專利名稱：淋巴囊腫病毒的快速檢測試劑盒及其檢測方法
淋巴劉中病毒的鵬檢測試劑敲微測方法
獄領域
本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物病原的檢測技術，具體是一種，環(huán)介導等溫擴增技術對: #巴劉中病 行鵬檢測的縱i戯微測施。 背景獄
淋巴劍中病毒(Lymphocystis disease virus，簡稱LCDV)屬于SE0病毒科，淋巴戴中病毒屬，可感 染9目34科計140種以上M,是對^^危害較為嚴重的病毒病之一，M^率達80%，死亡率達30%。 患病魚在口唇、鰓、鰭、M^體表等處散布大小不一的單個^^糊腫瘤，失去商品價值。淋巴劐中病 毒給7JC產(chǎn)f^lk帶來巨大的損失，同時嚴驟響經(jīng)、^&類的進出口貿易。屮國國家質量監(jiān)督檢驗檢疾總 局與韓國海洋7R^于2005年發(fā)布的《中韓進出口活水生-搬驗^S協(xié)議》中規(guī)定，中國出口到韓國 的艫魚、真鯛、大,平、牙辨^^i、鵬灘巴劐中病毒的檢驗驗。
目前魚魏毒的檢測方法主要包括鄰胞學診斷技術、敏學診斷技術、肝生物學診斷駄三大類。 細胞學珍斷技術主要包括細細胞土^#分離病毒、組織滴理切片及電^U察，其樹1^J貞，檢測周期長， 且靈S^低；免疫學診斷技術主要包括免疫熒光樹則、免疫點雜交，其方法具^t寺異性強、敏感性高的 優(yōu)點，但方法相當繁瑣，不適宜對大量樣品進行檢測；OT生物學診斷技術主要包括聚合^^反應 (PCR)，比較|^1、靈敏，但虔需要昂貴的PCR儀器，另外需要瓊脂撒 電泳，溴化乙錠^fe^察 結果，溴化乙錠^5fe^物，對人體和環(huán)境有危害，交叉污染問題比S^重。
7jc產(chǎn)辭直業(yè)和國p示魚類貿易的am切需要^:'腿、靈敏、M盼淋巴戴中病毒的檢測方法，打 破國夕hfe^H^，為國家貿易服務。環(huán)介導^ST增(Loop"Mediated Isothermal Amplification,簡稱LAMP) 技術，是一種敏感性高、特異性強的耙DNA tfei檢測方法，不需要品貴的儀器，樣品中含有少量的病
原就能檢出。環(huán)介導等顯擴增目前已lferSMB于檢測水產(chǎn)動物的病原體，如 的魚1#血;1 ^毒、傳
染幽^ffii^i毒；X獨下的病毒白斑纟^^鶴毒、黃 毒；細菌中的遲鈍愛德華氏菌等。據(jù)1t^',目
前尚未JAL^環(huán)介導等顯擴增技術對淋巴劉中病^t行'l3fai檢測的M。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的^lf共一種禾,環(huán)介導^^擴增技^^則淋巴翻屮病毒的檢測l敘iJ盒，3^艮現(xiàn)有技術 的不足，以滿足i貼鄰PRt^測的要求。
本發(fā)明的另一目的^if共^^淋巴劉中病毒的檢測方法，以方便在水產(chǎn)^5fclk和國際錢貿易屮對
淋巴劐巾病wai行t^i樹則中的鵬。
本發(fā)明的主要原理為LAMP技術是使核酸Mii在^a環(huán)境中的循環(huán)置銜廣增實J!X揭E^列的放 大，從而游l臉測的目的?；?^醉是針對鵬因的6個區(qū)域，設計2)(#寺異性引物，同時可以設計l-2 條環(huán)引物以加快反應速度，利用一種鏈置換脫氧核糖核酸聚合酶(Bacillus stearothemiopMus DNA pdyme跳簡稱BstDNA聚娜)，在直溫65。C左右鵬lh。 Bst DNA聚^f兩娥性一是具有 5'-3'聚合酶活性，能在恒溫狀態(tài)下擴增DNA核酸；二是BstDNA聚合酶具有l(wèi)ia換活性，肖剖冬新合成的核酸單!i^人新M的DNA雙鏈上置^(代)卜'來，形成兩條^&的核酸單鏈以開啟下1的DNA核 齢成，進而免去了每MT增前的DNA變性環(huán)節(jié)。LAMPSJSa程中， 一對弓胸的5'端含有一段與 下鄉(xiāng)增產(chǎn)物互補的窮K，因此，劍弓嫩的單飽^物就可形成-個類似咂鈴狀的回文結構，這種結構 !B子為下一^^溫H^r增反/^t共了一個可棚而fl^,用,嫩，BstDNA聚^SI^fIIB換活性， 后階段退火的引物置換前面引物所形成的鏈，從而保證了擴增的持續(xù)進行。LAMP切iZ^成一系列不RI 長度的具^^環(huán)結構的DNA產(chǎn)物，可以fflil熒^^料進行檢測。 本發(fā)明的技術方案如下
淋巴劉中病毒的環(huán)介導^a擴增快速檢測淑U盒，包括提供^SiMl、須的BstDNA聚儒、逆轉錄酶、 反應緩沖液、環(huán)介導等溫擴增混合液、引物混合液和熒艦色劑，以及鵬一種f柳該試齊隱檢測魚類 樣品中淋巴劐中病毒的方法，以實iPt淋巴劐中病毒^I檢測的杏^l化，為fe^淋巴劐中病毒的機則提 供一種快速、簡便、齡效、實用的檢測方法。
本發(fā)明盼淋巴劐巾病毐的環(huán)介導等顯擴增|^1檢》繊1」盒的配方如下
試劑A: BstDNA聚儒，每^L含8個活性單位(8U4iL);
i敘UB:鵬緩沖液，提供Bst腿聚娜辦作用所必須的物質，其中含有200畫J/Lp腦的 三羥基甲基 甲^^ (Tris-HCl)、 10Ommol/L氯化鉀(KC1)、 100mmoVL硫自((NH4)zS04)、 20mmol/L硫,(MgS04)禾口l^曲f頓X-100 (TritonX-100);
i敘化環(huán)介導^U擴增混合液，其中含有2.(M.0pL2.5mmol/LdNTP、 2.0"5.0pL1.6mo]/L甜麵 禾口 3.0-10.0 pL ^"子生物學MM7K;
縱IJD:引tr混合液，其屮含有0.8-2.0mL 10Mmol/L正向內引物、0.8-2.0^L10Mmol/L反向內弓l物、 0.2-0.5[iL 10 pmol/L正向夕卜弓|物、0.2-0.5mL 10 |jmol/L反向外弓l物和0.5-1.010 pmol/L環(huán)弓l物；其中弓I
物序列分別如下
正向內'j l物5'-ACCGAAAAAAAGGATnTAATGGCArnTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3'; 反向內引物5'-CCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGATnTGATCAGCAGCAATACCCG-3'; iK向外弓物5'- ACAAACAGCACCTAAACATG -3'; 反向外引物5'-CGAGCACTATnTCATAAACCAA-3'; 環(huán)弓l物5'《GGTGGAATTGCTAGCGA-3'。
試劑E:熒腿色劑，成分為100x的熒光染料SYBRGREENI。
上面所述的試劑C的最f鋮分為3攀2.5誦l/LdNTP、 4.0pL 1.6mol/L甜^Wl 6攀針生物 學鄉(xiāng)餘
上面所述的試劑D的最{f減分為:0.8 mL 10 Mmol/L正向內弓卿、0.8|jL 10 pmol/L反向內弓胸、0.2 10 Mmol/L正向外弓胸、0.2 joL 10pmol/L反向外弓胸和0.5 ^iL 10 jjmol/L環(huán)3胸。 利用J^淋巴劐中病毒的LAMP 'I^S樹則試劑盒的樹則方法如下 (1)待檢樣品的DNA的提取
用商業(yè)化的試劑盒^^傳統(tǒng)的方^^取待檢樣品的DNA，用核^^析儀測定DNA的OEWOD2so， 保證雜1.7-2.0范圍內，調整其^M 50-500n^iL之間。(2) 進斤淋巴劐中病毒的環(huán)介導等顯擴增反應
首先取一個0,2mL的聚丙烯塑料管，加入1-5ML的步驟(1)提取的待測樣品的DNA，再力PAlnL i敘UA、 2.5-5.0mL i式劑b、 7.0-19.0 pL試劑C和2.5-6.0 fjL試劑D,使得鵬總#|只為25^iL。其中弓l 物序列分別如下
正向內引物5'-ACCGAAAAAAAGGATnTAATGGCATnTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3'; 反向內引物5'- CCAGTrcrrCTCCTGTAATCnTGATnTGATCAGCAGCAATACCCG -3'; 正向外引物5'-ACAAACAGCACCTAAACATG-3'; 反向外引物5'-CGAGCACTATnTCATAAACCAA-3'; 環(huán)引物5'"CGGTGGAATTGCTAGCGA-3'。
將說塑料管置于60-65t:的瞎^7K^^中，力燈40^60min進fi^介導等顯擴增鵬；之后將水溫 再調到80-95'C，方燈3-5min以終止及應，取出含擴增產(chǎn)物的塑料管待檢。
(3) 擴增產(chǎn),的檢測
在步驟(2)的待檢塑料管中力U入lnL試劑E，混合均勻，肉鵬見察^4勿的Mfe。，如果為《絶，則 判定待檢樣品含裙林巴劐中病毒，如果為驗，貝鵬定待檢樣品不含有淋巴劉中病毒。 與現(xiàn)有^B比，本發(fā)明的有^llfe括
第一，本發(fā)明不需要,的儀器，不需^jt^劑，只需一(I^MM能反應，能滿忠見場及,
測的要求，操作簡單簡便。第二，本發(fā)明包括DNA提取、環(huán)介導等顯擴增鵬、；^t^測3^1程， 在不到3小時內即可完成，^iJ時間短。第三，本發(fā)明的擴增模板可僅為10拷貝甚至更少，產(chǎn)量可達到
109-101()個拷貝，靈敏變高。第四，本發(fā)明擴增iem列的六個區(qū)段，并_^^六個區(qū)段的川^^也有規(guī)定，因
此具有高度特異性。第五，本發(fā)明的LAMP附廣增產(chǎn)物可以與熒光染料結合，肉目歐見察就可以進4離果 判定，簡便高效。
Tffi結合具體實施例對本發(fā)明做進一步的詳細說明，但不作為對本發(fā)明的限制。 織例l
按照下列配方制悄林巴麵歸的環(huán)介導等W增鵬檢測試齊瞼。 微!JA: l攀BstDNA聚娜(8U批)；
淑JB: 2.5^iL鵬緩沖液，其中含有200mmol/LpH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCl)、 10Ommol/L氯化鉀(KC1)、 100mmol/L硫l^安((NH4》S04)、 20mmol/L硫麟(MgS04)和1%曲拉 通X-IOO (TritonX-謂)；
試劑C:環(huán)介導^^顯擴增混合液，其中含有2.0 pL2.5 mmol/LdNTP、 3.0 pL 1.6mol/L舌旨^T礙口 10.0 舒生物學^S^toK，共計15.0pL。
試劑D:引牧r混^^液，其中含有1.0(aL10MmoI/L正向內引物、1.0|jL10^imol/L反向內引物、0.5^L 10Mmol/L正向夕卜弓W勿、0.5pL10ijmol/L反向夕卜弓l物和0.5ML10Mmol/L環(huán)弓lt/， ^^十3.5mL。其中弓l物
序列分別如下
正向內弓吻5'-ACCGAAAAAAAGGATnTAATGGCATnTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3'，反向內弓l物5'- CCAGTrCTrCTCCTGTAArcnTGATnTGArCAGCAGCAATACCCG -3'， 正向外弓l物5'-ACAAACAGCACCTAAACATG隱3'， 反向外引物5'-CGAGCACTATnTCATAAACCAA-3'， 環(huán)引物 5'《GGTGGAATTGCTAGCGA-3'。
淑IJE: 1.0^熒艦色齊lj，成分為100x的熒光染料SYBR GREEN I。
按照以下辦進行翻
G) 待檢樣品DNA的提恥
待檢樣品為某#51場謝^^染淋巴觀中病的3^平，體表和鰭m，腹部膨脹，內有膨K。 ^^^S^物:r^呈公司的核^l取淑iJ盒(UniversalGenomicDNAExtractionKitVer.3.0)，按照說 明書進行樣品DNA的提取。具體步驟為取50mg的動物組織J(AS敝集管中，力口入350pL的溶液A和 0.9的RNase Al后用研磨棒I^S研磨成勻漿，65。C保溫5併中。力口入400nL的溶液B，振蕩混合。 加入1 ml的4。C預冷的溶液C，充分混勻后，ipm離心2 5>1中。棄去JlMWmt目，再加入1 ml 的4。C預冷的溶液C，充分混勻后，12,000 ipm離心2化鐘。棄去上MW機相，然后將*#溶液(趙 下層)轉移至置于收集管上的過濾管中，12,000 ipm離心1併中。棄過濾管，在濾液中加入4(X^L的 DB緩沖液，混合均勻。將試齊隱中的Spin Column安置于 管上。將±^作中混合溶 ^至Spin Column中，12,000rpm離心l併巾，棄濾液。加入500ijL的RinseA， 12,000rpm離心30秒，棄濾液。 加入700pL的Rinse B， 12,000 ipm離心30秒，棄濾液。將Spin Column安置于新的1.5 ml的離心管上， 在Spin Column膜的中央處加入50 200mL的分子生物學M^屯水，室溫靜置1 ->1中。12,000 ipm離心1 化沐即得到3W樣品的DNA。用核M^析儀測^3W樣品的DNA， ODW OD28o為1.8，濃度為100
(2) 進fi鄰巴顯中病毒的環(huán)介導離擴增鵬
首先取一個0,2mL的聚丙烯塑料管，力口入步驟(1)提取的3^樣品的DNA3.0ML，再加入lpL試 劑A、 2.5 mL試劑B、 15.0^試劑C禾tB.5ML試劑d，鵬總^I只為25^L。調節(jié)水滯咼^^^至60。C， 將i^塑料管于其中方燈30min以進行鄰介導幾點廣增鵬，之后將水溫再調到8(TC，放置3min以終 止i^Z，取出含擴增;^勿的塑料管待檢。
(3) 擴增產(chǎn)物的檢測
在步驟(2)的待檢塑料管中力口入lpL^^E，混合均勻，柳歐見察產(chǎn)物的鵬。鵬&物鵬為 鄉(xiāng)tfe，據(jù)此判定待檢樣品 中含有淋巴戴中病毒。 鄉(xiāng)例2
按照下列配方制作、淋巴劐中病毒的環(huán)介導難江擴增鵬檢測翩盒。
試劑A:同鄉(xiāng)例l。
i敘UB: 5.0nL反應緩沖液，成分同實施例l。
試劑C:環(huán)介導^^擴增混合液，其中含有3.0pL2.5mmol/LdNTP、4.0ML1.6mol/L甜^f戯口6.0pL 好生物學繊fcK，共計13攀。
i敘UD:引物混合液，其中含有0.8nL10pmol/L正向內引物、0.8pL10pmol/L反向內引物、0.2pL10nmol/L正向外引物、0.2nL10Mmol/L反向外引物和0.5nL10nmol/L環(huán)引物，共計25ijL。其中引物 序列同實施例l。
試劑E:同實施例l。 按照以下辦進行檢測
(1) 樣品DNA的提取 樣品為M^國進口的大^g科羊品，夕卜觀正常。
利用傳統(tǒng)的方艦行大^F樣品的DNA的提取，參照好克隆實驗指南(第二版)。具體為取50 mg 大^IWBMa織，加入600mL分離緩沖液a0mmol/LpH7.4的三P逮甲基魏甲烷—鹽酸,10mmol/L氯 化鈉，25mmol/L乙二胺四乙酸)，研磨后，力口入60^10%十二烷基磺,，混勻，力口入50ML10mg/ml 蛋白酶K， 37。C保溫2小時，憩賂液澄清。加入^^只酚氯仿:異戊醇(25:24:1 )抽提，待分層后，3000ipm 離心5溯。^Jb層7j^目至干凈的離心管中，力口入l/0^^只的3mol/L的醋,及2倍^f只的^K乙醇， 顛倒混合，-20°C^j[ ^N、al1J]^DNA。之后10000 rpm離心15 ^H中，倒 體，用70%乙||^先滌沉淀， 千/蹄溶解于30mL肝生物學MM7K中。用核酸分析儀測定OIWOD28o為1.9，鵬為50ng/pL。
(2) 進fr淋巴翻中病毒的環(huán)介導織擴增鵬
首先取—個0.21111的聚丙稀塑料管，力口入步驟(1)提鵬大^m羊品的DNA3.5pL，再加入lpL
i凝U a、 5.0 mL試劑b、 13.0 (jL試劑c和2.5 試劑d， M/^總4^只為25&。調節(jié)水滯咼的觀tM恒 ^7K浴65。C，將，塑料管方JS其中50min以進行環(huán)介導^^擴增H/免之后將7jC溫調到85。c，方燈 3min以終止反應，取出含擴增汽勿的塑料徵寺檢。
(3) 擴增,的檢測
在步驟(2)的待M料管中力口入&Li敘UE,混合均勻，肉目歐見察產(chǎn)物的0;色。切5^物顏色為 m，據(jù)此判定待檢樣品大,中不含有淋巴ftH中病毒。 鄉(xiāng)例3
按照同實施例2的配方制很林巴,中病毒的環(huán)介導^^擴增'I^I檢測淑!J盒。 按照以下辦進朽穩(wěn)
(1) 樣品DNA的提取 樣品為某銜直場采集的艫魚，夕卜miE常。
取50 mg艫MilM且織，樣品的DNA的提取方法同^M例2。用核^^析儀測定艫魚樣品的DNA ODWOD2so為1.8，濃度為70ng/pL。
(2) 進斤淋巴劐中病毒的環(huán)介導離擴增鵬
取一個0.2mL的聚丙烯塑料管，力口A^驟(1)提取的艫魚樣品的DNA3.5^， 1F加入的其它反 艦分及鵬斜牛同鄉(xiāng)例2。
(3) 擴增產(chǎn)物的翻!l
在步驟(2)的待,料管中力口入lML試劑E，混合均勻，卿歐je察產(chǎn)物的顏色。^Z產(chǎn)物鵬為 gfe，據(jù)此判定待檢樣品艫魚中不含有淋巴戴中病毒。
7核苷酸序列表
<110>山東出入境檢驗^SM檢驗^^駄中心 <120>淋巴,中病毒的tfel檢測試布皿^^則方法 <160> 5
<210> 1 <211> 52 〈12> DNA <213> AXj^列 <220>
<221> primer一bind <222> (1)...(52)
<223> t鵬環(huán)介導^a擴增sj應要求設計，用于擴增淋巴劐中病毒的正向內引物。
<400> 1
accgaaaaaaaggattttaatggcattttacctctaactattccaagtccta 52 <210> 2 《1> 47 <212> DNA 《3> AX序列 <220>
<221> primer一bind <222> (1)…(47)
<223>根據(jù)環(huán)介導等溫擴增鵬要求設計，用于擴增淋巴-劐中病毒的反向內引物。 <400> 2
ccagttcttc tectgtaatc tttgattttgatoagcagcaatacccg 47
《10> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> AU宇列 <220>
<221> primer—bind<222> (1)."(20)
<223>根據(jù)環(huán)介導紫顯擴增閱應要求設計，用于擴增淋巴劐中病毒的正向外引物。 <400> 3
acaaacagcacctaaacatg 20
<210> 4
<211> 23
々12> DNA
<213> AX/^列 <220>
<222> (1)…(23)
<223> ISg環(huán)介導等溫擴增SiS要求設計，用于擴增淋巴劐中病毒的反向夕卜引物。
<400> 4
cgagcactat tttcataaac caa 23
<210> 5 〈11> 18 <212> DNA <213> Aim列 <220>
<221> primer—bind <222> (1)...(18)
々23>根據(jù)環(huán)介導等顯擴增切立要求設計，用于擴潛淋巴劐中病毒的環(huán)引物。 <400> 5
cgg^gaattgctagcga 18
權利要求
1.一種淋巴囊腫病毒的快速檢測試劑盒，其特征在于試劑盒中包括試劑A-E試劑ABst DNA聚合酶，8U/μL；試劑B反應緩沖液，其中含有200mmol/L pH8.8的三羥基甲基氨基甲烷-鹽酸、100mmol/L氯化鉀、100mmol/L硫酸銨、20mmol/L硫酸鎂和1％曲拉通X-100；試劑C環(huán)介導等溫擴增混合液，其中含有2.0-4.0μL 2.5mmol/L dNTP、2.0-5.0μL 1.6mol/L甜菜堿和3.0-10.0μL分子生物學級超純水；試劑D引物混合液，其中含有0.8-2.0μL 10μmol/L正向內引物、0.8-2.0μL 10μmol/L反向內引物、0.2-0.5μL 10μmol/L正向外引物、0.2-0.5μL 10μmol/L反向外引物、0.5-1.0μL 10μmol/L環(huán)引物；其中各引物序列如下正向內引物5′-ACCGAAAAAAAGGATTTTAATGGCATTTTACCTCTAACTATTCCAAGTCCTA-3′；反向內引物5′-CCAGTTCTTCTCCTGTAATCTTTGATTTTGATCAGCAGCAATACCCG-3′；正向外引物5′-ACAAACAGCACCTAAACATG-3′；反向外引物5′-CGAGCACTATTTTCATAAACCAA-3′；環(huán)引物5′-CGGTGGAATTGCTAGCGA-3′；試劑E熒光顯色劑，成分為100×的熒光染料SYBR GREENI。
2.湖權利要求1中臓盼鵬檢測i敘,行淋巴,病毒的樹則施，辦征在于檢W辦口下(1) 待檢樣品的DNA的提取提取待檢樣品的DNA，其中提取的樣品DNA OEW OD2so在1.7-2.0范圍內，鵬在50-500 ng/pL 之間；(2) 進斤淋巴劐中病毒的環(huán)介導^a擴增a^首先取一個0.2 mL的聚丙烯塑料管，力口A^驟(1)提取的待測樣品的DNA l-5^L，再加入1 pL 淑!JA， 2.5-5.0mL反j^!沖液，7.(M9.0ML試劑C， 2.5mL試劑d。然后將塑料管置于60-65。C的恒 船jc辦咼中，方燈30"60min;之后將水溫調到80-95°C，方爐3-5min以終ih&iSL取出含擴增，的塑 料管待檢。(3) 擴增，的檢測在步驟(2)的待;^M料管中加入lnLi敘UE，混合均勻，肉目歐見察J^的Mfe，如果為纟絶，則 判定待檢樣品含有淋巴戴中病毒，如果為m，貝,定待檢樣品不含有淋巴戴中病毒。
全文摘要
本發(fā)明公開一種淋巴囊腫病毒的快速檢測試劑盒及其檢測方法。本發(fā)明包括由Bst DNA聚合酶、反應緩沖液、環(huán)介導等溫擴增混合液、引物混合液和熒光顯色劑共5種試劑組成的試劑盒，以及使用該試劑盒檢測魚類樣品中淋巴囊腫病毒的一套檢測操作程序，以實現(xiàn)對淋巴囊腫病毒快速檢測的標準化，為魚類的健康養(yǎng)殖和國際魚類貿易的發(fā)展提供科學依據(jù)。本發(fā)明具有特異性好、靈敏度高、操作簡便、高效等優(yōu)點，可廣泛的應用于水產(chǎn)養(yǎng)殖場以及進出口魚類貿易中的現(xiàn)場即時檢測，并可以為相關基礎研究提供技術支持，具有廣泛應用前景。
文檔編號C12Q1/68GK101550456SQ200810160300
公開日2009年10月7日 申請日期2008年11月19日 優(yōu)先權日2008年11月19日
發(fā)明者岳志芹, 健 張, 朱來華, 瓊 李, 梁成珠, 肖西志, 賈俊濤, 巍 趙, 辛學謙, 鄧明俊, 鄭小龍, 曉 陳 申請人:山東出入境檢驗檢疫局檢驗檢疫技術中心