專利名稱：：一種利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體制備微生物絮凝劑的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別涉及一種利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體制備微生物絮凝劑的方法。技術(shù)背景絮凝沉降技術(shù)是提高水質(zhì)處理效率的一種既經(jīng)濟又簡便的處理方法，被廣泛地應(yīng)用于工業(yè)廢水處理、給水處理、食品生產(chǎn)和發(fā)酵等工業(yè)中，隨著人們對環(huán)境污染問題的日益重視和人類生活水平的不斷提高，對水質(zhì)提出了越來越高的要求，同時給絮凝沉降技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展提供了廣闊的舞臺。目前，絮凝劑分為無機絮凝劑、有機絮凝劑和微生物絮凝劑三種，微生物絮凝劑是一種由微生物產(chǎn)生的具有絮凝活性的高分子化合物，可使液體中的固體懸浮顆粒、金屬離子、菌體細胞及膠體粒子等凝結(jié)、沉降，相比之下，利用生物技術(shù)得到的微生物絮凝劑具有高效、安全無毒、無二次污染等一系列優(yōu)點，對人類的健康和環(huán)境的保護具有很重要的現(xiàn)實意義，因此，微生物絮凝劑具有廣闊的應(yīng)用前景。微生物絮凝劑產(chǎn)生菌來源廣泛，種類較多。至今發(fā)現(xiàn)的具有絮凝性的微生物近80種(甘莉、孟召平，微生物絮凝劑的研究進展，水處理技術(shù)，2006-04:5-9)，其中細菌、真菌、放線菌及藻類均有分布，這些具有絮凝活性、被人關(guān)注的微生物大都篩選自土壤、淤泥、污水。目前，微生物絮凝劑的制備多利用糖或農(nóng)副產(chǎn)品作為生產(chǎn)原料，成本偏高，制約了微生物絮凝劑工業(yè)化生產(chǎn)和大規(guī)模應(yīng)用。該瓶頸問題的解決需要從兩個方面入手一是積極尋找廉價的原材料，大幅度降低生產(chǎn)成本，二是針對生物絮凝的理化性質(zhì)和用途，選擇合理的工業(yè)化提取工藝和使用方法(馬放等，復(fù)合型生物絮凝劑，中國專利號200610010369.6)，基于此，本發(fā)明將目光轉(zhuǎn)向工業(yè)發(fā)酵行業(yè)，利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體，直接開發(fā)成微生物絮凝劑，不僅大大降低了微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，同時也為發(fā)酵行業(yè)副產(chǎn)物的增值利用找到了一條出路。1,3-丙二醇和2.3-丁二醇是重要的化工原料，日益成為人們關(guān)注的熱點，其生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法，相比之下，微生物發(fā)酵法具有條件溫和、操作簡便、副產(chǎn)物少、環(huán)境污染小等優(yōu)點。隨著不可再生資源日益減少和世界人口的增多，以微生物發(fā)酵法為代表的綠色工業(yè)越來越被人們所重視，本發(fā)明首先通過利用以甘油或葡萄糖為主原料發(fā)酵生產(chǎn)1，3-丙二醇和2.3-丁二醇的副產(chǎn)物菌體來制備微生物絮凝劑。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體制備微生物絮凝劑的方法，如利用以甘油或葡萄糖為主原料發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇和2.3-丁二醇的副產(chǎn)物菌體來制備微生物絮凝劑，具體工藝是將克雷伯氏桿菌接入含甘油或葡萄糖的種子培養(yǎng)基中，30。C37。C培養(yǎng)12h24h，再將種子液按體積110%的接種量加入含甘油或葡萄糖濃度為3080g/l的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，304(TC條件下進行厭氧或有氧發(fā)酵，在發(fā)酵過程中通入01.Ovvm空氣，攪拌轉(zhuǎn)速30350rpm，流加甘油或葡萄糖使發(fā)酵液中甘油或葡萄糖濃度控制在1050g/l。并采用流加34M堿溶液來控制pH值5.08.0。發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后，采用膜過濾、離心等手段將發(fā)酵液固液分離，清液通過常規(guī)的脫鹽、蒸餾和真空精餾等步驟將l,3-丙二醇和2.3-丁二醇分離、提純，制備成產(chǎn)品1，3-丙二醇和2.3-丁二醇，固體(可含有少量發(fā)酵液)部分也就是發(fā)酵菌體，便可直接作為微生物絮凝劑使用。也可80105"C簡單加熱滅活處理或噴霧干燥，以便保存和運輸，對其絮凝活性影響不大。應(yīng)用時，每噸廢水先加入0500克氯化鈣，再加入0.11公斤未千燥的微生物絮凝劑(或20200克噴霧干燥的微生物絮凝劑)，混勻后用氫氧化鈉調(diào)pH值4.08.0，再充分混勻，靜置沉降即可。本發(fā)明的優(yōu)點在于，微生物絮凝劑直接來自發(fā)酵行業(yè)產(chǎn)生的副產(chǎn)物菌體，其不僅為發(fā)酵行業(yè)副產(chǎn)物的增值利用找到了一條出路，而且無需再專門對絮凝菌體進行培養(yǎng)，大大降低了微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本。具體實施方式本發(fā)明的目的是提供一種利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體制備微生物絮凝劑的方法，下面再以具體實施例對本發(fā)明予以進一步說明實例1(1)菌種克雷伯氏桿菌(2)發(fā)酵方式5L機械攪拌發(fā)酵罐，試劑甘油為原料，(3)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品1，3-丙二醇，副產(chǎn)少量2.3-丁二醇。A.培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基(L'1)發(fā)酵培養(yǎng)基(L—1)硫酸銨((NH4)2S04)2g4g磷酸氫二鉀(K2HP04*3H20)3.4g0.69g磷酸二氫鉀(KH2P04)1.3g0.25g硫酸鎂(MgS04)0.2g0.2g酵母粉(Yeastextract)lg1.5g甘油(glycerol)30g20-70g碳酸鈣(CaC03)lg/**微量元素(Traceelementsolution)2.0ml1.0ml*鐵溶液(Fe2+solution)1.0ml1.0ml泡敵少量*鐵溶液的配制每升水中加入FeS045.0g，37%的濃鹽酸4ml。**微量元素溶液的組成組分含量(mg'L")硫酸錳(MnS(V4H20)100氯化鋅(ZnCl2)70鉬酸鈉(Na2Mo04*2H20)35硼酸(H3B03)60氯化鈷(CoCl2*6H20)200硫酸銅(CuSCV5H20)29.28氯化鎳(NiCl2*6H20)25濃鹽酸G7%HC1)0.9mlB.發(fā)酵過程:種子培養(yǎng)將克雷伯氏桿菌接入含有30g/L甘油的種子培養(yǎng)基中(250ml三角瓶，裝液量50ml)，培養(yǎng)溫度3(TC，搖床轉(zhuǎn)速140rpm，好氧培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)采用5L發(fā)酵罐，裝液量禮，培養(yǎng)溫度37T:，用氫氧化鈉控制pH值6.8。將種子液按體積1%接種量接入含30g/L甘油的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵過程中流加甘油，控制發(fā)酵液中甘油濃度在20g/L左右。采用微氧發(fā)酵，通入0.2vvm空氣，轉(zhuǎn)速250rpm。48hr發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中1,3-丙二醇濃度81.53g/l,2.3-丁二醇濃度17.28g/l。(4)微生物絮凝劑的制備與應(yīng)用48小時發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液用離心機10000轉(zhuǎn)離心l分鐘使其固液分離，清液部分繼續(xù)進行1,3—丙二醇產(chǎn)品的提取，固體部分加入與離心上清液等量的水，混勻待用，于100毫升0.4%的高嶺土中，先加入1毫升1%氯化鈣溶液，再加入2毫升微生物絮凝液，未調(diào)pH值，充分混勻后，靜置6分鐘，原來渾濁的高嶺土懸濁液迅速結(jié)團沉淀，固液界面清晰，取上清液測定550mn下的OD值，計算絮凝率。結(jié)果如下-pH值OD550絮凝率％絮凝前絮凝后6.56.52.54160.135094.69實例2(1)菌種克雷伯氏桿菌(2)發(fā)酵方式5L機械攪拌發(fā)酵罐，葡萄糖為原料。(3)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品2，3-丁二醇。A.培養(yǎng)基培養(yǎng)基組成種子培養(yǎng)基(L—1)發(fā)酵培養(yǎng)基(L'1)硫酸銨((NH4)2S04)6.6g6.6g磷酸氫二鉀(K2HP04*3H20)13.7g13.7g磷酸二氫鉀(KH2P04)2.0g2.0g硫酸鎂(MgS04)0.25g0.3g硫酸鐵(FeS04)0.05g0.05g硫酸鋅(ZnS04)O適gO.OOlg硫酸錳(MnS04)O篇gO.OOlg磷酸氫二銨((NH4)2HP04)3.3glO.Og葡萄糖(glucose)30g150g碳酸鈣(CaC03)lg/泡敵少量B.發(fā)酵過程:種子培養(yǎng):將克雷伯氏桿菌接入含有30g/L葡萄糖的種子培養(yǎng)基中(250ml三角瓶，裝液量50ffll)，培養(yǎng)溫度37。C，搖床轉(zhuǎn)速180rpm,好氧培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)采用5L機械攪拌發(fā)酵罐，裝液量4L，培養(yǎng)溫度37'C，用氫氧化鈉控制pH值6.0。將種子液按體積10%接種量接入含150g/L葡萄糖的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵過程中流加質(zhì)量濃度為50%的葡萄糖溶液，控制發(fā)酵液中葡萄糖濃度在20g/L左右。采用有氧發(fā)酵，通入0.5wm空氣，轉(zhuǎn)速350rpm。72hr發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中2.3-丁二醇濃度87.36g/l。(4)微生物絮凝劑的制備與應(yīng)用72小時發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液用金屬膜進行過濾使其固液分離，清液部分繼續(xù)進行2,3—丁二醇產(chǎn)品的提取，固體(含有少量發(fā)酵液)加入與過濾清液等量的水，混勻后12rC20分鐘滅菌處理后待用，在100毫升稀釋30倍的藍墨水中，先加入1%氯化鈣溶液1毫升，再加入微生物絮凝液2毫升，充分混勻，靜置片刻即產(chǎn)生明顯的絮凝現(xiàn)象，30分鐘后藍色絮凝物沉淀，上清液顏色基本去除，比色測定脫色率達到85.79%。實例3(1)菌種克雷伯氏桿菌(2)發(fā)酵方式40L氣升發(fā)酵罐，生物柴油附產(chǎn)物甘油為原料。(3)發(fā)酵生產(chǎn)產(chǎn)品1,3-丙二醇，副產(chǎn)少量2.3-丁二醇。A.培養(yǎng)基同實例lB.發(fā)酵過程種子培養(yǎng)將克雷伯氏桿菌接入含有30g/L生物柴油附產(chǎn)物甘油的種子培養(yǎng)基中(250ml三角瓶，裝液量50ml)，培養(yǎng)溫度30。C，搖床轉(zhuǎn)速140rpm，好氧培養(yǎng)24h。發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵培養(yǎng)采用40L氣升發(fā)酵罐，裝液量30L，培養(yǎng)溫度37'C，用氫氧化鈉控制pH值6.8。將種子液按體積1%接種量接入含30g/L生物柴油附產(chǎn)物甘油的初始發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵過程中流加生物柴油附產(chǎn)物甘油，控制發(fā)酵液中甘油濃度在20g/L左右。采用微氧發(fā)酵，通入0.6vvm空氣。48hr發(fā)酵結(jié)束時，發(fā)酵液中1,3-丙二醇濃度78.90g/l，2.3-丁二醇濃度20.35g/l。(4)微生物絮凝劑的制備與應(yīng)用48小時發(fā)酵結(jié)束后，取發(fā)酵液用陶瓷膜進行過濾使其固液分離，清液部分繼續(xù)進行1,3—丙二醇產(chǎn)品的提取，固體部分加入與離心上清液等量的水，混勻待用，于IOO毫升某布料染整廠呈藍色的廢水中，先加入l毫升1%氯化鈣溶液，再加入2毫升微生物絮凝液，搖勻，用氫氧化鈉調(diào)pH值至7.5，充分混勻后，靜置15分鐘，取上清液測定550nm下的OD值，計算絮凝率。結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>權(quán)利要求1.一種利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體制備微生物絮凝劑的方法，其特征在于，工藝為將克雷伯氏桿菌接入含甘油或葡萄糖的種子培養(yǎng)基中，30℃～37℃培養(yǎng)12h～24h，再將種子液按體積1-10％的接種量加入含甘油或葡萄糖濃度為30～80g/l的初始發(fā)酵培養(yǎng)基，30～40℃條件下進行厭氧或有氧發(fā)酵，在發(fā)酵過程中通入0～1.0vvm空氣，攪拌轉(zhuǎn)速30～350rpm，流加甘油或葡萄糖使發(fā)酵液中甘油或葡萄糖濃度控制在10～50g/l；并采用流加3～4M堿溶液來控制pH值5.0～8.0；發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后，采用膜過濾、離心手段將發(fā)酵液固液分離，固體部分便可直接作為微生物絮凝劑使用。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物絮凝劑在80105"C加熱滅活處理或噴霧干燥，以便保存和運輸。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物絮凝劑應(yīng)用時，每噸廢水先加入0500克氯化鈣，再加入0.11公斤未干燥的微生物絮凝劑或20200克噴霧干燥的微生物絮凝劑，混勻后用氫氧化鈉調(diào)pH值4.08.0，再混勻，靜置沉降。4、根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述微生物絮凝劑的菌體來自發(fā)酵行業(yè)具有絮凝活性的生產(chǎn)菌。全文摘要一種利用發(fā)酵行業(yè)的副產(chǎn)物菌體制備微生物絮凝劑的方法，屬于生物化工
技術(shù)領(lǐng)域：
。工藝為將克雷伯氏桿菌接入含甘油或葡萄糖的種子培養(yǎng)基中，再將種子液加入含甘油或葡萄糖濃度初始發(fā)酵培養(yǎng)基，進行厭氧或有氧發(fā)酵，發(fā)酵生產(chǎn)結(jié)束后，采用膜過濾、離心手段將發(fā)酵液固液分離，所得固體部分便可直接作為微生物絮凝劑使用，而清液可通過脫鹽、蒸餾和真空精餾等步驟將1，3-丙二醇和2.3-丁二醇分離、提純，制備成產(chǎn)品1，3-丙二醇和2.3-丁二醇。本發(fā)明的優(yōu)點在于，菌體直接來自發(fā)酵行業(yè)，無需再專門對絮凝菌體進行培養(yǎng)，大大降低了微生物絮凝劑的生產(chǎn)成本，同時也為發(fā)酵行業(yè)副產(chǎn)物的增值利用找到了一條出路。文檔編號C12R1/22GK101254969SQ200810103128公開日2008年9月3日申請日期2008年3月31日優(yōu)先權(quán)日2008年3月31日發(fā)明者劉仲明,劉德華,燕孫申請人:清華大學(xué)