專(zhuān)利名稱(chēng)：一種實(shí)時(shí)熒光rt-pcr檢測(cè)h5亞型禽流感病毒的試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的試劑盒，特別是涉及 以一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR反應(yīng)技術(shù)早期、快速診斷H5亞型禽流感病毒感染的試劑盒。本 試劑盒可以檢測(cè)咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的AIV-H5 。
本發(fā)明的目的是提供一種使用一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR技術(shù)來(lái)定性及定量檢測(cè)樣 品中AIV-H5的試劑盒，特別是涉及AIV-H5的早期感染在實(shí)驗(yàn)室診斷中的應(yīng)用。其基本原理 是利用一對(duì)寡核苷酸的特異性引物和一條寡聚核苷酸的特異性探針，在逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、 耐熱DNA聚合酶(Taq酶)、RNA酶抑制劑(RNasin)、高質(zhì)量的脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs) 以及Mg2+等RT-PCR反應(yīng)緩沖液中，通過(guò)DA7600、 ABI7500等市售的熒光PCR擴(kuò)增儀實(shí)現(xiàn)靶 多核苷酸的循環(huán)擴(kuò)增，從而達(dá)到快速、實(shí)時(shí)、定量檢測(cè)靶多核苷酸的目的。
本發(fā)明所提供的檢測(cè)樣品中AIV-H5的試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液(即 TRIZ0L核酸抽提試劑)、RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和定量參考品并加 蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。其特征在于 RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向引物AIV-H5-F和反向引物AIV-H5-R的序 列分別是5' -GGAGTGGATACGCTGCAGACAAAG-3' (SEQ ID NO : 1)禾P 5' -TTATTAAATTCCCTT CCAACGGCCT-3' (SEQ IDNO :2)。 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增和監(jiān) 測(cè)體系的寡核苷酸探針AIV-H5-P的序列是5' -TCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAG-3' (SEQ ID NO :3)。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液由(a)耐熱DNA聚合 酶(Taq酶)、(b)逆轉(zhuǎn)錄酶(RT酶)、(c)RNA酶抑制劑(RNasin) 、 (d)脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs) 、 (e)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結(jié)合的正向引物，(f)能夠與雙鏈靶多核 苷酸的第二條鏈結(jié)合的反向引物，(g)和能夠與靶多核苷酸結(jié)合并且兩末端分別結(jié)合有熒 光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針組成。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的最佳引物 濃度為0. 40 ii mol/L、探針濃度為0. 20 y mol/L ;
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中的鎂離子最
佳濃度為2. 0mmol/L、Taq酶最佳用量為5U/反應(yīng)、RT酶最佳用量為100U/反應(yīng)、RNasin最
佳用量為20U/反應(yīng)、脫氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)最佳濃度為0. 22mmol/L。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中用于RT-PCR擴(kuò)增的最佳反應(yīng)溫度和時(shí)
間為40。C逆轉(zhuǎn)錄25min ;然后94。C預(yù)變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個(gè)循環(huán)。 根據(jù)本發(fā)明的另 一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中陰性質(zhì)控品為生理鹽水。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中陽(yáng)性質(zhì)控品為含有擴(kuò)增目標(biāo)片段的體外
轉(zhuǎn)錄RNA，濃度為1.0X1()2個(gè)EID50。 根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案，其中定量參考品為含有擴(kuò)增目標(biāo)片段的體外 轉(zhuǎn)錄RNA，包括4個(gè)濃度梯度1. OX 106個(gè)EID50、1. OX 105個(gè)EID50、 1. 0X 104個(gè)EID50、 1. 0X1()3個(gè)EID50。 本發(fā)明提供的一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)出AIV-H5的最低濃度 為1. OX 101個(gè)EID50，說(shuō)明本試劑盒具有非常好的靈敏度。 本發(fā)明針對(duì)AIV-H5基因組保守基因片段設(shè)計(jì)特異引物和探針，可檢測(cè)出AIV-H5， 但不能檢測(cè)出非AIV-H5病原體，如新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病 毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、AIV-H7、 AIV-H9等，說(shuō)明本試劑盒具有很好的特異 性。 本發(fā)明提供的實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒可以檢測(cè)咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉 或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的AIV-H5 ;可為靈敏、快速早期診斷AIV-H5感染提供可 靠的實(shí)驗(yàn)證據(jù)；同時(shí)由于能準(zhǔn)確定量，所以可對(duì)療效進(jìn)行有效監(jiān)測(cè)。


圖1顯示線(xiàn)性與靈敏度參考品的檢測(cè)結(jié)果圖。針對(duì)模板數(shù)為1. OX 101 1. OX 107 個(gè)EID50的線(xiàn)性與靈敏度參考品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)分析，檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)病毒量 為1.0X1(^個(gè)EID50時(shí)，檢測(cè)樣品的Ct值在34左右，即檢測(cè)靈敏度可到達(dá)1.0Xl(^個(gè) EID50。 圖2顯示定量參考品擴(kuò)增結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。針對(duì)模板數(shù)為1.0X103 1.0X106 個(gè)EID50的定量參考品進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)分析，繪制得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)斜率(Slope) 為-3.6339，在Y軸截距(Interc印t)為43. 9196，相關(guān)系數(shù)的平方(R2) = 0.9984。
圖3顯示3個(gè)陽(yáng)性參考品的檢測(cè)結(jié)果圖。3個(gè)陽(yáng)性參考品的熒光擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯 指數(shù)增長(zhǎng)期，并與設(shè)定的閾值線(xiàn)有一交點(diǎn)，由交點(diǎn)所在位置得出Ct值分別為18.01、24. 87、 30. 19，可明確判定為陽(yáng)性。 圖4顯示10個(gè)陰性參考品的檢測(cè)結(jié)果圖。10個(gè)陰性參考品的擴(kuò)增曲線(xiàn)平直或斜 向下且與閾值線(xiàn)無(wú)交叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性。10個(gè)陰性參考品分別為與AIV-H5 感染有相似癥狀的8種病毒樣品(新城疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病 毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、AIV-H7、 AIV-H9)以及2份正常禽類(lèi)的咽喉拭子和 泄殖腔拭子樣品。 圖5顯示6個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本的擴(kuò)增曲線(xiàn)。6個(gè)標(biāo)本的Ct值分別是15. 26、 18. 38、 22. 35、25. 20、29. 83、30. 79，結(jié)合擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，均能夠判定為陽(yáng)性。
具體實(shí)施例方式
下列實(shí)施例旨在舉例說(shuō)明而不是限制本發(fā)明。 實(shí)施例1 :H5亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑的研制 1、引物和探針的設(shè)計(jì)通過(guò)對(duì)Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)已有的AIV-H5核酸序列以及國(guó)內(nèi)外
已發(fā)表文獻(xiàn)中報(bào)導(dǎo)的核酸序列進(jìn)行序列比對(duì)分析，以AIV-H5基因組的基質(zhì)蛋白編碼基因
(M基因)的保守片段為擴(kuò)增靶位點(diǎn)，選擇無(wú)二級(jí)結(jié)構(gòu)且高度保守的區(qū)段，根據(jù)引物探針設(shè)
計(jì)的基本原則，利用軟件，人工設(shè)計(jì)多對(duì)引物和探針。 2、樣本的選擇根據(jù)國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道表明，可以選擇咽喉拭子、泄殖腔拭子、 肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品。
3、反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化 樣品的準(zhǔn)備以病毒培養(yǎng)鑒定為陽(yáng)性的3份AIV-H5樣品作為陽(yáng)性參考品；以病 毒培養(yǎng)鑒定為陰性的10份非AIV-H5樣品作為陰性參考品，分別為8種病毒樣品(新城 疫病毒、傳染性法氏囊病毒、雞傳染性支氣管炎病毒、鴨肝炎病毒、鴨瘟病毒、小鵝瘟病毒、 AIV-H7、AIV-H9)以及2份正常禽類(lèi)的咽喉拭子和泄殖腔拭子樣品。分別用TRIZ0L提取上 述陽(yáng)性參考品與陰性參考品的RNA，待用。 引物探針的篩選以上述1中設(shè)計(jì)的多組引物探針?lè)謩e檢測(cè)上述的陽(yáng)性參考品 與陰性參考品的RNA，經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，篩選出特異性、靈敏度和重復(fù)性好的最佳引物探針組合 (如序列表中SEQ ID NO :1 SEQ ID NO :3)。 引物探針濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 0. 20 ii mol/L至0. 5 ii mol/L濃度梯度的引物和從0. 10 y mol/L至0. 5 y mol/L濃度梯度的 探針進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的引物濃度為0. 40 ii mol/L、探針濃度 為0. 20iimol/L。 Taq酶用量的優(yōu)化在25 y L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 1U(酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定 最佳的Taq酶用量為5U/反應(yīng)。 RT酶用量的優(yōu)化在25iiL反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 50U(酶單位)至400U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定 最佳的RT酶用量為100U/反應(yīng)。 RNasin用量的優(yōu)化在25y L反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從 5U (酶單位)至40U濃度梯度的酶用量/反應(yīng)進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定 最佳的RNasin用量為20U/反應(yīng)。 dNTPs濃度的優(yōu)化在反應(yīng)體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0. lmmo1/ L至0. 25mmol/L濃度梯度的dNTPs進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的 dNTPs濃度為0. 22mmol/L。 反應(yīng)溫度的優(yōu)化根據(jù)酶的活性和寡多核苷酸的長(zhǎng)度，主要對(duì)退火溫度和延伸時(shí) 間進(jìn)行了優(yōu)化，經(jīng)多次重復(fù)試驗(yàn)，最終確定最佳的反應(yīng)溫度和時(shí)間為4(TC逆轉(zhuǎn)錄25min ; 然后94。C預(yù)變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個(gè)循環(huán)。 4、靈敏度實(shí)驗(yàn)將濃度為1. 0 X 108個(gè)EID50的滅活A(yù)IV-H5培養(yǎng)上清，10倍梯度稀釋成1. 0X1()7個(gè)EID50、1. 0X1()6個(gè)EID50、1. 0X1()5個(gè)EID50、1. 0X1()4個(gè)EID50、1. 0X103 個(gè)EID50、 1. OX 102個(gè)EID50、 1. OX 101個(gè)EID50作為線(xiàn)性與靈敏度參考品，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR檢測(cè)分析，當(dāng)病毒量為1. 0X 101個(gè)EID50時(shí)，檢測(cè)樣品的Ct值在34左右，即檢測(cè)靈 敏度可到達(dá)1.0X1(^個(gè)EID50(如附圖1所示)。 5、標(biāo)本檢測(cè)以咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等作為待檢 標(biāo)本，分別用TRIZOL提取標(biāo)本的RNA后，經(jīng)上述優(yōu)化建立的核酸擴(kuò)增體系檢測(cè)，結(jié)果表明 本試劑盒可以很靈敏的檢測(cè)出臨床標(biāo)本中的AIV-H5。 實(shí)施例2 :H5亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒及其使用
1、制備包括下列組成成分的試劑盒RNA提取液(50m1/管)1管、RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)
液(20iU/管)24管、陰性質(zhì)控品aooia/管)i管、陽(yáng)性質(zhì)控品aooia/管)i管、定量
參考品(50iU/管)4管。 2、標(biāo)本采集、運(yùn)送和保存 2. 1適用樣本類(lèi)型咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等。
2. 2樣品采集與前處理(注意無(wú)菌操作) 2. 2. 1活禽樣品——取咽喉拭子、泄殖腔拭子或新鮮糞便拭子，具體采集方法如 下 1)咽喉拭子采取時(shí)要將拭子深入喉頭及上腭裂來(lái)回刮3 5次，取咽喉分泌液；
2)泄殖腔拭子將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；對(duì)于易造成損傷的小珍禽， 直接用拭子沾取適量新鮮糞便； 3)將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有1. Oml PBS的離心管中，編號(hào)備用。
2. 2. 2內(nèi)臟或肌肉樣品——用無(wú)菌鑷剪夾取待檢樣品2. Og于研缽中充分研磨，再 加10mlPBS混勻，或置于組織勻漿器中，加入10ml PBS勻漿，然后將組織懸液轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心 管中3，000rpm離心10min，取上清液轉(zhuǎn)入離心管中，編號(hào)備用。 2. 2. 3血清或血漿——用無(wú)菌注射器直接吸取(不少于400iU)至無(wú)菌離心管中， 編號(hào)備用。 2. 3保存與運(yùn)送采集或處理的樣本在2 8t:條件下保存應(yīng)不超過(guò)24h ;若需長(zhǎng) 期保存，須放置-7(TC冰箱，但應(yīng)避免反復(fù)凍融(最多凍融3次)。采集的樣品密封后，采用 保溫壺或保溫桶加冰密封，盡快運(yùn)送到實(shí)驗(yàn)室。
3、檢測(cè)步驟
(l)RNA提取 A.取N個(gè)(N = 1管陰性質(zhì)控品+待測(cè)樣本數(shù))滅菌的1. 5ml離心管，作好標(biāo)記。 B.每管分別加入600 ii 1 Trizol試劑，然后分別加入200 y 1的陰性質(zhì)控品或待測(cè)
樣品上清液(充分混勻后吸取)，充分振蕩混勻15s，室溫靜置3 5分鐘； C.每管加入200 ii 1氯仿，上下顛倒混勻10秒后，12， OOOrpm離心4分鐘; D.小心吸取無(wú)色上層液體(注意不可觸及中間絮狀層)，轉(zhuǎn)移至新滅菌的1. 5ml
離心管，然后加入lOiU RNA提取液A(充分混勻后吸取)，充分吸打混勻，8，000rpm離心1
分鐘后，小心棄去所有液體；E.加入溶液C (確認(rèn)已加入無(wú)水乙醇)800 iil，充分吸打混勻，8， OOOrpm離心1分
鐘，盡可能將液體去除干凈(避免觸及沉淀顆粒)；
F.將離心管敞開(kāi)蓋，擺在通風(fēng)櫥中風(fēng)干15分鐘(也可使用開(kāi)放式加熱器于60°C 干燥5分鐘，需防止樣本交叉污染)，然后加入30 1 DEPC H20，吸打混勻管中沉淀，得到白 色的懸濁液，可直接用于檢測(cè)，也可存于-7(TC待用。
(2) RT-PCR反應(yīng)與結(jié)果分析 分別取陰性質(zhì)控品、標(biāo)本、陽(yáng)性質(zhì)控品、定量參考品各5iU，加入PCR反應(yīng)管中 進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。RT-PCR循環(huán)條件是40。C逆轉(zhuǎn)錄25min ;然后94。C預(yù)變性3min ;最后 93°C 15s，55。C 45s，40個(gè)循環(huán)。 反應(yīng)結(jié)束后保存檢測(cè)數(shù)據(jù)文件。根據(jù)RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果所得到的曲線(xiàn)圖調(diào)節(jié)分析 參數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Std curve)窗口下的定量參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)達(dá)到最佳(即相關(guān)系數(shù)的平 方(R2) >0.97)(參見(jiàn)附圖2所示)。由附圖3可以看出，3個(gè)陽(yáng)性參考品的熒光擴(kuò)增曲線(xiàn) 有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，并與設(shè)定的閾值線(xiàn)有一交點(diǎn)，由交點(diǎn)所在位置得出Ct值分別為18.01、 24. 87、30. 19;在附圖4中，由于10個(gè)陰性參考品的擴(kuò)增曲線(xiàn)平直或斜向下且與閾值線(xiàn)無(wú)交 叉，沒(méi)有Ct值，可明確判定為陰性。最后由儀器自動(dòng)分析計(jì)算出未知標(biāo)本的測(cè)定數(shù)值。
實(shí)施例3 :應(yīng)用H5亞型禽流感病毒一步法實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒定量檢測(cè) 臨床樣品 所有實(shí)驗(yàn)過(guò)程在哈爾濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室完成，臨床樣品由哈爾 濱獸醫(yī)研究所國(guó)家禽流感參考實(shí)驗(yàn)室提供，包括咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本等 樣品類(lèi)型；標(biāo)本RNA提取、RT-PCR反應(yīng)與結(jié)果分析參照實(shí)施例2進(jìn)行。
RT-PCR反應(yīng)結(jié)束后，根據(jù)擴(kuò)增曲線(xiàn)先調(diào)節(jié)分析參數(shù)，使標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)(Std curve)窗 口下的定量參考品標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)達(dá)到最佳(即相關(guān)系數(shù)的平方(R2) >0.97)，然后分析臨床樣 品。臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果如附圖5所示6個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo)本擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct值分別是15.26、 18. 38、22. 35、25. 20、29. 83、30. 79，結(jié)合擴(kuò)增曲線(xiàn)有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，均能夠判定為陽(yáng)性； 參照同一次試驗(yàn)中定量參考品的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖(如附圖2所示)可以判定6個(gè)臨床陽(yáng)性標(biāo) 本的AIV-H5濃度分別為7. 70X 107個(gè)EID50、1. 06X 107個(gè)EID50、8. 60X 105個(gè)EID50、 1. 42X 105個(gè)EID50、7. 52X 103個(gè)EID50、4. 10X 103個(gè)EID50。序列表〈110〉中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司〈120〉 一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)H5亞型禽流感病毒的試劑盒〈140〉〈141〉〈160>3〈210>1〈211>24〈212>DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物?！?00>1ggagtggatacgctgcagacaaag
〈210>2 〈211>25 〈212〉DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的引物。 〈400>2 ttattaaattcccttccaacggcct 〈210>3 〈211>32 <212>DNA 〈213〉人工序列 〈220〉 〈223〉根據(jù)特定核苷酸序列設(shè)計(jì)，以用作PCR擴(kuò)增的探針。 〈400>3 tcaactcgatcattgacaaaatgaacactcag
權(quán)利要求
一種檢測(cè)樣品中H5亞型禽流感病毒存在的試劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有RNA提取液、RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液、陰性質(zhì)控品、陽(yáng)性質(zhì)控品和定量參考品并加蓋密封的多個(gè)試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒，其中RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液包括耐熱DNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、脫氧核糖核苷三磷酸、正向引物、反向引物，兩末端分別結(jié)合有熒光報(bào)告基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)的寡核苷酸探針，其特征在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中用于靶多核苷酸擴(kuò)增的正向和反向引物的序列分別為正向引物AIV-H5-F5’-GGAGTGGATACGCTGCAGACAAAG-3’；反向引物AIV-H5-R5’-TTATTAAATTCCCTTCCAACGGCCT-3’。
2. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中所使用的寡核苷酸探 針AIV-H5-P的序列為5， -TCAACTCGATCATTGACAAAATGAACACTCAG-3，。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中正向引物濃度為 0. 40 ii mol/L、反向引物濃度為0. 40 y mol/L、寡核苷酸探針濃度為0. 20 y mol/L。
4. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中耐熱DNA聚合酶的濃 度為5U/反應(yīng)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中逆轉(zhuǎn)錄酶的濃度為 100U/反應(yīng)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中RNA酶抑制劑的濃度 為20U/反應(yīng)。
7. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)液中脫氧核糖核苷三磷酸 (dNTPs)的濃度為0. 22mmol/L。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1的試劑盒，其特征還在于用于RT-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)溫度和時(shí)間為 40。C逆轉(zhuǎn)錄25min ;然后94。C預(yù)變性3min ;最后93°C 15s，55。C 45s，40個(gè)循環(huán)。
9. 根據(jù)權(quán)利要求l的試劑盒，其特征還在于所檢測(cè)的樣品可選自但不局限于咽喉拭 子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種實(shí)時(shí)熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，特別是涉及以一步法實(shí)時(shí)熒光逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)早期、快速診斷H5亞型禽流感病毒感染的試劑盒。本試劑盒具有很高的靈敏度和特異性，通過(guò)本發(fā)明的試劑盒實(shí)現(xiàn)對(duì)咽喉拭子、泄殖腔拭子、肌肉或臟器樣本、血清或血漿等樣品中的H5亞型禽流感病毒的快速早期檢測(cè)和定量分析。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101736090SQ200810218939
公開(kāi)日2010年6月16日 申請(qǐng)日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2008年11月7日
發(fā)明者何蘊(yùn)韶, 李明, 李 杰, 王秋泉, 程鋼, 胡守旺, 鄧中平, 高秀潔 申請(qǐng)人:中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司