專利名稱：細(xì)胞立體構(gòu)造體的生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及將各種細(xì)胞配置于任意的三維空間，制作僅由細(xì)胞構(gòu)成的立體構(gòu)造體的方法，以及采用該方法制作的細(xì)胞構(gòu)筑物(構(gòu)築體)。
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以再生失去的臟器為目標(biāo)，將細(xì)胞移植至患處的再生醫(yī)療正在逐步實(shí)用化。傳統(tǒng)上，為了再生大型器官/臟器，需要吸收性材料作為細(xì)胞在體內(nèi)的錨地(足場)。作為這些吸收性材料，嘗試使用了動物來源的膠原、水解的合成聚合物，但在安全性、成本等方面未能取得滿意效果。因而，發(fā)明人等開發(fā)出了僅使用細(xì)胞來制作立體構(gòu)造體的方法("組織填充物的生產(chǎn)方法"，專利文獻(xiàn)l)。在該方法中，通過使細(xì)胞團(tuán)流入型模中，在傳統(tǒng)上極其
困難的大型的僅由細(xì)胞構(gòu)成的構(gòu)造體的制作方面，取得了成功。該發(fā)明的有效性通過動物實(shí)驗得以確認(rèn)，并且已經(jīng)發(fā)展到面向臨床應(yīng)用的前期階段，
因而廣受矚目。
根據(jù)上述細(xì)胞填充物(cell plug)的制作方法，通過使不同系統(tǒng)的細(xì)胞團(tuán)按順序流入培養(yǎng)容器等中，能夠制作出像地層那樣的復(fù)合細(xì)胞構(gòu)造體。但是，臟器具有更加復(fù)雜的細(xì)胞排列結(jié)構(gòu)，因而有必要進(jìn)一步開發(fā)可以采取任意排列結(jié)構(gòu)的細(xì)胞填充物的制作方法。此外，由于細(xì)胞構(gòu)造體的大型、
路徑，今后為了進(jìn)行大型臟器再生，有必要做進(jìn)一步改良。
近年來，已經(jīng)開發(fā)出在37度附近固化、而在低溫時液化的特殊明膠(溫敏型明膠)。已經(jīng)進(jìn)行了使細(xì)胞粘附在明膠上來制作細(xì)胞薄片、并進(jìn)一步將細(xì)胞薄片之間層疊起來制作細(xì)胞立體構(gòu)造體的嘗試。但是，在該方法中，向細(xì)胞構(gòu)造體內(nèi)部的培養(yǎng)液供給是困難的，而且構(gòu)造體的厚度方面似乎存在2毫米左右的界限。此外，根據(jù)該方法，在構(gòu)造體制備完成后，似乎可以降低溫度使溫敏型明膠液化，然后從構(gòu)造體內(nèi)部回收明膠。然而，是否可以從構(gòu)造體內(nèi)部完全地將明膠回收還存在疑問，而殘留明膠引起的體內(nèi)異物反應(yīng)等副作用是令人恐懼的(非專利文獻(xiàn)1)。
(專利文獻(xiàn)l)特開2004_357694號公報
(非專利文獻(xiàn)l)-匕、才一少(注冊商標(biāo))^工少^用V、力c軟骨組織(D再生、^ 乂夕一氺:y卜<UR L : HYPERLINK "http://www. mebiol. co. jp/rd— img/nankotu.
pdf" http:Z/www. mebiol. co. jp/rd —
img/nankotu. pdf>

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明所要解決的問題
本發(fā)明的目的是提供將各種細(xì)胞配置于任意的三維空間、制作僅由細(xì)胞構(gòu)成的立體構(gòu)造體的方法。解決問題的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明人等為解決上述課題進(jìn)行了深入研究，結(jié)果通過使用本發(fā)明的臨時固定用支持體，在將各種細(xì)胞配置于任意的三維空間、制作僅由細(xì)胞構(gòu)成的立體構(gòu)造體方面取得了成功，從而完成了本發(fā)明。
即，本發(fā)明如下。
(1) 一種支持體，其是用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間的支持體，該支持體具備
基板和用于將細(xì)胞團(tuán)(細(xì)胞塊，cell clusters)串起來(貫通S甘3)的線狀體或針狀體。
(2) (1)所述的支持體，其中，所述線狀體或針狀體配置在所述基板的近<以法纟戔方向(〖5這、 去條曳方向，almost perpendicular direction)上。
(3) (1)或(2)所述的支持體，其還具備覆蓋所述基板的薄片(、乂一卜，sheet)。
(4) 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其中，所述線狀體或針狀體是非細(xì)
胞粘著性的。
(5) (1)或(2)所述的支持體，其中，以下述間隔來確定所述線狀體或針狀體的位置，所述間隔使得將細(xì)胞團(tuán)串起來時，相鄰細(xì)胞團(tuán)能夠接觸。
(6) (3)所述的支持體，其中，所述薄片是非細(xì)胞粘著性的。
(7) (3)所述的支持體，其中，所述薄片具有孔或呈網(wǎng)眼狀，使得固定于200880010943.5
(8) (1)或(2)所述的支持體，其中，所述細(xì)胞團(tuán)是球狀體(7 7工口^ K,spheroid)。
(9) (1)或(2)所述的支持體，其中，所述針狀體是圓錐形的。
(10) (1)或(2)所述的支持體，其中，所述線狀體或針狀體是聚丙烯制、尼龍制或不銹鋼制的。
(11) (3)所述的支持體，其中，所述薄片經(jīng)過了氟加工或聚曱基丙烯酸羥乙酯加工。
(12) 用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間的方法，所述方法包括
a) 形成細(xì)胞團(tuán)的步驟，
b) 用權(quán)利要求1所述的支持體的線狀體或針狀體將所形成的細(xì)胞團(tuán)串起來的步驟，
和
c) 使該串起來的細(xì)胞團(tuán)之間相接觸的步驟。
(13) 細(xì)胞構(gòu)筑物的生產(chǎn)方法，所述方法包括
a) 形成細(xì)胞團(tuán)的步驟，
b) 用權(quán)利要求1所述的支持體的線狀體或針狀體將所形成的細(xì)胞團(tuán)串起來的步驟，
c) 使該串起來的細(xì)胞團(tuán)之間相接觸的步驟，和
d) 回收接觸的細(xì)胞團(tuán)的步驟。
(14) (12)或(13)所述的方法，其中，所述細(xì)胞團(tuán)被串起來，使得它們在所述線狀體或針狀體的長度方向上連續(xù)并彼此接觸。
(15) (13)所述的方法，其中，所述接觸的細(xì)胞團(tuán)的回收是通過從融合的細(xì)胞團(tuán)上拉掉支持體的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
(16) (12) (15)中任一項所述的方法，其中，所述細(xì)胞團(tuán)是球狀體。
(17) 采用(12) (15)中任一項所述的方法制作的細(xì)胞構(gòu)筑物。
(18) (17)所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，所述細(xì)胞構(gòu)筑物是由同一種類的細(xì)胞構(gòu)成的。
(19) (17)所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，所述細(xì)胞構(gòu)筑物是由多個種類的細(xì)胞構(gòu)成的。
(20) (17) (19)中任一項所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，其用于醫(yī)療用途或?qū)嶒炗猛尽?br> (21)(20)所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，其用于關(guān)節(jié)的再生。 發(fā)明效果
根據(jù)本發(fā)明，可以提供用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間的支持體， 以及用于制作沒有異物殘留的、僅由細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞構(gòu)筑物的方法，所述 方法中，使用上述支持體將各種細(xì)胞配置于任意的三維空間，在細(xì)胞團(tuán)之 間彼此融合/結(jié)合而形成構(gòu)造體后，再拔去支持體。已知細(xì)胞團(tuán)(球狀體)如 果以近接狀態(tài)放置就會發(fā)生融合，但通過使用本發(fā)明的支持體和方法，能 夠控制通過球狀體的融合而形成的構(gòu)筑物的形狀，在任意的三維空間中以 所希望的狀態(tài)配置細(xì)胞團(tuán)。此外，通過本發(fā)明的方法，能夠不在細(xì)胞構(gòu)造 體內(nèi)部(由細(xì)胞團(tuán)構(gòu)建而成的構(gòu)造體的內(nèi)壁部)配置細(xì)胞團(tuán)而是設(shè)置空隙(隧
道)，并能夠從該隧道部供給培養(yǎng)液。其結(jié)果是，能夠形成大型的細(xì)胞構(gòu)造 體。這樣獲得的細(xì)胞構(gòu)造體，可以在例如以器官或臟器的再生為目的的醫(yī) 療用細(xì)胞移植中使用。此外，還可以在用于體外藥物篩選等研究的器官/臟 器模擬物方面使用。


閨1A示出了本發(fā)明的支持體。
圖1B示出了基板的基底面上具備薄片的本發(fā)明的支持體。 圖1D是顯示針狀體為圓錐形的實(shí)施方式的圖。
圖1E示出了(使用例如塞子(stopper)等)將線狀體的一端固定、從另
一端使其串起細(xì)胞團(tuán)的例子。
圖1F示出了將細(xì)胞團(tuán)串在線狀體上，在使線拉緊的狀態(tài)下將其固
定，并使細(xì)胞團(tuán)進(jìn)行排列的例子。
圖2A示出了 將細(xì)胞團(tuán)(球狀體)應(yīng)用于本發(fā)明的支持體。
圖2B示出了使用機(jī)器人手臂(robotarm)將細(xì)胞團(tuán)應(yīng)用于針狀體。
圖2C為從側(cè)面觀察串在本發(fā)明的支持體上的細(xì)胞團(tuán)的圖。
圖2D為串在本發(fā)明的支持體上的細(xì)胞團(tuán)的立體圖。
圖3A為回收采用本發(fā)明的方法制作的細(xì)胞團(tuán)的步驟的例子。圖3B示出了采用本發(fā)明的方法制作的細(xì)胞團(tuán)的例子。 圖4A示出了由2種細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成的細(xì)胞構(gòu)筑物的1個例子。 圖4B示出了 由2種細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成的細(xì)胞構(gòu)筑物的另一個例子。 圖4C示出了由2種細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成的細(xì)胞構(gòu)筑物的另一個例子。 圖4D示出了在細(xì)胞團(tuán)內(nèi)具有空間的細(xì)胞構(gòu)筑物的另一個例子。 圖5為發(fā)生了融合的細(xì)胞團(tuán)的顯微鏡照片的圖。
圖6按時間順序顯示了在用于獲得本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)筑物的1個實(shí)施例 中，直至獲得細(xì)胞團(tuán)的流程。
圖7A 圖7E顯示了根據(jù)本發(fā)明使細(xì)胞團(tuán)融合，并進(jìn)行顯微鏡觀察。 圖8為用于觀察細(xì)胞構(gòu)造體的內(nèi)部的截面圖。 圖9A為使帶針的縫合線串起細(xì)胞團(tuán)的圖。
圖9B按時間順序顯示了使用帶針的縫合線直至獲得細(xì)胞構(gòu)筑物的流程。
圖9C為本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)筑物的 一個例子。
符號說明
10:支持體本體；11:基板；12:線狀體或針狀體；13:薄片
發(fā)明的
具體實(shí)施例方式
以下，對本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行說明。以下的實(shí)施方式僅是用于說明 本發(fā)明的示例，并非意味本發(fā)明受這些實(shí)施方式的限定。本發(fā)明在不超出 其要旨的范圍內(nèi)，可以以各種方式實(shí)施。
而且，本說明書中引用的所有出版物、例如現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)和公開公報、 專利公報及其它專利文獻(xiàn)，均全文并入本說明書中作為參考。本說明書包 括作為本申請優(yōu)先^又基礎(chǔ)的特愿2007-094313號"^兌明書(申請日2007年3 月30日)的內(nèi)容。
以下，對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
l.支持體
本發(fā)明的支持體的1個實(shí)施方式示于圖1A和圖1B。在圖1A中，支持 體本體10具有基板11和線狀體或針狀體12。支持體本體10具備任意形狀 的基板11，基板11上具備線狀體或針狀體12。圖1A為線狀體或針狀體配置在基板的基底面的近似法線方向的形態(tài)的一個例子?；?1和線狀體或
針狀體12，整體而言可以由獨(dú)立的部件構(gòu)成并固定在一起，也可以由例如 熱可塑性樹脂等一體式地制作而成。此外，支持體所具有的線狀體或針狀 體的數(shù)目為1個以上，可以使用希望的任意數(shù)目的線狀體或針狀體。在本 說明書中使用時，語句"近似法線方向"是指線狀體或針狀體的長度方向與 基板ll的基底面所成的角度為約90。的任意角度的方向，優(yōu)選是指90°。在 其它實(shí)施方式中，基板ll還具備薄片13,該薄片13覆蓋基板的存在有線 狀體或針狀體的一側(cè)的表面(圖1B)。薄片13的表面積可以小于、等于或大 于基板ll的基底面的表面積，但優(yōu)選存在覆蓋線狀體或針狀體的區(qū)域的基 底面。
作為本發(fā)明的其它形態(tài)，可以不將線狀體或針狀體配置在法線方向， 而是將其配置在非法線方向(例如，與法線方向成角度的方向)。"非法線方 向"的線狀體或針狀體的角度可以在相對于支持體本體10為1。~89。的范圍 內(nèi)適宜選4奪，可以列舉出例如10°、 20。、 30。、 40。、 50°、 60°、 70°和80° 等。此外，"非法線方向，，的線狀體或針狀體可以從支持體上朝一定方向以直 線狀伸出，也可以像圓或者橢圓的弧的一部分等那樣以非直線狀伸出(圖 1C)。存在于1個支持體上的線狀體或針狀體的形狀，沒有必要統(tǒng)一為1個 類型，也可以組合使用各種類型的線狀體或針狀體(圖1C)。作為它們的形 態(tài)，可以列舉出組合使用法線方向的線狀體或針狀態(tài)與在非法線方向上 具有 一定角度的線狀體或針狀體的支持體，組合使用法線方向的線狀體或 針狀體與具有對應(yīng)于圓弧的一部分的軌跡的線狀體或針狀體的支持體，以 及，組合使用法線方向的線狀體或針狀態(tài)、在非法線方向具有一定角度的 線狀體或針狀體與具有對應(yīng)于圓弧的一部分的軌跡的線狀體或針狀體的支 持體等，但不限于此。例如，使線狀體或針狀體為曲線狀，將其配置在圓 周上而形成弓形結(jié)構(gòu)(7 —于)，沿該弓形結(jié)構(gòu)將細(xì)胞團(tuán)串起來并使之融合， 就可以構(gòu)建例如碗狀的細(xì)胞構(gòu)筑物。此外，如果線狀體或針狀體為直線狀， 則根據(jù)配置方式可以使之為圓錐形、中空狀或者金字塔狀等形狀。通過組 合使用多種類型的線狀體或針狀體，可以形成復(fù)雜形狀的細(xì)胞構(gòu)筑物。
針狀體或針狀體12和薄片13均優(yōu)選為非細(xì)胞粘著性材質(zhì)?；逡矁?yōu) 選為非細(xì)胞粘著性，但當(dāng)在支持體中使用薄片13時，細(xì)胞團(tuán)不與基板11 直接接觸，因此對基板11的材質(zhì)沒有限定。術(shù)語"非細(xì)胞粘著性"是指能
9夠阻止細(xì)胞通過細(xì)胞外粘著因子附著在壁面上的性質(zhì)，涂布了賦予非細(xì)胞 粘著性機(jī)能的物質(zhì)(例如氟)的材料等具有上述性質(zhì)。在優(yōu)選的實(shí)施方式中，
線狀體或針狀體12為聚丙烯制、尼龍制或不銹鋼制。在其它優(yōu)選實(shí)施方式 中，薄片13是經(jīng)過了氟加工或聚曱基丙烯酸羥乙酯聚合物 (Polyhydroxyethylmethacrylate polymer)力。工(聚HEMA(poly-HEMA)力口工)的 薄片。本發(fā)明的線狀體或針狀體12和薄片13可以是特氟隆(注冊商標(biāo))、 poly-HEMA、丙烯酸板、氯乙烯板、ABS樹脂板、聚酯類樹脂板、聚碳酸 酯板等樹脂，PP(聚丙烯)、ABS(丙烯腈丁二烯苯乙烯)、PE(聚乙烯)、 POM(polyacetal聚縮醛)、PC(聚碳酸酯)、PEEK(聚醚醚酮)、MCN(單體流 延尼龍，monomer casting nylon)、 6N(6尼龍)、66N(66尼龍)等工程塑料。除 了這些材料以外，還可以使用降低細(xì)胞粘著性的材料，對其沒有限定。作 為上述支持體，雖然也可以考慮使用生物體吸收性材料，但如果使用生物 體吸收性材料，則會殘留分解產(chǎn)物、未溶盡的殘留物，有引發(fā)毒性的可能 性，因此優(yōu)選不是生物體吸收性材料。
上述線狀體或針狀體12是用于將細(xì)胞團(tuán)串成所謂的串兒(串刺L)狀的 棒狀體，各線狀體或針狀體的定位相互隔開間隔，所述間隔使得串起來的
細(xì)胞團(tuán)能夠與串在相鄰的線狀體或針狀體上的細(xì)胞團(tuán)接觸并發(fā)生融合。線 狀體或針狀體可以呈例如棋盤格狀規(guī)則地配置，也可以無規(guī)配置。線狀體
為細(xì)胞團(tuán)直徑的約100%~110%的長度。例如，細(xì)胞團(tuán)的直徑為lmm時，線 狀體或針狀體之間按得間隔優(yōu)選為約lmm 1.lmm。
線狀體或針狀體12的截面的直徑可以取任意值，只要不破壞細(xì)胞團(tuán)、 妨礙細(xì)胞團(tuán)的融合即可。此外，在l個實(shí)施方式中，針狀體12為圓錐體， 其中，錐體的底面與基板ll的基底面相接(圖1D)。薄片13具有孔或呈網(wǎng) 眼狀，使得配置在基板11的基底面的近似法線方向上的線狀體或針狀體能 夠穿過該薄片，能夠從基板11和線狀體或針狀體12上將薄片13取下。優(yōu) 選針狀體12為圓錐形的實(shí)施方式(圖1D)，因為能夠容易地將薄片從針狀體 取下。本發(fā)明的支持體主要是為了獲得希望形狀的細(xì)胞構(gòu)筑物，而用于在 細(xì)胞團(tuán)之間發(fā)生融合之前的臨時固定。在若干形態(tài)中，還可以在本發(fā)明的 支持體上保持細(xì)胞構(gòu)筑物，而作為臟器模擬物等使用。在這種情況下，可 以將支持體從細(xì)胞構(gòu)筑物上取下，也可以不將支持體從細(xì)胞構(gòu)筑物上取下。此外，在其它實(shí)施方式中，線狀體12也可以是例如縫合線等。優(yōu)選地， 作為該線狀體，可以使用帶針的縫合線。例如，通過將線的一端固定在基 板上、并使另一端為尖銳的形狀(例如針)，能夠更容易地將細(xì)胞團(tuán)穿在線狀 體上(圖1E)。此外，還可以將細(xì)胞團(tuán)串在線上，以拉緊狀態(tài)將線固定，從 而使細(xì)胞團(tuán)排列起來(圖1F)。還可以先將指定的多個細(xì)胞團(tuán)依次串在一端 固定于第1基板上的線上，使之呈串兒狀，然后再將用于串起細(xì)胞的線的 尖端固定在第2基板上。此外，使用相對于第1基板與第2基板之間的距 離為充分長的線，將串有細(xì)胞團(tuán)的線在第l基板與第2基板之間數(shù)次往復(fù)， 來進(jìn)行固定，使得出現(xiàn)相鄰的細(xì)胞團(tuán)能夠?qū)崿F(xiàn)接觸的間隔。
2.細(xì)月包團(tuán)
細(xì)胞大體上可分類為懸浮細(xì)胞和錨地依賴性細(xì)胞，血液類或免疫類細(xì) 胞屬于前者、皮膚、骨格等的細(xì)胞屬于后者。皮膚、骨格等的細(xì)胞如果在 培養(yǎng)液中懸浮就會死亡，其必須要附著在玻璃等平皿上才能增殖。因而， 如果在經(jīng)過特氟隆(注冊商標(biāo))加工的平板上培養(yǎng)細(xì)胞，則細(xì)胞會尋找錨地， 相互粘著連合在一起，形成細(xì)胞聚集體(凝集塊)即球狀體。進(jìn)而，如果球狀 體之間粘著融合，則球狀體會變成更大的形狀。例如，如果在非細(xì)胞粘著 性的平板上播種細(xì)胞來進(jìn)行培養(yǎng)，則細(xì)胞會自然聚集形成球狀體。到球狀 體形成為止的培養(yǎng)時間為6~24小時，優(yōu)選24 48小時。細(xì)胞團(tuán)的制作方法 并不限于上述方法，還已知有多種方法，例如向旋轉(zhuǎn)的溶液中加入細(xì)胞 懸濁液的旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法，向試管中加入細(xì)胞懸濁液、再用離心分離器進(jìn)行沉 淀的方法，或者海藻酸鹽珠法等。從能夠大量地處理和回收均質(zhì)的細(xì)胞團(tuán) 的角度來看，在防濕性、非細(xì)胞粘著性的多孔板上加入細(xì)胞懸濁液的方法 是有效率的，因而優(yōu)選。
近年來，有報告提示在間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells)向軟骨 細(xì)胞分化時，以細(xì)胞-細(xì)胞之間的粘著為開關(guān)，膠原等開始表達(dá)(YoonYM, J Cell Biochem 2002; 87(3): 342-59)。由此可以認(rèn)為通過將細(xì)胞做成球狀 體、使細(xì)胞之間發(fā)生粘著，細(xì)胞進(jìn)入細(xì)胞周期的穩(wěn)定期(靜止期)，蛋白質(zhì)的 生產(chǎn)增加。因而，為了將細(xì)胞誘導(dǎo)至蛋白質(zhì)產(chǎn)生增加的穩(wěn)定期，優(yōu)選將細(xì) 胞先做成球狀體，再形成指定的形狀。而且，先將細(xì)胞誘導(dǎo)至穩(wěn)定期再使 其分化，這稱為"細(xì)胞脫離增殖循環(huán)、進(jìn)入細(xì)胞分化"。適于球狀體的細(xì)胞是干細(xì)胞(ES細(xì)胞、臍帶血來源的細(xì)胞、未分化間充
質(zhì)干細(xì)胞等)等未分化細(xì)胞或它們的分化型細(xì)胞。成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、脂 肪細(xì)胞可以容易地由未分化間充質(zhì)干細(xì)胞分化誘導(dǎo)出來，因而，還可以使 用這些分化誘導(dǎo)細(xì)胞(關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞、骨細(xì)胞等)。此外，還可以使用成體間 充質(zhì)干細(xì)胞。因而，考慮到將本發(fā)明中制作的細(xì)胞構(gòu)筑物應(yīng)用于具有立體 形狀的組織片的生成的情況，作為這樣的立體構(gòu)建的組織，以中胚葉系的 組織為代表，可以列舉出關(guān)節(jié)軟骨、骨，以及乳房等脂肪組織，韌帶、腱、
齒、耳廓(耳介)、鼻等；而且，不僅限于中胚葉系，還可以使用肝臟、胰臟、 血管、神經(jīng)等幾乎所有的粘著細(xì)胞。此外，球狀體并非一定要以單一種類 的細(xì)胞的聚集體的形式形成，只要能形成球狀體，還可以由多個種類的細(xì) 胞來形成。使用這樣的嵌合型球狀體，也可以生產(chǎn)本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)筑物。
間充質(zhì)干細(xì)胞可以從受試動物(例如、小鼠、兔、大鼠、豚鼠、犬、豬、 羊、牛等的實(shí)驗動物)或人的骨髓中采用Dexter法、磁珠法、細(xì)胞分選法等 公知方法來釆集。此外，還可以從皮膚、皮下脂肪、肌肉組織等采集間充 質(zhì)干細(xì)胞。
3J己置細(xì)胞團(tuán)的方法
根據(jù)本發(fā)明，可以使用本發(fā)明的支持體將細(xì)胞團(tuán)配置于支持體上的任 意位置空間。因而，本發(fā)明的方法包括a)形成細(xì)胞團(tuán)的步驟、b)將形成的 細(xì)胞團(tuán)串在上述支持體的線狀體或針狀體上的步驟、和c)使該串好的細(xì)胞 團(tuán)之間接觸的步驟。在第1步驟、即形成細(xì)胞團(tuán)的步驟中，可以通過例如 向旋轉(zhuǎn)的溶液中加入細(xì)胞懸濁液來形成細(xì)胞團(tuán)。然后，將通過第1步驟形 成的細(xì)胞團(tuán)(即球狀體)串在支持體上的線狀體或針狀體上。該步驟例如可以 這樣實(shí)施將含細(xì)胞團(tuán)的移液管的尖端對準(zhǔn)針狀體的尖端，在與移液管的 尖端相反的一側(cè)施加壓力，從而擠出細(xì)胞團(tuán)(圖2A)。擠出的細(xì)胞團(tuán)穿在針 狀體上，從而被固定在指定的位置。或者，在其它實(shí)施方式中，該步驟如 下實(shí)現(xiàn)使用加載有細(xì)胞團(tuán)的小型機(jī)器人手臂，從針狀體的上部串入細(xì)胞 團(tuán)(圖2B)。此外，還可以用鑷子等將細(xì)胞團(tuán)固定住，并使用線狀體(優(yōu)選為 帶針的線)將細(xì)胞團(tuán)串起來。但是，本發(fā)明的方法不受這樣的步驟的限定。 將細(xì)胞團(tuán)串在l根線狀體或針狀體上，使得多個細(xì)胞團(tuán)之間接觸(即所謂的 米面團(tuán)子(団子)狀)(圖2C)。通過細(xì)胞團(tuán)之間的接觸，細(xì)胞團(tuán)可以在縱方向(垂
12直方向(例如Z方向))上融合。此外，對各線狀體或針狀體的位置進(jìn)行設(shè)定， 使它們的間隔能夠在將細(xì)胞團(tuán)串起來時、使其與相鄰的細(xì)胞團(tuán)接觸，因此， 在對黃方向(水平方向和纟從深方向(例如，x方向和y方向))也可以4妄觸并融合。 因而，通過這些細(xì)胞團(tuán)融合，可以在本發(fā)明的支持體上構(gòu)建由細(xì)胞構(gòu)成的 立體構(gòu)造體(圖2D)。
4. 生產(chǎn)細(xì)胞構(gòu)筑物的方法
物的生產(chǎn)可以通過回收按上述規(guī)程接觸并融合的細(xì)胞團(tuán)來實(shí)現(xiàn)。細(xì)胞團(tuán)的
回收可以通過從融合了的細(xì)胞團(tuán)上拔去支持體的步驟實(shí)現(xiàn)(圖3A)。從細(xì)胞 團(tuán)拔去支持體，可以通過從用鑷子等將細(xì)胞團(tuán)直接固定并融合而成的細(xì)胞 團(tuán)上拔去線狀體或針狀體來實(shí)現(xiàn)，或者也可以通過從支持體上取下薄片的 步驟來實(shí)現(xiàn)。取下薄片，可以通過從固定的薄片上拔去支持體來進(jìn)行，也 可以通過從固定的支持體上分離薄片來進(jìn)行。通過包括這些一 系列步驟的 方法，可以提供在空間上按所希望的那樣配置的任意形狀的細(xì)胞構(gòu)筑物(圖 3B)。
5. 細(xì)胞構(gòu)筑物
本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)筑物可以僅由同 一種類的細(xì)胞構(gòu)成，或者也可以包含 多個種類的細(xì)胞。當(dāng)在本說明書中使用時，術(shù)語"同一種類的細(xì)胞"是指單 一種類的相同組織或器官等來源的功能上等同的細(xì)胞。包含多個種類的細(xì) 胞的細(xì)胞構(gòu)筑物，可以通過將由不同異種類的細(xì)胞分別形成的細(xì)胞團(tuán)(例如， 由a細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)A與由b細(xì)胞構(gòu)成的細(xì)胞團(tuán)B)應(yīng)用于本發(fā)明的支持 體來獲得。這里，a細(xì)胞和b細(xì)胞可以是任意的細(xì)胞，只要它們的細(xì)胞團(tuán)之 間能夠融合即可。a細(xì)胞與b細(xì)胞，可以是例如不同組織(或器官)來源的同 種細(xì)胞，也可以是相同組織(或器官)來源的異種細(xì)胞，還可以是不同組織(或 器官)來源的異種細(xì)胞。在l個實(shí)施方式中，在本發(fā)明的支持體上配置成棋 盤格狀的第1列針狀體群串起細(xì)胞團(tuán)A,第2列針狀體群串起細(xì)胞團(tuán)B，并 使它們?nèi)诤希@樣可以提供由細(xì)胞團(tuán)A和細(xì)胞團(tuán)B構(gòu)成的嵌合型細(xì)胞構(gòu)筑 物(圖4A)。在進(jìn)一步的實(shí)施方式中，通過在上述的第1歹ij、第2列的基礎(chǔ) 上，第3列針狀體群串起細(xì)胞團(tuán)A、第4列針狀體群串起細(xì)胞團(tuán)B(下同)......，這樣交互地應(yīng)用兩種細(xì)胞團(tuán)，可以制作出由細(xì)胞團(tuán)A和細(xì)胞團(tuán)B交互地形 成層的構(gòu)筑物(圖4B)。此外，還可以改變串連在一根針狀體上的細(xì)胞團(tuán)的 種類(圖4C)。通過以相同的方法，將細(xì)胞團(tuán)A與細(xì)胞團(tuán)B按希望的比例應(yīng) 用于希望位置上的針狀體，可以控制嵌合狀細(xì)胞構(gòu)筑物的立體結(jié)構(gòu)的構(gòu)成。 使用的不同種類的細(xì)胞不限于2種，還可以使用3種以上的細(xì)胞。
在其它實(shí)施方式中，根據(jù)本發(fā)明的方法，可以生產(chǎn)在細(xì)胞構(gòu)筑物的內(nèi) 部具有不存在細(xì)胞的間隙空間的細(xì)胞構(gòu)筑物。該細(xì)胞構(gòu)筑物可以這樣來提 供在將細(xì)胞應(yīng)用于本發(fā)明的支持體時，并不是使全部細(xì)胞連續(xù)地接觸， 而是在針狀體上留出希望成為間隙空間的區(qū)域，而在其周圍配置細(xì)胞團(tuán)， 并進(jìn)行融合。該細(xì)胞構(gòu)筑物內(nèi)部的間隙空間可以任意地設(shè)計，但優(yōu)選可以 設(shè)計為結(jié)構(gòu)物壁面由細(xì)胞團(tuán)構(gòu)成、而其內(nèi)部為空洞的筒狀(隧道狀)形態(tài)(圖 4D)。通過將這樣的間隙空間設(shè)置在細(xì)胞構(gòu)筑物的內(nèi)部，可以通過該空間將 培養(yǎng)液中所含的營養(yǎng)成分、氧等輸送至細(xì)胞團(tuán)內(nèi)部的細(xì)胞，因而，具有間 隙空間的細(xì)胞構(gòu)筑物，在必須制作體積更大的細(xì)胞構(gòu)筑物的情況下是有利 的。
6.醫(yī)療用或?qū)嶒炗眉?xì)胞構(gòu)筑物
本發(fā)明的細(xì)胞構(gòu)筑物可以用于再生醫(yī)療用或?qū)嶒炗谩Ｈ绻褂密浌羌?xì) 胞的細(xì)胞團(tuán)來形成細(xì)胞構(gòu)筑物，則通過將該構(gòu)筑物移植到損耗的關(guān)節(jié)部、 或者因事故等原因失去的關(guān)節(jié)部，就可以用于關(guān)節(jié)的再生醫(yī)療。
除上述例子以外，現(xiàn)在包含肝細(xì)胞的球狀體的研究十分盛行。因而， 通過使用肝細(xì)胞的細(xì)胞團(tuán)來形成細(xì)胞構(gòu)筑物，形成的細(xì)胞構(gòu)筑物可以用于 肝臟的再生醫(yī)療。
但是，本發(fā)明的構(gòu)筑物并不限于上述臟器或器官，可以以希望再生醫(yī) 療的所有臟器以及器官為對象。
而且，已知對于多種細(xì)胞而言，與傳統(tǒng)的二維培養(yǎng)物相比，具有三維 結(jié)構(gòu)的球狀體能夠更好地反映體內(nèi)行為，已有報道稱使用球狀體進(jìn)行了 腫瘤-免疫細(xì)胞相互作用研究、用于藥物開發(fā)的篩選等。因而，通過本發(fā)明 生產(chǎn)的細(xì)胞構(gòu)筑物，除了代表性的在人工臟器中的應(yīng)用之外，還可以在各 種細(xì)胞測定、篩選等實(shí)驗中使用。實(shí)施例
1. 球狀體制作
對采集自兔骨盆(骨盤)的骨髓來源間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行了單層培養(yǎng)。最
終，得到了 1.0xl(^個/15cm培養(yǎng)皿的間充質(zhì)干細(xì)胞。將該細(xì)胞用胰蛋白酶 進(jìn)行處理，得到了細(xì)胞懸濁液，將其播種在住友Bakelite公司制造的球狀體 平板上，每平板加入1.0xl()S個細(xì)胞。然后，在37。C、 5%(302的條件下進(jìn)行 培養(yǎng)，于翌日制作好了直徑平均為0.3mm的細(xì)胞團(tuán)。
2. 細(xì)胞構(gòu)筑物的制作(1)
將Terumo公司制造的33G注射針(商品名Nanopath)的不銹鋼制針部分 以4根平行的方式固定在三菱WELL PHARMA公司制造的a-磷酸三鈣(卜 U ]jy酸力/l^y夕厶，tricalcium phosphate)(商品名BIOPEX R)上，制作了 支持體。在立體顯微鏡下進(jìn)行觀察，同時用尖銳的鑷子將球狀體一個一個 地串在固定于支持體上的不銹鋼制針尖上。串入后，在37。C、 5。/。C02的條 件下進(jìn)行培養(yǎng)，約2天后，可以確認(rèn)得到了細(xì)胞構(gòu)造體，所述細(xì)胞構(gòu)造體
合)(圖5)。
3. 細(xì)胞構(gòu)筑物的制作(2)
將合計9根Terumo公司制造的33G注射針(商品名Nanopath)的不銹鋼 制針部分，以3x3的棋盤格狀、間隔0.4mm的形式，沿法線方向固定在三 菱WELL PHARMA公司制造的a-磷酸三釣(商品名BIOPEX R)上，制作 了支持體。在該支持體的上表面上，使針穿透FALCON公司制造的濾膜(商 品名CELL CULTURE INSERT;聚對苯二曱酸乙二醇酯，尺寸8.0pm,商 品號353093),將該濾膜配置在針的底部。在用立體顯微鏡進(jìn)行觀察的同時， 將像上述"l.球狀體制作"一項中記載的那樣制作的球狀體(約50個)用尖銳 的鑷子一個一個地串在支持體的針上(圖6、 a)。串入后，在37。C、 5°/。C02 的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約3天后，可以確認(rèn)得到了細(xì)胞構(gòu)造體，所述細(xì)胞構(gòu) 造體中，相鄰球狀體之間在縱方向和橫方向中的任何方向上均發(fā)生了融合
(結(jié)合)(圖6、 b)。在確認(rèn)了細(xì)胞構(gòu)造體后，使用尖銳的鑷子，將預(yù)先設(shè)置在 支持體與細(xì)胞構(gòu)筑物之間的濾膜與融合的細(xì)胞構(gòu)筑物一起，從支持體上緩慢地拔去，回收了細(xì)胞構(gòu)筑物(圖6、 c)。所得細(xì)胞構(gòu)筑物是1個大融合團(tuán)塊 (直徑約3mm)(圖6、 d和e)。
4.細(xì)胞構(gòu)筑物的制作(3)
將Invitrogen公司制造的活細(xì)胞標(biāo)記用試劑盒系列的Qtracker(商品 名)655(紅色)和565(綠色)這2種分別單獨(dú)地加入間充質(zhì)干細(xì)胞，準(zhǔn)備了在熒 光顯微鏡下分別呈紅色、綠色的球狀體。
對于前述的固定有4根針的支持體，在用立體顯微鏡進(jìn)行觀察的同時， 用尖銳的鑷子將各種球狀體一個一個地、紅綠交互地串在固定于支持體的 不銹鋼制的針尖上。串入后，在37。C、 5。/。C02的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，約2天 后，可以確認(rèn)得到了細(xì)胞構(gòu)造體，所述細(xì)胞構(gòu)造體中，相鄰球狀體之間在 縱方向和橫方向中的任何方向上均發(fā)生了融合(結(jié)合)(圖7A、 a)。而且，用 熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，則可以確認(rèn)得到了具有所希望的顏色分布的細(xì)胞構(gòu) 造體(圖7A、 b)。
將合計25根Terumo公司制造的33G注射針(商品名Nanopath)的不銹 鋼制針部分，以5x5的棋盤^f各狀、間隔0.4mm的形式，沿法線方向固定在 三菱WELL PHARMA公司制造的a—磷酸三鈣(商品名BIOPEX R)上，制 作了支持體。在該支持體的上表面上，使針穿透FALCON公司制造的濾膜 (商品名CELL CULTURE INSERT;聚對苯二曱酸乙二醇酯，尺寸8.0pm， 商品號353093),將該濾膜配置在針的底部。使用該支持體，制作了以下各 種形態(tài)的細(xì)胞構(gòu)筑物(圖7B 圖7D)。
圖7B:十字圖案
制作立方體狀的細(xì)胞構(gòu)筑物，其中，將呈紅色的球狀體配置成十字狀。 圖7C:
呈現(xiàn)(,^一、^)將血管系的細(xì)胞配置在頂點(diǎn)和中心的肝臟組織(肝小葉)， 其中，在四角的頂點(diǎn)和面的中心配置呈紅色的球狀體。
圖7D:
制作立方體狀的細(xì)胞構(gòu)筑物，其中，將呈紅色的球狀體配置成十字狀。 將Terumo公司制造的33G注射針(商品名Nanopath)的不銹鋼制針部分 配置在直徑0.3毫米的圓和直徑0.7毫米的雙重同心圓上，將其固定在三菱 WELL PHARMA公司制造的a -磷酸三鉀(商品名BIOPEX R)上，制作了支持體。制作了呈雙色的(2色^ L)、內(nèi)部具有空洞的圓柱狀細(xì)胞構(gòu)造體。該細(xì)胞構(gòu)造體模仿的是內(nèi)側(cè)為血管內(nèi)皮、外側(cè)為平滑肌的血管(圖7E)。
將前述的具有十字狀圖案的雙色球狀體細(xì)胞構(gòu)造體投入液氮中，進(jìn)行瞬間冷凍。將冷凍好的構(gòu)造體制成切片，在熒光顯微鏡下觀察其截面。細(xì)胞構(gòu)造體內(nèi)部沒有配置血管，存在內(nèi)部的細(xì)胞因營養(yǎng)不足而發(fā)生細(xì)胞死亡、構(gòu)造體內(nèi)部溶解形成空洞的擔(dān)憂，但實(shí)際上，在切片觀察的范圍內(nèi)，不存在空洞，可以確認(rèn)基本上全部的細(xì)胞均是存活的(圖8)。
5.細(xì)胞構(gòu)筑物的制作(4)
截除BD FalconTM細(xì)胞濾過器(型號352360)的底面的一部分網(wǎng)眼，使截除的部分呈長方形。將細(xì)胞濾過器反轉(zhuǎn)過來，在立體顯微鏡下，將帶針的縫合線(ALFERSA PHARMA公司制造NESCO SUTURE尺寸9-0尼龍)的一端連結(jié)線固定在截好的網(wǎng)眼的端部。在用立體顯微鏡進(jìn)行觀察的同時，使用尖銳的鑷子將像上述的"l.球狀體制作"一項中記載的那樣制作的球狀體，從帶針的縫合線(9-0尼龍)的尖端(即針尖)串起來，并使3個球狀體以可融合的狀態(tài)相鄰。將線連結(jié)在最初連結(jié)上的網(wǎng)眼截斷端的相反側(cè)，同樣地串上3個球狀體，往返式地進(jìn)行，合計為3根(圖9A)。
調(diào)節(jié)線來進(jìn)行配置，使得球狀體不僅在串連的線的縱方向上可融合，而且在橫方向上各球狀體也可融合(圖9B的al和a2)。串入后，在37°C、5%C02的條件下進(jìn)行培養(yǎng)，翌日觀察到相鄰的球狀體之間開始發(fā)生融合(bl和b2)。約3天后，可以確認(rèn)得到了細(xì)胞構(gòu)造體，所述細(xì)胞構(gòu)造體中，相鄰球狀體之間在縱方向和橫方向中的任何方向上均發(fā)生了融合(結(jié)合)(cl和c2)。在確認(rèn)了細(xì)胞構(gòu)造體后，將線剪斷，在用鑷子按住細(xì)胞構(gòu)造體的同時，拉去殘留在構(gòu)造體中的線，回收了細(xì)胞構(gòu)筑物(dl和d2)。所得細(xì)胞構(gòu)筑物為1個大的融合團(tuán)塊(圖9C)。
權(quán)利要求
1.一種支持體，其用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間，該支持體具備基板，以及用于將細(xì)胞團(tuán)串起來的線狀體或針狀體。
2. 權(quán)利要求1所述的支持體，其中，所述線狀體或針狀體配置在所述 基板的近似法線方向。
3. 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其還具備覆蓋所述基板的薄片。
4. 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其中，所述線狀體或針狀體是非細(xì) 胞粘著性的。
5. 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其中，以下述間隔來設(shè)定所述線狀 體或針狀體的位置，所述間隔使得在將細(xì)胞團(tuán)串起來時，相鄰的細(xì)胞團(tuán)能夠接觸。
6. 權(quán)利要求3所述的支持體，其中，所述薄片為非細(xì)胞粘著性的。
7. 權(quán)利要求3所述的支持體，其中，所述薄片具有孔或呈網(wǎng)眼狀，使 得固定于所述基板的所述線狀體或針狀體能夠穿透該薄片。
8. 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其中，所述細(xì)胞團(tuán)為球狀體。
9. 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其中，所述針狀體為圓錐形。
10. 權(quán)利要求1或2所述的支持體，其中，所述線狀體或針狀體是聚丙 烯制、尼龍制或不銹鋼制的。
11. 權(quán)利要求3所述的支持體，其中，所述薄片為經(jīng)過了氟加工或聚曱 基丙烯酸羥乙酯加工的薄片。
12. —種用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間的方法，該方法包括a) 形成細(xì)胞團(tuán)的步驟，b) 用權(quán)利要求1所述的支持體的線狀體或針狀體將所形成的細(xì)胞團(tuán)串 起來的步驟，和c) 使該連起來的細(xì)胞團(tuán)之間彼此接觸的步驟。
13. —種生產(chǎn)細(xì)胞構(gòu)筑物的方法，該方法包括a) 形成細(xì)胞團(tuán)的步驟，b) 用權(quán)利要求1所述的支持體的線狀體或針狀體將所形成的細(xì)胞團(tuán)串起來的步驟，C)使該串起來的細(xì)胞團(tuán)之間彼此接觸的步驟，和 d)回收接觸的細(xì)胞團(tuán)的步驟。
14. 權(quán)利要求12或13所述的方法，其中，將所述細(xì)胞團(tuán)串起來，使得
15. 權(quán)利要求13所述的方法，其中，所述接觸的細(xì)胞團(tuán)的回收是通過 從融合的細(xì)胞團(tuán)上取下支持體的步驟來實(shí)現(xiàn)的。
16. 權(quán)利要求12 15中任一項所述的方法，其中，所述細(xì)胞團(tuán)為球狀體。
17. 釆用權(quán)利要求12 15中任一項所述的方法制作的細(xì)胞構(gòu)筑物。
18. 權(quán)利要求17所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，所述細(xì)胞構(gòu)筑物是由同一種類的 細(xì)月包構(gòu)成的。
19. 權(quán)利要求17所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，所述細(xì)胞構(gòu)筑物是由多個種類的 細(xì)胞構(gòu)成的。
20. 權(quán)利要求17 19中任一項所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，其用于醫(yī)療或?qū)嶒灐?br> 21. 權(quán)利要求20所述的細(xì)胞構(gòu)筑物，其用于關(guān)節(jié)的再生。
全文摘要
根據(jù)本發(fā)明，可以提供在任意的三維空間以細(xì)胞團(tuán)的形式配置各種細(xì)胞，制作僅由細(xì)胞構(gòu)成的希望形狀的立體構(gòu)造體的方法。此外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間的、具備基板和用于串起細(xì)胞團(tuán)的線狀體或針狀體的支持體。上述支持體視需要具備可取下的覆蓋基板的薄片。而且，本發(fā)明還提供使用上述支持體用于將細(xì)胞團(tuán)配置于任意的空間的方法以及生產(chǎn)立體細(xì)胞構(gòu)筑物的方法。
文檔編號C12N11/02GK101679947SQ20088001094
公開日2010年3月24日 申請日期2008年3月31日 優(yōu)先權(quán)日2007年3月30日
發(fā)明者中山功一, 古賀俊亙, 巖本幸英, 永里壯一 申請人:國立大學(xué)法人九州大學(xué)