專利名稱：：一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物及其用法的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及雜交鵝掌楸的分子檢測引物及其用法，專用于鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸快速分子檢測和鑒定，屬于植物新品種鑒定領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
：木蘭科鵝掌楸屬(hWo&"^wO植物現(xiàn)存2個種，一種是北美鵝掌楸(Z.Linn.);另一種為鵝掌楸U.c/z/"e"se(Hemsl.)Sarg.〕。鵝掌楸生長迅速，樹干圓滿通直，材質(zhì)優(yōu)良，病蟲害很少，葉形奇特，花冠色澤淡雅，具有較高的觀賞價值，因此，鵝掌楸是優(yōu)良的園林綠化與工業(yè)用材樹種(王章榮，等.鵝掌楸屬樹種雜交育種與利用[M].北京:中國林業(yè)出版社，2005)。自1963年我國已故著名林木遺傳育種學(xué)家葉培忠教授成功獲得雜交鵝掌楸以來，南京林業(yè)大學(xué)先后培育出一批雜交鵝掌楸優(yōu)良家系與無性系，經(jīng)過40余年的試驗研究，證實了雜交鵝掌楸具有非常強的雜種優(yōu)勢。與2個親本種鵝掌楸與北美鵝掌楸相比，雜交鵝掌楸表現(xiàn)出速生、花色艷麗、葉大、抗逆性強、適應(yīng)性廣、幾乎無病蟲害等優(yōu)勢，是優(yōu)良的園林綠化及珍貴用材樹種。迄今為止，雜交鵝掌楸已在江蘇、福建、湖南、浙江、江西、山東、湖北、湖南、貴州、云南、北京等地區(qū)推廣，產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟和社會效益。2007年，因其葉形似中國傳統(tǒng)服裝馬褂以及雜交鵝掌楸速生、觀賞性好、適應(yīng)性廣等優(yōu)點而被列為2008年北京奧運會的奧運樹。隨著人們對雜交鵝掌楸利用價值的不斷認(rèn)識，其推廣應(yīng)用規(guī)模迅速擴大，導(dǎo)致其苗木供不應(yīng)求，苗木價格不斷攀升。為追逐利益的最大化，許多不法苗木經(jīng)營商常將鵝掌楸或北美鵝掌楸苗木假冒雜交鵝掌楸苗木出售，造成雜交鵝掌楸苗木市場的混亂，無形中傷害了正規(guī)苗木生產(chǎn)者與經(jīng)營商的積極性，必將阻礙雜交鵝掌楸的推廣和發(fā)展。因此，生產(chǎn)上急需一種方便、快速、可靠的雜交鵝掌楸鑒別方法。傳統(tǒng)的鵝掌楸種類鑒定基于形態(tài)特征(劉洪諤，沈湘林,曾玉亮.，中國鵝掌楸、美國鵝掌楸及其雜種在形態(tài)和生長形狀上的遺傳和變異，浙江林業(yè)科技，1991，11(5):1822)、解剖特征(葉金山,周守標(biāo),王章榮.雜種鵝掌楸葉解剖結(jié)構(gòu)特征的識別.植物資源與環(huán)境，1997，6(4):5860)和同工酶譜帶(黃敏仁,陳道明，雜種馬褂木的同工酶分析，南京林產(chǎn)工業(yè)學(xué)院學(xué)報，1979，1(2):156158)等方面。但形態(tài)特征在苗期差異并不明顯且受環(huán)境因素影響較大、同工酶標(biāo)記也受基因表達(dá)的限制而影響其使用?；跈z測DNA水平多態(tài)性的分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展為雜種識別和親本選配提供了有效的途徑。李周岐、王章榮采用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)，對雜種鵝掌楸識別方法進(jìn)行了探討(李周岐，王章榮.用RAPD標(biāo)記進(jìn)行鵝掌楸雜種識別和親本選配.林業(yè)科學(xué)，2002，38(5):169~174)，利用RAPD指紋圖譜進(jìn)行雜種馬褂木無性系鑒定(李周岐，王章榮.雜種馬褂木無性系隨機擴增多態(tài)DNA指紋圖譜的構(gòu)建.東北林業(yè)大學(xué)學(xué)報，2001，29(4):5-8)。但基于RAPD技術(shù)的分子檢測與品種鑒定存在以下主要缺陷(l)RAPD的檢測受反應(yīng)條件的影響較大，其重復(fù)性和穩(wěn)定性差，從而嚴(yán)重影響檢測結(jié)果的可信度。(2)需要使用多對引物，操作煩瑣，耗時長，不能達(dá)到快速、準(zhǔn)確鑒定的目標(biāo)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是克服以往雜交鵝掌楸鑒定方法存在的缺陷，提供結(jié)果高度準(zhǔn)確可靠、易于操作、靈敏度高的雜交鵝掌楸的檢測和診斷方法。該方法可以直接應(yīng)用于生產(chǎn)實踐，對于雜交鵝掌楸苗木的鑒定和交易無疑具有十分重要的意義。為達(dá)到上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案如下一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物，包括鵝掌楸特異性SSR引物對LT008L/R，其引物序列為LT008LCCGAACGATGATAAAGTGAGLT008RGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG上述LT008L和LT008R引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp雙帶位的產(chǎn)物。上述雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物的用法，包括DNA提取采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序用引物對LT008L和LT008R對鵝掌楸的樣本進(jìn)行PCR擴增；PCR的反應(yīng)體系lOpL，包括模板DNA1^L(約20~25ng)、10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2nL、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25^L、AmpliTaqGold0.05nL、ddH206.25nL;PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94'C4min;梯度降溫擴增15循環(huán)的94'C30s，60°C30s(此后每個循環(huán)退火溫度均比前一個循環(huán)低OTC)，72'C30s;—般性擴增15循環(huán)的94。C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72。Clh和最終的保存4。C;然后對PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后采用了銀染的方法對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無和大小來判定結(jié)果。本發(fā)明的關(guān)鍵技術(shù)是鵝掌楸簡單序列重復(fù)(simplerepeatsequence,SSR)標(biāo)記引物。所用的引物來自于本實驗室從北美鵝掌楸EST序列中開發(fā)出的EST-SSR引物(XuM,LiHQZhangB.FifteenpolymorphicsimplesequencerepeatmarkersfromexpressedsequencetagsofLiriodendrontulipifera.MolechlarEcologyNotes,2006，6:728~730)。北美鵝掌楸ESTs序列來自dbEST數(shù)據(jù)庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/dbEST/in-dex.html)。將EST序列下載后利用Phrap軟件拼接聚類得到6520條EST序列。然后用SSR鑒定軟件SSRIT(SimpleSequenceRepeatIdentificationTool)對這6520條EST序列進(jìn)行SSR檢索(http:〃www.gramene.org/gramene/searches/ssrt-ool)，對所檢索到的SSR-ESTs序列進(jìn)行引物設(shè)計，所用弓I物設(shè)計軟件為Primer3.0(http:Wwww.genome.wi.mit.edu)。最后成功設(shè)計176對EST-SSR引物。隨機選擇鵝掌楸、北美鵝掌楸各4個DNA樣品，雜交鵝掌楸3個樣品對176對引物進(jìn)行PCR擴增，篩選出有產(chǎn)物，主帶清晰的種特異性引物8對；然后再用不同種源的鵝掌楸11個DNA樣品、北美鵝掌楸5個DNA樣品，不同交配組合的雜交鵝掌楸4個DNA樣品，對初篩所得到的引物進(jìn)行復(fù)篩，最后選取一對特異性強、通用性好且多態(tài)性高的特異性SSR引物，即LT008L/R。該引物的EST序列號為250734，共273個堿基。該引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜種鵝掌楸中特異性擴增出190bp和180bp兩種產(chǎn)物。本發(fā)明方法適用于鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸的快速可靠的分子檢測和鑒定，對于雜交鵝掌楸苗木的鑒定具有重要的實用價值，與國內(nèi)其他方法相比，本發(fā)明具有以下的技術(shù)優(yōu)勢1、結(jié)果高度準(zhǔn)確、可靠本發(fā)明已經(jīng)對不同種源的鵝掌楸與北美鵝掌楸樣本，不同雜交組合的雜交鵝掌楸的DNA樣本進(jìn)行了檢測，檢測結(jié)果100%準(zhǔn)確，為檢測結(jié)果提供了高度的可靠性。2、操作簡便快速本實驗方法對樣本進(jìn)行簡單處理、PCR擴增和常規(guī)的聚丙烯酰胺凝膠電泳后即可以判斷結(jié)果，無需對擴增的產(chǎn)物進(jìn)行限制性內(nèi)切酶酶切。一般整個檢測過程可在4個小時內(nèi)完成。3、檢測結(jié)果靈敏度高對待檢測樣品僅需提供模板DNA20ng即可準(zhǔn)確鑒定其所屬種。4、取材方便、經(jīng)濟效益明顯本方法實驗采樣方便，葉片、冬芽、花等組織或器官均可為實驗材料，苗期、幼林期、成年大樹均可取樣，不受季節(jié)、地點限制。通過對鵝掌楸苗木進(jìn)行分子鑒定可以避免苗木生產(chǎn)與銷售過程中出現(xiàn)魚龍混雜的現(xiàn)象，對于雜交鵝掌楸的苗木生產(chǎn)與銷售具有十分重要的經(jīng)濟效益。圖1引物L(fēng)T008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸的基因組DNA樣本的PCR擴增電泳圖。其中，M:DNA標(biāo)記，1-7為不同組合的雜交鵝掌楸群體，8-14為北美鵝掌楸群體，15-21不同種源地的鵝掌楸群體。圖2引物L(fēng)T008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸的基因組DNA樣本的PCR擴增電泳圖。其中M:DNA標(biāo)記，1-6為不同組合的雜交鵝掌楸群體，7-12為北美鵝掌楸群體，13-18為不同種源地的鵝掌楸群體。具體實施例方式本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容是微衛(wèi)星SSR引物一對LT008L/R，其引物序列為CCGAACGATGATAAAGTGAGGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG該對引物可準(zhǔn)確地鑒定鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸。在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和1卯bp兩種產(chǎn)物。各種鵝掌楸存在條件下的鑒定方法DNA提取采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序用引物對LT008L/R對鵝掌楸的樣本進(jìn)行PCR擴增。PCR的方應(yīng)體系10nL，包括模板DNAl^iL(20~25ng)、10xBufferlpL、10mMdNTPs(上海捷瑞生物有限公司)0.2pL、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25pL、AmpliTaqGold(上海捷瑞生物有限公司)0.05pL、ddH206.25pL。PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94。C4min;梯度降溫擴增15循環(huán)的94'C30s，60'C30s(此后每個循環(huán)退火溫度均比前一個循環(huán)低0.7'C);72'C30s，一般性擴增15循環(huán)的94'C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72。Clh和最終的保存4。C。所用的PCR儀為APPL正DBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。然后對PCR產(chǎn)物加7uL上樣緩沖液，進(jìn)行8%聚丙烯酰胺凝膠電泳(500mL8。/。丙烯酰胺含尿素210g，甲叉lg，丙烯酰胺39g，10XTBE50ML)。200v穩(wěn)壓電泳lhours左右后固定染色；固定10min(固定液10%乙醇，0.5%乙酸)，ddH20漂洗2次每次2min;再用0.15%硝酸銀染色7min，雙蒸水漂洗2次每次2min，最后顯影(1.5%氫氧化鈉，0.00756%四硼酸鈉，1%甲醛)至條帶清晰，然后對擴增產(chǎn)物進(jìn)行大小判斷。實施例l:引物L(fēng)T008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸進(jìn)行種類鑒定。利用引物對LT008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸各15個樣本進(jìn)行種類鑒定。結(jié)果在鵝掌楸群體上都特異地擴增出190bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸群體上都特異地擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜交鵝掌楸群體上特異地擴增出180bp和190bp兩種產(chǎn)物雜，PCR的方應(yīng)體系10pL，包括模板DNAlpL10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2(上海捷瑞生物有限公司)、25mMMgCl2lpL、F-primer0.25pL、R-primer0.25^L、AmpliTaqGold0.05(上海捷瑞生物有限公司)、ddH206.25^L。PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94。C4min;梯度降溫擴增15循環(huán)的94。C30s，60'C30s(此后每個循環(huán)退火溫度均比前一個循環(huán)低0.7。C);72'C30s,—般性擴增15循環(huán)的94'C30s，49.5°C30s，72°C30s;延伸72°Clh和最終的保存4°C。所用的PCR儀為APPLIEDBIOSYSTEMSGeneAmpPCRsystem9700。所用的樣品具體情況見表1，檢測結(jié)果見圖1。表l、弓I物L(fēng)T008L/R對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>實施例2:引物L(fēng)T008L/R對不同于實施例1的鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸進(jìn)行種類鑒定。利用引物對LT008L/R對不同于實施例1中的鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜種鵝掌楸各15個樣本進(jìn)行種類鑒定。結(jié)果在鵝掌楸群體上都特異地擴增出l卯bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸群體上都特異地擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜交鵝掌楸群體上特異地擴增出180bp和190bp兩種產(chǎn)物。PCR的方應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序均同實例1的鵝掌楸的檢測分析步驟。所用的樣品具體情況見表2，檢測結(jié)果見圖2表2、引物L(fēng)T008L/R引物對鵝掌楸、北美鵝掌楸和雜交鵝掌楸_各15個樣本的特異性擴增結(jié)果_樣本數(shù)量LT008L/R檢測結(jié)果雜交組合(個)190bpl抑bpl卯，180bp鵝掌楸浙江松陽2+—_浙江富陽1+——四川敘永2+—江西廬山3+—云南西疇1+——云南馬關(guān)1+—_浙江遂昌1+—_貴州松桃1+—_貴州黎平1+——浙江安吉1+——安徽績溪1+—一北美鵝掌楸密蘇里3_+_路易斯6_+_佐治亞6—+—雜交鵝掌楸南卡X桑植11—_+北美X廬山21一—+密蘇里x黃山1_—+北美X廬山31__+路易斯X廬山11——+松陽x北卡1—_+北卡x松陽1——+路易斯x富陽1_+路易斯X廬山21_+路易斯x酉陽1——+南卡x松陽1_一+南卡X桑植21—_+廬山x路易斯1——+路易斯x松陽1_—+密蘇里x廬山1_—+實施例3:利用本發(fā)明的特異性引物L(fēng)T008L/R對鵝掌楸多父本混合控制授粉子代鑒定利用引物對LT008L/R對母本為南卡、路易斯和廬山，父本范圍已知(廬山、富陽、密蘇里、南卡、路易斯)的控制授粉子代進(jìn)行的86個樣本進(jìn)行種類鑒定。PCR的方應(yīng)體系和PCR反應(yīng)程序均同實施例1的鵝掌楸的檢測分析步驟。實驗的具體結(jié)果見表3。表3、引物L(fēng)T008L/R對鵝掌楸多父本混合控制授粉子代鑒定結(jié)果母本子代數(shù)量190bpLT008L/R檢測結(jié)果180bp190,180bp鑒定結(jié)果南卡7—+一北美鵝掌楸(北美鵝掌楸)31—+雜交鵝掌楸路易斯1—+_北美鵝掌楸(北美鵝掌楸)19———+雜交鵝掌楸廬山24+——鵝掌楸(鵝掌楸)4——+雜交鵝掌楸SEQUENCELISTING<110>南京林業(yè)大學(xué)〈120〉一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物及其用法<130〉njfu080917<140〉2008100224416<141〉2008-07-21<160>2〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉〈223〉LT008L<400>1ccgaacgatgataaagtgag<210>2<211>20<212〉DNA〈213〉A(chǔ)rtificial〈220〉<223>LT008R〈400〉2gtaggtttgaagggaagagg權(quán)利要求1、一種雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物，包括鵝掌楸特異性SSR引物對LT008L/R，其引物序列為LT008LCCGAACGATGATAAAGTGAGLT008RGTAGGTTTGAAGGGAAGAGG上述LT008L和LT008R引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp兩種產(chǎn)物。2、權(quán)利要求1所述雜交鵝掌楸快速分子檢測特異性引物的用法，包括DNA提取采用改進(jìn)的CTAB裂解-硅珠吸附法，按照如下的PCR反應(yīng)體系和反應(yīng)程序用引物對LT008L和LT008R對鵝掌楸的樣本進(jìn)行PCR擴增；PCR的反應(yīng)體系10pL，包括模板DNAluL、10xBufferlpL、10mMdNTPs0.2pL、25mMMgCl2ljxL、F-primer0.25^L、R-primer0.25nL、AmpliTaqGold0.05nL、ddH206.25nL;PCR反應(yīng)程序為預(yù)變性94'C4min;梯度降溫擴增15循環(huán)的94'C30s，60'C30s(此后每個循環(huán)退火溫度均比前一個循環(huán)低0.7'C)，72'C30s;—般性擴增15循環(huán)的94。C30s，49.5。C30s，72。C30s;延伸72°Clh和最終的保存4'C。；然后對PCR產(chǎn)物用8%聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，然后采用銀染方法對PCR擴增產(chǎn)物進(jìn)行檢測，根據(jù)擴增產(chǎn)物的有無和擴增產(chǎn)物大小來判定結(jié)果。全文摘要本發(fā)明公開了一種雜交鵝掌楸分子檢測引物及其用法，專用于鵝掌楸、北美鵝掌楸、雜交鵝掌楸的快速分子檢測和鑒定，屬于植物新品種分子鑒定領(lǐng)域。設(shè)計了一對SSR引物對即LT008L/R，該引物對在鵝掌楸中特異性擴增出190bp的產(chǎn)物，在北美鵝掌楸中特異性擴增出180bp的產(chǎn)物，在雜交鵝掌楸中特異性擴增出180bp和190bp兩種產(chǎn)物。本發(fā)明采用一對特異性SSR引物，進(jìn)行一次PCR擴增反應(yīng)，利用8％聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳，可直接根據(jù)產(chǎn)物的片斷進(jìn)行判斷。本發(fā)明可直接應(yīng)用于雜交鵝掌楸及鵝掌楸、北美鵝掌楸種水平的鑒定。文檔編號C12N15/11GK101348830SQ20081002244公開日2009年1月21日申請日期2008年7月21日優(yōu)先權(quán)日2008年7月21日發(fā)明者馮源恒,張紅蓮,李火根,猛胥申請人:南京林業(yè)大學(xué)