專利名稱：一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高靈芝三萜產(chǎn)量的發(fā) 酵工藝。
背景技術(shù)：
靈芝(C^"wfem"/w/^^)是我國著名的藥用真菌。由于它能預(yù)防和
治療許多疾病，在古代曾被稱為"仙草"?！吨腥A人民共和國藥典》規(guī)定，赤
芝(Gawocfemw/wcWw附)禾口紫芝(Gawocfenw" 為靈芝正品。近年
來包括我國在內(nèi)的東南亞國家以及美國和加拿大的許多學(xué)者對(duì)靈芝進(jìn)行 了深入的研究，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明，靈芝的關(guān)鍵藥效成分是靈芝多糖和 靈芝三萜。其中靈芝三萜具有消炎止痛、鎮(zhèn)靜、解毒、保肝、抗艾滋病病 毒、抗腫瘤等功能，是靈芝發(fā)揮藥效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)。
現(xiàn)階段，靈芝菌體及其關(guān)鍵藥效成分的產(chǎn)量成為阻礙靈芝產(chǎn)品應(yīng)用的 瓶頸。由于野生靈芝稀少，而傳統(tǒng)的栽培方法周期長，產(chǎn)量遠(yuǎn)不能滿足市 場需要。由于液體深層發(fā)酵技術(shù)生產(chǎn)靈芝具有生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品活性物質(zhì) 與野生靈芝基本一致等特點(diǎn)，目前已成為獲取靈芝及其活性物質(zhì)的最有效 方法。近年來，靈芝的液體發(fā)酵技術(shù)取得了很大進(jìn)展，但如何進(jìn)一步提高 靈芝菌體或關(guān)鍵藥效成分的產(chǎn)量以降低生產(chǎn)成本、提高經(jīng)濟(jì)效益，已成為 加快靈芝產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程亟待解決的問題。
靈芝的關(guān)鍵藥效成分一靈芝三萜的發(fā)酵技術(shù)主要分為兩大類，第一類 主要是通過對(duì)靈芝發(fā)酵基質(zhì)和發(fā)酵過程的優(yōu)化，如優(yōu)化培養(yǎng)基組成、優(yōu)化 發(fā)酵過程參數(shù)，或采用補(bǔ)料-分批發(fā)酵等策略來提高靈芝三萜的產(chǎn)量，如
文獻(xiàn)李平作，徐柔，夏結(jié)紅，章克昌.靈芝深層發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán)三萜酸
的研究.工業(yè)微生物,2000， 30 (1): 15-17。報(bào)道了一種深層發(fā)酵生產(chǎn)四環(huán) 三萜酸的基本工藝，但四環(huán)三萜酸的產(chǎn)量較低。
文獻(xiàn)Tang YJ, Zhong JJ. Fed隱batch fermentation of /wcz't/wm for hyperproduction of polysaccharide and anoderic acid. Enzyme and Microbial Technology,2002，31:20-28。報(bào)道了一種采用補(bǔ)加乳糖的流加發(fā)酵 方法，得到靈芝酸(靈芝三萜)的產(chǎn)量為297.9-367.1mg/L。
中國專利鐘建江等，申請?zhí)?0111953.2提出了液體發(fā)酵法同時(shí)生產(chǎn) 靈芝多糖和靈芝三萜的技術(shù)。采用液體好氧發(fā)酵、液體好氧發(fā)酵-靜置培養(yǎng)、 或液體靜置培養(yǎng)的發(fā)酵方法，其生產(chǎn)的靈芝菌體中的靈芝酸(靈芝三萜) 含量可達(dá)2.8mg/100mg。該技術(shù)的發(fā)酵策略較好，產(chǎn)量也可以提高，但缺 點(diǎn)是靈芝三萜的發(fā)酵周期太長，液體好氧發(fā)酵加上靜置培養(yǎng)的總發(fā)酵時(shí)間 超過了20天，而一般靈芝產(chǎn)品的發(fā)酵時(shí)間為4-8天，因此其整體生產(chǎn)效率 較低。
另一類是在發(fā)酵工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過添加外源物質(zhì)來促進(jìn)靈芝三 蔽的生物合成，從而提高靈芝三萜的產(chǎn)量。如
文獻(xiàn)王玉紅,丁重陽，章克昌，徐柔.苦蕎對(duì)靈芝發(fā)酵生產(chǎn)靈芝酸的 影響.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003,29 (9): 97-99。報(bào)道了添加中藥苦蕎后，靈 芝酸(靈芝三萜)的產(chǎn)量有所提高，其發(fā)酵液中靈芝酸的最高產(chǎn)量為 310mg/L。文獻(xiàn)劉高強(qiáng)，丁重陽，章克昌.蜣螂對(duì)靈芝發(fā)酵菌絲體生長和三 萜產(chǎn)物形成的影響.菌物學(xué)報(bào),2008,27(5).報(bào)道了添加昆蟲蜣螂后，靈芝三 萜的產(chǎn)量有所提高，其發(fā)酵液中三萜(胞外三萜)的最高產(chǎn)量為304.3 mg/L。 以上方法雖能使靈芝三萜產(chǎn)量有所提高，但中藥的成本較高，且存在毒副 作用方面的隱患。
我們通過大量的篩選實(shí)驗(yàn)，找到了一種能顯著提高靈芝三萜產(chǎn)量的外 源添加物質(zhì)，同時(shí)對(duì)發(fā)酵策略及液體培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，形成了一種
能顯著提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量、且生產(chǎn)工藝簡單的靈芝三萜生產(chǎn) 工藝。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有靈芝三萜發(fā)酵技術(shù)存在的種種不足，提供 一種能顯著提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量、且生產(chǎn)工藝簡單、添加物成 本低廉、發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較短的靈芝三萜生產(chǎn)工藝。
為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的技術(shù)方案是-
采用中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏的靈芝屬G朋c^emw /wd血m (LeyssexFr.) Karst.的菌種，菌株保藏號(hào)為CCGMC 5.616。菌種 的有關(guān)性質(zhì)可以參閱中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)(CCGMC)菌 種目錄，本發(fā)明不再詳述。
將靈芝菌種接種液體培養(yǎng)基后，在溫度為26-30°C、轉(zhuǎn)速為 130-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵1-5天；補(bǔ)加棕櫚酸1.5-3.0g/L后，在 溫度為25-30°C、轉(zhuǎn)速為100-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵3-6天結(jié)束， 從發(fā)酵液中提取靈芝三萜。
本發(fā)明的液體培養(yǎng)基組成為以玉米粉、葡萄糖為碳源，優(yōu)選含量分 別為5-10g/L、25-38g/L;以蛋白胨、豆餅粉為氮源，優(yōu)選含量分別為3-4g/L、 2-3 g/L;以KH2P04和MgS04為礦物元素，優(yōu)選含量分別為1.5 g/L、 0.75 g/L。
待發(fā)酵結(jié)束后進(jìn)行靈芝三萜的提取，提取方法為先將發(fā)酵液濃縮， 加入4倍體積的工業(yè)酒精以沉淀大分子多糖和蛋白質(zhì)，取上清液蒸去水后， 用95%乙醇溶液回流提取2小時(shí)，提取物再用正丁醇在5(TC下振搖提取3 小時(shí)，60。C下蒸去正丁醇，獲得靈芝三萜產(chǎn)品。
與現(xiàn)有靈芝發(fā)酵技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)勢1) 通過在靈芝發(fā)酵一段時(shí)間后補(bǔ)加適量的棕櫚酸，可顯著提高靈芝
發(fā)酵液中靈芝三萜的產(chǎn)量，其產(chǎn)量高達(dá)396.2mg/L，高于已有文獻(xiàn)報(bào)道產(chǎn)
2) 本發(fā)明的發(fā)酵工藝簡單，且靈芝三萜總的發(fā)酵時(shí)間較短，生產(chǎn)效 率明顯提高，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
3) 本發(fā)明添加的是可食用的棕櫚酸，無毒副作用，且添加量很少， 與現(xiàn)有的中藥添加物相比成本較低。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例h
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ga"^femz" /Mc!'血m)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
液體培養(yǎng)基組成玉米粉10g/L，葡萄糖25g/L，蛋白胨3g/L，豆餅 粉3 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。將10mL種子接種于150mL 培養(yǎng)基，置于500mL搖瓶中發(fā)酵。發(fā)酵溫度為26。C，轉(zhuǎn)速為130 r/min， 先發(fā)酵1天，然后一次性補(bǔ)加1.5g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵6天， 收獲發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。
將發(fā)酵液在8000r/min下離心8分鐘，獲上清液并濃縮，加入4倍體 積的工業(yè)酒精，沉淀大分子多糖和蛋白質(zhì)等，取200mL上清液，蒸去水后， 用400mL、 95%乙醇溶液回流提取2小時(shí)，提取物再用正丁醇在5(TC下振 搖提取3小時(shí)，6(TC下蒸去正丁醇，獲得得提取物，用甲醇溶解后作為樣 品，經(jīng)顯色反應(yīng)后，于250nm處測定吸光度，計(jì)算得靈芝三萜的產(chǎn)量為 351.3 mg/L。
實(shí)施例2:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ga"o&m^ /"ddww)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
液體培養(yǎng)基組成葡萄糖30g/L，玉米粉10g/L，蛋白胨4g/L，豆餅 粉4 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。接種10mL種子于150mL培 養(yǎng)基/500mL搖瓶中。發(fā)酵溫度為28"C，轉(zhuǎn)速為150r/min,先發(fā)酵2天， 然后一次性補(bǔ)加2.0g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵5天。結(jié)束發(fā)酵，收 獲發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同案例1，結(jié)果靈芝三萜的 產(chǎn)量為359.8 mg/L。
實(shí)施例3:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(G朋o^rma /wd血m)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
培養(yǎng)基組成和接種量同實(shí)施例2。發(fā)酵溫度為30°C，轉(zhuǎn)速為180r/min， 先發(fā)酵2天，然后一次性補(bǔ)加2.0g^棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵5天。 結(jié)束發(fā)酵，收獲發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同實(shí)施例1， 結(jié)果靈芝三萜的產(chǎn)量為353.8 mg/L。
實(shí)施例4:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ga"^/am" /wcWwm)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
發(fā)酵液體培養(yǎng)基組成葡萄糖35g/L，玉米粉8g/L，蛋白胨5g/L， 豆餅粉3 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。接種10mL種子于100mL 培養(yǎng)基/500mL搖瓶中。發(fā)酵溫度為3(TC，轉(zhuǎn)速為140r/min，先發(fā)酵2天， 然后一次性補(bǔ)加2.0g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵5天。結(jié)束發(fā)酵，收 獲發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同實(shí)施例1，結(jié)果靈芝三萜
的產(chǎn)量為369.5 mg/L。 實(shí)施例5:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(G""o&m7" /wc/^^w)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
發(fā)酵液體培養(yǎng)基組成葡萄糖38g/L，玉米粉5g/L，蛋白胨4g/L， 豆餅粉2 g/L， KH2P04 1.5 g/L， MgS04 0.75 g/L。接種10mL種子于100mL 培養(yǎng)基/500mL搖瓶中。發(fā)酵溫度為3(TC，轉(zhuǎn)速為160r/min，先發(fā)酵3天， 然后一次性補(bǔ)加3.0g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵5天。結(jié)束發(fā)酵，收 獲發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同實(shí)施例1，結(jié)果靈芝三萜 的產(chǎn)量為378.5 mg/L。
實(shí)施例6:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(G朋o^mw /wczWwm)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
培養(yǎng)基組成、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速同實(shí)施例5。先發(fā)酵4天，然 后一次性補(bǔ)加2.5g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵4天。結(jié)束發(fā)酵，收獲 發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同實(shí)施例1，結(jié)果靈芝三萜的 產(chǎn)量為383.6 mg/L。
實(shí)施例7:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(Ga"o&rm" /"ddwm)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
培養(yǎng)基組成、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速同實(shí)施例5。先發(fā)酵5天，然 后一次性補(bǔ)加2.8g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵3天。結(jié)束發(fā)酵，收獲 發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同實(shí)施例1，結(jié)果靈芝三萜的
產(chǎn)量為396.2 mg/L。 實(shí)施例8:
采用中國普通微生物菌種保藏管理中心保藏的靈芝菌種(G""oc/wm" /w"V/wm)，保藏號(hào)CCGMC 5.616。
培養(yǎng)基組成、接種量、發(fā)酵溫度和轉(zhuǎn)速同實(shí)施例5。先發(fā)酵4天，然 后一次性補(bǔ)加3.0g/L棕櫚酸于發(fā)酵液中，繼續(xù)發(fā)酵4天。結(jié)束發(fā)酵，收獲 發(fā)酵液和相關(guān)產(chǎn)品。產(chǎn)品的提取和分析方法同實(shí)施例1，結(jié)果靈芝三萜的 產(chǎn)量為380.3 mg/L。
權(quán)利要求
1、一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法，其特征在于使用靈芝屬Ganoderma lucidum(Leyss ex Fr.)Karst.的菌種，菌株保藏號(hào)為CCGMC5.616，通過如下步驟進(jìn)行1)將靈芝菌種接種含有碳源、氮源、礦物元素成分的培養(yǎng)基，在溫度為26-30℃、轉(zhuǎn)速為130-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵1-5天；2)補(bǔ)加棕櫚酸1.5-3.0g/L后，在溫度為25-30℃、轉(zhuǎn)速為100-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵3-6天結(jié)束；3)從發(fā)酵液中提取靈芝三萜。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法， 其特征在于培養(yǎng)基組成是以玉米粉、葡萄糖為碳源，以蛋白胨、豆餅粉為 氮源，以KH2P04和MgS04為礦物元素。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法， 其特征在于培養(yǎng)基中玉米粉含量為5-10g/L、葡萄糖含量為25-40g/L。
4、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法， 其特征在于培養(yǎng)基中蛋白胨含量為3-5g/L、豆餅粉含量為2-4g^。
5、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法， 其特征在于培養(yǎng)基中KH2P04含量為1.5g/L、 MgSO4含量為0.75g/L。
6、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法， 其特征在于，發(fā)酵液中靈芝三萜提取方法為發(fā)酵液經(jīng)濃縮，加入4倍體積 的工業(yè)酒精以沉淀大分子多糖和蛋白質(zhì)，取上清液蒸去水后，用95%乙醇溶 液回流提取2小時(shí)，提取物再用正丁醇在50。C下振搖提取3小時(shí)，得靈芝三 萜產(chǎn)品。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種提高靈芝發(fā)酵液中靈芝三萜產(chǎn)量的方法，采用中國普通微生物菌種保藏管理委員會(huì)保藏的靈芝菌種(Ganoderma lucidum)，菌株保藏號(hào)為CCGMC 5.616，接種靈芝菌種后，在溫度為26-30℃、轉(zhuǎn)速為130-180r/min條件下回轉(zhuǎn)式深層發(fā)酵1-5天；補(bǔ)加棕櫚酸1.5-3.0g/L后，在溫度為25-30℃、轉(zhuǎn)速為100-180r/min條件下繼續(xù)發(fā)酵3-6天結(jié)束，本發(fā)明方法的靈芝三萜產(chǎn)量高達(dá)396.2mg/L。
文檔編號(hào)C12R1/645GK101353689SQ200810143120
公開日2009年1月28日 申請日期2008年9月2日 優(yōu)先權(quán)日2008年9月2日
發(fā)明者劉高強(qiáng), 王曉玲, 魏美才 申請人:中南林業(yè)科技大學(xué)