專利名稱：一種利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因轉(zhuǎn)染豬皮轉(zhuǎn)染效率的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種提高攜帶外源基因的 重組腺病毒載體轉(zhuǎn)染豬皮效率的方法。
背景技術(shù)：
燒傷是一類發(fā)生率及致殘率均較高的特殊類型創(chuàng)傷，其根本問題就 是創(chuàng)面問題，如果燒傷創(chuàng)面得不到及時有效的覆蓋、封閉，必將引起患
者機體內(nèi)環(huán)境的紊亂、感染及多臟器功能障礙的發(fā)生；此外，還可能出 現(xiàn)創(chuàng)面的非生理性愈合，使疤痕形成增加，殘疾程度加劇。因此，對燒 傷創(chuàng)面進行皮膚移植的研究是現(xiàn)代燒傷治療的迫切需要；也是燒傷研究 的熱點及難點。
深度燒傷創(chuàng)面需經(jīng)皮膚移植才能愈合，而大面積、特大面積燒傷患 者自體皮源嚴重不足，需經(jīng)非自體(同種異體或異種)皮覆蓋創(chuàng)面方能取 得較好的臨床效果，同種異體皮(主要是尸體皮)是目前燒傷創(chuàng)面治療中 公認效果較好的生物敷料，但由于來源和倫理等多種條件限制，同種異 體皮無法滿足臨床需求。豬皮由于與人皮在組織結(jié)構(gòu)和生理功能上的高 度相似性，是臨床使用最為廣泛的異種皮膚，但由于豬和人之間的種屬差 異，其排斥反應(yīng)比較嚴重，無法起到長期覆蓋作用。
專利申請?zhí)枮?0103528.2,發(fā)明名稱是"一種用重組基因轉(zhuǎn)染的異 體皮膚，，的專利申請公開了利用傳統(tǒng)的Ad5腺病毒載體攜帶免疫抑制基 因CTLA4Ig對豬皮膚進行體外轉(zhuǎn)染，可使CTLA4Ig蛋白在豬皮組織活細 胞內(nèi)表達，從而起到抑制免疫排斥的發(fā)生，在燒傷創(chuàng)面誘導(dǎo)移植皮膚局 部特異性免疫耐受，達到延長移植異種皮膚成活的目的。但是，由于Ad5腺病毒載體和被轉(zhuǎn)染細胞表面均帶負電荷，相互之間 存在靜電排斥力，所以上述利用Ad5腺病毒載體攜帶免疫抑制基因 CTLA4Ig對豬皮膚組織細胞的轉(zhuǎn)染效率較低，需要較高滴度的病毒感染才 能發(fā)揮效果，使得基因轉(zhuǎn)染豬皮的生產(chǎn)成本較高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種提高基因轉(zhuǎn)染豬皮轉(zhuǎn)染效率的方法，該方 法可以提高Ad5重組腺病毒載體對豬皮膚細胞的轉(zhuǎn)染效率。 實現(xiàn)本發(fā)明目的的技術(shù)方案如下
一種利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因轉(zhuǎn)染豬皮轉(zhuǎn)染效率的方法，包 括如下步驟
1) 制備待轉(zhuǎn)染的豬皮膚；
2) 使用濃度為500-5000jug/ml二乙氨乙基葡聚糖對l()8pFU/ml Ad5 重組腺病毒載體進行震蕩混合，孵育后制備成轉(zhuǎn)染液；
3) 將步驟2 )制備的轉(zhuǎn)染液對步驟1)制備的豬皮膚進行轉(zhuǎn)染。 其中，步驟l)所述豬皮膚是任何一種品系的豬皮膚，優(yōu)選巴馬香豬
皮膚，進一步優(yōu)選小于6個月豬齡的豬皮膚，最優(yōu)選4-6月齡的巴馬香 豬皮膚。所述豬皮膚的厚度為0. 1-1. 0毫米，優(yōu)選0. 4 - 0. 6毫米。
其中，步驟2)中所述Ad5重組腺病毒載體含有CTLA4Ig重組基因， 可按照專利申請?zhí)枮?0103528,發(fā)明名稱是"一種用重組基因轉(zhuǎn)染的異 體皮膚，，的專利申請公開的方法制備CTLA4Ig重組基因和含有CTLA4Ig 重組基因的Ad5腺病毒載體。
其中，步驟2)中所述孵育具體為4'C孵育10-20分鐘。
其中，步驟3)中所述轉(zhuǎn)染具體是在C02培養(yǎng)箱內(nèi)37。C轉(zhuǎn)染l-3小時。
其中，步驟3 )具體為將步驟2 )中處理后的轉(zhuǎn)染液按0. 8 - 2. 2ml/cm2 的比例對步驟1 )中處理后的豬皮膚在C02培養(yǎng)箱內(nèi)37。C轉(zhuǎn)染1 - 3小時。其中步驟3)優(yōu)選將步驟2)制備的轉(zhuǎn)染液按lml/cm2的比例對步驟l ) 制備的豬皮膚在C02培養(yǎng)箱內(nèi)37。C轉(zhuǎn)染2小時。
本發(fā)明中使用的二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)是一種常見的 帶有陽離子基團的有機分子，其陽離子基團二乙氨乙基(DEAE)結(jié)合有 一定的陽離子，當(dāng)其與Ad5重組腺病毒載體采用適合的比例混合后轉(zhuǎn)染豬 皮膚細胞時，可中和腺病毒載體和細胞表面的陰離子基團，降低了腺病 毒載體和細胞表面之間的靜電排斥力，從而增加腺病毒與細胞的相互接
觸，提高腺病毒載體對豬皮膚細胞的轉(zhuǎn)染效率。
本發(fā)明在體外利用二乙氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)對Ad5重組腺 病毒載體轉(zhuǎn)染液進行處理，以此處理后的腺病毒轉(zhuǎn)染液對豬皮組織進行 轉(zhuǎn)染，與未經(jīng)處理的腺病毒轉(zhuǎn)染相比，發(fā)現(xiàn)可以提高轉(zhuǎn)染效率75-130倍， 大大的提高了基因轉(zhuǎn)染的效率，降低了生產(chǎn)成本。而且試驗表明，二乙 氨乙基葡聚糖不會引起腺病毒載體和細胞的變性或失活，因此可以4艮好 地發(fā)揮協(xié)助腺病毒載體對豬皮膚的轉(zhuǎn)染作用。


圖l為CTLA4Ig標準品的吸光值標準曲線圖。
具體實施例方式
以下通過實施例詳細說明本發(fā)明。在下面的實施例中所涉及的實-瞼
得。本發(fā)明所使用的含有CTLA4Ig重組基因的Ad5腺病毒載體，可按照 專利申請?zhí)枮?0103528,發(fā)明名稱是"一種用重組基因轉(zhuǎn)染的異體皮膚" 的專利申請公開的方法制備。
實施例l利用本發(fā)明方法制備CTLA4Ig基因轉(zhuǎn)染豬皮 步驟l:取皮消毒
將豬處死后用洗衣粉清洗外部皮膚，手術(shù)刀刮毛，再用5%碘伏消毒，酒精脫色后無菌取皮，在潔凈環(huán)境下用皮鼓將豬皮剖成厚度層為0.6mm 厚度皮塊備用。
步驟2: 二乙氨乙基葡聚糖對Ad5-CTLA4Ig腺病毒載體的處理
使用濃度為500-5000 jug/ml的二乙氨乙基葡聚糖(SIGMA公司產(chǎn)品) 對108PFU/ml Ad5-CTLA4Ig腺病毒載體進行震蕩混合，在4。C下孵育10-20 分鐘，制備成轉(zhuǎn)染液。 步驟3:腺病毒載體轉(zhuǎn)染
將步驟2中處理后的轉(zhuǎn)染液4姿lml/lcn^的比例對步驟1中處理后的 皮片進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染條件為C02培養(yǎng)箱內(nèi)37X:轉(zhuǎn)染2h,同時以未經(jīng)二乙 氨乙基葡聚糖(DEAE-dextran)處理的腺病毒轉(zhuǎn)染液為對照對步驟1中 處理后的皮片進行轉(zhuǎn)染，對照組處理措施除腺病毒轉(zhuǎn)染液未經(jīng)二乙氨乙 基葡聚糖處理外，其余處理措施及轉(zhuǎn)染條件和二乙氨乙基葡聚糖處理組 完全一致。
實施例2 二乙氨乙基葡聚糖處理組與對照組的目的基因轉(zhuǎn)入量比較
提取實施例1中二乙氨乙基葡聚糖處理組和對照組中的基因組總DNA (提取方法參照《分子克隆實驗指南》(第3版)463-471。科學(xué)出版社)。 然后進行目的基因轉(zhuǎn)染的定量檢測，以確定目的基因的轉(zhuǎn)入量。目的基 因轉(zhuǎn)染的定量檢測的方法如下
用目的引物與內(nèi)參引物分別對樣品DNA進^f亍擴增。
目的引物5， AGGTCAAGTTCAACTGGTACG 3，，見SEQ ID NO: 1。
5， CTTGTACTCCTTGCCATTCA 3，，見SEQ ID NO: 2。 內(nèi)參引物:5， TTTAACTCTGGCAAAGTGGAC 3，，見SEQ ID NO: 3。 5， GGTGGAATCATACTGGAACAT 3，，見SEQ ID NO: 4。 定量PCR反應(yīng)程序 95°C 3min94°C 30s 60°C 30s 讀板
40個循環(huán) 72 °C 3min 95°C lmin 55。C lmin
熔解曲線從55。C到95°C,每0. 5。C循環(huán)一次10s。
目的基因的量比上內(nèi)參基因的量即為目的基因的導(dǎo)入量。實驗結(jié)果 表明經(jīng)用二乙氨乙基葡聚糖處理的腺病毒轉(zhuǎn)染豬皮后目的基因?qū)肓枯^ 未經(jīng)處理的腺病毒轉(zhuǎn)染豬皮提高了 75-130倍。
實施例3 ELISA檢測二乙氨乙基葡聚糖處理組和對照組的腺病毒轉(zhuǎn)染 豬皮后豬皮組織中CTLA4Ig的表達量的比較 1)樣品準備
將實施例1轉(zhuǎn)染后的豬皮組織繼續(xù)培養(yǎng)48小時，然后將不同處理的 豬皮組織在滅菌燒杯或一次性培p中用滅菌PBS漂洗三次，在一次性 培養(yǎng)m內(nèi)剪碎，每張皮片加1.5ml滅菌PBS用勻漿器在離心管內(nèi)制備勻 漿，再離心5000r/min， 3min取上清作為樣品；培養(yǎng)皮片后的培養(yǎng)基也 作為樣品。
2 ) ELISA檢測
CTLA4Ig標準品標定曲線用CTLA4Ig標準品(R&D System USA) 制做標定曲線和曲線方程，結(jié)果見表1,根據(jù)表1結(jié)果制作CTLA4Ig標準 品的吸光值標準曲線圖，見圖1。表明隨標準品濃度增力口，吸光值也隨之 增力口，并呈線性相關(guān)趨勢，相關(guān)系數(shù)112=0. 9622，表明相關(guān)程度較高，說明利 用此圖可以準確;險測樣品中0-24 )i g的CTljHIg濃度。樣品中CTLA4Ig測試酶標板每孔加入100 jul (ljug/ml)大鼠抗 CTLA4Ig的一抗(Abnova)， 4'C包一皮過夜，洗板，然后每孔加入200jal 封閉液(l%BSA+0. 02%Tween—20+PBS) 4。C過夜，洗板，每孔加入100 jal 樣品室溫反應(yīng)2h,洗板，每孔加入100 |il (liag/ml)羊抗大鼠二抗 (southern biotech),室溫反應(yīng)2h，洗—反，每孔加入100 y 1底物顯色 液(雙氧水+鄰苯二胺)，室溫反應(yīng)30min,力口入100 |a 1 2MH2S04，用酶標 儀在49Gnm波長測定吸光度。
實驗結(jié)果見表2,將表2數(shù)值帶入CTLA4Ig標準品的吸光值標準曲線 方程(Y=0. 0444X+0. 1621 ),得出二乙氨乙基葡聚糖處理組勻漿中表達 CTLA4Ig量為225ng/ml，對照組勻漿中含量為130ng/ml，說明二乙氨乙 基葡聚糖處理組的Ad5-CTLA4Ig腺病毒轉(zhuǎn)染豬皮組織勻漿中表達CTLA4Ig 量比對照組的高95 ng/ml; 二乙氨乙基葡聚糖處理組的Ad5-CTLA4Ig腺 病毒轉(zhuǎn)染豬皮組織培養(yǎng)基中分泌的CTLA4Ig為189ng/ml,對照組為 70ng/ml， 二乙氨乙基葡聚糖處理組比對照組高119ng/ml。
表1 用CTLA4Ig標準品3次重復(fù)測試吸光值
標準品(ng) 02 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24
吸光值(重復(fù)l) 0.124 0.216 0.327 0.392 0.586 0.54 0.708 0.937 0.839 1.06 0.899 1,032 1.254
吸光值(重復(fù)2) 0.135 0.238 0.338 0.394 0.655 0.54 0.706 0.989 0.841 1.075 1.057 1.041 1.243
吸光值(重復(fù)3 ) 0.162 0.217 0.325 0.4 0.665 0.53 0.734 0.641 0.866 1.071 1.057 0.983 1.289
平均值 0.1403 0.224 0.33 0.395 0.635 0.54 0.716 0.856 0.849 1.069 1.004 1.019 1.262表2 二乙氨乙基葡聚糖處理組與對照組轉(zhuǎn)染豬皮CTLA4Ig吸光值比較
實驗次數(shù)對照組勾漿 OD值對照組培養(yǎng)基 分泌OD值處理組勻漿 OD值處理組培養(yǎng)基 分泌OD值
第一次0. 81270. 46941. 20011. 1200
第二次0. 65340. 52391. 14210. 9934
第三次0. 75180, 42541. 14110. 8905
平均值0. 73930. 47291. 16111. 0013
以上實施例只是用于進一 步說明本發(fā)明，而不是用來限制本發(fā)明的 保護范圍。凡是在本發(fā)明保護范圍內(nèi)所做出的具體實施方式
及應(yīng)用范圍 上的些許變動，也屬于本發(fā)明的保護范圍。序列表
<110> 重慶宗申軍輝生物技術(shù)有限公司
<120> —種利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因轉(zhuǎn)染豬皮轉(zhuǎn)染效率的方法
<130> MP080771
<160> 4
<170> Patentln version 3. 3
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 目的引物
<400> 1
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<210> 2
<211> 20
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<223> 目的引物
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<223> 內(nèi)參引物
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<210> 4
<211> 21
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<220><223> 內(nèi)參引物 <400> 4
ggtgga"ca tactggaac3 t 2權(quán)利要求
1、一種利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因轉(zhuǎn)染豬皮轉(zhuǎn)染效率的方法，其特征在于包括如下步驟1)制備待轉(zhuǎn)染的豬皮膚；2)使用濃度為500-5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖對108PFU/ml Ad5重組腺病毒載體進行震蕩混合，孵育后制備成轉(zhuǎn)染液；3)將步驟2)制備的轉(zhuǎn)染液對步驟1)制備的豬皮膚進行轉(zhuǎn)染。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述豬皮膚是巴馬香豬 皮膚。
3、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述豬皮膚是小于6個 月豬齡的豬皮膚。
4、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述豬皮膚是4-6月齡 的巴馬香豬皮膚。
5、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述豬皮膚的厚度為 0. 1-1. 0毫米。
6、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于步驟2)中所述Ad5重 組腺病毒載體含有CTLA4Ig重組基因。
7、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟2)中所述孵育具 體為4t:孵育10-20分鐘。
8、 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3)中所述轉(zhuǎn)染具 體是在C02培養(yǎng)箱內(nèi)37。C轉(zhuǎn)染1 - 3小時。
9、 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3 )具體為將步驟2 ) 制備的轉(zhuǎn)染液按0. 8-2. 2ml/cm2的比例對步驟1)制備的豬皮膚在C02 培養(yǎng)箱內(nèi)37。C轉(zhuǎn)染1 - 3小時。
10、 權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于步驟3 )具體為將步驟2 ) 制備的轉(zhuǎn)染液按lml/cm2的比例對步驟1)制備的豬皮膚在C02培養(yǎng)箱內(nèi)/37。C轉(zhuǎn)染2小時,
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用二乙氨乙基葡聚糖提高基因轉(zhuǎn)染豬皮轉(zhuǎn)染效率的方法，包括如下步驟1)制備待轉(zhuǎn)染的豬皮膚；2)使用濃度為500-5000μg/ml二乙氨乙基葡聚糖對10⁸PFU/ml Ad5重組腺病毒載體進行震蕩混合，孵育后制備成轉(zhuǎn)染液；3)將步驟2)制備的轉(zhuǎn)染液對步驟1)制備的豬皮膚進行轉(zhuǎn)染。本發(fā)明中二乙氨乙基葡聚與Ad5重組腺病毒載體混合后轉(zhuǎn)染豬皮膚細胞時，其攜帶的陽離子可中和腺病毒載體和細胞表面的陰離子，降低了腺病毒載體和細胞表面之間的靜電排斥力，從而增加腺病毒載體與豬皮膚細胞的相互接觸，提高腺病毒載體對豬皮膚的轉(zhuǎn)染效率。
文檔編號C12N15/67GK101613709SQ20081012682
公開日2009年12月30日 申請日期2008年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2008年6月24日
發(fā)明者志 劉, 軍 吳, 葛良鵬, 泓 魏 申請人:重慶宗申軍輝生物技術(shù)有限公司