polll并表 達(dá)PB1，PB2, PA和NP蛋白的質(zhì)粒一起轉(zhuǎn)染到人293細(xì)胞中。但轉(zhuǎn)染效率極低，每次轉(zhuǎn)染約 10個(gè)轉(zhuǎn)染的病毒粒子。此外，這種基于質(zhì)粒的策略依賴(lài)于輔助病毒的幫助。在WO 01/04333中，分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒用一組12個(gè)表達(dá)基因組VRNA節(jié)段和 RNP蛋白的表達(dá)質(zhì)粒來(lái)構(gòu)建。WO 01/04333中所述的載體是基于眾所周知的pUC19或pUC18 質(zhì)粒。根據(jù)該說(shuō)明書(shū)的描述，此系統(tǒng)需要8種質(zhì)粒來(lái)表達(dá)所有8種流感病毒節(jié)段，并另外有 4個(gè)質(zhì)粒來(lái)表達(dá)核蛋白和表達(dá)RNA依賴(lài)型RNA聚合酶(PB1，PB2, PA和NP)的亞單位。WO 00/60050涵蓋一組載體，其中至少兩種載體包含與連接轉(zhuǎn)錄終止序列的流感 病毒節(jié)段cDNA(ΡΑ, PBl, PB2, HA, NP, ΝΑ, M)可操作相連的啟動(dòng)子，還有至少兩種載體包含與 流感病毒節(jié)段DNA(PA，PBl, PB2, NP)可操作相連的啟動(dòng)子。使用大量不同載體，是想避免 將病毒RNA合成所需的8種RNA聚合酶I轉(zhuǎn)錄盒組合在一個(gè)質(zhì)粒上。WO 01/83794描述了環(huán)狀表達(dá)質(zhì)粒，其包含插入在RNA聚合酶II(polII)啟動(dòng)子和 聚腺苷酸化信號(hào)之間的RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)。術(shù)語(yǔ)“載體”在本申 請(qǐng)中是指一種質(zhì)粒，其通常是雙鏈DNA的自含分子，能接受額外的外來(lái)DNA，并可容易地導(dǎo) 入合適的宿主細(xì)胞。病毒性疾病的地區(qū)流行(Epidemics)和全球大流行(pandemics)仍?shī)Z去人的生 命，并對(duì)全球經(jīng)濟(jì)造成影響。流感在全球?qū)е律习偃f(wàn)的失業(yè)人口和門(mén)診量，成百上千的住 院病例(Couch 1993, Ann. NY. Acad. Sci 685 ;803，)，上萬(wàn)的過(guò)多死亡例(Collins&Lehmann 1953 Public Health Monographs 213 1 ；Glezen 1982 Am. J. Public Health 77:712)以 及上億歐元的健康護(hù)理費(fèi)用(Williams et al. 1988，Ann. Intern. Med. 108 :616)。當(dāng)健康 成人得到免疫后，當(dāng)前的疫苗在70-90%的病例中阻止臨床疾病。該水平在65歲以上年齡 組中降至30-70%，在65歲以上的療養(yǎng)院(nursing homes)人群中降得更低(Strategic Perspective 2001 :The Antiviral Market. Datamonitor. ρ· 59)。病毒頻繁改變抗原性也 造成大量死亡病例，因?yàn)榧词故敲磕甑念A(yù)防接種也不能保證保護(hù)作用。因此，美國(guó)的死亡病 例從 1976/77 年的 16，363 例到 1998/99 年增至 4 倍(Wall Street Journal,Flu-related deaths in US despite vaccineresearches. January 7,2003)。尤其當(dāng)病毒性疾病爆發(fā)大流行時(shí)，最重要的就是提供預(yù)防接種或在疾病爆發(fā)后立即治療。鑒于對(duì)病毒性疾病提供有效保護(hù)和治療的緊迫需求，仍非常需要開(kāi)發(fā)經(jīng)濟(jì)、快速 且有效的表達(dá)系統(tǒng)用于病毒生產(chǎn)，以克服現(xiàn)有表達(dá)系統(tǒng)的缺點(diǎn)和困難。發(fā)明簡(jiǎn)述本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，使用不含任何常規(guī)基于質(zhì)粒的細(xì)菌擴(kuò)增和/或選擇序列、但 將病毒基因克隆到有RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)的表達(dá)盒中、插在RNA聚 合酶II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間得到的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，提供高度經(jīng)濟(jì)化且 有效的快速拯救病毒粒子的工具。與已知技術(shù)所用的質(zhì)粒相反，無(wú)需在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行克 隆的步驟。因此，病毒粒子轉(zhuǎn)染和表達(dá)所需時(shí)間可大大縮短，優(yōu)選縮短至少數(shù)周至數(shù)日。例如，本發(fā)明的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可用于開(kāi)發(fā)抗RNA病毒，尤其是抗流感病毒野生 株、突變株、或重配株的疫苗。這為流感流行或大流行時(shí)需要快速產(chǎn)生任何病毒疫苗提供了 工具。需要時(shí)，線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可以用短接頭序列環(huán)化。還可以提供一些方法，用線(xiàn)性表 達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生病毒粒子，或者，將完整病毒的一些病毒性基因節(jié)段通過(guò)環(huán)化表達(dá)構(gòu)建體來(lái) 表達(dá)，且至少一種所述基因節(jié)段通過(guò)本發(fā)明的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體來(lái)表達(dá)。附1示線(xiàn)性雙向表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生。a)片段Fl，F(xiàn)2和F3分別通過(guò)PCR擴(kuò)增來(lái)生 成。b)片段F4用寡核苷酸P4和P6通過(guò)重疊PCR來(lái)生成。發(fā)明詳述如背景部分已述，目前使用的分節(jié)段RNA病毒的反遺傳拯救系統(tǒng)仍需要轉(zhuǎn)染大量 的不同質(zhì)粒，和/或仍需要在細(xì)菌細(xì)胞中亞克隆病毒基因并隨后擴(kuò)增以得到足量質(zhì)粒。對(duì) 每個(gè)克隆，都需測(cè)序質(zhì)粒DNA并從細(xì)菌中純化，而后僅能再用于轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞。此方法耗 時(shí)、成本高，且難以自動(dòng)化。本發(fā)明提供新的線(xiàn)性表達(dá)盒，其不含任何常規(guī)基于質(zhì)粒的細(xì)菌擴(kuò)增和/或選擇序 列，但將病毒基因克隆到有RNA聚合酶I (poll)啟動(dòng)子和poll終止信號(hào)的表達(dá)盒中，插在 RNA聚合酶II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間，其可用于表達(dá)病毒粒子?！氨磉_(dá)盒”是指一種編碼表達(dá)產(chǎn)物的DNA編碼序列或節(jié)段(segment)，所述表達(dá)產(chǎn) 物在指定的限制性位點(diǎn)插入該表達(dá)構(gòu)建體。所述表達(dá)盒限制性位點(diǎn)被開(kāi)發(fā)出來(lái)是為了確保 將所述表達(dá)盒插入正確的讀框中。本發(fā)明構(gòu)建體允許將cDNA轉(zhuǎn)錄成mRNA和全長(zhǎng)負(fù)鏈(有義)vRNA(雙向轉(zhuǎn) 錄(bidirectional transcription))，或轉(zhuǎn)錄成mRNA和全長(zhǎng)正鏈(有義)cRNA (單向 (unidirectional)轉(zhuǎn)錄)。在單向轉(zhuǎn)錄時(shí)，將基因置于poll啟動(dòng)子和polll啟動(dòng)子下游。polll啟動(dòng)子產(chǎn)生 帶帽的正義鏈病毒mRNA，poll啟動(dòng)子產(chǎn)生不帶帽的正義鏈病毒cRNA。在雙向轉(zhuǎn)錄時(shí)，將 基因置于polll啟動(dòng)子上游、poll啟動(dòng)子下游。polll啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生帶帽的正義鏈病毒 mRNA, poll啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不帶帽的負(fù)義鏈vRNA。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，這種創(chuàng)新的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可有效用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞和表達(dá)完整 病毒粒子，盡管本領(lǐng)域常有文獻(xiàn)說(shuō)，用線(xiàn)性片段轉(zhuǎn)染動(dòng)物細(xì)胞，可因細(xì)胞的內(nèi)切核酸酶降解 作用導(dǎo)致這些片段解體(van der Aa et al. 2005，JGene Med. 7 :208_17)，或?qū)е卤晦D(zhuǎn)染的細(xì)胞的凋亡增加(Yao et al. 2001, J BiolChem. 276 :2905_13)。所述線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體不含細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)增質(zhì)粒所需的任何選擇或擴(kuò)增序列。也不含 ori (復(fù)制起始)序列或抗生素抗性基因或任何其它選擇標(biāo)記。根據(jù)本發(fā)明的具體實(shí)施方案，所述線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可在構(gòu)建體的N端和/或C端 包含額外的保護(hù)序列。例如，這些保護(hù)序列可以是WO 00/56914所述肽核酸序列(PNA)。這 些PNA是核酸類(lèi)似物，其中完整的脫氧核糖磷酸骨架被換成化學(xué)性質(zhì)完全不同、但結(jié)構(gòu)類(lèi) 似、含2-氨基乙基甘氨酸單元的聚酰胺(肽)骨架。已發(fā)現(xiàn)，PNA “鉗(clamp)”增加穩(wěn)定 性，在該結(jié)構(gòu)中，兩個(gè)相同的PNA序列通過(guò)含3個(gè)8-氨基_3，6-二氧辛酸(dioxaoctanoic acid)單元的柔性發(fā)卡接頭相連。當(dāng)PNA與互補(bǔ)同型嘌呤(homopurine)或同型嘧啶 (homopyrimidine)DNA靶序列混合時(shí)，可形成非常穩(wěn)定的PNA-DNA-PNA三體(Bentin et al. ，1996， Biochemistry，35，8863-8869， Egholm et al. ，1995， Nucleic Acids Res. ，23， 217-222，Nielsen et al.，Science,1991，254，1497—1500，Demidov et al.，Proc. Natl. 八0&(1.5(^.，1995，92，2637-2641)。有證據(jù)表明，它們耐受核酸酶和蛋白酶消化(Demi do ν et al.，Biochem. Pharm.，1994，48，1010-1013)。為了提供抗細(xì)胞核酸酶的保護(hù)作用，保護(hù)序列可以是長(zhǎng)度至少20個(gè)核酸的任何 核酸序列，優(yōu)選至少50個(gè)核酸，更優(yōu)選至少100個(gè)核酸。這些核酸可用核酸酶消化，從而保 護(hù)表達(dá)構(gòu)建體的核心序列，或推遲其降解，所述核心序列是，啟動(dòng)子序列、病毒序列、和終止 序列。線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可包含至少一個(gè)插在poll啟動(dòng)子和終止信號(hào)之間的病毒性基因 節(jié)段。術(shù)語(yǔ)“病毒基因”在本發(fā)明中是指，編碼或?qū)?yīng)于具體氨基酸序列的DNA或cDNA 序列或RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“基因”還包括，全長(zhǎng)基因和其片段、以及包含天然基因序列 的修飾的衍生物。這些修飾可以是，缺失，取代或插入核苷酸，導(dǎo)致氨基酸修飾，以及沉默突 變，其中一或多個(gè)核苷酸的改變未導(dǎo)致該位置編碼的氨基酸的變化。修飾還可包括功能保 守的突變，其中指定氨基酸殘基的改變不引起多肽整體構(gòu)象和功能的變化。這包括各種突 變體，序列保守變體和功能保守的RNA病毒基因節(jié)段，優(yōu)選負(fù)鏈RNA病毒基因節(jié)段。修飾可 通過(guò)隨機(jī)誘變技術(shù)或通過(guò)定點(diǎn)誘變技術(shù)來(lái)引入，如基于PCR的序列修飾。RNA病毒一或多個(gè) 單獨(dú)基因節(jié)段的修飾可允許開(kāi)發(fā)減毒病毒或復(fù)制缺陷病毒。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“復(fù)制缺陷”是指，用本領(lǐng)域熟知的血凝試驗(yàn)、TCID50試驗(yàn)或空斑 試驗(yàn)測(cè)得，干擾素感受態(tài)(interferon competent)宿主細(xì)胞中的復(fù)制速率比野生型流感病 毒至少低5 %，優(yōu)選低1 %，優(yōu)選低0.1%。本發(fā)明的表達(dá)構(gòu)建體可用于表達(dá)分節(jié)段的和非分節(jié)段的RNA基因組。非分節(jié)段的 病毒的例子有彈狀病毒科或副粘病毒科的病毒。根據(jù)本發(fā)明，表達(dá)構(gòu)建體可優(yōu)選用于表達(dá)分節(jié)段的RNA病毒。例如，將對(duì)應(yīng)于目標(biāo) 病毒基因組中每一基因的病毒cDNA插入本發(fā)明的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，得到一組覆蓋整個(gè)病 毒基因組的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體。為擴(kuò)增這些表達(dá)構(gòu)建體，可以用本領(lǐng)域已知的PCR技術(shù)，避免耗時(shí)的在細(xì)菌宿主 細(xì)胞中的克隆、擴(kuò)增、測(cè)序和純化。根據(jù)優(yōu)選實(shí)施方案，所述病毒節(jié)段來(lái)自正粘病毒科、布尼 亞病毒科和沙粒病毒科的病毒。更優(yōu)選地，它們來(lái)自甲、乙、和丙型流感病毒，以及Thogoto和Dhori病毒，和傳染性鮭貧血病毒。在流感病毒的例子中，病毒基因節(jié)段可選自PA，PB1， ΡΒ2,ΗΑ, ΝΑ, NP,M或NS基因或其一部分。可選地，病毒NS基因節(jié)段可編碼非功能型NSl蛋 白。這可以是在NS基因中的任何修飾，即取代、插入或缺失核酸。優(yōu)選NS基因的修飾消除 或減弱NS基因產(chǎn)物拮抗細(xì)胞IFN應(yīng)答的能力。干擾素拮抗活性降低或缺失的流感病毒的 例子詳見(jiàn)US 6，669，943或US 6，468，544，它們引入本文做參考。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可提供重配病毒(reassortant viruses)，其中每個(gè)病毒節(jié)段 可選自特定病毒株，例如H1N1、H3N2、甚至H5W或任何被鑒定為與當(dāng)季流感最相關(guān)的季節(jié) 株。重配病毒因此可在允許宿主細(xì)胞有效生產(chǎn)的背景下攜帶所需抗原特性。例如，重配的流 感病毒將真正的兩次爆發(fā)之間(interpandemic)的病毒的表面糖蛋白，血凝素(HA)和/或 神經(jīng)氨酸酶(NA)，的基因與5或6或7個(gè)編碼減毒主毒株的其它蛋白的RNA節(jié)段組合(6Λ 組合)，或7/1重配體或5/3重配體，分別含不同來(lái)源的M基因。這些重配病毒然后可作為毒種，用于產(chǎn)生病毒體，以制備疫苗。術(shù)語(yǔ)“病毒體”是指病毒粒子，其在轉(zhuǎn)染或與本發(fā)明表達(dá)系統(tǒng)共轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞 中、或從所述宿主細(xì)胞首次產(chǎn)生時(shí)是具有充分感染性的。這種系統(tǒng)然后產(chǎn)生vRNA和病毒蛋 白(來(lái)自病毒RNA翻譯)，由此導(dǎo)致裝配感染性病毒粒子。本發(fā)明的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體也可組合成至少兩個(gè)表達(dá)構(gòu)建體的組合。例如，可提供 一組共8個(gè)線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其中每一個(gè)都含有流感病毒PA，PBl，PB2, HA, NA, NP, M和NS 中的一個(gè)病毒基因節(jié)段或其一部分。可選地，線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可以用接頭和/或重疊序列環(huán)化。用于環(huán)化的各種不同 系統(tǒng)都是可能的，象使用帶有GGGG延伸的5' oligo和帶有CCCC序列的3' oligo?？蛇x 地，在有dATP和dTTP存在的情況下經(jīng)T4DNA聚合酶處理(以產(chǎn)生粘端)，可以使線(xiàn)性表達(dá) 構(gòu)建體經(jīng)由連接作用而環(huán)化。本發(fā)明還提供含有至少一個(gè)本發(fā)明的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體的宿主細(xì)胞。在本發(fā)明范圍 內(nèi)，術(shù)語(yǔ)〃細(xì)胞〃或“宿主細(xì)胞”是指培養(yǎng)的表達(dá)病毒的單個(gè)細(xì)胞、組織、器官、昆蟲(chóng)細(xì)胞、禽 細(xì)胞、哺乳動(dòng)物細(xì)胞、雜交瘤細(xì)胞、原代細(xì)胞、傳代細(xì)胞系、和/或遺傳改造的細(xì)胞，如重組 細(xì)胞。例如是，BSC-I細(xì)胞，LLC-MK細(xì)胞，CV-I細(xì)胞，CHO細(xì)胞，COS細(xì)胞，鼠細(xì)胞，人細(xì)胞， HeLa細(xì)胞，293細(xì)胞，Vero細(xì)胞，MDBK細(xì)胞，MDCK細(xì)胞，MDOK細(xì)胞，CRFK細(xì)胞，RAF細(xì)胞，TCMK 細(xì)胞，LLC-PK細(xì)胞，PK15細(xì)胞，W1-38細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞，T-FLY細(xì)胞，BHK細(xì)胞，SP2/0細(xì)胞， NSO, PerC6(人視網(wǎng)膜細(xì)胞)，雞胚細(xì)胞或其衍生物，含胚的卵細(xì)胞，含胚的雞卵細(xì)胞或其衍 生物。優(yōu)選細(xì)胞系是Vero細(xì)胞系。除了眾所周知的將cDNA序列引入表達(dá)系統(tǒng)的方法，本發(fā)明還提供了另一種簡(jiǎn)易 構(gòu)建線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體的方法，其中，病毒節(jié)段與互補(bǔ)序列一起提供，所述互補(bǔ)序列與poll 啟動(dòng)子和poll終止子序列重疊。在該例中，三種不同片段組合，退火并經(jīng)PCR擴(kuò)增。應(yīng)用本發(fā)明的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，則無(wú)需在細(xì)菌細(xì)胞中進(jìn)行質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化和擴(kuò)增。分 別包含流感病毒基因組的至少一個(gè)節(jié)段或其一部分的所述多個(gè)線(xiàn)性片段可直接用于轉(zhuǎn)染 宿主細(xì)胞。這些線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體的應(yīng)用提供了用本發(fā)明表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染和表達(dá)病毒粒子的 系統(tǒng)，其僅需較少天數(shù)就能收獲完整病毒粒子。總之，從流感病毒分離物開(kāi)始，可以在收獲 病毒的數(shù)小時(shí)至最多2-3天后進(jìn)行轉(zhuǎn)染。相反，根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)克隆質(zhì)粒，不測(cè)序的情況下至 少需要4-5天。轉(zhuǎn)染可在第5天進(jìn)行。但對(duì)于每個(gè)“新”節(jié)段，都不得不測(cè)試數(shù)個(gè)細(xì)菌克隆，
7以便優(yōu)化利用正確質(zhì)粒的機(jī)會(huì)。如果每種病毒分離物的序列都是已知的，對(duì)每個(gè)節(jié)段的數(shù) 個(gè)克隆進(jìn)行測(cè)序又將整個(gè)過(guò)程推遲大約1天。如此一來(lái)，轉(zhuǎn)染最早將在第6天進(jìn)行。在事 先不知道序列信息的情況下，全面測(cè)序?qū)⒔o寡核苷酸合成過(guò)程再加2-3天。根據(jù)另一實(shí)施方案，本發(fā)明涉及產(chǎn)生線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體的方法，其中，將包含病毒節(jié) 段、和同源于poll啟動(dòng)子的序列、和同源于poll終止子的序列的DNA片段，包含保護(hù)序列、 pol I啟動(dòng)子序列、poly A信號(hào)序列和互補(bǔ)于所述病毒節(jié)段的至少5個(gè)(優(yōu)選至少10個(gè)， 優(yōu)選至少12個(gè))核苷酸的重疊序列的DNA片段，包含保護(hù)序列、CMV啟動(dòng)子、pol I終止子 序列和互補(bǔ)于所述病毒節(jié)段的至少5個(gè)(優(yōu)選至少10個(gè)，優(yōu)選至少12個(gè))核苷酸的重疊 序列的DNA片段，都通過(guò)重疊PCR融合在一起，并用標(biāo)準(zhǔn)純化方法進(jìn)行純化。根據(jù)另一方法，包含病毒節(jié)段、和同源于poll啟動(dòng)子的序列、和同源于pol I終止 子的序列的DNA片段可額外包含至少5核苷酸，它們被引入該片段，是作為含Poll終止子 和CMV啟動(dòng)子以及Poll啟動(dòng)子和poly A信號(hào)的兩個(gè)片段的互補(bǔ)序列，這些片段通過(guò)PCR 技術(shù)融合在一起。兩種用于擴(kuò)增病毒節(jié)段的寡核苷酸都可被設(shè)計(jì)成，包含與含CMV啟動(dòng)子和Poll終 止子的DNA片段互補(bǔ)、以及與含Poll啟動(dòng)子和poly A信號(hào)的DNA片段互補(bǔ)的序列(見(jiàn)圖 1的F2，F(xiàn)3)。如此，病毒基因節(jié)段(見(jiàn)

圖1的Fl)與含CMV啟動(dòng)子和Poll終止子的DNA片 段、以及病毒基因節(jié)段與含Poll啟動(dòng)子和poly A信號(hào)的DNA片段之間的重疊區(qū)的長(zhǎng)度增 加，這有利于第二個(gè)PCR步驟，該步驟中，病毒基因節(jié)段與含CMV啟動(dòng)子和Poll終止子的 DNA片段、以及含Poll啟動(dòng)子和poly A信號(hào)的DNA片段融合。本發(fā)明還涉及產(chǎn)生負(fù)鏈病毒粒子的方法，包括在允許產(chǎn)生病毒蛋白和vRNA或 cRNA的條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞。例如，含有全部的病毒基因節(jié)段的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體可用于轉(zhuǎn) 染宿主細(xì)胞。然后在培養(yǎng)基中維持細(xì)胞，可從培養(yǎng)上清液中分離并純化得到病毒粒子?？蛇x地，可包括第二個(gè)純化步驟以增加表達(dá)構(gòu)建體的純度，降低轉(zhuǎn)染至宿主細(xì)胞 中的毒性。商購(gòu)PCR清潔試劑盒(cleaning kit)通常依賴(lài)DNA與硅化膜(silicamembrane) 在高鹽條件下的結(jié)合。本發(fā)明人意外發(fā)現(xiàn)，經(jīng)商購(gòu)純化試劑盒一步純化的PCR片段轉(zhuǎn)染至 Vero細(xì)胞中表現(xiàn)出高毒性，可阻止病毒拯救(rescue)。當(dāng)PCR產(chǎn)物再經(jīng)歷一個(gè)依賴(lài)于陰離 子交換樹(shù)脂的純化步驟后，其純度增加，能以更高效率進(jìn)行病毒拯救。可選地，進(jìn)行基于陰 離子交換樹(shù)脂的單個(gè)純化步驟。根據(jù)具體實(shí)施方案，Taq聚合酶和校正聚合酶(如Pfu聚合酶)的混合物可用于 所有PCR擴(kuò)增步驟。如此一來(lái)，可將PCR衍生的突變減至最少。此外，消除了將額外的胸苷 堿基摻入含CMV啟動(dòng)子和Poll終止子的DNA片段、以及病毒基因節(jié)段和含Poll啟動(dòng)子和 poly A信號(hào)的DNA片段的需求。本發(fā)明涵蓋產(chǎn)生流感病毒粒子的方法，其中至少一種線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體被直接轉(zhuǎn)染 到宿主細(xì)胞中，所述宿主細(xì)胞在表達(dá)流感病毒的條件下培養(yǎng)，收集病毒粒子并純化。進(jìn)一步地，本發(fā)明涵蓋一種方法，其中可選將病毒粒子在減毒或滅活后與可藥用 載體和/或佐劑一起摻入藥物組合物中，作為治療或預(yù)防藥物。優(yōu)選的，用所述病毒粒子產(chǎn) 生用于治療性或預(yù)防性處理傳染病(therapeutic orprophylyactic treatment)的藥物制
8劑，如疫苗制劑。引入方法包括但不限于，肌肉內(nèi)，腹腔內(nèi)(intraperitoneal)，靜脈內(nèi)，鼻內(nèi)，硬膜 外(印idural)或口腔途徑。優(yōu)選鼻內(nèi)引入。在優(yōu)選實(shí)施方案中，可能希望將藥物制劑經(jīng)任 何合適途徑進(jìn)入肺。肺給藥也可以采用例如吸入器或噴霧器(nebulizer)，或?qū)⑵渑c霧化劑 (aerosolizing agent) 一起吸入。藥物制劑也可通過(guò)控釋系統(tǒng)如泵來(lái)運(yùn)送。本發(fā)明的藥物可包含治療有效量的復(fù)制缺陷病毒和可藥用載體?！翱伤幱谩笔侵?， 由管理部門(mén)如FDA或EMEA批準(zhǔn)。術(shù)語(yǔ)“載體”是指，稀釋劑、輔助劑、賦形劑或運(yùn)載劑，它們 與所述制劑一起施用。鹽水溶液，葡萄糖(dextrose)和甘油溶液(作為載液)或賦形劑 象葡萄糖(glucose)，乳糖，蔗糖，或本領(lǐng)域已知可用于藥物制劑的其它賦形劑都可以使用。 此外，也可以包括穩(wěn)定劑，以增加藥物的貨架期。優(yōu)選地，提供即用型(ready-to-use)輸注 液。可選地，可將所述制劑配制成粉末，臨用前再溶于合適的水溶液中。本發(fā)明藥物制劑治療具體疾病的有效量取決于該疾病的特性，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)臨床技 術(shù)來(lái)確定。此外，可選采用體外實(shí)驗(yàn)幫助鑒定最佳劑量范圍。配制劑中的精確用量取決于 給藥途徑和疾病嚴(yán)重性，應(yīng)根據(jù)醫(yī)生的判斷和每個(gè)患者的環(huán)境來(lái)決定。但合適的給藥劑量 范圍通常最多Slogs (104-5X IO6Pfu)復(fù)制缺陷病毒，可以給藥一次，或有間隔地給藥多次， 次數(shù)根據(jù)需要來(lái)定。包含104-5X IO6Pfu復(fù)制缺陷的減毒病毒的本發(fā)明藥物制劑可經(jīng)鼻內(nèi)、氣管內(nèi)、肌 肉內(nèi)或皮下給藥。有效劑量可從體外或動(dòng)物模型測(cè)試系統(tǒng)獲得的劑量應(yīng)答曲線(xiàn)外推得出。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語(yǔ)“疫苗”是一種制劑，當(dāng)給予受試者后，可激發(fā)抗RNA病毒的保護(hù) 性免疫力。它是指含有病毒，滅活病毒，減毒病毒，拆分的(split)病毒或病毒蛋白，象表面 抗原之類(lèi)，能用于在受試者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫力的制劑。疫苗都給予保護(hù)性劑量，這是單獨(dú) 或與一或多種已知增加免疫原性的佐劑一起給藥、足以導(dǎo)致保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗量。參考下列實(shí)施例將更全面理解以上描述。但這些實(shí)施例僅代表實(shí)施本發(fā)明一或多 個(gè)實(shí)施方案的方法，不應(yīng)將它們理解為限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例實(shí)施例1 制備線(xiàn)性H3N2HA表達(dá)構(gòu)建體經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)的甲流H3N2病毒的HA節(jié)段用寡核苷酸Pl和P2(圖Ia的Fl)進(jìn) 行 PCR擴(kuò)增。隨后，將來(lái)自 pHW2000 (Hoffmann et al. 2000, ProcNatl Acad Sci U S Α. 97 6108-13)的兩個(gè)DNA片段(圖1的F2和F3)與HAPCR產(chǎn)物通過(guò)重疊PCR進(jìn)行融合(見(jiàn)圖 lb)。第一個(gè)DNA片段(F2)含CMV啟動(dòng)子和Poll終止子，第二個(gè)(F3)含人Poll啟動(dòng)子和 BGH polyA信號(hào)。為有利于產(chǎn)生重疊PCR產(chǎn)物，用于HA擴(kuò)增的寡核苷酸在其5’端延伸，使 Pl包含與Poll終止子互補(bǔ)的序列，使P2包含與Poll啟動(dòng)子互補(bǔ)的序列(見(jiàn)圖la)。同樣 地，用于產(chǎn)生片段Fl和F2的引物P3和P5在其5’端延伸，以包含與HA的5’和3’端互補(bǔ) 的序列(見(jiàn)圖la)。片段F2和F3包含來(lái)自pHW2000骨架的保護(hù)序列。這些序列不直接參 與mRNA和vRNA轉(zhuǎn)錄，但減少外切核酸酶對(duì)雙向表達(dá)盒的降解。病毒RNA從Vero細(xì)胞培養(yǎng)的甲流H3N2病毒用Qiagen ViralAmp試劑盒提取，按 文獻(xiàn)(Hoffmann et al. 2001，Arch Virol. 146 :2275_89)所述用 Unil2 寡核苷酸進(jìn)行逆轉(zhuǎn)
9錄。HA節(jié)段用表1所示寡核苷酸、以及Pfu Turbo DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶的混合物 進(jìn)行擴(kuò)增。表1
Pl5 ’ -CGAAGTTGGGGGGG] GCAAAA GCA GGGGA TAA TTCTA TTAA C-3 ‘ (SEQ ID No. 1)P25 ’ -GCCGCCGGGTTATL4 GTA GAAACAA GGGTGTTTTTAA TTAA TGC-3 ‘ (SEQ ID No. 2)對(duì)應(yīng)于H3序列的核苷酸用粗斜體表示，同源于Poll終止子(Pl)和Poll啟動(dòng)子 (P2)的核苷酸用標(biāo)準(zhǔn)大寫(xiě)字母表示。HA F4PCR產(chǎn)物用Qiaquick PCR純化試劑盒(Qiagen)純化。PCR片段F2和F3從 PHW2000質(zhì)粒DNA進(jìn)行擴(kuò)增，分別使用引物對(duì)P3+P4和P5+P6 (見(jiàn)表2和圖la)，并用到Pfu Turbo DNA聚合酶與Taq DNA聚合酶的混合物。PCR產(chǎn)物F2和F3用QIAquick PCR純化試 劑盒(Qiagen)進(jìn)行純化。表2:
P35,-CCTGCTTTTGCTCCCCCCCAAC τCGGAGG C-3, (SEQ ID No. 3)P45‘-GGGGTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATAC-3 ‘ (SEQ ID No. 4)P55'-CCTTGTTTCTACTAATAACCCGGCGGCCCAAAATGC-3‘ (SEQ ID No. 5)P65‘-CCCCTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGTTC3 ‘ (SEQ ID No. 6)對(duì)應(yīng)于H3序列的P3和P5核苷酸用粗斜體表示，互補(bǔ)于pHW2000的核苷酸用標(biāo)準(zhǔn) 大寫(xiě)字母表示。對(duì)于P4和P6，除了 5’端4個(gè)核苷酸以外的所有核苷酸都對(duì)應(yīng)于PHW2000。為產(chǎn)生含HA的全長(zhǎng)PCR產(chǎn)物(F4)，將CMV啟動(dòng)子、Poll終止子、Poll啟動(dòng)子和 BGH polyA信號(hào)、片段F1、F2和F3組合在一起，用引物P4和P6、以及Pfu Turbo DNA聚合 酶與Taq DNA聚合酶的混合物，通過(guò)重疊PCR選行擴(kuò)增。圖1顯示線(xiàn)性雙向表達(dá)構(gòu)建體的產(chǎn)生。圖la)示分別經(jīng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的片段F1， F2和F3。片段Fl含各自的病毒節(jié)段，并包含與Poll啟動(dòng)子和Poll終止子互補(bǔ)的延伸序 列。片段F2含CMV啟動(dòng)子和Poll終止子、以及與各自病毒節(jié)段互補(bǔ)的延伸序列。片段F3 含Poll啟動(dòng)子和BGH聚腺苷酸化信號(hào)、以及與各自病毒節(jié)段互補(bǔ)的延伸序列。用于PCR擴(kuò) 增Fl片段的寡核苷酸Pl和P2都與各自病毒節(jié)段互補(bǔ)。Pl包含與Poll終止子互補(bǔ)的5’ 延伸序列，P2包含與Poll啟動(dòng)子互補(bǔ)的5’延伸序列。寡核苷酸P3和P4用于PCR擴(kuò)增F2 片段，其中P3包含與各自病毒節(jié)段互補(bǔ)的5’延伸序列。寡核苷酸P5和P6用于PCR擴(kuò)增 F3片段，其中P5包含與各自病毒節(jié)段互補(bǔ)的5’延伸序列。保護(hù)序列都來(lái)自PHW2000骨架， 不含有直接參與mRNA或vRNA轉(zhuǎn)錄的序列。
10
實(shí)施例2 用線(xiàn)性HA表達(dá)構(gòu)建體拯救甲流病毒甲流H3N2病毒的6種分離物在MDCK細(xì)胞上培養(yǎng)。HA節(jié)段用PCR擴(kuò)增(圖1的 Fl)，在瓊脂糖凝膠電泳上用Qiaex II試劑盒(Qiagen)純化。按實(shí)施例1所述，將片段F2 和F3與Fl融合，產(chǎn)生全長(zhǎng)表達(dá)構(gòu)建體F4。經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化后，片段F4經(jīng)PCR再擴(kuò) 增，產(chǎn)生足量DNA用于轉(zhuǎn)染。最后，用F4HA DNA片段和7個(gè)質(zhì)粒(pHW2000衍生物)在Vero 細(xì)胞上進(jìn)行病毒拯救，所述質(zhì)粒含有適應(yīng)了 Vero的甲流Hmi delNSl病毒株(GHBOl)的剩 余節(jié)段。圖Ib顯示了用寡核苷酸P4和P6經(jīng)重疊PCR產(chǎn)生的片段F4。F4HA DNA片段的產(chǎn)生類(lèi)似于實(shí)施例1描述的過(guò)程。對(duì)每一種病毒分離物，總量 10-20yg 的F4HA DNA 首先用 Qiaquick 試劑盒(Qiagen)純化，然后用 Qiagen Endofree 質(zhì) 粒試劑盒純化。當(dāng)PCR產(chǎn)物僅用PCR純化試劑盒(Qiaquick，Qiagen)在單個(gè)步驟中純化時(shí)，轉(zhuǎn)染 Vero細(xì)胞后觀察到高毒性，導(dǎo)致阻止病毒拯救。Vero細(xì)胞在含10%胎牛血清和1 % Glutamax-I添加物的DMEM/F12培養(yǎng)基中37°C 予以維持。為產(chǎn)生病毒，針對(duì)PHW2000的公開(kāi)序列(Hoffmarmet al.，見(jiàn)上文)產(chǎn)生7種衍 生物，它們包含來(lái)自GHBOl的節(jié)段PA，PBl，PB2, ΝΑ, M，NP和delNSl，將它們以及編碼甲流 病毒 PR8NS 1 的蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pCAGGS-NSl (SAM) ； (Salvatore et al. 2002，J Virol. 76 1206-12))與各自F4HA DNA片段一起用于共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，為支持病毒復(fù)制，將 Vero細(xì)胞在不含血清的培養(yǎng)基(Opti-Pro ；Invitrogen)中含5μ g/ml胰蛋白酶的條件下 進(jìn)行培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染的3-4天后，觀察到50-100% CPE，將拯救的病毒凍存，或進(jìn)一步在Vero細(xì) 胞上擴(kuò)增。因此，用一個(gè)被線(xiàn)性PCR產(chǎn)物替換的雙向表達(dá)質(zhì)粒來(lái)拯救甲流病毒是可行的。實(shí)施例3 從線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體完全拯救甲流病毒針對(duì)適應(yīng)了 Vero細(xì)胞的甲流HlNl delNSl病毒(GHBOl)，通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生8種 線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體(F4)。用8種含GHBOl節(jié)段的pHW2000衍生物作為PCR模板。針對(duì)每種節(jié) 段產(chǎn)生足量F4片段，再用于在Vero細(xì)胞上進(jìn)行病毒拯救。針對(duì)8種節(jié)段，通過(guò)直接PCR擴(kuò)增每一種節(jié)段的完整雙向表達(dá)盒，產(chǎn)生F4DNA片 段，所述表達(dá)盒包含各自的流感病毒節(jié)段，用相應(yīng)的PHW2000衍生物作為模板。PCR擴(kuò)增用 寡核苷酸P4和P6 (見(jiàn)表3)、以及Pfu DNATurbo聚合酶與Taq DNA聚合酶的混合物進(jìn)行。表 3
權(quán)利要求
線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，不含任何擴(kuò)增和/或選擇序列，含RNA聚合酶I(polI)啟動(dòng)子和polI終止信號(hào)，它們插在RNA聚合酶II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間。
2.權(quán)利要求1的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，在所述構(gòu)建體的N-端和/或C-端含有額外的保護(hù) 序列。
3.權(quán)利要求1或2的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其中所述保護(hù)序列可以是不直接參與病毒RNA 轉(zhuǎn)錄的任何序列。
4.權(quán)利要求1-3之一的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，有至少一個(gè)病毒基因節(jié)段插在poll啟動(dòng)子和 poll終止信號(hào)之間。
5.權(quán)利要求4的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其中所述病毒節(jié)段來(lái)自甲、乙、或丙型流感病毒。
6.權(quán)利要求4或5的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其中所述病毒基因節(jié)段選自流感病毒的PA， PBl, PB2, HA, NA, NP, M, NS基因節(jié)段或其一部分。
7.權(quán)利要求4-6之一的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其中所述病毒NS基因節(jié)段表達(dá)非功能型NSl 蛋白。
8.權(quán)利要求4-7之一的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其中所述病毒基因節(jié)段是所述節(jié)段的cDNA拷 貝或RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。
9.一組線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，含有至少兩個(gè)按照權(quán)利要求1-8之一所述的表達(dá)構(gòu)建體。
10.權(quán)利要求9的一組線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，有8個(gè)構(gòu)建體，每個(gè)構(gòu)建體含有至少一個(gè)流感 病毒基因節(jié)段或其一部分，所述節(jié)段是指PA，PBl，PB2, HA, NA, NP, M和NS基因節(jié)段。
11.宿主細(xì)胞，含有至少一個(gè)按照權(quán)利要求1-10之一所述的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體。
12.產(chǎn)生權(quán)利要求1-8之一的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體的方法，其中，將包含病毒節(jié)段、和同源 于pol I啟動(dòng)子的序列、和同源于pol I終止子的序列的DNA片段，包含保護(hù)序列、pol I啟 動(dòng)子序列、poly A信號(hào)序列和互補(bǔ)于所述病毒節(jié)段的至少5個(gè)核苷酸的重疊序列的DNA片 段，包含保護(hù)序列、CMV啟動(dòng)子、pol I終止子序列和互補(bǔ)于所述病毒節(jié)段的至少5個(gè)核苷酸 的重疊序列的DNA片段，都通過(guò)重疊PCR融合在一起，并純化。
13.產(chǎn)生負(fù)鏈RNA病毒體的方法，包括，在允許產(chǎn)生病毒蛋白和vRNA或cRNA的條件下， 培養(yǎng)權(quán)利要求11的宿主細(xì)胞。
14.產(chǎn)生流感病毒粒子的方法，其中將至少一種線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體直接轉(zhuǎn)染動(dòng)物宿主細(xì) 胞，并且，在表達(dá)流感病毒的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞，收集病毒粒子，并純化。
15.權(quán)利要求12或13的方法，包括至少兩個(gè)純化步驟。
16.權(quán)利要求12-14之一的方法，其中所述病毒粒子任選在減毒或滅活后，與可藥用載 體一起摻入藥物組合物中。
17.權(quán)利要求1-8之一的表達(dá)構(gòu)建體產(chǎn)生的病毒粒子的用途，是用于制備治療性處理 或預(yù)防性處理傳染病的醫(yī)學(xué)制劑。
18.對(duì)受試者進(jìn)行預(yù)防接種使之抵抗負(fù)鏈RNA病毒感染的方法，包括對(duì)該受試者鼻內(nèi) 或胃腸外施用保護(hù)劑量的藥物組合物，所述藥物組合物含有根據(jù)權(quán)利要求14制得的流感 病毒粒子。
全文摘要
本發(fā)明提供了不含任何常規(guī)擴(kuò)增和/或選擇序列的線(xiàn)性表達(dá)構(gòu)建體，其包含RNA聚合酶I(polI)啟動(dòng)子和polI終止信號(hào)，它們插入在RNA聚合酶II(polII)啟動(dòng)子和聚腺苷酸化信號(hào)之間，用于表達(dá)病毒RNA節(jié)段，優(yōu)選流感病毒。本發(fā)明的構(gòu)建體可用于有效快速制備病毒粒子，尤其是制備用于治療流行性疾病和/或大流行疾病的疫苗配制劑。
文檔編號(hào)C12N15/86GK101952427SQ200880022354
公開(kāi)日2011年1月19日 申請(qǐng)日期2008年6月26日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月27日
發(fā)明者克里斯琴·斯特爾, 安德雷杰·埃戈羅夫, 托馬斯·馬斯特, 邁克爾·伯格曼, 馬庫(kù)斯·沃爾謝克 申請(qǐng)人:阿維爾綠山生物技術(shù)研究發(fā)展貿(mào)易股份公司