專利名稱：：一種調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域中一種調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法。
背景技術(shù)：
：木質(zhì)素是由三種醇單體或單木質(zhì)酚(對(duì)香豆醇、松柏醇、芥子醇)合成的一種復(fù)雜的酚類聚合物。在細(xì)胞壁的木質(zhì)化過程中，木質(zhì)素滲入到細(xì)胞壁中，填充于纖維素構(gòu)架內(nèi)，如導(dǎo)管和管胞細(xì)胞的形成。由于木質(zhì)素的滲入，加大了細(xì)胞壁的硬度，增強(qiáng)了細(xì)胞的機(jī)械支持力或抗壓強(qiáng)度，促進(jìn)機(jī)械組織的形成，以有利于鞏固和支持植物體及水分輸?shù)赖茸饔?，同時(shí)由于木質(zhì)素的化學(xué)特性，如不可溶性和復(fù)雜的酚類聚合物，使得木質(zhì)部具有細(xì)胞壁疏水性，也增強(qiáng)了抗病能力。樹木的次生木質(zhì)部有纖維素(e-l-4-糖苷)木質(zhì)素(苯基多聚物)和半纖維素(異型多糖)，比例約為2:1:1。在樹木生長(zhǎng)時(shí)，纖維素微纖絲為細(xì)胞壁提供張力，木質(zhì)素增加纖維素微纖絲的硬度。木質(zhì)素含量高的木材由于硬度高而廣泛用于建筑和家具領(lǐng)域。但在造紙過程中卻需要清除木質(zhì)素。目前去除木漿中的木質(zhì)素一般需借助毒性較高的化學(xué)物質(zhì)，這道工序是造紙工業(yè)中最耗費(fèi)能源、對(duì)環(huán)境危害最大的一個(gè)環(huán)節(jié)。無論是提高樹木的木質(zhì)素含量還是降低木質(zhì)素含量都將有益于生產(chǎn)。從策略上說，可以從多個(gè)方面進(jìn)行木質(zhì)素含量控制(l)控制木質(zhì)素合成途徑中的各種酶系的合成是一個(gè)重要途徑，如對(duì)從PAL酶到過氧化物酶/漆酶等進(jìn)行反義基因轉(zhuǎn)化有可能達(dá)到目的；(2)改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)組成和化學(xué)性質(zhì)。由于研究木質(zhì)素含量遺傳變異的重要目的之一就是為工業(yè)造紙服務(wù)，在難以直接降低木質(zhì)素含量情況下，改變木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)組成有可能間接地達(dá)到同樣的效果；(3)必須認(rèn)識(shí)到木質(zhì)素的前體是在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)合成的，然后轉(zhuǎn)移到細(xì)胞壁并進(jìn)行脫氫聚合形成木質(zhì)素，因此木質(zhì)素的合成調(diào)控也需注意涉及到一些非酶化學(xué)分子的作用，即傳遞運(yùn)輸過程的控制，但這方面的研究至今卻很少見報(bào)道研究。單個(gè)酶的作用及多個(gè)酶間的相互作用對(duì)于探索木質(zhì)素的合成機(jī)理有重要意義，因此木質(zhì)素合成酶的分子生物學(xué)特性及作用機(jī)理研究日益受重視。目前直接應(yīng)用基因工程的方法來改變木質(zhì)素含量的研究已有報(bào)道。Piquemal等從岡尼桉(Eucalyptus)分離出來的CCR(羥基肉桂酰輔酶A還原酶)(EC1.2.1.44)酶的cDNA的反義構(gòu)建載體，通過農(nóng)桿菌(Agrobacerium)轉(zhuǎn)化到煙草(^ico"a73ta&c鵬L)上，結(jié)果顯示出在穩(wěn)態(tài)時(shí)CCRraRNA含量和CCR活性下降，且含量下降的植株木質(zhì)部細(xì)胞壁呈橙棕色，紫丁香基與愈創(chuàng)木基的比率提高，且出現(xiàn)不正常細(xì)胞壁酚類物質(zhì)。然而CCR活性嚴(yán)重下降的植物除了表現(xiàn)出木質(zhì)素下降外，還表現(xiàn)出形體小、葉形異常和縐縮導(dǎo)管等特征。通常認(rèn)為CAD(輕基肉桂醇脫氫酶)是催化木質(zhì)素前體合成的最后一步的酶，因此降低CAD活性有可能減少木質(zhì)素前體的合成。Baucher等研究將從毛果楊X美洲黑楊(尸.z^z'c力ocarpa7bnGroyX尸.ofe"ojVes#arW.)分離出來的CAD酶的cDNA通過農(nóng)桿菌進(jìn)行正義和反義轉(zhuǎn)化到歐洲山楊X銀白楊(尸^reM/7a厶X尸.s7力aZ.)中，結(jié)果表明3個(gè)反義轉(zhuǎn)化和2個(gè)共抑制的品系的木質(zhì)部組織CAD活性下降70%，在CAD活性少于60%的品系中，可檢測(cè)到紅色的木質(zhì)部，但木質(zhì)素含量和組成與對(duì)照品系相似，并未下降。但是細(xì)胞壁的化學(xué)特性不同，應(yīng)用間苯三酚染色后，正常品系的木質(zhì)部呈典型的淡紅色，而CAD活性下降的品系染色后呈棕紅色。用NaOH處理后，通過將細(xì)胞壁中具有堿溶性的部分進(jìn)行酸化處理后，具有紅色木質(zhì)部的品系的木質(zhì)素可沉淀，而白色木質(zhì)部的品系的木質(zhì)素不沉淀。光譜分析顯示出紅色木質(zhì)部的楊樹香蘭素和紫丁香基醛含量提高。紙漿試驗(yàn)證明CAD活性下降的品系只有少量的木質(zhì)素存于紙漿中。類似的報(bào)道還有Higuchi等，CAD反義轉(zhuǎn)化的植株木質(zhì)素含量并不下降，但木質(zhì)素的組成和化學(xué)性質(zhì)發(fā)生了改變。CAD反義轉(zhuǎn)化后木質(zhì)素含量不下降，這與自然界中火炬松CAD突變體的結(jié)果不一致。OMT是重要的控制木質(zhì)素合成酶，Dwivedi等將美洲山楊中編碼0MT(EC2.1.1.6)酶的反義序列與CaMV35S基因的增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和終止子組裝后轉(zhuǎn)化到煙草基因組內(nèi)后，轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出正常的表現(xiàn)型。在4個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的莖部中，0MT(咖啡酸0-甲基轉(zhuǎn)移酶)酶的活性平均下降29%。莖部木材化學(xué)分析結(jié)果顯示出紫丁香基單位含量下降，木質(zhì)素含量下降水平與0MT酶活性程度相關(guān)。Doorsselaere等應(yīng)用反義COMT(咖啡酸甲基轉(zhuǎn)移酶)轉(zhuǎn)化歐洲山楊X銀白楊后，COMT活性下降為正常的5%，但木質(zhì)素含量并不下降。根據(jù)應(yīng)用轉(zhuǎn)化單酶基因方法改造煙草木質(zhì)素含量的研究報(bào)道，降低單個(gè)酶0MT、CAD、P0D(過氧化物酶)、C0MT和F5H(阿魏酸5-羥基化酶)等酶活性，并不影響木質(zhì)素含量變化，而降低酶系PAL(苯丙氨酸解氨酶)、C4H(肉桂酸4-羥基化酶)、和CCR(羥基肉桂酰輔酶A還原酶)等酶活性，則可以降低木質(zhì)素含量。通過鑒定樹木與草本植物中木質(zhì)素合成途徑的酶和基因，以往努力減少樹木中木質(zhì)素的含量，通過下調(diào)編碼咖啡酸o-甲基轉(zhuǎn)移酶或肉桂醇脫氫酶含量沒有獲得成功，只是修飾了木質(zhì)素的結(jié)構(gòu)。在轉(zhuǎn)基因煙草中降低這些酶的含量顯示沒有減少木質(zhì)素的含量。然而通過在轉(zhuǎn)基因煙草中降低苯丙氨酸脫氨酶含量，顯著減少了木質(zhì)素的含量，該酶催化木質(zhì)素合成途徑中進(jìn)入苯丙基衍生物的途徑導(dǎo)致了一系列表型不正常。同樣在轉(zhuǎn)基因擬南芥和煙草中通過降低肉桂酸輔酶A還原酶的含量也降低了(25%-40%)木質(zhì)素的含量，但導(dǎo)致了細(xì)胞壁的委縮和矮化。這些草木系統(tǒng)清晰地表明了修飾次生代謝和木質(zhì)素質(zhì)量的可能性。因此，樹木生物技術(shù)的問題是能否降低木質(zhì)素含量而不影響結(jié)構(gòu)的硬度和樹木的生長(zhǎng)。楊樹的4CL(4-香豆酸輔酶A連接酶)蛋白Pt4CLl、Pt4CL2催化羥基肉桂酸與CoA的連接反應(yīng)，為木質(zhì)素和類黃酮的生物合成提供酚類前體。Pt4CL2在莖和葉的表皮細(xì)胞中表達(dá)，與類黃酮合成相關(guān)。Pt4CLl是在發(fā)育的木質(zhì)部維管組織中表達(dá)，和木質(zhì)素的合成相關(guān)。發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法，是將含有4CL1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量升高的植物；將含有反義4CL1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量降低的植物。所述4CL1基因是具有序列表中序列1的多核苷酸序列，所述反義4CL1基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。序列表中的序列1由1741個(gè)堿基組成，序列2由1637個(gè)堿基組成。用于構(gòu)建所述含有4CL1基因的表達(dá)載體或含有反義4CL1基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體可為Ti類質(zhì)粒載體和病毒載體，優(yōu)選為Ti類質(zhì)粒載體。所述Ti類質(zhì)粒載體優(yōu)選為雙元載體，如pBI121。所述含有4CL1基因的表達(dá)載體優(yōu)選為pB4CL;所述含有反義4CL1基因的表達(dá)載體優(yōu)選為pBan4CL。所述轉(zhuǎn)化方法可為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。本發(fā)明方法中，所述植物可為草本植物或木本植物，其中，所述草本植物優(yōu)選為煙草，所述木本植物優(yōu)選為楊樹。本發(fā)明通過在植物細(xì)胞中用載體引入4CL1基因或反義4CL1基因，來生產(chǎn)木質(zhì)素含量升高或降低的轉(zhuǎn)基因植物特別是轉(zhuǎn)基因樹木，為培育木質(zhì)素含量降低或升高的植物以及改良樹木材性提供了一條重要的途徑。圖1為35S-4CL1融合基因載體pB4CL構(gòu)建過程示意圖圖2為pB4CL的PCR鑒定圖譜圖3為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株照片圖4為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的PCR檢測(cè)圖譜圖5為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的southern雜交圖譜圖6為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的northern雜交圖譜圖7a為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草葉中的4CL1活性分析柱狀7b為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草莖中的4CL1活性分析柱狀圖圖8a為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草植株照片圖8b為空白煙草植株照片圖9為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草與空白煙草的含水量、木質(zhì)素及纖維素含量比較柱狀圖圖10為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草與空白煙草的木質(zhì)素含量分布曲線圖11為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草與空白煙草的纖維素含量分布曲線圖12a為35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL構(gòu)建過程示意圖圖12b為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株的PCR檢測(cè)結(jié)果圖譜圖13為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株的Southern雜交結(jié)果圖譜圖14為蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線圖15a為空白煙草植株中4CL1酶活性動(dòng)力曲線圖15b為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株中4CL1酶活性動(dòng)力曲線圖16為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株中4CL1酶活性柱狀圖圖17a為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線圖17b為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的木質(zhì)素含量比較柱狀圖圖17c為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的纖維素含量比較柱狀圖圖18a為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的木質(zhì)素含量比較柱狀圖圖18b為轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株的纖維素含量比較柱狀圖具體實(shí)施例方式實(shí)施例1、培育木質(zhì)素含量提高的轉(zhuǎn)基因煙草本實(shí)施例所用的地高新試劑盒的貨號(hào)為92445820，31Oct2003，Boehringer公司。1、35S-4CL1融合基因載體pB4CL構(gòu)建以按照常規(guī)方法提取的楊樹總DNA為模板，在引物F6:CGGATCCGCAATGGACGCCACAATGAATCC，F(xiàn)7:CCGGGTACTGTCTTACGTTGGGTACG的引導(dǎo)下，按照如下循環(huán)程序94度5min;94度30sec，55度45sec，72度90sec，30個(gè)循環(huán)；72度10min進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到4CL1基因片段，分別利用1&7^5>ra7酶切純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和PUC18，然后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct，經(jīng)篩選得到陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆中的質(zhì)粒，得到亞克隆載體pU4CL。35S-4CL1融合基因載體pB4CL構(gòu)建過程如圖1所示，具體步驟如下按照常規(guī)方法用J力a//5feal將4CL1基因片段從亞克隆載體pU4CL上切下，并與經(jīng)Jte/A&31酶切的pBI121載體進(jìn)行連接，獲得含有融合基因35S-4CL1基因的重組載體pB4CL。用質(zhì)粒pB4CL按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)篩選后，提取質(zhì)粒同時(shí)進(jìn)行Tte//Smal酶切和以引物l:CGCAATGGACGCCACAATGAATCC和引物2:TACTGTCTTACGTTGGGTACG為弓|物進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果如圖2所示，表明4CL1基因已插入表達(dá)載體。按常規(guī)方法對(duì)質(zhì)粒pB4CL進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明插入的4CL1基因具有序列表中序列1的核苷酸序列，位于pB4CL的5827bp-7567bp之間；序列表中的序列1由1741個(gè)堿基組成，4CL1基因的開放閱讀框架為自5'端第5位-1627位核苷酸序列。2、煙草的轉(zhuǎn)化與鑒定分析按改進(jìn)的An方法，直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在鏈霉素(Sm)125mg/L和卡納霉素(Km)50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽(yáng)性克隆。含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/l，Kra50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到0D600=0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/L)稀釋,繼續(xù)培養(yǎng)到00600=0.2-0.3。將煙草無菌苗的葉片剪下，除去葉脈，切成O.5-1.Ocm的小塊，在菌液中浸泡2-3min，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在表面鋪一張濾紙的MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到含100mg/LKm，500rag/LCar的MS培養(yǎng)基(0.5mg/LIAA，2.Omg/LBA)上28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)抗性芽長(zhǎng)到1-3cm時(shí)切下，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基中長(zhǎng)莖。當(dāng)莖長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，按照文獻(xiàn)(王關(guān)林，方宏筠，1998，科學(xué)出版社)的方法轉(zhuǎn)到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基中生根，結(jié)果如圖3所示，得到再生苗37株。以在抗性培養(yǎng)基上生根的轉(zhuǎn)化苗的葉片總DNA與未轉(zhuǎn)化的煙草葉片的總DNA為模板，在引物1:CGCAATGGACGCCACAATGAATCC和引物2:TACTGTCTTACGTTGGGTACG的引導(dǎo)下按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖4所示，表明轉(zhuǎn)化苗樣品中產(chǎn)生一個(gè)約1700bp的片段，而未轉(zhuǎn)化煙草樣品則沒有該片段。初步證明4C11基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。3、轉(zhuǎn)基因煙草的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，使用BamHI/Smal限制性內(nèi)切酶在37度酶解3小時(shí)后，1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNa0H)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris—Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時(shí)。取lugPCR得到的4CL1基因片段，加蒸餾水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42"C。預(yù)雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42'C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1呢SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC,0.1%SDS50。C清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液一100ral馬來酸緩沖液(Maleicacidbuffer)(0.1M馬來酸，0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置1小時(shí)。結(jié)果如圖5所示，表明轉(zhuǎn)基因煙草中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉(zhuǎn)基因煙草則沒有這條帶，證明該4CL1基因已經(jīng)插入轉(zhuǎn)基因煙草中。圖5中，CK為非轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)照，l-4為轉(zhuǎn)基因煙草。4、轉(zhuǎn)基因煙草的Northern雜交按照常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因煙草的總RNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳。使用20XSSC進(jìn)行RNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時(shí)。用lug由PCR得到的4CL1基因的DNA，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min，加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻，37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶)至42'C。預(yù)雜交30min。取RNA探針煮沸5min，迅速放置與冰水中。將變性探針RNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡并封口、42°。過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS5(TC清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液一100ml馬來酸緩沖液(Maleicacidbuffer)(0.1M馬來酸0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置l小時(shí)。結(jié)果如圖6所示，表明在轉(zhuǎn)基因煙草中有明顯的雜交帶，而非轉(zhuǎn)基因煙草沒有，證明4CL1基因已經(jīng)在轉(zhuǎn)基因煙草中表達(dá)。圖6中，CK為非轉(zhuǎn)基因煙草，sample為轉(zhuǎn)基因煙草植株。5.轉(zhuǎn)基因煙草4CL1酶活性的測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖分別在液氮下粉碎，用提取緩沖液(0.2MTris-HClpH7.5，8mMMgCl2，5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶肽(Leup印tin))提取，提取液在18000g、4'C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白粗提液定量。lml酶反應(yīng)液中包括.0.2MTris-HC1，pH7.5，8mMMgCl2，0.8mMATP，0.lmM底物(分別為4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)和25-30ul粗提液于24t:反應(yīng)12分鐘，然后測(cè)定A333，A346，A35。的增加。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表l、表2、圖7a和圖7b所示，表明在轉(zhuǎn)基因煙草的葉中4CL1酶活性提高2-4倍，而在轉(zhuǎn)基因煙草的莖中4CL1酶活性提高40%-50%。在轉(zhuǎn)基因煙草的葉中4CL1酶活性增加比例比較多。但是轉(zhuǎn)基因煙草葉莖中4CL1酶活性的絕對(duì)增加量基本是相同的，說明在該系列的轉(zhuǎn)基因煙草中，4CL1酶在轉(zhuǎn)基因煙草各組織中得到大量而平均的表達(dá)。圖7a和圖7b中，CK為非轉(zhuǎn)基因煙草植株，1-9為轉(zhuǎn)基因煙草植株。表l.轉(zhuǎn)基因煙草葉中4CL1靡E活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表2.轉(zhuǎn)基因煙草莖中4CL1酶活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>6、轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的含水量、木質(zhì)素及纖維素分布分析(1)轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的形態(tài)觀察在相同組織培養(yǎng)條件下成苗的轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草植株和非轉(zhuǎn)基因煙草植株移栽入花盆中，在相同條件下培育45天，轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草植株的苗高58.5cm，根長(zhǎng)12.5cm，葉片數(shù)52枚，非轉(zhuǎn)基因煙草植株的苗高58.Ocm，根長(zhǎng)15cm，葉片數(shù)48片。通過從移栽到煙草的開花、結(jié)籽整個(gè)生長(zhǎng)發(fā)育過程的觀察及上面所測(cè)數(shù)據(jù)分析，轉(zhuǎn)基因植株與空白煙草植株(非轉(zhuǎn)基因植株)除形態(tài)表現(xiàn)正常外(圖8a和圖8b)，開花、結(jié)果的時(shí)間也沒有明顯的差異。因此，初步認(rèn)為轉(zhuǎn)4CL1基因能夠有效調(diào)控木質(zhì)素的生物合成而不影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育。(2)轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的根、莖、葉的含水量、木質(zhì)素及纖維素含量轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的根、莖、葉的含水量、木質(zhì)素及纖維素含量如表3、圖9所示，表明轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草中根、莖、葉的含水量與空白相差不大，而木質(zhì)素的含量分別高于空白煙草植株中的含量，而纖維素的含量變化則與之相反，這與上面對(duì)整株植株的比較結(jié)果相一致。圖9中，Trans表示轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草，CK表示空白煙草(非轉(zhuǎn)基因)。表3.轉(zhuǎn)基因煙草與空白煙草的含水量、木質(zhì)素及纖維素含量比較測(cè)定項(xiàng)目轉(zhuǎn)基因煙草空白煙草根莖葉根莖葉含水量(%)91.6588.2690.5591.8988.4191.08木質(zhì)素含量a)6356.3534532.531變化量+18+23.822—————纖維素含量(%)3.2113.395.4115.1634.730.04變化量-11.85-21.31-24.63—一一(3)轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的木質(zhì)素含量分布分析選取煙草根及莖段(每10cm—段)樣品，按由低到高的順序一次編號(hào)l,2,3，4，5，6，7。按照常規(guī)方法分別測(cè)定轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草和空白煙草的木質(zhì)素及纖維素含量，結(jié)果如表4、表5、圖10、表6、表7和圖11所示，表明轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草的木質(zhì)素含量隨其高度的增加而減少，而纖維素的含量則隨其高度的增加而增加，這可能是由于(1)植物中老組織的細(xì)胞比新生幼嫩組織的細(xì)胞要成熟，所以使得外源基因在組織中表達(dá)更充分些；(2)植物莖基部的木質(zhì)部較發(fā)達(dá)，而新生嫩組織的木質(zhì)部形成層還不成熟。由此形成木質(zhì)素含量的連續(xù)降低趨勢(shì)和纖維素含量的連續(xù)增長(zhǎng)趨勢(shì)。另外，在空白植株中也表現(xiàn)出同樣的遞增和遞減趨勢(shì)，但是在其木質(zhì)素及纖維素含量上與轉(zhuǎn)基因植株有明顯差別表現(xiàn)在空白植株各部分的木質(zhì)素含量相對(duì)于轉(zhuǎn)基因植株各部分的木質(zhì)素含量要低，而纖維素含量則高些。圖10和圖11中，Trans表示轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草，CK表示空白煙草(非轉(zhuǎn)基因)。表4.轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙木質(zhì)素含量樣品號(hào)烘干前重(g)烘干后重(g)木質(zhì)素重(g)木質(zhì)素含量(%)11.88481.89110.00636321.96641.97320.00686831.90381.910.00626241.94071.94660.00595951.88431.88980.00555561.95861.96350.00494971.92111.92560.004545表5.空白煙草木質(zhì)素含量樣品號(hào)烘千前重(g)烘干后重(g)木質(zhì)素重(g)木質(zhì)素含量(W11.92311.92760.004545<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>實(shí)施例2、培育木質(zhì)素含量降低的轉(zhuǎn)基因煙草1、35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL構(gòu)建以按照常規(guī)方法提取的楊樹總DNA為模板，在引物FAN1:CTCTAGATTATATGCCTGCCAACTTTTC，F(xiàn)AN2:CCCCGGGATGGACGCCACAATGAATCCAC的引導(dǎo)下，按照如下循環(huán)程序94度5min;94度30sec，55度45sec，72度90sec，30個(gè)循環(huán)；72度10min進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收、純化PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，得到反義的4CL1基因片段，分別利用Xtei^6i/;a7酶切純化的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和PUC18，然后進(jìn)行連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，經(jīng)篩選得到陽(yáng)性克隆，提取陽(yáng)性克隆中的質(zhì)粒，得到亞克隆載體pUan4CL。35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL構(gòu)建過程如圖12a所示，具體步驟如下按照常規(guī)方法用1&//6)/;s/將反義4CL1基因(anti-4CL1)片段從亞克隆載體pUan4CL上切下，并與經(jīng)Jte//5fes/酶切的pBI121載體進(jìn)行連接，獲得含有融合基因35S-反義4CL1基因的重組載體pBan4CL。用質(zhì)粒pBan4CL按照常規(guī)方法轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM109感受態(tài)細(xì)胞。在含卡那霉素的LB平板培養(yǎng)篩選后，提取質(zhì)粒按常規(guī)方法對(duì)質(zhì)粒pBan4CL進(jìn)行測(cè)序，結(jié)果表明反義4CL1融合基因具有序列表中序列2的核苷酸序列，位于pBan4CL的5827bp-7463bp之間；序列表中的序列2由1637個(gè)堿基組成。2、煙草的轉(zhuǎn)化與鑒定分析按改進(jìn)的An方法，直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在Sm125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽(yáng)性克隆。含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/l，Km50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到OD600二0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到00600=0.2-0.3。將煙草無菌苗的葉片剪下，除去葉脈，切成0.5-1.Ocm的小塊，在菌液中浸泡2-3min，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在表面鋪一張濾紙的MS培養(yǎng)基上，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到含100mg/LKm，500mg/LCar(羧卞霉素)的MS培養(yǎng)基(0.5mg/LIAA，2.0mg/LBA)上28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)抗性芽長(zhǎng)到l-3cra時(shí)切下，轉(zhuǎn)到培養(yǎng)基中長(zhǎng)莖。當(dāng)莖長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，按照文獻(xiàn)(王關(guān)林，方宏筠，1999，科學(xué)出版社)的方法轉(zhuǎn)到含有卡那霉素和羧芐霉素到生根培養(yǎng)基中生根，得到再生苗。以在抗性培養(yǎng)基上生根的轉(zhuǎn)化苗的葉片總DNA、pBan4CL質(zhì)粒以及未轉(zhuǎn)化的煙草葉片的總DNA為模板，在引物Fanl—TTATATGCCTGCCAACTTTTC和Fan2—ATGGACGCCACAATGAATCCAC的引導(dǎo)下按常規(guī)方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果如圖12b所示，表明轉(zhuǎn)化苗樣品中產(chǎn)生一個(gè)約1700bp的片段，而以未轉(zhuǎn)化植株為負(fù)對(duì)照的PCR產(chǎn)物在L7Kb處無條帶。證明反義4CL1融合基因已經(jīng)整合到煙草基因組中。圖12b中，十ck為pBan4CL植物二元表達(dá)載體，一ck為未轉(zhuǎn)化煙草樣品，M為核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)，Trans為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草樣品。3、轉(zhuǎn)基因煙草的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因煙草和非轉(zhuǎn)基因煙草的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為陰性對(duì)照，以pBan4CL植物二元表達(dá)載體為陽(yáng)性對(duì)照，使用vSs/sMA&al限制性內(nèi)切酶在37度進(jìn)行酶解3小時(shí)，進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時(shí)。用lugPCR制得得反義4CL1基因作為模板DNA加蒸餾水至16ul。沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH二8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒自帶)至42。C。預(yù)雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42'C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS50。C清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液(100ml馬來酸緩沖液(0,1M馬來酸，0.15MNaQ，pH7.5)中加入0.3mltween20)清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置1小時(shí)。結(jié)果如圖13所示，表明轉(zhuǎn)基因煙草中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉(zhuǎn)基因煙草則沒有這條帶，證明該反義4CL1基因已經(jīng)插入轉(zhuǎn)基因煙草中。圖13中，CK為非轉(zhuǎn)基因煙草陰性對(duì)照，l為陽(yáng)性對(duì)照pBan4CL植物二元表達(dá)載體，2-4為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草。4、轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草中4CL1酶活性的測(cè)定轉(zhuǎn)基因煙草葉片和莖在液氮下粉碎，用提取緩沖液(0.2MTris-HC1pH7.5，8mMMgCl"5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶肽(Leup印tin))提取，提取液在18000g、4'C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白粗提液定量。蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定值如表8所示，得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖14所示。lml酶反應(yīng)液中包括O.2MTris-HC1，pH7.5，8mMMgCl"0.8mMATP，0.lmM底物(分別為4-香豆酸，阿魏酸和咖啡酸)和25-30ul粗提液，于24'C分別反應(yīng)5、10、15、20、25、30、35分鐘，然后測(cè)定A，A346，A35。，得到如圖15a和15b所示的空白煙草對(duì)照和轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草中4CL1酶活性曲線，表明4CL1酶在15min時(shí)的活性最高，因此，本研究在測(cè)定轉(zhuǎn)基因植株與空白植株中4CL1的活性時(shí)采用反應(yīng)時(shí)間為15rain時(shí)的酶活性。而且轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株的4CL1酶活性明顯低于空白植株的酶活性。lml酶反應(yīng)液和25-30ul粗提液，于24。C分別反應(yīng)15分鐘測(cè)定A,A346，A350的減少。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表9和圖16所示，表明轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草中的4CL1酶活性明顯低于空白煙草中的4CL1酶活性。圖16中，CK1，CK2和CK3為空白煙草植株，Samplel-Sample6為轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株。表8.蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定值<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>(1)從獲得的80多株轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因煙草植株中取5、6株，分別檢測(cè)了它們與空白煙草植株中木質(zhì)素含量及纖維素含量變化，結(jié)果如圖17b和圖17c所示，表明轉(zhuǎn)基因煙草植株的木質(zhì)素含量比空白植株平均下降了19.1%，同時(shí)，纖維素含量平均升高了11.4%。對(duì)實(shí)施例1中得到的6株轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因煙草植株與空白煙草植株木質(zhì)素與纖維素含量進(jìn)行分析，結(jié)果如圖18a和圖18b所示，表明轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因植株的木質(zhì)素含量比空白植株平均升高了36.83%，同時(shí)，纖維素含量平均下降了23.70%。通過對(duì)轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因、35S-反義4CL1融合基因煙草植株的分析發(fā)現(xiàn)，無論正義還是反義基因轉(zhuǎn)化獲得的轉(zhuǎn)基因植株木質(zhì)素與纖維素之間均表現(xiàn)出相互補(bǔ)償?shù)年P(guān)系。即木質(zhì)素含量在下降的同時(shí)，纖維素含量則有所上升；反之亦然。實(shí)施例3、培育木質(zhì)素含量升高的轉(zhuǎn)基因毛白楊7411、毛白楊741的轉(zhuǎn)化將構(gòu)建好的35S-4CLl植物二元表達(dá)載體pB4CL，按改進(jìn)的An方法，直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在Sm125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽(yáng)性克隆。含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sra100rag/1，Km50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到0D600=0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到0D60(H).2-0.3。將毛白楊741無菌苗的葉片剪下，切成0.5-1.0cm的小塊，在菌液中浸泡IOmin，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在毛白楊741葉片分化培養(yǎng)基上一MS培養(yǎng)基(0.lmg/LNM，1.0mg/LBA)，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到含100mg/LKm，250mg/LCar(羧卞霉素)的葉片分化MS培養(yǎng)基(0.lmg/LIAA，1.0mg/LBA)，28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。每隔M天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)莖長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，轉(zhuǎn)到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基(O.3mg/LNAA，1.Omg/LBA)中生根，結(jié)果得到再生苗14株。2、轉(zhuǎn)基因毛白楊741的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因毛白楊741和非轉(zhuǎn)基因毛白楊741的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，使用5)^I限制性內(nèi)切酶在30度酶解10小時(shí)后，1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2XSSC洗膜，于80。C干燥2小時(shí)。用lug由PCR得到的4CL1基因片段作探針，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42t。預(yù)雜交30min。取DNA探針(探針用量為25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42'C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS50°C清洗2次，每次5min。用lOOml洗滌液一100ml馬來酸緩沖液(Maleicacidbuffer)(0.1M馬來酸，0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse，封口，夾X光片，室溫放置1小時(shí)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因毛白楊741中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉(zhuǎn)基因毛白楊741則沒有這條帶，證明該4CL1基因已經(jīng)插入轉(zhuǎn)基因毛白楊741中。3、轉(zhuǎn)基因毛白楊7414CL1酶活性的測(cè)定將一年生的轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片在液氮下粉碎，用提取緩沖液(O.2MTris-HClpH7.5，8mMMgCl"5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶月太(Leup印tin))提取，提取液在18000g、4。C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白粗提液定量。lml酶反應(yīng)液中包括.0.2MTris-HCl，pH7.5，8mMMgCl2，0.8mMATP，0.lmM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液于24'C反應(yīng)12分鐘，然后測(cè)定A333的增加。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表ll所示，表明轉(zhuǎn)基因毛白楊741的葉片的4CL1酶活性有所增加。表11.轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片中4CL1酶活性分析<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>4、轉(zhuǎn)35S-4CL1融合基因毛白楊741葉片的木質(zhì)素、纖維素分析按照文獻(xiàn)(willis.A.lignin.MethodsinEnzymology，1988，161;13-30)描述的方法測(cè)定了一年生轉(zhuǎn)基因毛白楊741與空白毛白楊741植株的硫酸木質(zhì)素及纖維素含量，結(jié)果如表12所示，表明35S啟動(dòng)的毛白楊7414C11基因在穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)基因毛白楊741中，可以改變轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片的木質(zhì)素和纖維素含量。表12.轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片木質(zhì)素、纖維素分析<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實(shí)施例4、培育木質(zhì)素含量降低的轉(zhuǎn)基因毛白楊7411、毛白楊741的轉(zhuǎn)化按改進(jìn)的An方法，將實(shí)施例2中構(gòu)建好的35S-反義4CL1融合基因載體pBan4CL直接轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，在Sm125mg/L和Km50mg/L的YEB培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選，并挑取單克隆提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，得到陽(yáng)性克隆。含表達(dá)載體的農(nóng)桿菌LBA4404在YEB培養(yǎng)基(Sm100mg/l，Km50mg/L)中28°C震蕩培養(yǎng)到0D600=0.6-0.8，按1%-2%的比例用新鮮的YEB培養(yǎng)基(SmlOOmg/L)稀釋，繼續(xù)培養(yǎng)到0D600二0.2-0.3。將毛白楊741無菌苗的葉片剪下，切成0.5-1.Ocm的小塊，在菌液中浸泡IOmin，其間不斷搖動(dòng)，使薄片與菌液充分接觸，取出，用無菌濾紙吸干表面菌液，放在毛白楊741葉片分化培養(yǎng)基上一MS培養(yǎng)基(0.lmg/LNAA，l.Omg/LBA)，28。C暗培養(yǎng)4天，將外植體轉(zhuǎn)移到含lOOmg/LKm,250mg/LCar(羧卞霉素)的葉片分化MS培養(yǎng)基(0.lmg/LIAA，l.Omg/LBA)上28。C繼續(xù)培養(yǎng)，同時(shí)將未轉(zhuǎn)化的組織同樣處理作為負(fù)對(duì)照。每隔14天換一次培養(yǎng)基。當(dāng)莖長(zhǎng)到3-5cm時(shí)，轉(zhuǎn)到含有卡那霉素和羧芐霉素的生根培養(yǎng)基1/2MS培養(yǎng)基(O.3mg/LNAA，1.Omg/LBA)中生根，結(jié)果得到再生苗19株。2、轉(zhuǎn)基因毛白楊741的southern雜交按照常規(guī)方法提取轉(zhuǎn)基因毛白楊741和非轉(zhuǎn)基因毛白楊741的總DNA，以非轉(zhuǎn)基因煙草為對(duì)照，使用5i^I限制性內(nèi)切酶在30度酶解10小時(shí)后，1%瓊脂糖凝膠電泳，將電泳膠放在IO倍體積的變性液(1.5MNaCl，0.5MNaOH)中震蕩40min，再在10倍體積的中和液(1.5MNaCl，0.5MTris-Cl，pH7.0)中震蕩40min，使用20XSSC進(jìn)行DNA轉(zhuǎn)膜過夜，用2XSSC洗膜，于8(TC干燥2小時(shí)。用lugPCR得到的反義4CL1基因片段作探針，加蒸餾水至16ul，沸水浴10min，迅速置于冰水中5min。加入2ulDIG-HIGHPRIME,混勻。37。C保溫lh，加入0.2MEDTA(PH=8.0)，混勻。預(yù)熱雜交液(地高新試劑盒中自帶的雜交液)至42X:。預(yù)雜交30min。取DNA探針(25ng/ml雜交液)煮沸5min，迅速放置于冰水中。將變性探針DNA加入雜交液中混勻與雜交膜一起放入雜交袋中。除去氣泡，封口，42"C過夜。取出雜交膜用50ml2XSSC，0.1%SDS清洗2次，每次5min。100ml0.5XSSC，0.1%SDS5CTC清洗2次，每次5min。用100ml洗滌液一100mlMaleicacidbuffer(0.1MMaleticacid0.15MNaCl，pH7.5)中加入0.3mltween20清洗1-5min，加入80ml封閉液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用20ml抗體液(地高新試劑盒中自帶)保溫30min，用100ml洗滌液清洗2次，每次15min。用20ml檢測(cè)液平衡2-5分鐘，將雜交膜放在新雜交袋中，加入CSPD-ready-touselml除氣泡，保溫4分鐘。除去CSPD-ready-touse,封口，夾X光片，室溫放置l小時(shí)。結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因毛白楊741中出現(xiàn)一條1700bp的帶，而未轉(zhuǎn)基因毛白楊741則沒有這條帶，證明反義4CL1基因已經(jīng)整合到轉(zhuǎn)基因毛白楊741中。3、轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因毛白楊741中4CL1酶活性的測(cè)定將一年生的轉(zhuǎn)基因毛白楊741葉片在液氮下粉碎，用提取緩沖液(O.2MTris-HClpH7.5，8mMMgCl"5mMDTT，30%甘油，lug/ml亮抑酶肽(Le叩印tin))提取，提取液在18000g、4。C離心15min，上清液用于酶活性分析。使用BSA做標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)蛋白粗提液定量。lml酶反應(yīng)液中包括.O.2MTris-HC1，pH7.5，8mMMgCl2，0.8mMATP，0.lmM底物(4-香豆酸)和25-30ul粗提液于24'C反應(yīng)12分鐘，然后測(cè)定A333的增加。每個(gè)樣品做3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如表13所示，表明轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因毛白楊741中的4CL1酶活性明顯低于空白毛白楊741中的4CL1酶活性。表13.轉(zhuǎn)基因毛白楊741與空白毛白楊741植株中4CL1酶活性測(cè)定值<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>4、一年生轉(zhuǎn)基因毛白楊741，樹干的樹皮和木質(zhì)部的含水量、木質(zhì)素及纖維素含量測(cè)定按照文獻(xiàn)(willis.A.lignin.MethodsinEnzymology，1988，161;13-30)描述的方法測(cè)定了一年生轉(zhuǎn)基因毛白楊741與野生毛白楊植株的含水量、硫酸木質(zhì)素及纖維素含量，結(jié)果如表14所示，表明轉(zhuǎn)基因毛白楊741木質(zhì)部和樹皮的含水量和木質(zhì)素含量均低于野生毛白楊相應(yīng)部位，轉(zhuǎn)基因毛白楊741木質(zhì)部的纖維素含量低于野生毛白楊的木質(zhì)部，轉(zhuǎn)基因毛白楊741樹皮的纖維素含量高于野生毛白楊的樹皮。表14.一年生轉(zhuǎn)35S-反義4CL1融合基因毛白楊741的含水量、木質(zhì)素及纖維素分布分析表<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage21</formula>a^gitcttaatgaccctgaggcaacctcaagaacaatagacaaagaaggatggctgcacac1260aggcgatatcggctacattgatgatgatgatgagcttttcatcgttgacagattgaagga1320attgatcaagtataaagggtttcaggttgctcctgctgaactcgaagctttgttaatagc1380ccatccagagatatccgatgctgctgtagtaggattgaaagatgaggatgcgggagaagt1440tcctgttgcatttgtagtgaaatcagaaaagtctcaggccaccgaagatgaaattaagca1500gt3tatttc3aaacaggtgatattctacaagagaataaaacgagttttcttcattgaagc1560tattcccaaggcaccatctggcaagatcctgaggaagaatctgaaagaaaagttggcagg1620catataactgaagatgttactgaacatttaatcctctgtcttatttctttaatacttgag1680eiatc3ttgt3gtgttgaaccaagcatgcttggaaaagacacgtacccaacgtaagacagt174031741<210>2〈211〉1637〈212〉腿〈213>人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2ctctagattatatgcctgccaacttttcttgtgccttgggaatagcttcaatg犯gaaaagttttgaaatatactgcttaatttcatcttcaaatgcaacaggaacttctcccgcatcctatatctctggatgggctatt犯caaagctttatacttgatcaattccttc3atctgtc3aagccgatatcgcctgtgtgcagccatccttggtcattaagatatcctttcatgatctgattcctcggtagagaggcccctgtttctgggtcagtcccacatgcacctggttttatgtcgacteigaac3ggtcctgcctcggtcattccattagctctgacagtatcttcaagttccttgctcaaagaagacaagtcatgcttgtcaagattcagattcttcctcaggatcttgccagatg60ctcgttttattctcttgtagaatatcacct120cggtggcctgagacttttctgatttcacta180catxtttcaatcctactacagcagcatcgg240cgagttcagcaggagcaacctgaaaccctt300cgatgaaaagctcatcatcatcatcaatgt360ctttgtctattgttcttgaggttgcctcag420caccccggatgcagatctcaccaggctggt480caacaatcttcatctctgceittcctgacta540atggttccttggcaaatgccaagcacattg600atccctgaccaagtctagcctgaggaaact660ccaatggagcccctccagattttatcatcc了20caggtgacttagcaa/ttgacatcatcacag780gtggaacaaccggtgctatagataccttgtacttctcaatcaatcccagtaaagaaccaa840tctcaaactttggcattatcaaaatcggggcaccgactctcagcccgcagagcattattg900aattcagagcatagettatggaacataggcagcacacacagaatcacatcttcactgtgaa960aatacaggttaggattgtctccatctacctgttgagcaacactggttattagccctttgt1020gcgttaacatgaccccttttggcaaccctgtagtccctgatgaataaggcaatgctacga1080catcatcgggactaatgtcgacctgaggcgcttcattttcgtctgcctgtgttagctctg1140aaaagtgcaagcatccatccggggcagagtccacgcacatgaccttaacatcactttctc1200gggcaaaatctttaaccttctcgtagtaacaagcctgtgttatcagaagctttgctctcg1260aggccttggcatgttttgctagctctgcaggggtggagaaaggattggcagcagtgataa1320tggcacctctgtgtgaagcgcctaggaaagcaagcacgaattcaggtgaacttggtagga1380agagcatgatcacgtcaccttgttgaataccaatcttgttcagaccagaagcaactcttc1440ttgctgtgagctcaacgtcagcataggtgtagacatctccattcgcgccatttatcaggc1500aaggttttgatgaatggttagacaagttttcaagaacgtatgaatgcaggggaaggtttt1560tcgggatgtagatgtctggtaattttgagcgaaagatgaattcttcttgtggattcattg1620tggcgtccatcccgggg163權(quán)利要求1、一種調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法，是將含有反義4CL1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量降低的植物。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述反義4CL1基因是具有序列表中序列2的多核苷酸序列。3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于用于構(gòu)建所述含有反義4CL1基因的表達(dá)載體的出發(fā)載體為Ti類質(zhì)粒載體和病毒載體。4、根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述出發(fā)載體為Ti類質(zhì)粒載體。5、根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述Ti類質(zhì)粒載體為雙元載體。6、根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述雙元載體為pBI121。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述含有反義4CL1基因的表達(dá)載體為pBan4CL。8、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述植物為草本植物或木本植物；所述草本植物優(yōu)選為煙草，所述木本植物優(yōu)選為楊樹。9、根據(jù)權(quán)利要求l、2或3所述的方法，其特征在于所述轉(zhuǎn)化方法為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法、基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法或花粉管通道法，優(yōu)選為農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化法。全文摘要本發(fā)明公開了一種調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法。本發(fā)明所提供的調(diào)控植物木質(zhì)素含量的方法，是將含有4CL1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量升高的植物；將含有反義4CL1基因的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植物，得到木質(zhì)素含量降低的植物。本發(fā)明通過在植物細(xì)胞中用載體引入4CL1基因或反義4CL1基因，來生產(chǎn)木質(zhì)素含量升高或降低的轉(zhuǎn)基因植物特別是轉(zhuǎn)基因樹木，為培育木質(zhì)素含量降低或升高的植物以及改良樹木材性提供了一條重要的途徑。文檔編號(hào)C12N15/82GK101319227SQ20081012646公開日2008年12月10日申請(qǐng)日期2004年7月22日優(yōu)先權(quán)日2004年7月22日發(fā)明者蔣湘寧,趙艷玲,海陸,陳雪梅申請(qǐng)人:北京林業(yè)大學(xué)