專利名稱：多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物187a5的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及作為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物的187A5基因，具體而言，本發(fā)明涉及多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的檢測(cè)手段、以及該細(xì)胞的檢測(cè)方法和;險(xiǎn)測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
多巴胺系統(tǒng)是與哺乳動(dòng)物腦內(nèi)重要的運(yùn)動(dòng)調(diào)節(jié)、激素分泌調(diào)節(jié)、情感調(diào)節(jié)等相關(guān)的非常重要的系統(tǒng)。因而，多巴胺能性神經(jīng)傳導(dǎo)的異?？梢l(fā)各種神經(jīng)系統(tǒng)障礙。例如，帕金森病是由中腦黑質(zhì)的多巴胺能神經(jīng)元特異性脫落原因引起的錐體外系統(tǒng)神經(jīng)變性疾病(HARRISON'S PRINCIPLESOF INTERNAL MEDICINE第2巻第23版，Isselbacher等編，McGraw-Hill Inc.:NY(1994)pp.2275-7)。
帕金森病的治療方法主要采用口服給與L-DOPA(3,4-二羥基苯丙氨酸)的方法以補(bǔ)償多巴胺產(chǎn)量的減少，但已知該方法療效的持續(xù)性不好。
因此，作為補(bǔ)償失去的多巴胺能神經(jīng)元的方法，人們最近正在嘗試一種移植含有多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的6-9周齡流產(chǎn)胚胎的中腦腹側(cè)區(qū)的治療方法(美國(guó)專利第56卯927號(hào)；Spencer等人(1992) N. Engl. J. Med. 327:1541-8; Freed等人(1992) N. Engl. J. Med, 327: 1549-55; Widner等人(1992) N.Engl. J. Med. 327: 1556-63; Kordower等人(1995) N. Engl. J. Med.332:1118-24; Defer等人(1996) Brain 119: 41-50; Lopez-Lozano等人(1997)Transp. Proc. 29: 977-80 )。但是，現(xiàn)階段，該方法不僅在細(xì)胞供應(yīng)方面和倫理方面存在問題(Rosenstain(1995) Exp. Neurol. 33: 106; Turner等人(1993)Neurosurg. 33: 1031-7)，而且還被指出在感染污染的危險(xiǎn)性、移植物的免疫排斥(Lopez-Lozano et al, (1997) Transp. Proc. 29: 977-80; Widner andBrudin (1988) Brain Res. Rev. 13: 287-324 )、由于與糖酵解相比胚胎組織更主要地依賴脂類代謝而造成的存活率低下(Rosenstain(1995) Exp. Neurol. 33:106)等各個(gè)方面存在問題。為了解決倫理層面、供應(yīng)不足等問題，人們又提出了例如利用豬源的
皮質(zhì)、紋及中腦細(xì)胞的方法等。(例如，特表平10-508487號(hào)公報(bào)；特表平10-508488號(hào)公報(bào)；特表平10-509034號(hào)公報(bào))。在這些方法中，為了抑制排斥反應(yīng)，必須要進(jìn)行改變細(xì)胞表面抗原(MHC-I類抗原)的繁雜操作。作為消除移植物排斥的方法，例如，有人提出可通過同時(shí)移植Sertoli細(xì)胞而進(jìn)行局部免疫抑制(特表平11-509170號(hào)公報(bào);特表平11-501818號(hào)公報(bào)；Seawry和Cameron (1993) Cell Transplant 2:123-9 )。雖然也可從MHC匹配的有血緣關(guān)系的人、他人的骨髓、骨髓銀行及臍帶血銀行等獲取移植細(xì)胞，但如果能夠利用患者自身的細(xì)胞，就可以無需多余的操作和步驟而解決排斥反應(yīng)的問題。
因而，有望實(shí)現(xiàn)來自于胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)、骨髓間質(zhì)細(xì)胞等非神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞的體外多巴胺能神經(jīng)元分化體系作為移植材料的應(yīng)用，而以此代替流產(chǎn)胚胎來源的細(xì)胞。實(shí)際上，有報(bào)道稱向大鼠帕金森病模型的病變紋移植后，ES細(xì)胞來源的多巴胺能神經(jīng)元可以具有功能性(Kim et al. (2002)Nature 418: 50-56)?？梢哉J(rèn)為將來，源自ES細(xì)胞或患者本人的神經(jīng)干細(xì)胞的再生治療會(huì)越來越重要。
在神經(jīng)組織損傷的治療方面，腦機(jī)能的再構(gòu)建是必須的，為了能夠與周圍的細(xì)胞形成合適的連接(形成網(wǎng)絡(luò))，必須移植不是成熟細(xì)胞而可以體內(nèi)分化為神經(jīng)元的細(xì)胞。在神經(jīng)元祖細(xì)胞移^i方面，除上述供給方面的問題之外，該祖細(xì)胞可能分化為不均一的細(xì)胞群，也是存在的問題之一。例如，在帕金森病的治療中，必須從含有兒茶酚胺的神經(jīng)元中選擇性地移植多巴胺能神經(jīng)元。目前為止，作為已經(jīng)提出的可用于帕金森病治療的移植細(xì)胞，例如包括紋狀體(Lindvall et al. (1989) Arch. Neurol. 46: 615-31; Widneret al. (1992) N. Engl. J. Med. 327: 1556-63 )、人胚胎神經(jīng)來源的無限增殖化細(xì)胞系(特表平8-509215號(hào)公報(bào)；特表平11-506930號(hào)公報(bào)；特表2002-522070號(hào)公報(bào))、NT2Z細(xì)胞的有絲分裂后人神經(jīng)元(特表平9-5050554號(hào)公報(bào))、神經(jīng)元原基細(xì)胞(特表平11-509729號(hào)公報(bào))、通過外源基因轉(zhuǎn)染而產(chǎn)生多巴胺等兒茶酚胺類物質(zhì)的細(xì)胞、骨髓基質(zhì)細(xì)胞(特表2002-504503號(hào)公報(bào)；特表2002-513545號(hào)公報(bào))、基因修飾的ES細(xì)胞(Kim et al. (2002) Nature 418:50-56)等。然而，上述細(xì)胞均非僅含有多巴胺能神經(jīng)元或可分化為多巴胺能神經(jīng)元的細(xì)胞。作為從未分化的細(xì)胞群中選擇性地濃縮、分離多巴胺能神經(jīng)元的方法，
有人提出在多巴胺能神經(jīng)元表達(dá)的酪氨酸羥化酶(以下也稱為"TH")等的
基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的控制下，將表達(dá)熒光蛋白的報(bào)告基因?qū)爰?xì)胞群 中的各細(xì)胞，通過分離發(fā)出熒光的細(xì)胞，實(shí)現(xiàn)多巴胺能神經(jīng)元在存活狀態(tài)
下的可視化，進(jìn)而進(jìn)行濃縮、分離或鑒定的方法(特開2002-51775號(hào)公報(bào))。 但是在該方法中，外源基因?qū)脒@樣繁瑣復(fù)雜的過程是必不可少的，而且 在用于基因治療的目的時(shí)，報(bào)告基因的存在也造成毒性、免疫原性方面的 問題。
由此看來，現(xiàn)階段帕金森病移植治療中的一個(gè)大問題是流產(chǎn)胚胎的 中腦腹側(cè)區(qū)來源的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞或分化誘導(dǎo)而得的多巴胺能神經(jīng) 元祖細(xì)胞均是多種細(xì)胞的混合物?？紤]到形成神經(jīng)回路的安全性，希望能 夠僅分離出目的細(xì)胞種類來使用。而且，考慮到細(xì)胞在移植目標(biāo)的腦內(nèi)的 存活以及正確形成網(wǎng)絡(luò)的能力，從治療效果的觀點(diǎn)來看，可以說希望分離
出盡量早期的增殖祖細(xì)胞來進(jìn)行移植。
到目前為止，已經(jīng)報(bào)導(dǎo)了在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中表達(dá)的基因 ——Lrp4 (WO2004/065599號(hào)公報(bào))。此外，還報(bào)導(dǎo)了數(shù)個(gè)多巴胺能神經(jīng)元 祖細(xì)胞的標(biāo)志物(W02004/038018號(hào)公報(bào)、WO2005/052190號(hào)公報(bào))。

發(fā)明內(nèi)容
為了分離出在多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞 中選擇性表達(dá)的基因，本發(fā)明人等從大鼠13.5日胚中腦腹側(cè)和后腦腹側(cè)分 離了 Lrp4(多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因)蛋白陽性的細(xì)胞，采用差 減法(N-RDA)法在中腦中尋找Lrp4陽性細(xì)胞特異性基因，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了在多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)的基因(187A5基因，在本說明書中 也簡(jiǎn)稱為"187A5")(實(shí)施例2)。本發(fā)明正是基于以上認(rèn)識(shí)。
本發(fā)明的目的是提供多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞)的檢測(cè)手段、多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞)的檢測(cè)方法和多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞)的檢測(cè)試劑盒。
此外，本發(fā)明目的還在于提供對(duì)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的分化誘導(dǎo)有效的物質(zhì)的篩選方法。此外，本發(fā)明目的還在于提供用于帕金森病治療的多巴胺能神經(jīng)元 祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的制造方法。
本發(fā)明提供選自以下的(i)、 (ii)、 (iii)和(iv)中的多核苷酸(以下也稱 "187A5基因，，)
(i) 包含SEQIDNO:l的核苦酸序列的多核苷酸；
(ii) 編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序 列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下 述核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO:l的核苷酸序列中發(fā) 生一個(gè)或多個(gè)核普酸的插入、取代、缺失而成的核苷酸序列和/或在SEQID NO:l的核香酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而成的 核苦酸序列；
(iii) 與由SEQ ID NO:l的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜 交，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能
的蛋白的多核苷酸；以及
(iv) 與由SEQ ID NO:l的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸具有70%以上的 同一性，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基S吏序列構(gòu)成的蛋白等同的 功能的蛋白的多核苷酸。
本發(fā)明還提供選自以下的(v)、 (vi)、 (vii)和(viii)中的蛋白(以下又稱 "187A5蛋白質(zhì)"):
(v) 包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；
(vi) 由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失而成的氨基酸 序列和/或在SEQ ID NO:2的氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè) 氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii) 由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ IDNO:2的 氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；和
(viii) 由與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有70。/o以上同一性的氨基酸序 列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的 蛋白。本發(fā)明還提供能夠與187A5基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的、 用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的檢測(cè)或選 擇的探針或引物(以下分別也稱"本發(fā)明的探針"和"本發(fā)明的引物")。
本發(fā)明還提供用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞)的檢測(cè)或選擇的、對(duì)187A5蛋白具有結(jié)合性的抗體(以下也稱"本發(fā)明 的抗體")。
本發(fā)明還提供多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞) 的檢測(cè)或選擇方法(以下也稱"本發(fā)明的檢測(cè)方法")，該方法包括檢測(cè)187A5 基因的表達(dá)或187A5蛋白的步驟。
本發(fā)明還提供用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞)的檢測(cè)或選擇的試劑盒(以下也稱"本發(fā)明的試劑盒")，該試劑盒至 少包含本發(fā)明的探針、引物、引物組或抗體。
本發(fā)明還提供用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞)的檢測(cè)或選擇的試劑(以下也稱"本發(fā)明的檢測(cè)用試劑")，該試劑至 少包含本發(fā)明的探針、引物、引物組或抗體。
本發(fā)明還提供對(duì)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞)的分化誘導(dǎo)有效的物質(zhì)的篩選方法，該方法包括檢測(cè)187A5基因的表達(dá) 或187A5蛋白的步驟。
本發(fā)明提供用于治療帕金森病的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的制備方法。
本發(fā)明的探針、引物、引物組和抗體可以在中腦中作為多巴胺能神經(jīng) 元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞特異性標(biāo)志物使用。因此，本發(fā) 明在移植材料的純度檢測(cè)、多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增 殖祖細(xì)胞的體外分化誘導(dǎo)方法的開發(fā)等方面是極其有價(jià)值的，其在推進(jìn)再 生醫(yī)療的實(shí)用化方面做出了很大貢獻(xiàn)。此外，本發(fā)明的蛋白并非簡(jiǎn)單地表 達(dá)，而是蛋白的一部分表達(dá)在細(xì)胞外。因此，通過以本發(fā)明的蛋白的細(xì)胞 外域?yàn)橹笜?biāo)，不僅能夠確實(shí)地檢測(cè)生活狀態(tài)的細(xì)胞，該可以分離并獲取該 細(xì)胞，這可以說對(duì)再生醫(yī)療的實(shí)用化做出了更大貢獻(xiàn)。


圖1顯示了多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物基因的表達(dá)時(shí)期。圖2:采用免疫染色法對(duì)大鼠14.5日胚的中腦和后腦中Lrp4、 TH蛋白 的表達(dá)進(jìn)行分析所得的結(jié)果。
圖3:采用RT-PCR法對(duì)中腦和后腦Lrp4陽性細(xì)胞中187A5、 Lmxla 以及Lrp4的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析所得的結(jié)果。
圖4:采用原位雜交對(duì)小鼠12.5日胚的中腦和后腦中187A5和Lrp4的 mRNA表達(dá)進(jìn)行分析所得的結(jié)果。
圖5:采用RT-PCR法對(duì)通過SDIA法從ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)得到的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中187A5、 Lmxla以及Lrp4的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析 所得的結(jié)果。
圖6:釆用RT-PCR法對(duì)通過5階段法從ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)得到的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中187A5、 Lmxla以及Lrp4的mRNA表達(dá)進(jìn)行分析 所得的結(jié)果。
圖7為顯示小鼠187A5和187A5-SEAP的圖。
圖8:對(duì)187A5的信號(hào)序列活性的分析結(jié)果。
圖9:采用細(xì)胞表面蛋白的生物素化》務(wù)飾法對(duì)187A51蛋白的細(xì)胞表面 表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖10:采用FACS分析考察187A5蛋白的細(xì)胞表面表達(dá)的結(jié)果。圖中 方框包圍的部分表示187A表達(dá)細(xì)胞。
圖11:采用免疫染色法對(duì)小鼠11.5日胚的中腦和后腦腹側(cè)的187A5蛋 白的表達(dá)進(jìn)行分析的結(jié)果。
圖12:采用FACS分析對(duì)小鼠12.5日胚的中腦和后腦腹側(cè)的187A5蛋 白和Lrp4蛋白的表達(dá)進(jìn)行考察的結(jié)果。
圖13:采用FACS分析對(duì)通過SDIA法從ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)得到的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中187A5蛋白和Lrp4蛋白的表達(dá)進(jìn)行考察的結(jié)果。
圖14:對(duì)通過SDIA法從ES細(xì)胞分化誘導(dǎo)得到的187A5/Lrp4共陽性 細(xì)胞進(jìn)行分離和培養(yǎng)的結(jié)果。
圖15示意性地顯示了可用于選擇多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的DNA 構(gòu)建體的結(jié)構(gòu)。
發(fā)明的具體實(shí)施方式
以下，針對(duì)本發(fā)明進(jìn)行具體說明。以下的描述是用于說明本發(fā)明的示 例，并非意味著本發(fā)明僅限于這些實(shí)施方式。本說明書中使用的全部技術(shù) 術(shù)語、科學(xué)術(shù)語和專業(yè)術(shù)語均具有本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員一 般性理解的含義，這里僅是出于對(duì)特定實(shí)施方式進(jìn)行說明的目的而使用， 并非意味著限定。只要不脫離其要旨，本發(fā)明可以各種方式實(shí)施。而且， 本說明書引用全部現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)和公開公報(bào)、專利公報(bào)及其它專利文獻(xiàn)均 作為參考并入本說明書中，可以用于本發(fā)明的實(shí)施。
在本發(fā)明中，作為餘測(cè)或選擇的對(duì)象的"多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞"是 指成熟前的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞。
此外，在本發(fā)明中，作為檢測(cè)或選擇的對(duì)象的"多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞，，是指分裂停止前的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。
多巴胺能神經(jīng)元從神經(jīng)上皮細(xì)胞開始，歷經(jīng)增殖祖細(xì)胞(proliferative progenitor cell)、有絲分裂后的前體細(xì)月包(postmitotic precursor cell)等分4匕階 段，分化為成熟多巴胺能神經(jīng)元。多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞是多巴胺能神經(jīng) 元的祖細(xì)胞；這其中，多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞是多巴胺能神經(jīng)元的最 早期的祖細(xì)胞，因而，可以期待其具有移植目標(biāo)的腦內(nèi)的高存活率和高網(wǎng) 絡(luò)形成能力。因此，多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，特別是多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞對(duì)帕金森病等起因于多巴胺能神經(jīng)元的變性脫落造成的多巴胺減少 的疾病的移植治療是有價(jià)值的。
以本發(fā)明的探針、引物、引物組或抗體為指標(biāo)選擇出的細(xì)胞是多巴胺 能神經(jīng)元祖細(xì)胞，所以，在安全性、存活率、網(wǎng)絡(luò)形成能力等方面，其與 現(xiàn)有的異種細(xì)胞集團(tuán)或?qū)肓送庠椿虻亩喟桶纺苌窠?jīng)元祖細(xì)胞相比是帕 金森病等神經(jīng)變性疾病的移植治療所優(yōu)選的。特別是，當(dāng)使用本發(fā)明的探 針、引物、引物組或抗體檢測(cè)或選擇的細(xì)胞是分裂停止前的多巴胺能神經(jīng) 元祖細(xì)胞即增殖中的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞時(shí)，有可能在腦內(nèi)的最適位置 分化成熟，還存在多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞在體內(nèi)進(jìn)一步增殖的可能性，因 而，可以期待更長(zhǎng)期的治療效果。因此可以說，本發(fā)明在帕金森病等神經(jīng) 變性疾病的有效移植治療的實(shí)用化方面開辟了途徑。 [187A5基因和蛋白]
在本發(fā)明中，"187A5基因"表示編碼187A5蛋白的那些，不僅包括cDNA，還包括基因組DNA。此外，還包括相應(yīng)的RNA。
在本發(fā)明中，作為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞存在的指標(biāo)的"187A5基因"， 在小鼠中，已經(jīng)作為功能未知序列登錄在數(shù)據(jù)庫(kù)中，而在人、大鼠、牛、 犬、黑猩猩等中，僅是預(yù)測(cè)了序列。公開每個(gè)序列的GenBank登錄號(hào)如下。 人XM—044062(SEQ ID NO:3 (石咸基序列)、SEQ ID NO:4 (氨基酸序列)， 以下順序同)、AK126715 (SEQ ID NO:5、 SEQ ID NO:6)、 HSM803256 (SEQ ID NO:7、 SEQ ID NO:8)、 HSM803467 (SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO: 10)
小鼠AK028289(SEQIDNO:11、 SEQIDNO:12)、 AK157823 (SEQ ID NO:13(堿基序列))、AK028541 (SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 15)、 AK035053 (SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 17)、 XM—485684 (SEQ ID NO:18、 SEQIDNO:19)、 AK163356 (SEQ ID NO:20(堿基序列)) 大鼠XM—344107(SEQIDNO:21、 SEQIDNO:22) 牛XM一509147(SEQIDNO:23、 SEQIDNO:24) 犬XM—543360 (SEQ ID NO:25、 SEQIDNO:26) 黑猩猩XM—522557 (SEQ ID NO:27、 SEQIDNO:28) 在本發(fā)明中，作為在中腦部位的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)中選擇性表達(dá)的基因，人187A5基因的cDNA序列(SEQ ID NO:l)已經(jīng)確定；此外，作為在多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)中選擇性表達(dá)的蛋白(多肽)，人18了A5蛋白(多肽)的氨基酸 序列(SEQ ID NO:2)已經(jīng)確定。
本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠基于SEQ ID NO:l的187A5基因核苷酸序列或 SEQ ID NO:2的187A5蛋白氨基酸序列，確定各種動(dòng)物的187A5基因核苷 酸序列或187A5蛋白氨基酸序列。例如，基于人或小鼠的187A5基因或 187A5蛋白進(jìn)行同源性檢索，可以檢索并確定該動(dòng)物的187A5基因或187A5 蛋白。因此，在本發(fā)明中，"187A5基因"和"187A5蛋白，，除了是指人來 源的187A5基因或人來源的187A5蛋白之外，還包括各種動(dòng)物(優(yōu)選哺乳動(dòng) 物)的187A5基因或187A5蛋白。
作為187A5基因的例子，可以列舉出
編碼包含SEQ IDNO:2、 SEQ ID NO:4、 SEQ ID NO:6、 SEQ ID NO:8 或SEQIDNO:10的氨基酸序列的人187A5蛋白的多核苷酸；
19編碼包含SEQ ID NO: 12、 SEQ ID NO:15、 SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO:19的氨基酸序列的小鼠187A5蛋白的多核苷酸；
編碼包含SEQIDNO:22的氨基酸序列的大鼠187A5蛋白的多核苷酸； 編碼包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的牛187A5蛋白的多核脊酸； 編碼包含SEQIDNO:26的氨基酸序列的犬187A5蛋白的多核苷酸；和 編碼包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的黑猩猩187A5蛋白的多核苷酸。
作為187A5基因的例子，還可以列舉出
包含SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:3 、 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:9所示的人187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；
包含SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:13、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:16、 SEQ ID NO:18或SEQ ID NO:20所示的小鼠187A5基因的核苷酸序列的多 核苷酸；
包含SEQIDNO:21所示的大鼠187A5基因的核苷酸序列的多核苦酸； 包含SEQIDNO:23所示的牛187A5基因的核苷酸序列的多核苷酸；包 含SEQ ID NO:25所示的犬187A5基因的核苦酸序列的多核苷酸；和
包含SEQ ID NO:27所示的黑猩猩187A5基因的核苦酸序列的多核苷酸。
作為187A5基因，可以列舉出選自以下的(i，)、 (ii，)、 (iii，)和(iv，)中的多 核芬酸
(i，)包含SEQIDNO:l、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQ ID NO:9、 SEQ ID NO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 18、 SEQIDNO:20、 SEQIDNO:21、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的核苷酸序列的多核苦酸；
(ii，)編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由 下述核苷酸序列編碼，所述核香酸序列是在SEQIDNO:l、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQIDNO:14、 SEQ ID NO: 16、 SEQIDNO:18、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:21、 SEQIDNO:23、 SEQIDNO:25或SEQIDNO:27的核香酸序列中發(fā) 生一個(gè)或多個(gè)核芬酸的插入、取代、缺失而成的核苦酸序列和/或在上述序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核香酸的增加而成的核普S吏序列；
(iii，)下述多核苷酸，所述多核苷酸與由SEQIDN0:1、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:13、 SEQIDNO:14、卿ID NO:16、 SEQIDNO:18、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:21、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的核苦酸序列構(gòu)成 的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白；
(iv，)下述多核苦酸，所述多核苷酸與由SEQIDNO:l、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:13、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:16、 SEQ ID NO:18、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:21、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的核普酸序列構(gòu)成 的多核苷酸具有70%以上的同一性，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨 基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白。
作為187A5基因，可以列舉出編碼選自以下的(v，)、 (vi，)、 (vii，)和(viii，) 中的蛋白的多核苷酸
(v，)包含SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQ ID NO:12、 SEQIDNO:15、 SEQIDNO:17、 SEQ ID NO:19、 SEQIDNO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28 的氨基酸序列的蛋白；
(vi，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQIDNO:17、 SEQIDNO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQIDNO:26或SEQIDNO:28的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨 基酸的插入、取代、缺失，和/或在上述氨基酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生 一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii，)由下述多核苷酸編碼，且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID NO:2、 SEQ IDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQ ID NO:17、 SEQIDNO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQIDNO:26或SEQIDNO:28的氨基酸序列的多核普酸在嚴(yán)格條件下雜交；
(viii，)由與SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQ ID NO:17、 SEQ ID NO:19、 SEQIDNO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28 的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQID NO: 2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白。
此外，本發(fā)明優(yōu)選提供選自以下的(i")、 (ii")、 (iii，，)和(iv")中的多核苷
酸二
(i")包含SEQIDNO:l的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii")編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由 下述核苷酸序列編碼，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO:l的核苷酸序列中 發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、取代、缺失和/或在該核苷酸序列的一個(gè)或 兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii")與由SEQ ID NO:l的核苦酸序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下 雜交，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功 能的蛋白的多核苷酸；
(iv，，)與由SEQ IDNO:l的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸具有70%以上的 同一性，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的 功能的蛋白的多核苷酸。
此外，本發(fā)明優(yōu)選提供編碼選自以下的(v，，)、 (vi，，)、 (vii，，)和(viii，，)中的 蛋白的多核苷酸
(v")包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白；
(vi")由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或在該氨基 酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序 列；
(vii")由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID NO:2的 氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；和(viii，，)由與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸 序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能 的蛋白。
本發(fā)明更優(yōu)選提供選自以下的(i，，，)、 (ii，，，)、 (iii，，，)和(iv，，，)中的人來源 多核香酸
(i"，)包含SEQIDNO:l的核苷酸序列的多核苷酸；
(ii"，)編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸 序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由 下述核普酸序列編碼，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO:l的核苷酸序列中 發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苦酸的插入、取代、缺失和/或在該序列的一個(gè)或兩個(gè)末 端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii，")與由SEQIDNO:l的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜 交，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能 的蛋白的多核苷酸；
(iv，，，)與由SEQIDNO:l的核苦酸序列構(gòu)成的多核苦酸具有95%以上的 同一性，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的 功能的蛋白的多核苷酸。
此外，本發(fā)明更優(yōu)選提供編碼選自以下的(v"，)、 (vi，")、 (vii"，)和(viii，") 中的人來源的蛋白的多核苷酸
(v，")包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；
(vi"，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序 列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或在該序列 的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii，")由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID NO:2 的氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；以及
(viii"，)由與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有95%以上同一性的氨基酸 序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能 的蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選提供包含SEQ ID NO:l的核苷酸序列的人來源的多核芬酸。
此外，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選提供編碼包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的 人來源的蛋白的多核苷酸。
作為187A5蛋白(多肽)的例子，可以列舉出
包含SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:IO的氨基酸序列的人187A5蛋白；
包含SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQ ID NO:17或SEQ ID NO:19 的氨基酸序列的小鼠187A5蛋白；
包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列的大鼠187A5蛋白；
包含SEQ ID NO:24的氨基酸序列的牛187A5蛋白；
包含SEQ ID NO:26的氨基酸序列的犬187A5蛋白；和
包含SEQ ID NO:28的氨基酸序列的黑猩猩187A5蛋白。
作為187A5蛋白(多肽)的例子，還可以列舉出
由包含SEQ ID NO: 1 、 SEQ ID NO:3 、 SEQ ID NO:5 SEQ ID NO:7或SEQ IDNO:9所示的人187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列編碼的蛋白；
由包含SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14 SEQ ID NO: 16 或SEQIDNO:18或SEQIDNO:20所示的小鼠187A5基因核苷酸序列的核 苷酸序列編碼的蛋白；
由包含SEQ ID NO:21所示的大鼠187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序 列編碼的蛋白；
由包含SEQ ID NO:23所示的牛187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列 編碼的蛋白；
由包含SEQ ID NO:25所示的犬187A5基因的核苷酸序列的核苷酸序列 編碼的蛋白；和
由包含SEQ ID NO:27所示的黑猩猩187A5基因的核普酸序列的核苦酸 序列編碼的蛋白。
作為187A5蛋白(多肽)，可以列舉出選自以下的的(i，)、 (ii，)、 (iii，)和(iv，) 中的蛋白
(i，)由SEQIDNO:l、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQ IDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO:18、 SEQ ID NO:20、 SEQ ID NO:21、 SEQ ID NO:23、 SEQ IDNO:25或SEQ ID NO:27的核苦酸序列編碼的蛋白；
(ii，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列編 碼，所述核苷酸序列是在SEQIDNO:l、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQ IDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQIDNO:13、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:16、 SEQIDNO:18、 SEQ ID NO:20、 SEQIDNO:21、 SEQ ID NO:23、 SEQIDNO:25或SEQIDNO:27的核苷酸序列中、發(fā)生一個(gè)或多個(gè) 核苦酸的插入、取代、缺失和/或在上述序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或 多個(gè)核苦酸的增加而成的核苦酸序列；
(iii，)由下述核苦酸序列編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，所述核苷酸序列與由SEQIDNO:l、 SEQ ID NO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO:13、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:16、 SEQIDNO:18、 SEQIDNO:20、 SEQ ID NO:21 、 SEQ ID NO:23 、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的核芬酸 序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；
(iv，)由下述核苷酸序列編碼、'且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，所述核苷酸序列與由SEQIDNO:l、 SEQ ID NO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO: 13、 SEQ ID NO: 14、 SEQ ID NO: 16、 SEQ ID NO: 18、 SEQIDNO:20、 SEQIDNO:21、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO:25或SEQ ID NO:27的核苷酸 序列構(gòu)成的多核苷酸具有70%以上的同一性。
此外，作為187A5蛋白(多肽)，可以列舉出選自以下的(v，)、 (vi，)、 (vii，) 和(viii，)中的蛋白
(v，)包含SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQIDNO:17、 SEQ ID NO:19、 SEQIDNO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28 的氨基酸序列的蛋白；
(vi，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQIDNO:17、 SEQIDNO:19、 SEQ ID NO:22、 SEQ IDNO:24、 SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨 基酸的插入、取代、缺失和/或在上述序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多 個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii，)由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID NO:2、 SEQ IDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQIDNO:12、 SEQIDNO:15、 SEQIDNO:17、 SEQ ID NO:19、 SEQ ID NQ:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條 件下雜交；
(viii，)由與SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQIDNO:8、 SEQIDNO:IO、 SEQ ID NO:12、 SEQIDNO:15、 SEQ ID NO:17、 SEQ ID NO:19、 SEQIDNO:22、 SEQ ID NO:24、 SEQ ID NO:26或SEQ ID NO:28 的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白。
本發(fā)明優(yōu)選提供選自以下的(i")、 (ii")、 (iii")和(iv")中的蛋白(多肽)
(i")由SEQIDNO:l的核苷酸序列編碼的蛋白；
(ii")由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列編 碼，所述核香酸序列是在SEQ ID NO:l的核苷酸序列中、發(fā)生一個(gè)或多個(gè) 核苷酸的插入、取代、缺失而成的核苷酸序列和/或在SEQIDNO:l的核苷 酸序列的一側(cè)或兩末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而成的核苷S吏序列；
(iii")由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸與由SEQ ID NO:l的核苷酸序 列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；
(iv")由下述多核苦酸編碼，且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸與由SEQ ID NO:l的核苷酸序 列構(gòu)成的多核苷酸具有70%以上的同一性。
此外，本發(fā)明優(yōu)選提供選自以下的(v")、 (vi，，)、 (vii")和(viii")中的蛋白 (多肽)
(v")包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白；
(vi，，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或在該序列 的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii")由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu) 成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQIDNO:2的 氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；
(viii，，)由與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸 序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能 的蛋白。
本發(fā)明更優(yōu)選提供選自以下的(i，，，)、 (ii，，，)、 (iii，，，)和(iv，，，)中的人來源 的蛋白(多肽)
(i"，)由SEQIDNO:l的核苷酸序列編碼的蛋白；
(ii"，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列由下述核苷酸序列 編碼，所述核普酸序列是在SEQ ID NO:l的核苦酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè) 核苷酸的插入、取代、缺失和/或該核苷酸序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè) 或多個(gè)核苷酸的增加而成的核苷酸序列；
(iii"，)由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸與由SEQ ID NO:l的核苷酸 序列構(gòu)成的多核苦酸在嚴(yán)格條件下雜交；
(iv"，)由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，所述多核苷酸與由SEQ ID NO:l的核苷酸 序列構(gòu)成的多核苷酸具有95%以上的同一性。
此外，本發(fā)明更優(yōu)選提供選自以下的(v，")、 (vi，，，)、 (vii"，)和(viii"，)中 的人來源的蛋白(多肽)
(v，")包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白；
(vi"，)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序 列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQIDNO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或該序列的 一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；
(vii"，)由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列
27構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID NO:2 的氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；
(viii，")由與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有95。/。以上同一性的氨基酸 序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能 的蛋白。
本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選提供由SEQ ID NO:l的核苷酸序列編碼的人來源的 蛋白。
此外，本發(fā)明進(jìn)一步優(yōu)選提供包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的人來 源的蛋白。
在本說明書中，"在多核苷酸中、發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、取 代、缺失和/或在該序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而 成的"以及"在氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失 和/或在該序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的"是 指通過定點(diǎn)突變誘導(dǎo)等公知技術(shù)方法產(chǎn)生的變異，或者在能夠自然發(fā)生的 程度內(nèi)的多個(gè)核苷酸或氨基酸的取代等。對(duì)于多核苷酸而言，還包括單堿 基多態(tài)(SNPs)。在核苷酸和氨基酸的變異的個(gè)數(shù)方面，可以例如發(fā)生1~30 個(gè)、優(yōu)選1 20個(gè)、更優(yōu)選1 10個(gè)、更優(yōu)選1或數(shù)個(gè)(例如9個(gè)以下)、特別 優(yōu)選1 4個(gè)、最優(yōu)選1~2個(gè)核香酸和氨基酸的插入、取代或缺失和/或添加 到一個(gè)或兩個(gè)末端。
變異氨基酸序列優(yōu)選具有1或多個(gè)(例如1個(gè) 數(shù)個(gè)、或者1、 2、 3或4 個(gè))保守取代的SEQIDNO:2的氨基酸序列。
在(ii)、 (ii，)、 (ii，，)或(ii"，)中，導(dǎo)入核苷酸序列中的插入、取代、缺失或 增加的數(shù)目?jī)?yōu)選為1或數(shù)個(gè)(例如9個(gè)以下)，更優(yōu)選為1~6個(gè)，特別優(yōu)選為 1~4個(gè)、最優(yōu)選為1~2個(gè)。
在(vi)、 (vi，)、 (vi")或(vi，，，)中，導(dǎo)入氨基酸序列中的插入、取代、缺失 或增加的數(shù)目?jī)?yōu)選為1或數(shù)個(gè)(例如9個(gè)以下)，更優(yōu)選為1~6個(gè)，特別優(yōu)選 為1~4個(gè)、最優(yōu)選為1~2個(gè)。
在本說明書中，"保守取代"是指將1或多個(gè)氨基酸殘基取代為化學(xué) 性質(zhì)相似的其它氨基酸殘基，而不在實(shí)質(zhì)上改變蛋白的功能。例如包括 將某個(gè)疏水性殘基取代為其它疏水性殘基的情況、將某個(gè)極性殘基取代為 帶相同電荷的其它極性殘基，等等?？梢赃M(jìn)行這種取代的功能上相似的氨基酸，就每種氨基酸而言是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。作為具體例子，作為
非極性(疏水性)氨基酸可以列舉出丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、
脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、曱硫氨酸等。作為極性(中性)氨基酸，可以列
舉出甘氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、半胱氨 酸等。作為帶正電荷(堿性)氨基酸，可以列舉出精氨酸、組氨酸、賴氨酸 等。作為帶負(fù)電荷(酸性)的氨基酸，可以列舉出天冬氨酸、谷氨酸等。
作為變異核苷酸序列，可以列舉出具有下列取代的核苷酸序列將SEQ IDNO:l的核苷酸序列中的512位的鳥噪呤取代為腺嘌呤、844位的鳥嘌呤 取代為腺嘌呤、1360位的鳥嘌呤取代為腺嘌呤、2458位的腺嘌呤取代為鳥 嘌呤、2991位的腺。票呤取代為鳥噤呤。變異核苷酸序列可以具有上述的全 部取代，也可以具有上述取代中的一部分的組合。
作為變異氨基酸序列，可以列舉出具有下列取代的氨基酸序列將SEQ ID N0:2的氨基酸序列中的161位的精氨酸取代為組氨酸、272位的纈氨酸 取代為異亮氨酸、444位的纈氨酸取代為異亮氨酸、或者810位的精氨酸取 代為甘氨酸。變異氨基酸序列可以具有上述的全部取代，也可以具有上述 取代中的 一部分的組合。
在本說明書中，"在嚴(yán)格條件下雜交"是指在嚴(yán)格條件下與目標(biāo)多 核香酸雜交。具體而言，可以列舉出下述多核苷酸，當(dāng)利用FASTA、BLAST、 Sm他-Waterman(Meth. Enzym., 164, 765(1988))等同源性檢索軟件使用缺省 (初始設(shè)定)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算時(shí)，所述多核苦酸與目標(biāo)核苷酸序列具有至少70% 以上、優(yōu)選80%以上、更優(yōu)選85%以上、更優(yōu)選90°/。以上、更優(yōu)選95%以 上，特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上的同一性。此外，"嚴(yán)格條件" 可以按照下述方法進(jìn)行在本領(lǐng)域技術(shù)人員通?？梢允褂玫碾s交緩沖液中、 在40。C 70。C、優(yōu)選60。C 65。C等溫度下進(jìn)行反應(yīng)，在15~300mmol/L，優(yōu) 選15~60mmol/L等鹽濃度的洗滌溶液中進(jìn)行洗滌。溫度、鹽濃度可以根據(jù) 所使用的探針的長(zhǎng)度適宜調(diào)整。而且，洗滌雜交物時(shí)的條件，可以在0.2或 2xSSC、 0.1%SDS、溫度20。C 68。C的條件下進(jìn)行。選擇嚴(yán)格條件(高嚴(yán)緊度) 還是選擇溫和條件(低嚴(yán)緊度)，可以用洗滌時(shí)的鹽濃度或溫度來設(shè)置差異。 當(dāng)用鹽濃度來設(shè)置雜交的差異時(shí)，可以這樣進(jìn)行使用0.2xSSC、 0.1%SDS 作為嚴(yán)格洗滌緩沖液(高嚴(yán)緊度洗滌緩沖液)，使用2xSSC、 0.1。/。SDS作為溫 和洗滌緩沖液(低嚴(yán)緊度洗滌緩沖液)。此外，當(dāng)用溫度來設(shè)置雜交的差異時(shí)，嚴(yán)格條件時(shí)為68°C、中等程度(中等嚴(yán)緊度)時(shí)為42°C、溫和條件時(shí)為室溫 (20°C~25°C)，可以均在0.2xSSC、 0.1%SDS的條件下進(jìn)行。
通常，在實(shí)施預(yù)雜交時(shí)，在與雜交相同的條件下進(jìn)行；而雜交和預(yù)洗 滌并不一定在相同條件下進(jìn)行。
雜交可以釆用公知方法進(jìn)行。此外，當(dāng)使用市售文庫(kù)時(shí)，可以按附帶 的使用說明書所描述的方法進(jìn)行。
在本說明書中，對(duì)氨基酸序列而言，"同 一性"(有時(shí)也稱同源性)是指 在被比較的序列之間，構(gòu)成各個(gè)序列的氨基酸殘基的一致程度。此時(shí)，需 要考慮空位(gap)的存在和氨基酸的性質(zhì)(Wilbur, Natl. Acad. Sci. USA 80: 726-730(1983))。在同源性的計(jì)算方面，可以使用商業(yè)軟件BLAST (Altschul: J. Mol. Biol. 215: 403-10(1990))、 FASTA (Peasron: Methods in Enzymology 183:63-69(1990))等。
"同 一性"的數(shù)值均可以是使用本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的同源性檢索程 序計(jì)算出的數(shù)值，例如，可以在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的同源 ^生算'法BLAST (Basic local alignment search tool) http:〃www.ncbi.nlm.nih. gov/BL-AST/中使用缺省(初始設(shè)定)參數(shù)來計(jì)算。
與SEQ ID NO:l的核苷酸序列具有至少70%以上同一性的核苦酸序列 優(yōu)選可以是具有80%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95% 以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99。/。以上的同一性的核苷酸序列。
與SEQ ID NO:2的氨基酸序列具有至少70%以上同一性的氨基酸序列 優(yōu)選可以是具有80%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選90%以上、更優(yōu)選95% 以上、特別優(yōu)選98%以上、最優(yōu)選99%以上的同一性的氨基酸序列。
在本發(fā)明中，如果給定SEQ ID NO:2的氨基酸序列，則可以容易地確 定編碼它的核苦酸序列，可以對(duì)編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列的各種核 苷酸序列進(jìn)行選擇。因此，編碼由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白 的多核苷酸是指SEQIDNO:l所表示的cDNA序列的一部分或全部，以及 具有編碼同一氨基酸、且具有處于簡(jiǎn)并關(guān)系的密碼子作為cDNA序列的序 列。而且，還指包含內(nèi)含子或非翻譯區(qū)的基因組DNA。在發(fā)明中，還包括 與之相應(yīng)的RNA序列。
在本說明書中，是否"具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋 白等同的功能，，，可以通過對(duì)與187A5基因的表達(dá)相關(guān)聯(lián)的生物現(xiàn)象或功
30能進(jìn)行評(píng)價(jià)來確定，例如對(duì)在中腦中、在多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中是否選擇性表達(dá)進(jìn)行評(píng)價(jià)。
本發(fā)明提供包含下述多肽的蛋白，所述多肽由SEQ ID N0:2所示氨基 酸序列的248位 397位或792位~877位的氨基酸序列中的至少5個(gè)氨基酸 殘基(優(yōu)選至少6個(gè)氨基酸殘基)或其全部構(gòu)成。該蛋白相當(dāng)于187A蛋白的 氨基酸序列中的高識(shí)別性部分，所以，可以用作能夠高準(zhǔn)確度識(shí)別187A5 蛋白的抗體的抗原。
187A5蛋白是I型l次跨膜蛋白，其表達(dá)在細(xì)胞表面，取向?yàn)镹末端 側(cè)位于細(xì)胞外。因此，通過使用了與該蛋白具有結(jié)合性的抗體的流式細(xì)胞 術(shù)，能夠分離表達(dá)該蛋白的活細(xì)胞。
本發(fā)明提供包含下述多肽的蛋白，所述多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸 序列的28位~927位、SEQ ID NO:4的氨基酸序列的16位 1267位、SEQ ID NO:6的氨基酸序列的1位~550位、SEQ ID NO:8的氨基酸序列的1位~542 位、SEQ ID NO:IO的氨基酸序列的1位~418位、SEQ ID NO:12的氨基酸 序列的76位 964位、SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的40位 928位、SEQ ID NO:17的氨基酸序列的1位~540位、SEQ ID N6:19的氨基酸序列的40位 ~1106位、SEQIDNO:22的氨基酸序列的24位 1524位、SEQIDNO:24的 氨基酸序列的43位~1018位、SEQ ID NO:26的氨基酸序列的43位~908位 或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的1位~866位的氨基酸序列的至少5個(gè)氨基 酸殘基(優(yōu)選至少6個(gè)氨基酸殘基)或其全部構(gòu)成。該蛋白相當(dāng)于187A蛋白 的氨基酸序列的細(xì)胞外區(qū)域，所以，可以用作用于制備下述抗體的抗原， 所述抗體能夠在保持生活狀態(tài)的情況下檢測(cè)出作為檢測(cè)對(duì)象的細(xì)胞。
本發(fā)明提供本發(fā)明的蛋白用作檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的指標(biāo)的用途。 [探針、引物和引物組]
用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的檢測(cè) 或選擇的本發(fā)明的探針和引物，能夠與187A5基因特異性雜交。根據(jù)實(shí)施 例2,在處于多巴胺能神經(jīng)元發(fā)生期的小鼠12.5日胚中，187A5的mRNA 在Lrp4陽性多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞所存在的中腦最腹側(cè)的腦室區(qū)域(腦室 區(qū)；VZ)和中腦最背側(cè)的頂板區(qū)域選擇性表達(dá)，但在Lrp4陽性的后腦底板 細(xì)胞中不表達(dá)，因此可知187A5的mRNA在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中選擇性表達(dá)。因而，187A5基因的表達(dá)作為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的指 標(biāo)是有用的。因此，本發(fā)明的探針、引物和引物組可以用作多巴胺能神經(jīng) 元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的檢測(cè)用標(biāo)志物。
本發(fā)明的探針和引物只要能夠檢測(cè)187A5基因的表達(dá)即可，其是指由 多個(gè)脫氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)等的堿基或堿基對(duì)構(gòu)成的聚合 體。已知雙鏈cDNA也可以用于組織原位雜交，本發(fā)明的探針和引物也包 含這樣的雙鏈cDNA。作為在組織中RNA的檢測(cè)中特別優(yōu)選的探針和引物， 可以列舉出RNA探針(核糖核香酸探針)。
作為本發(fā)明的探針和引物，例如可以包含由187A5基因的核苷酸序列 或其互補(bǔ)序列的連續(xù)至少10個(gè)、優(yōu)選至少15個(gè)核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列。 此外，作為本發(fā)明的探針和引物，例如可以包含由優(yōu)選10 50個(gè)或10~30 個(gè)、更優(yōu)選15~50個(gè)或15-30個(gè)、更優(yōu)選20-50個(gè)或20~30個(gè)、更優(yōu)選25~50 個(gè)或25 30個(gè)、最優(yōu)選26~39個(gè)或26~35個(gè)核苷酸構(gòu)成的核苷酸序列。
本發(fā)明的探針和引物的長(zhǎng)度可以為至少IO個(gè)堿基，優(yōu)選為至少15個(gè) 堿基，更優(yōu)選為至少20個(gè)堿基、更優(yōu)選為至少25個(gè)堿基。此外，本發(fā)明 的探針和引物的長(zhǎng)度可以優(yōu)選為10 50個(gè)或10-30個(gè)石咸基、更優(yōu)選為15~50 個(gè)或15-30個(gè)堿基、更優(yōu)選為20-50個(gè)或20~30個(gè)堿基、更優(yōu)選25~50個(gè) 或25 30個(gè)堿基、最優(yōu)選26~39個(gè)堿基或26 35個(gè)堿基。
根據(jù)本發(fā)明的探針和引物的優(yōu)選實(shí)施方式，可以提供下述多核苷酸 所述多核苷酸包含由187A5基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的連續(xù)至少10 個(gè)(更優(yōu)選至少15個(gè))核苷酸構(gòu)成的核苦酸序列，能夠與187A5基因雜交， 能夠用于中腦中多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的 檢測(cè)或選擇，并且其長(zhǎng)度為15-50個(gè)或15~30個(gè)堿基、優(yōu)選25~50個(gè)或25~30 個(gè)堿基、最優(yōu)選26~39個(gè)堿基或26~35個(gè)堿基。
根據(jù)本發(fā)明的探針的優(yōu)選實(shí)施方式還提供下述多核苷酸，所述多核苷 酸能夠與187A5基因的核香酸序列中的高識(shí)別性部分雜交。通過使用這樣 的多核苷酸，能夠更高準(zhǔn)確度地檢測(cè)祖細(xì)胞優(yōu)選增殖祖細(xì)胞。作為這樣的 多核普酸，可以列舉出下述多核苷酸，所述多核苷酸與包含SEQ ID NO:l 所示核苦酸序列的774位 1221位或2403位~2666位的核苷酸序列的一部 分或全部的核苷酸序列互補(bǔ)。
根據(jù)本發(fā)明的引物的優(yōu)選實(shí)施方式還提供下述多核苷酸，所述多核苷酸能夠通過核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增187A5基因的核苷酸序列中的高識(shí)別性部 分，或者能夠與187A5基因的核苷酸序列中的高識(shí)別性部分雜交。通過使 用這樣的多核苷酸，能夠更高準(zhǔn)確度地檢測(cè)祖細(xì)胞優(yōu)選增殖祖細(xì)胞。作為 這樣的多核苷酸，可以列舉出下述多核苷酸，所述多核苷酸能夠通過核酸 擴(kuò)增方法擴(kuò)增包含SEQ ID NO:l所示核苷酸序列的774位 1221位或2403 位 2666位的核苷酸序列的一部分或全部的核苷酸序列。
本發(fā)明的探針可以在Northern印跡法、Southern印跡法、原位雜交等 檢測(cè)目的基因的公知方法中，按常規(guī)方法作為探針使用。
本發(fā)明的探針可以基于本說明書中公開的核苷酸序列來化學(xué)合成。探 4十的制備是7>知的，可以*按照例如《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.》(Cold Spring Harbor P腦(1989)、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley &801^(1987-1997))實(shí)施。
本發(fā)明的引物可以以由2種以上的該引物構(gòu)成的引物組的形式使用。
本發(fā)明的引物和引物組，可以在利用PCR法、RT-PCR法、實(shí)時(shí)PCR 法、原位PCR等核酸擴(kuò)增方法檢測(cè)目的基因的公知方法中，按照常規(guī)方法 作為引物和引物組使用。
可以對(duì)本發(fā)明的引物組進(jìn)行選擇，使得其能夠通過PCR法等核酸擴(kuò)增 方法擴(kuò)增出187A5基因的核苷酸序列。核酸擴(kuò)增方法是公知的，核酸擴(kuò)增 方法中引物組的選擇是本領(lǐng)域技術(shù)人員所清楚的。例如在PCR法中，可以 對(duì)引物進(jìn)行選擇，使得兩個(gè)引物(引物對(duì))中的一個(gè)與187A5基因雙鏈DNA 的正鏈配對(duì)，另一個(gè)引物與雙鏈DNA的負(fù)鏈配對(duì)，并且一個(gè)引物與由另一 個(gè)引物延伸而成的延伸鏈配對(duì)。此外，在LAMP法(W000/28082號(hào)公報(bào))中， 對(duì)于靶基因，,人3'末端側(cè)起規(guī)定了 F3c、 F2c、 Flc這3個(gè)區(qū)域，從5'末端 側(cè)起規(guī)定了B1、 B2、 B3這3個(gè)區(qū)域，利用這6個(gè)區(qū)域可以設(shè)計(jì)4種引物。
物的制備是7^知的，可以4妄照例如《Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed.》(Cold Spring Harbor Press(1989)、 《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley &8。113(1987-1997))實(shí)施。 [抗體]
本發(fā)明的抗體能夠特異性地識(shí)別187A5蛋白。根據(jù)實(shí)施例5，確認(rèn)了 187A5蛋白存在于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。因而，187A5蛋白的存在可以用作為包括多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞在內(nèi)的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的指 標(biāo)。因此，本發(fā)明的抗體可以用作多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神
經(jīng)元3且細(xì)力包^r測(cè)用標(biāo)志物。
4)，所以，本發(fā)明的抗體從能夠以活細(xì)胞的狀態(tài)檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元 祖細(xì)胞這方面來看是有利的(實(shí)施例6)。此外，本發(fā)明的抗體從能夠?qū)S 細(xì)胞來源的細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)或選擇這方面來看是有利的(實(shí)施例7)。
用于獲得本發(fā)明的抗體的187A5蛋白只要具有187A5的抗原性即可， 可以列舉出上述蛋白。此外，還包括具有在187A5蛋白的氨基酸序列中發(fā) 生1或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入、取代或增加而得的氨基酸序列的蛋 白。公知這樣的蛋白可以維持與原蛋白相同的生物學(xué)活性(Mark等(1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:5662-6; Zoller和Smith (1982) Nucleic Acids Res. 10:6487-500; Wang等(1984) Science 224:1431-3; Dalbadie-McFarland等(1982) Pro" Natl. Acad. Sci. USA 79:6409-13 )。在維持原蛋白的抗原性狀態(tài)下、在 某種蛋白中進(jìn)行1或多個(gè)氨基酸殘基的缺失、插入、取代或增加的方法是 公知的。例如，可以這樣獲得采用定點(diǎn)突變誘導(dǎo)方法制備編碼突變蛋白 的多核苦酸并使其適宜地表達(dá)(Molecular Cloning, A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Press (1989); Current Protocols in Molecular Biology John Wiley & Sons (1987-1997)， Section 8.1-8.5; Hashimoto-Goto等 (1995)Gene 152:271-5; Kunkel (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:488-92; Kramer和Fritz (1987) Method. Enzymol. 154:350-67; Kunkel (1988) Method. Enzymol. 85:2763-6)。
本發(fā)明的抗體還包括對(duì)187A5蛋白的一部分特異的抗體。即，除了具 有187A5蛋白的全長(zhǎng)氨基酸序列的多肽之外，用于獲得本發(fā)明的抗體的 187A5蛋白還包括具有與187A5蛋白的至少6個(gè)以上氨基酸殘基(例如8、 10、 12或15個(gè)以上氨基酸殘基)同一的序列的多肽片段。本說明書中的 187A5蛋白多肽片段只要具有187A5蛋白或其抗原性即可，可以是任何片 段。
作為優(yōu)選的片段，可以列舉出187A5蛋白的氨基末端等多肽片段。多 肽的抗原決定部位，可采用分析蛋白質(zhì)氨基酸序列的疏水性/親水性的方法 (Kyte-Doolittle (1982) J. Mol. Bio. 157:105-22 ) 、 二級(jí)結(jié)構(gòu)分析方法(Chou-Fasman (1978) Ann. Rev. Biochem. 47:251-76 )進(jìn)行推定，并進(jìn)一步 通過計(jì)算機(jī)程序(Anal. Biochem. 151:540-6(1985))或采用合成短肽并檢驗(yàn) 其抗原性的PEPSCAN法(特表昭60-500684號(hào)公報(bào))等進(jìn)行確認(rèn)。
作為與187A5蛋白具有結(jié)合性的抗體的例子，可以列舉出
與由SEQIDNO:2、 SEQIDNO:4、 SEQIDNO:6、 SEQ ID NO:8或SEQ IDNO:10的氨基酸序列或其一部分構(gòu)成的蛋白具有結(jié)合性的抗體；
與由SEQ ID NO: 12 、 SEQ ID NO: 15 、 SEQ ID NO: 17或SEQ ID NO: 19 的氨基酸序列或其 一部分構(gòu)成的蛋白具有結(jié)合性的抗體；
與由SEQ IDNO:22的氨基酸序列或其一部分構(gòu)成的蛋白具有結(jié)合性的 抗體；
與由SEQ IDNO:24的氨基酸序列或其一部分構(gòu)成的蛋白具有結(jié)合性的 抗體；
與由SEQ IDNO:26的氨基酸序列或其一部分構(gòu)成的蛋白具有結(jié)合性的 抗體；和
與由SEQ ID NO:28的氨基酸序列或其一部分構(gòu)成的蛋白具有結(jié)合性的抗體。
本發(fā)明的抗體的優(yōu)選實(shí)施方式提供識(shí)別187A5蛋白中的高識(shí)別性多肽 部分的抗體。通過使用這樣的抗體，可以高準(zhǔn)確度地4企測(cè)祖細(xì)胞優(yōu)選增殖 祖細(xì)胞。作為這樣的抗體，可以列舉出與包含下述多肽的蛋白具有結(jié)合性 的抗體，所述多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸序列的248位~397位或792位 877位氨基酸序列的至少5個(gè)氨基酸殘基(優(yōu)選至少6個(gè)氨基酸殘基)或其全 部構(gòu)成。
此外，本發(fā)明的抗體的優(yōu)選實(shí)施方式提供識(shí)別187A5蛋白的表達(dá)在 細(xì)胞外的多肽部分的抗體。通過使用這樣的抗體，可以在生活狀態(tài)下^r測(cè) 祖細(xì)胞優(yōu)選增殖祖細(xì)胞。作為這樣的抗體，可以列舉出與187A5蛋白的表 達(dá)在細(xì)胞外的多肽部分具有結(jié)合性的抗體，例如可以列舉出與包含下述多 肽的蛋白具有結(jié)合性的抗體，所述多肽由SEQIDNO:2的氨基酸序列的28 位~927位、SEQ ID NO:4的氨基酸序列的16位~1267位、SEQ ID NO:6的 氨基酸序列的1位~550位、SEQ ID NO:8的氨基酸序列的1位~542位、SEQ ID NO:10的氨基酸序列的1位~418位、SEQ ID NO:12的氨基酸序列的76 位 964位、SEQ ID NO: 15的氨基酸序列的40位~928位、SEQ ID NO: 17的氨基酸序列的1位 540位、SEQ ID NO: 19的氨基酸序列的40位~1106位、 SEQ ID NO:22的氨基酸序列的24位 1524位、SEQ ID NO:24的氨基酸序 列的43位~1018位、SEQ ID NO:26的氨基酸序列的43位 908位或SEQ ID NO:28的氨基酸序列的1位 866位的氨基酸序列的至少5個(gè)氨基酸殘基(優(yōu) 選至少6個(gè)氨基酸殘基)或其全部構(gòu)成。
本發(fā)明的抗體可以采用本領(lǐng)域技術(shù)人員7>知的方法獲得(例如《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons (1987); Antibodies: A Laboratory Manual, Ed Harlow和David Lane， Cold Spring Harbor Laboratory (1988》。
本發(fā)明的抗體包括多克隆抗體、單克隆抗體、嵌合抗體、單鏈抗體 (scFV)、人源化抗體、多特異性抗體以及Fab、 Fab'、 F(ab，)2、 Fc、 Fv等 抗體片段(fragment)。
如果是多克隆抗體，則可以采集用抗原致敏的哺乳動(dòng)物的血液，通過 公知方法從該血液中分離血清，作為含有多克隆抗體的血清。
視需要，還可以從該血清中進(jìn)一步分離含多克隆抗體的級(jí)分。
如果是單克隆抗體，則可以采集從用抗原致敏的哺乳動(dòng)物的脾臟或淋
巴結(jié)獲得的抗體生成細(xì)胞，使其與骨髓瘤細(xì)胞等細(xì)胞融合，克隆化所得的 雜交瘤(融合細(xì)胞)，從其培養(yǎng)物中回收抗體，作為單克隆抗體。
作為免疫抗原，可以使用187A5蛋白的片段?；蛘?，可以使用基于上 述氨基酸序列合成的抗原。抗原也可以以與載體蛋白所成的復(fù)合物的形式 使用。在抗原與載體蛋白的復(fù)合物的制備中，可以使用各種縮合劑，例如 可以使用戊二醛、碳二亞胺、馬來酰亞胺活性酯等。載體蛋白可以是牛血 清白蛋白、曱狀腺球蛋白、血藍(lán)蛋白等常用的載體蛋白，通常采用以1~5 倍量的比例偶聯(lián)的方法。
作為免疫動(dòng)物，可以列舉出小鼠、大鼠、倉(cāng)鼠、豚鼠、兔、貓、犬、 豬、羊、馬或牛等，優(yōu)選小鼠、大鼠、兔、豚鼠、倉(cāng)鼠等。接種方法可以 列舉出皮下、肌肉或腹腔內(nèi)施用。施用時(shí)，可以與弗氏完全佐劑或弗氏不 完全佐劑混合后施用，施用可以通常每2-5周進(jìn)行1次。
可以使從免疫后動(dòng)物的脾臟或淋巴結(jié)獲得的抗體生成細(xì)胞與骨髓瘤細(xì) 胞發(fā)生細(xì)胞融合，并以雜交瘤的形式將其分離出來。作為骨髓瘤細(xì)胞，可 以使用小鼠、大鼠、人等來源的骨髓瘤細(xì)胞，優(yōu)選與抗體生成細(xì)胞同種來源的骨髓瘤細(xì)胞，但有些情況下也可以在異種間進(jìn)行。
雜交瘤(細(xì)胞融合)4喿作可以按已知方法(例如Nature, 256,495, 1975)實(shí)施。作為促融合劑，可以列舉出聚乙二醇、仙臺(tái)病毒等，通常通過如下方法實(shí)施細(xì)胞融合使用20~50%左右濃度的聚乙二醇(平均分子量1000-4000)，在20。C 40。C、優(yōu)選30。C 37。C的溫度下，在抗體生成細(xì)胞數(shù)與骨髓瘤細(xì)胞數(shù)之比通常為1:1 10:1左右的條件下，反應(yīng)約1 10分鐘左右。
對(duì)于抗體生成雜交瘤的篩選，可以使用各種免疫化學(xué)方法?？梢粤信e出例如使用包被了 187A5蛋白的微孔板的ELISA法，使用包被了抗免疫球蛋白抗體的微孔板的EIA法，在對(duì)含187A5蛋白的樣品進(jìn)行電泳后又使用硝酸纖維素轉(zhuǎn)印膜的免疫印跡法，等等。
從這樣的孔出發(fā)，進(jìn)一步采用例如有限稀釋法進(jìn)行克隆化，可以獲得克隆。雜交瘤的選擇和培養(yǎng)通常使用添加了 HAT(次黃嘌呤、氨基蝶呤、胸苷)且含有10 20。/。胎牛血清的動(dòng)物細(xì)胞用培養(yǎng)基(例如RPMI1640)進(jìn)行。將這樣獲得的克隆植入到預(yù)先施用了降植烷(7° U 7夕>0的SCID小鼠的腹腔內(nèi)，10~14日后采集含高濃度單克隆抗體的腹水，可以作為抗體純化的原料。此外，也可以培養(yǎng)該克隆，將其培養(yǎng)物作為抗體純化的原料。
單克隆抗體的純化可以采用作為免疫球蛋白純化方法為人所知的方法。例如，采用硫酸銨分級(jí)法、PEG分級(jí)法、乙醇分級(jí)法、陰離子交換劑的利用、以及使用187A5蛋白的親和層析等方法可以容易地實(shí)現(xiàn)。
從血清中純化多克隆抗體也可以采用相似的方法進(jìn)行。
187A5基因的表達(dá)充當(dāng)如上所述的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞且優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞存在的指標(biāo)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可通過檢測(cè)187A5基因的表達(dá)來檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖3且細(xì)月包。
本說明書中使用的"檢測(cè)187A5基因的表達(dá)"的方法不特別限定，只要其能夠檢測(cè)待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品中187A5基因的表達(dá)，并且可以例如通過以下步驟進(jìn)行
(a) 使待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品與本發(fā)明的探針、引物或引物組接觸；和
(b) 檢測(cè)反應(yīng)性的有無。
37本說明書中使用的"檢測(cè)反應(yīng)性的有無"的方法包括例如雜交方法和核酸擴(kuò)增方法。
本說明書中使用的"待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，，可以是被認(rèn)為含有多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞且優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞樣品，可優(yōu)選使用中
腦腹側(cè)區(qū)中的細(xì)胞?？赏ㄟ^已知方法獲得中腦腹側(cè)區(qū)中的細(xì)胞(Studer， L.,等人Nature Neurosci( 1998) 1:290-295)。例如，可使用胚胎(優(yōu)選人類流產(chǎn)胚
胎)或患者的中腦腹側(cè)區(qū)的自身細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品。此外，可以使用含有體外誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞且優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖
祖細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞?？梢允褂靡阎椒?，例如SDIA方法(Kawasaki等人Neuron (2000) 28 (1): 31-40)或5階段法(Lee, SH.等人，Nature Biotech (2000)18: 675-579)，使用已知的ES細(xì)胞(Kawasaki等人，Neuron (2000) 28 (1): 31-40和Lee，SH等人，Nature Biotech (2000) 18: 675-579)、骨髓間質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)源性永生化細(xì)胞系(特表平8-509215、特表平11-506930和特表2002-522070)或神經(jīng)元胚性細(xì)胞(特表平11-509729)等細(xì)胞作為起始材料，通過分化處理來進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞或多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。優(yōu)選地，可使用經(jīng)SDIA方法分化處理的ES細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品。
本說明書中使用的"SDIA方法"可通過將ES細(xì)胞與基質(zhì)細(xì)胞系PA6在無血清培養(yǎng)基中共培養(yǎng)而進(jìn)行(Kawasaki等人.Neuron (2000) 28 (1):31-40)。此外，所述"5階段法，，可以如下進(jìn)行。在非黏附性培養(yǎng)板上有血清存在下培養(yǎng)ES細(xì)胞，從而形成擬胚體(EB)。接著使EB附著于黏附性培養(yǎng)板上，從而選擇神經(jīng)祖細(xì)胞。最后，向其中加入生長(zhǎng)因子，例如Shh、 FGF2或FGF8，從而誘導(dǎo)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(Lee, SH.，等人.Nature Biotech(2000) 18: 675-579))。
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法的第一個(gè)實(shí)施方案，利用本發(fā)明的探針，使所述檢測(cè)用多核苷酸與核酸樣品(mRNA或其轉(zhuǎn)錄物)雜交，檢測(cè)雜交復(fù)合物，即核香酸雙鏈。由此可以檢測(cè)細(xì)胞樣品中187A5基因的表達(dá)。
關(guān)于雜交方法的詳細(xì)過程，可以參考《Molecular Cloning, A LaboratoryManual 2nd ed.》(Cold Spring Harbor Press (1989)，尤其是第9.47-9.58節(jié))、《Current Protocols in Molecular Biology》(John Wiley & Sons (1987-1997)，尤其是第6.3-6.4節(jié))，以及《DNA Cloning l:Core Techniques A PracticalApproach 2nd ed.》(Oxford University(1995)，關(guān)于條件可具體參考第2.10節(jié))。
使用雜交方法的187A5基因表達(dá)的檢測(cè)可以例如通過以下步驟進(jìn)行(a-l)使源自待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的多核苷酸與本發(fā)明的探針接觸；和(b-l)檢測(cè)雜交復(fù)合物。
在步驟(a-l)中，可以使從被認(rèn)為包含多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的細(xì)胞樣品制備的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA (cDNA)作為源自待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的多核苷酸與探針接觸。
在使用探針的檢測(cè)方法中，所述探針可以被標(biāo)記。所述標(biāo)記包括使用放射性(例如^P、 "C和355)、熒光(例如FITC和銪)、酶(例如過氧化物酶或堿性磷酸酶)反應(yīng)如化學(xué)著色等的標(biāo)記。
可以利用眾所周知的方法進(jìn)行雜交產(chǎn)物的檢測(cè)，所述方法例如northern雜交、southern雜交或菌落雜交。
檢測(cè)到雜交復(fù)合物的細(xì)胞是表達(dá)187A5基因的細(xì)胞，因此可以確定該細(xì)胞為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法的第二個(gè)實(shí)施方案，利用針對(duì)本發(fā)明的引物或引物組，通過核酸擴(kuò)增方法擴(kuò)增核酸樣品(mRNA或其轉(zhuǎn)錄物)，檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物。由此，可以檢測(cè)細(xì)胞樣品中187A5基因的表達(dá)。
使用核酸擴(kuò)增方法的187A5基因表達(dá)的檢測(cè)可以例如通過以下步驟進(jìn)
行
(a-2)利用源自待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的多核苷酸作為沖莫板，利用本發(fā)明的引物或引物組實(shí)施核酸擴(kuò)增方法；和(b-2)檢測(cè)形成的擴(kuò)增產(chǎn)物。
在步驟(a-2)中，可以使用從被認(rèn)為包含多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的樣品制備的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA(cDNA)作為模板。
可以利用核酸擴(kuò)增方法(例如PCR法、RT-PCR法、實(shí)時(shí)PCR法或LAMP法)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)。
檢測(cè)到擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞是表達(dá)187A5基因的細(xì)胞，因此可以確定該細(xì)胞為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
187A5蛋白是如上所述的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞且優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞存在的指標(biāo)。因此，根據(jù)本發(fā)明，可通過檢測(cè)187A5蛋白來檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
本說明書中使用的"檢測(cè)187A5蛋白"的方法不特別限定，只要其能夠4企測(cè)待;險(xiǎn)驗(yàn)細(xì)胞樣品中的187A5蛋白，例如包括抗原-抗體反應(yīng)方法。
根據(jù)針對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)方法的第三個(gè)實(shí)施方案，使本發(fā)明的抗體與細(xì)胞樣品接觸，檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)。由此可以檢測(cè)細(xì)胞樣品中的187A5蛋白。
使用抗原-抗體反應(yīng)的187A5蛋白的檢測(cè)可以例如通過以下步驟進(jìn)行
(c) 使源自待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)與本發(fā)明的抗體接觸；和
(d) 檢測(cè)反應(yīng)性的有無。
本發(fā)明書中使用的"檢測(cè)反應(yīng)性存在與否"的方法例如包括抗原-抗體反應(yīng)方法。
本說明書中使用的"待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品"可以是被認(rèn)為包含多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，優(yōu)選中腦腹側(cè)區(qū)中的細(xì)胞或含有體外誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的培養(yǎng)細(xì)胞。例如，源自胚胎中腦的細(xì)胞樣品可用作待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品。用于獲得待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的方法如上所述。 使用抗原-抗體反應(yīng)方法的187A5蛋白的檢測(cè)可以例如通過以下步驟進(jìn)行
(c-l)使源自待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)與針對(duì)本發(fā)明的抗體接觸；和(d-l)檢測(cè)抗原-抗體復(fù)合物。
用于檢測(cè)抗原-抗體反應(yīng)的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的，例如可以用免疫學(xué)方法檢測(cè)被認(rèn)為包含多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品中的187A5蛋白。作為所述免疫學(xué)方法，可以將先前已知的方法(例如免疫組織染色法、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定、蛋白質(zhì)印跡法、凝集法、竟?fàn)幏ɑ驃A心法)應(yīng)用于根據(jù)需要經(jīng)適當(dāng)處理(例如細(xì)胞分離或提取操作)的細(xì)胞樣品。免疫組織染色法可以例如通過以下方法進(jìn)行使用標(biāo)記抗體的直接法和使用能與抗體結(jié)合的標(biāo)記抗體的間接法。關(guān)于標(biāo)記試劑，可以使用已知的標(biāo)記物質(zhì)，例如焚光物質(zhì)、放射性物質(zhì)、酶、金屬或色素。
源自待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品的蛋白質(zhì)優(yōu)選為包括胞外區(qū)(即N-末端區(qū))的多肽。
檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞是表達(dá)187A5蛋白的細(xì)胞，因此可以確定其為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
對(duì)于用在帕金森病的治療中，多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能
神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的純度宜較高。
通過不僅一次，而是重復(fù)地實(shí)施各個(gè)上述檢測(cè)步驟，可以增強(qiáng)檢測(cè)或
選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以通過實(shí)施上述步驟兩次或更多次，
以更高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元
增殖;詛細(xì)月包。
此外，通過與其他標(biāo)志物基因，優(yōu)選除187A5基因之外的多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因一起使用，可以進(jìn)一步增強(qiáng)多巴胺能神經(jīng)元祖 細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞檢測(cè)或選擇的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)針對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)方法，可以通過與多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞標(biāo)志物基因(除187A5基因之外)或其蛋白質(zhì)、有絲分裂后多巴胺 能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)、除187A5基因之外的多巴胺能 神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)、或者成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo) 志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，并不僅檢測(cè)187A5基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)， 而且檢測(cè)上述其他標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而以更高的準(zhǔn)確度檢 測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞且優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在各個(gè)分化階段中選擇性表達(dá)的多巴胺能神經(jīng)元相關(guān)的標(biāo)志物基因示 于圖1。
在以檢測(cè)187A5基因的表達(dá)為特征的檢測(cè)方法中，可以通過與多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因(除了 187A5基因)或其蛋白質(zhì)一起使用， 并不僅檢測(cè)187A5基因，而且檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因 (除了 187A5基因)或其蛋白質(zhì)的表達(dá)，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇 多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(a)中，可以通過使用片全測(cè)到多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì) 胞標(biāo)志物基因(除了 187A5基因)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品， 從而以較高的準(zhǔn)確度片企測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(b)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如， 檢測(cè)到雜交復(fù)合物或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)是既表達(dá)187A5基因，又表達(dá)除了 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或者有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為經(jīng)檢測(cè)或選擇的 多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
此外，關(guān)于步驟(b)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到雜交復(fù)合物
或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-l)——即檢測(cè)除了 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的表 達(dá)——的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度沖企測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞， 優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，步驟(e-l)中，檢測(cè)到除了 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的表 達(dá)的細(xì)胞，是既表達(dá)187A5基因、又表達(dá)除了 187A5基因之外的多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或者有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以
較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為以檢測(cè)或選擇到的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞， 優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在以檢測(cè)187A5基因的表達(dá)為特征的檢測(cè)方法中，通過與有絲分裂后 多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，可以確定這樣 的事實(shí)，即187A5基因被表達(dá)，但未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前 體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或 選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(a)中，可以通過使用未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神 經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品， 從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神 經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(b)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如 檢測(cè)到雜交復(fù)合物或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)，是表達(dá)187A5基因，但不表達(dá)有 絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì) 胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能 神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
此外，關(guān)于步驟(b)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如檢測(cè)到雜交復(fù)合物或 擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-2)——即檢測(cè)有絲分裂 后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)一一的方法，從 而以較高的準(zhǔn)確度^r測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(e-2)中未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神 經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞，是表達(dá)187A5基因、但不表達(dá)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因并且也沒有其蛋 白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所4企測(cè)或選 擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，且優(yōu)選檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞。
在以檢測(cè)187A5基因的表達(dá)為特征的檢測(cè)方法中，通過與除了 187A5 基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，并不 僅檢測(cè)187A5基因，而且檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因(除了 187A5基因)的表達(dá)或其蛋白質(zhì)，可以以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺 能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(a)中，可以通過使用檢測(cè)到除了 187A5基因之外的多 巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞 樣品，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(b)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞 (例如，檢測(cè)到雜交復(fù)合物或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)是既表達(dá)187A5基因，又 表達(dá)除了 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或者有其蛋 白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選 擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
此外，在步驟(b)中，對(duì)于檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如檢測(cè)到雜交復(fù)合 物或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-3)——即檢測(cè)除了 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)一 —的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(e-3)中，^r測(cè)到除187A5 基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞， 是那些既表達(dá)187A5基因的細(xì)胞，又表達(dá)除187A5基因之外的多巴胺能神 經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或者有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的 準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，且優(yōu)選檢 測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在以檢測(cè)187A5基因的表達(dá)為特征的檢測(cè)方法中，通過與成熟的多巴 胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，可以確定這樣的事實(shí)， 即187A5基因被表達(dá)，但未檢測(cè)到成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因 或其蛋白質(zhì)的表達(dá)。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(a)中，可以通過使用未檢測(cè)到成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(b)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如檢測(cè)到雜交
復(fù)合物或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)是表達(dá)187A5基因，但不表達(dá)成熟的多巴胺能
神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
此外，關(guān)于步驟(b)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如檢測(cè)到雜交復(fù)合物或擴(kuò)增產(chǎn)物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-4)——即檢測(cè)成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)——的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，步驟(e-4)中，未檢測(cè)到成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞，是那些表達(dá)187A5基因，但不表達(dá)成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在以檢測(cè)187A5蛋白為特征的檢測(cè)方法中，通過與除了 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，并不僅檢測(cè)187A5蛋白，而且檢測(cè)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)，可以以較高的準(zhǔn)確度^^測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(c)中，可以通過使用檢測(cè)到除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(d)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)，是既有187A5蛋白存在，又表達(dá)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或者有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。此外，關(guān)于步驟(d)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合
物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-l)——即檢測(cè)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)——的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，步驟(e-l)中，檢測(cè)到除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞，是有187A5蛋白存在，并且表達(dá)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或者有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞
在以檢測(cè)187A5蛋白為特征的檢測(cè)方法中，通過與有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，可以確定這樣的事實(shí)，即187A5蛋白被表達(dá)，但未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度;f全測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(c)中，可以通過使用未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(d)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)是那些有187A5蛋白存在，但不表達(dá)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
此外，關(guān)于步驟(d)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-2)——即檢測(cè)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)——的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(e-2)中，未;f企測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞，是有187A5蛋白存在，但不表達(dá)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在以檢測(cè)187A5蛋白為特征的檢測(cè)方法中，還可以通過與除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，并不僅檢測(cè)187A5蛋白，而且檢測(cè)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(c)中，可以通過使用檢測(cè)到除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(d)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)，是那些有187A5蛋白存在，并且表達(dá)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
此外，關(guān)于步驟(d)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-3)——即檢測(cè)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)——的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(e-3)中，；險(xiǎn)測(cè)到除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞，是那些有187A5蛋白存在，且表達(dá)除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
在以檢測(cè)187A5蛋白為特征的檢測(cè)方法中，還可以通過與成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)一起使用，確定如下事實(shí)，即187A5蛋白被表達(dá)，但未檢測(cè)到成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
具體地，在步驟(c)中，可以通過使用未檢測(cè)到成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞作為待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，在步驟(d)中，檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到抗
原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)是有187A5蛋白存在，但不表達(dá)成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞
此外，關(guān)于步驟(d)中檢測(cè)到反應(yīng)性的細(xì)胞(例如，檢測(cè)到抗原-抗體復(fù)合物的細(xì)胞)，可以通過實(shí)施進(jìn)一步包括步驟(e-4)——即檢測(cè)成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)一_的方法，從而以較高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。在此情況下，步驟(e-4)中，未檢測(cè)到成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)的細(xì)胞是那些有187A5蛋白存在，但不表達(dá)成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因且沒有其蛋白質(zhì)存在的細(xì)胞。從而，可以以較高的準(zhǔn)確度確定所述細(xì)胞為所檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞
"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)"是指"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因"或"除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)，，。
"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因，，包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))中表達(dá)的除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因，例如Lrp4基因、Nato3基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因。
Lrp4基因記載于WO 2004/065599。 Nato3基因記載于WO 2007/021003。Msxl基因和Msx2基因記載于WO 2007/021004。 Mashl基因記載于Kele J,Simplicio N, Ferri AL, Mira H, Guillemot F， Arenas E， Ang SL. iVewrogem'w 2 &
Development 2006 Feb; 133(3):495畫505.
除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的檢測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知基因的表達(dá)的方法，例如包括如上所述的雜交方法和核酸擴(kuò)增方法。
"除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)，，包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))中表達(dá)的除了 187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)，優(yōu)選包括僅在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中被檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。
所述蛋白質(zhì)包括Lrp4基因、Nato3基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因的蛋白質(zhì)。
除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)的檢測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，例如包括如上所述的抗原-抗體反應(yīng)方法。
"有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)"包括在中腦最腹側(cè)套層(ML區(qū))中表達(dá)的基因或其蛋白質(zhì)，包括Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3基因和TH基因。此外，所述標(biāo)志物基因包括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))中表達(dá)的基因或其蛋白質(zhì)，包括65B13基因。
Nurrl基因記載于Science. 1997 11; 276 (5310): 248-50。 Enl基因記載于J. Neurosci, 2001 21(9): 3126-34。 En2基因記載于J. Neurosci. 2001 21(9)3126-34。 Ptx3基因記載于Proc, Natl. Acad. Sci. 1997 94: 13305-10。 TH基因記載于Science 1997 11; 276 (5310): 248-50。 65B13基因描述于WO2004/038018。
有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的檢測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，例如包括如上所述的雜交方法、核酸擴(kuò)增方法和抗原-抗體反應(yīng)方法。
"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)，，是指"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因"或"除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)"。
"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因"包括在中腦最腹側(cè)區(qū)中表達(dá)的除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因，包括Lmxla基因。
Lmxla基因描述于WO 2005/052190。
除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的檢測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知基因的表達(dá)的方法，例如包括如上所述的雜交方法和核酸擴(kuò)增方法。
"除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)"包括在中腦最腹側(cè)表達(dá)的除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)。所述蛋白質(zhì)包括例如Lmxla基因的蛋白質(zhì)。
除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)的檢測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，例如包括如上所述的抗原-抗體反應(yīng)方法。
"成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因"包括例如DAT基因。
DAT基因記載于Development 2003 131: 1145-55。
成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的檢測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，例如包括如上所述的雜交方法、核酸擴(kuò)增方法和抗原-抗體反應(yīng)方法。
此外，通過與包含187A5基因的啟動(dòng)子可操作連接于標(biāo)志物基因的基因構(gòu)建體的載體一起使用，可以進(jìn)一步提高多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的檢測(cè)或選擇的準(zhǔn)確度。
因此，根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，通過與187A5基因的啟動(dòng)子可操作連接于標(biāo)志物基因的基因構(gòu)建體一起使用，同時(shí)不僅檢測(cè)187A5基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)，而且檢測(cè)標(biāo)志物基因的表達(dá)，可以以更高的準(zhǔn)確度檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
使用包含187A5基因的啟動(dòng)子可操作連接于標(biāo)志物基因的基因構(gòu)建體的載體進(jìn)行的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的檢測(cè)，可以根據(jù)例如特開2002-51775來實(shí)施。
將能夠在多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞中表達(dá)的187A5基因的啟動(dòng)子/增強(qiáng)子控制下^皮4企測(cè)到的標(biāo)志物基因引入細(xì)胞群體中的各細(xì)胞，檢測(cè)所述標(biāo)志物基因的表達(dá)，從而可以檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。
具體地，通過實(shí)施下述步驟可以;險(xiǎn)測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞用包括本發(fā)明的基因的啟動(dòng)子和標(biāo)志物基因可操作連接的基因構(gòu)建體的載體轉(zhuǎn)化待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品，檢測(cè)待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá)。在此情況下，該步驟中，可以以較高的準(zhǔn)確度確定檢測(cè)到標(biāo)志物基因的表達(dá)的細(xì)胞為檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
本說明書中使用的"本發(fā)明的基因的啟動(dòng)子"的核苷酸序列包括通過下文描述的187A5基因的表達(dá)區(qū)分析獲得的啟動(dòng)子區(qū)的核普酸序列，還包括其具有大致等同的啟動(dòng)子活性的{務(wù)飾序列。
本說明書中使用的"標(biāo)志物基因"可以是能夠在187A5基因的啟動(dòng)子/ 增強(qiáng)子控制下被檢測(cè)到的標(biāo)志物基因，包括GFP。
本說明書中使用的"基因構(gòu)建體"可以具有如下結(jié)構(gòu)其中在187A5 基因的表達(dá)控制序列(包括啟動(dòng)子、增強(qiáng)子等)的控制下，187A5基因連 接在標(biāo)志物基因的上游或下游。另外，可以將編碼標(biāo)志物的基因敲入(knock in) 187A5基因座位。作為所述基因構(gòu)建體的優(yōu)選實(shí)施方案，可例舉具有示 意地描述于圖15 2-4的結(jié)構(gòu)的構(gòu)建體。
本發(fā)明提供用于實(shí)施針對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)方法的4企測(cè)試劑。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑的第 一個(gè)實(shí)施方案包括用于實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法 的第一個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè)試劑，具體地，包括一種用于檢測(cè)187A5基因表 達(dá)的檢測(cè)試劑，其至少含有本發(fā)明的探針。該探針可以被標(biāo)記。該檢測(cè)試 劑通過雜交體形成方法檢測(cè)187A5基因的表達(dá)。因此，第一個(gè)實(shí)施方案的 檢測(cè)試劑可根據(jù)需要進(jìn)一步包括各種用于實(shí)施雜交體形成方法的試劑，例 如，用在標(biāo)記檢測(cè)中的底物復(fù)合物、雜交緩沖液，說明書，和/或器材等等。
此外，用于以較高準(zhǔn)確度實(shí)施檢測(cè)的檢測(cè)試劑包括進(jìn)一步含有探針、 引物、引物組或抗體的檢測(cè)試劑，所述探針、引物、引物組或抗體可檢測(cè) 除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋 白質(zhì)、有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、 除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白 質(zhì)，或者成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。探針、 引物、引物組或抗體可以被標(biāo)記。檢測(cè)試劑通過雜交體形成方法、核酸擴(kuò) 增方法和抗原-抗體反應(yīng)方法中任何一種，進(jìn)一步檢測(cè)除187A5基因之外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、有絲分裂后多 巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、除187A5基因之外 的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)，或者成熟的多巴 胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑的第二個(gè)實(shí)施方案包括用于實(shí)施針對(duì)本發(fā)明的檢測(cè) 方法的第二個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè)試劑，具體地，包括一種用于檢測(cè)187A5基因表達(dá)的試劑，其至少含有本發(fā)明的引物或本發(fā)明的引物組。該檢測(cè)試劑
通過核酸擴(kuò)增方法檢測(cè)187A5基因的表達(dá)。因此，第二個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè) 試劑可根據(jù)需要進(jìn)一步包括各種用于實(shí)施核酸擴(kuò)增方法的試劑，例如，緩 沖液、表明擴(kuò)增反應(yīng)可正常進(jìn)行的內(nèi)標(biāo)，說明書，和/或器材等等。
此外，用于以較高準(zhǔn)確度實(shí)施檢測(cè)的檢測(cè)試劑包括進(jìn)一步含有探針、 引物、引物組或抗體的檢測(cè)試劑，所述探針、引物、引物組或抗體可檢測(cè) 除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋 白質(zhì)、有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、 除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白 質(zhì)，或者成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。這些 探針、引物、引物組或抗體可以被標(biāo)記。所述檢測(cè)試劑通過雜交體形成方 法、核酸擴(kuò)增方法和抗原-抗體反應(yīng)方法中任何一種，進(jìn)一步4企測(cè)除187A5 基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、有 絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、除187A5 基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)，或者成 熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。
本發(fā)明的檢測(cè)試劑的第三個(gè)實(shí)施方案包括用于實(shí)施本發(fā)明的檢測(cè)方法 的第三個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè)試劑，具體地，包括用于檢測(cè)187A5蛋白的檢測(cè) 試劑，其至少含有本發(fā)明的抗體。該抗體可以:故標(biāo)記。該^r測(cè)試劑通過抬r 測(cè)抗原-抗體反應(yīng)檢測(cè)187A5蛋白的表達(dá)。因此，第三個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè)試 劑可根據(jù)需要進(jìn)一步包括各種用于實(shí)施抗原-抗體反應(yīng)的試劑，例如，用于 ELISA方法等中的二抗、顯色試劑、緩沖液，說明書，和/或器材等等。
此外，用于以較高準(zhǔn)確度實(shí)施檢測(cè)的檢測(cè)試劑包括進(jìn)一步含有探針、 引物、引物組或抗體的檢測(cè)試劑，所述探針、引物、引物組或抗體可檢測(cè) 除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋 白質(zhì)、有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、 除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白 質(zhì)，或者成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。所述 探針、引物、引物組或抗體可以被標(biāo)記。所述檢測(cè)試劑通過雜交體形成方 法、核酸擴(kuò)增方法和抗原-抗體反應(yīng)方法中的任何一種方法，進(jìn)一步檢測(cè)除 187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)、
除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白 質(zhì)，或者成熟的多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。
此外，作為用于以較高準(zhǔn)確度實(shí)施檢測(cè)的檢測(cè)試劑，可以例舉包括根 據(jù)本發(fā)明的第一至第三個(gè)實(shí)施方案的檢測(cè)試劑，其進(jìn)一步包括載體，所述 載體包含187A5基因的啟動(dòng)子與標(biāo)志物基因可操作連接的基因構(gòu)建體。
可應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法來篩選對(duì)于誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元 祖細(xì)胞有效的物質(zhì)。具體地，通過利用187A5基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)作為 指標(biāo)，確定通過候補(bǔ)物質(zhì)的加入是否誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞， 優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞，^v而可篩選對(duì)于誘導(dǎo)分化成多巴胺能神 經(jīng)元祖細(xì)胞有效的成分。
因此，本發(fā)明提供一種用于篩選對(duì)誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞 有效的物質(zhì)的方法，包括以下步驟
(i) 使可分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞與待檢驗(yàn)物質(zhì)接觸；和
(ii) 檢測(cè)已與待檢驗(yàn)物質(zhì)接觸的細(xì)胞中187A5基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。 步驟(i)中可分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞優(yōu)選為可分化成多巴
胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞，優(yōu)選可從胚胎中腦收集或從含有由ES細(xì)胞 誘導(dǎo)分化的神經(jīng)元祖細(xì)胞的培養(yǎng)細(xì)胞收集。
步驟(i)中"與待檢驗(yàn)物質(zhì)接觸"可以例如通過將待檢驗(yàn)物質(zhì)加至培養(yǎng) 細(xì)胞來進(jìn)行，所述培養(yǎng)細(xì)胞包含可分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞， 優(yōu)選可分化成多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞。
所述"待檢驗(yàn)物質(zhì)"包括例如合成的低分子化合物、蛋白質(zhì)、合成肽、 純化或部分純化的多肽、抗體、細(xì)菌釋放物質(zhì)(包含細(xì)菌代謝物)和核酸 (例如反義、核酶和RNAi),優(yōu)選為化合物或其鹽，或其溶劑合物(例如 水合物)，但并不限于此。所述"待檢驗(yàn)物質(zhì)，，可以是新物質(zhì)或已知物質(zhì)。
在步驟(ii)中，可以根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法，來檢測(cè)187A5基因的表達(dá) 或其蛋白質(zhì)。
具體地說，分別對(duì)于使用雜交方法的檢測(cè)通過實(shí)施步驟(a-l)和(b-l)，對(duì) 于使用核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法通過實(shí)施步驟(a-2)和(b-2),對(duì)于使用抗原-抗體反應(yīng)的檢測(cè)方法通過實(shí)施步驟(c-l)和(d-l)，可以檢測(cè)187A5基因的表達(dá)或
其蛋白質(zhì)。
在步驟(ii)中，當(dāng)通過接觸待檢驗(yàn)物質(zhì)而檢測(cè)待檢驗(yàn)細(xì)胞樣品中187A5 基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)時(shí)，可以確定該物質(zhì)為對(duì)于誘導(dǎo)分化成多巴胺能神 經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞有效的物質(zhì)。
胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞有效的物質(zhì)。
本發(fā)明提供用于篩選對(duì)于誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞有效的物 質(zhì)的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟
(iii-l)檢測(cè)在與待檢驗(yàn)物質(zhì)接觸后的上述細(xì)胞中除187A5基因之外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)。
當(dāng)步驟(ii)中檢測(cè)到187A5基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)，且步驟(iii-l)中檢測(cè) 到除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或其 蛋白質(zhì)時(shí)，可以確定該物質(zhì)為以較高準(zhǔn)確度誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元祖 細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的有效成分。
步驟(iii-l)可在步驟(i)之后實(shí)施，可在步驟(ii)之前或之后實(shí)施。
本發(fā)明提供用于篩選對(duì)于誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞有效的成 分的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟
(iii-2)檢測(cè)與待檢驗(yàn)物質(zhì)接觸后的所述細(xì)胞中有絲分裂后多巴胺能神 經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)。
當(dāng)在步驟(ii)中檢測(cè)到187A5基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)，但在步驟(iii-2) 中未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì) 時(shí)，可以以較高的準(zhǔn)確度確定該物質(zhì)為對(duì)于誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元祖 細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞有效的成分。
步驟(iii-2)可在步驟(i)之后實(shí)施，可在步驟(ii)之前或之后實(shí)施。 "除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋 白質(zhì)"是指"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因" 或"除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)"。
"除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因"包括 在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))中表達(dá)的除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng) 元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因，包括Lrp4基因、Nato3基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl基因。
除187A5基因之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的檢測(cè)不 特別限定，只要使用可檢測(cè)已知基因的表達(dá)的方法，例如上述的雜交方法 和核酸擴(kuò)增方法。
"除187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)"包 括在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(VZ區(qū))中表達(dá)的除了 187A5蛋白之外的多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)，優(yōu)選僅在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞中 被檢測(cè)到的蛋白質(zhì)。
所述蛋白質(zhì)包括Lrp4基因、Nato3基因、Msxl基因、Msx2基因和Mashl 基因的蛋白質(zhì)。
除了 187A5蛋白之外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)記物蛋白質(zhì)的檢 測(cè)不特別限定，只要使用可檢測(cè)已知蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，例如包括抗原-抗體反應(yīng)方法。
"有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)"包括 在中腦最腹側(cè)套層(ML區(qū))中表達(dá)的基因或其蛋白質(zhì)，包括例如Nurrl基 因、Enl基因、En2基因、Ptx3基因和TH基因。此外，所述標(biāo)志物基因或 其蛋白質(zhì)包括在中腦最腹側(cè)腦室?guī)^(qū)(VZ區(qū))中表達(dá)的基因或其蛋白質(zhì)， 包括65B13基因。
有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因或其蛋白質(zhì)的檢測(cè)不 特別限定，只要使用可檢測(cè)已知基因或其蛋白質(zhì)的表達(dá)的方法，例如包括 上述的雜交方法、核酸擴(kuò)增方法和抗原-抗體反應(yīng)方法。
本發(fā)明提供用于篩選誘導(dǎo)對(duì)于分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞有效的成 分的方法，其進(jìn)一步包括以下步驟
(iii-3)用載體轉(zhuǎn)化已與待檢驗(yàn)物質(zhì)接觸的細(xì)胞，并檢測(cè)細(xì)胞中標(biāo)志物基 因的表達(dá)，其中所述載體包含基因構(gòu)建體，所述構(gòu)建體中187A5基因的啟 動(dòng)子與標(biāo)志物基因基因可操作連接。
當(dāng)在步驟(ii)中檢測(cè)到187A5基因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)，且在步驟(iii-3) 中檢測(cè)到標(biāo)志物基因的表達(dá)時(shí)，可以以較高準(zhǔn)確度確定該物質(zhì)為對(duì)于誘導(dǎo) 分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞有效的成 分。
步驟(iii-3)可在步驟(i)之后實(shí)施，可在步驟(ii)之前或之后實(shí)施。此外，
56步驟(iii-3)可在步驟(iii-1 )或步驟(iii-"之后實(shí)施。 [生產(chǎn)方法]
根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法可以4企測(cè)或選4奪多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。多巴 胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞可用在帕金森病的治療中。因此，可以從利用187A5基 因的表達(dá)或其蛋白質(zhì)作為指標(biāo)而檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞來生 產(chǎn)用于帕金森病治療的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。
這里，多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。 本發(fā)明提供一種用于生產(chǎn)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的方法，包括以下步
驟
(i) 獲得可能包含多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞；
(ii) 利用本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞；和
(iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中獲得的細(xì)胞。
本發(fā)明提供一種用于帕金森病的治療試劑，其包括用根據(jù)本發(fā)明的檢 測(cè)方法檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞。
本發(fā)明提供用根據(jù)本發(fā)明的檢測(cè)方法檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖 細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞在制備用于帕金森病治療的藥物中 的用途。
本發(fā)明提供 一 種用于治療帕金森病的方法，其包括將用根據(jù)本發(fā)明的 檢測(cè)方法檢測(cè)或選擇的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖 祖細(xì)胞移植到哺乳動(dòng)物(包括人類)的腦中。
在本說明書中，"4企測(cè)"還包括"鑒別(discrimination)"。此外，"檢 測(cè)，，不僅包括細(xì)胞作為對(duì)象被鑒別為特定種類細(xì)胞的情況，還包括細(xì)胞作 為對(duì)象被鑒別為非特定種類細(xì)胞的情況。
實(shí)施例多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞選擇性基因的分離和序列分析 已經(jīng)鑒定Lrp4基因?yàn)橛糜诜蛛x多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的細(xì)胞表面 標(biāo)志物(WO 2004/065599)，由此，利用抗-Lrp4抗體分離源自ES細(xì)胞的多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞成為可能。因而，下文將描述多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞選擇性基因的分離和序列分析。
(1)Lrp4陽性細(xì)胞的分離
首先，利用accumax (MS Techno Systems)分散大鼠13.5日胚胎的中腦 和后腦腹側(cè)區(qū)，然后不經(jīng)固定和透化處理，使用抗-Lrp4單克隆抗體〔獲自 雜交瘤(保藏號(hào)FERM BP-10315和FERM BP-10316)，稀釋至1/10， 1% 胎牛血清(JRH)， 5。/。胎大鼠血清(JRH)， lmMEDTA(Invitrogen)/PBS(Sigma)〕 于4。C將細(xì)胞染色30min。然后，使用FACS緩沖液〔？88+1%胎牛血清(7朋)+ lmM EDTA〕，于4'C洗滌3次，每次3min，使用PE標(biāo)記的抗-倉(cāng)鼠IgG 抗體(Becton Dickinson, 8嗎/ml、 1%胎牛血清、5%胎大鼠血清、lmM EDTA/PBS)于4。C將細(xì)胞染色20min。然后，以同樣的方式進(jìn)行洗滌。染 色后，用細(xì)胞分選儀(FACS vantage SE, Becton Dickinson)分離Lrp4-陽性細(xì) 胞(圖2)。分離后立即用RNeasy微量試劑盒(Qiagen)從該細(xì)胞制備總RNA, 用cNNA合成試劑盒(TAKARA)合成雙鏈cDNA。接著，用限制性核酸內(nèi)切 酶Rsa I (TAKARA)消化合成的cDNA ，然后向其中加入ad2 。用ad2S作為 引物通過PCR擴(kuò)增所述cDNA。
擴(kuò)增在下述條件下進(jìn)行于72。C保溫5min，然后進(jìn)行如下反應(yīng)20個(gè) 循環(huán)94°C 30s, 65°C 30s，72。C 2min,最后于72。CM呆溫2min。
ad2S: CAGCTCCACAACCTACATCATTCCGT (SEQ ID NO: 29)
ad2A: ACGGAATGATGT (SEQ ID NO: 30)
用含有以下成分的反應(yīng)溶液進(jìn)行PCR。
10xExTaq 5jal
2.5mM dNTP 爭(zhēng)
ExTaq 0.25 jil
100pM引物 0.5fil
cDNA 2^1
蒸餾水 38.25^1
接著，使用相當(dāng)于4ng、 0.4ng和0.04ng擴(kuò)增cDNA的cDNA作為模板， 在以下的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR。 10xExTaq 1jli1 2.5mM dNTP 0単ExTaq IOOjiM引物
cDNA
0.05(il
各0.1(xl
l^il
蒸餾水
6.95^1
94。C保溫2min后，進(jìn)行如下擴(kuò)增反應(yīng)94°C 30s, 65°C 30s和72°C 2min,最后，于72。C保溫2min。 PCR擴(kuò)增進(jìn)行26個(gè)循環(huán)。 以下引物用在PCR中。
Lrp4: TAGTCTACCACTGCTCGACTGTAACG (SEQ ID NO: 31) CAGAGTGAACCCAGTGGACATATCTG (SEQ ID NO: 32)
Lmxla: TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG (SEQ ID NO: 33) GAGTTGTAGACGCTCTGTTCAATGGC (SEQ ID NO: 34)
結(jié)果表明，Lrp4基因在中腦和后腦Lrp4-陽性細(xì)胞任何一種中以近似相 等的水平表達(dá)。但確定了 Lmxla基因(WO 2005/052190)(其為多巴胺能神 經(jīng)元和多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的標(biāo)志物基因)僅在中腦Lrp4-陽性細(xì)胞中強(qiáng) 表達(dá)(圖3)。因此，認(rèn)為中腦Lrp4-陽性細(xì)胞含有多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞，但后腦Lrp4-陽性細(xì)胞不含多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
因此，接著利用該樣品，使用差減法(N-RDA)(描述于WO 2004/065599 ) 在中腦中搜尋Lrp4-陽性細(xì)胞特異的基因。結(jié)果表明，分離的cDNA片段之 一(187A5)是一個(gè)編碼功能未知基因的片段。接著，利用下列引物用上述 RT-PCR方法確定了該基因的表達(dá)。
187A5: ACCAGGAAGGACAATGCCATTCGTCC (SEQ ID NO: 35) CCTTCTTCACCTTGGCTCTTAGGATG (SEQ ID NO: 36)
結(jié)果，證實(shí)了 187A5基因在中腦Lrp4-陽性細(xì)胞中以與Lmxla基因同 樣的方式特異性表達(dá)(圖3)。
(2)序列分析
數(shù)據(jù)庫(kù)檢索的結(jié)果表明，獲得了被認(rèn)為是該基因全長(zhǎng)的大鼠和小鼠 cDNA序列〔例如，序列號(hào)小鼠187A5 AK028289、小鼠187A5 AK157823 (移碼)、小鼠187A5 AK028541 、小鼠187A5 XM—485684 (備選)、小鼠 187A5 AK163356 (移碼)、大鼠187A5 XM—344107 (預(yù)測(cè))〕。還獲得了 被認(rèn)為是人類同源基因的部分序列(SEQIDNO:l),但不能獲得其全長(zhǎng)序 列。因此，對(duì)人類基因組序列進(jìn)行同源性檢索，預(yù)測(cè)了人cDNA序列。但對(duì)于5，末端附近，未能發(fā)現(xiàn)具有高同源性的區(qū)域。因此，利用5，RACE方 法進(jìn)行序列測(cè)定。
從1嗎人胚胎腦mRNA (Clontech),用5， RACE核心試劑盒(TAKARA) 擴(kuò)增cDNA，并進(jìn)行自身連接。通過使用以下引物，擴(kuò)增了cDNA5，末端。 將得到的片段克隆到pCRII (Invitrogen)，進(jìn)行序列測(cè)定。
RT反應(yīng)CATCCCAGTCTC (SEQ ID NO: 37)
初次PCR: TGGAGAAGGTTGTGCCTCTGGACTTG (SEQ ID NO: 38) CTGGTTGGCTTCCTTGAGGAAGAAGG (SEQ ID NO: 39)
二次PCR: TCCTGCGGGACAAAGTCTACCTGAGC (SEQ ID NO: 40) CTGAGGATGTGGTAGCTCACAGGTAG (SEQ ID NO: 41)
用以下混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
10xExTaq 5|il
2.5mM dNTP 爭(zhēng)
ExTaq 0.25jli1
100岸引物 各0.5pl
模板 1^1
DMSO 1.5^1
蒸餾水 37.25^1
94。C保溫2min后，進(jìn)行如下擴(kuò)增反應(yīng)94°C 30s， 65°C 30s和72°C 2min，最后，于72。C保溫2min。對(duì)于初次PCR,該P(yáng)CR擴(kuò)增進(jìn)行35個(gè)循 環(huán)，用初次PCR產(chǎn)物稀釋10倍作為模板進(jìn)行二次PCR，擴(kuò)增進(jìn)行20個(gè)循環(huán)。
接著，為了證實(shí)預(yù)測(cè)序列是正確的，將其分為三個(gè)分區(qū)，分別用RT-PCR 擴(kuò)增。將PCR產(chǎn)物克隆到pCRII (Invitrogen),進(jìn)行序列測(cè)定。
從0.5pg人胚胎腦mRNA(Clontech)，用RNA PCR試劑盒(TAKARA)擴(kuò) 增cDNA。使用該cDNA作為模板，進(jìn)行PCR。通過使用以下引物，擴(kuò)增了 5'末端附近。
人187A5 F4: GAGGTCGACGCCACCATGCGCTCCGAGGGTGCGGC CCCC (SEQ ID NO: 42)
人187A5 Rl: GGGTCCATAGCTGGCATTGAGCACTG (SEQ ID NO:
43)用以下混合物進(jìn)行PCR反應(yīng)。
10xLATaq 5|al
MgCl2 5^1
2.5mM dNTP 8^1
LATaq 0.5 pi
lOO)iM引物 各0.5ji1
cDNA 1^1
DMSO 1.5|al
蒸餾水 28^1
94。C保溫2min后，進(jìn)行如下擴(kuò)增反應(yīng)35個(gè)循環(huán)94°C 30s， 65°C 30s 和72。C 3.5min，最后，于72。C保溫2min。
通過聯(lián)合使用下列引物F12和R5還有F13和R4擴(kuò)增剩余區(qū)域。
人187A5 F12: CTACCTGTGAGCTACCACATCCTCAG (SEQ ID NO:
44)
人187A5 R5: TTCTCTGCCAGGATGGAGTCAGACAG (SEQ ID NO:
45)
人187A5 F13: ACTGGCAGTTCGACATCACTCACCTG (SEQ ID NO:
46)
人187A5 R4: GAGGAATTCCAGTACAAGGAAGGCATCTGGGCAGG (SEQ ID NO: 47)
序列測(cè)定的結(jié)果表明，編碼這種人類基因的蛋白質(zhì)顯示出與小鼠187A5 蛋白整個(gè)區(qū)域有高同源性，有77%的氨基酸同一和87%的氨基酸同源。因 此，認(rèn)為該基因是人187A5同源基因(SEQIDNO:l)。利用187A5基因原位雜交的表達(dá)分析 為了詳細(xì)地研究多巴胺能神經(jīng)元鐠系的細(xì)胞中187A5基因的表達(dá)模 式，根據(jù)以下方案利用原位雜交進(jìn)行187A5和Lrp4 mRNAs的表達(dá)分析。 首先，用下述方法生產(chǎn)DIG-探針。
從12.5日小鼠(獲自SLC )胚胎，切出中腦后腦區(qū)。用RNeasy微量試 劑盒(Qiagen)制備總RNA，用cDNA合成試劑盒(TAKARA)合成雙鏈cDNA。 接著，用合成的cDNA作為模板，在以下的反應(yīng)系統(tǒng)中擴(kuò)增187A5和Lrp4的cDNA。
10xExTaq 5|xl
2.5mM dNTP 4^1
ExTaq 0.25 |il
100pM引物 各0.5^1
cDNA l^il
dmso 1.5m1
蒸餾水 37.25|il
擴(kuò)增在如下條件下進(jìn)行94。C保溫5min后，進(jìn)行如下反應(yīng)35個(gè)循環(huán) 94°C 30s, 65°C 30s和72。C 2min,最后，于72。C保溫2min。 在PCR中使用以下引物。
187A5: AGCTGAGCCACCTTCTCAGTCCAGAC (SEQ ID NO: 48)
CCACGTCCAGGTCTTGACAAACCCAC (SEQ ID NO: 49) Lrp4: GACAGTGAACCTTTGGTCACTGATGG (SEQ ID NO: 50)
GCCTTCCTGTCCTGGGATCAGCTTGG (SEQ ID NO: 51) 將擴(kuò)增的cDNA片段克隆到pCRII(Invitrogen)，用作模板，從而在以下 的反應(yīng)系統(tǒng)中合成了 DIG-探針(所有試劑購(gòu)自Roche)。 RNA聚合酶緩沖液 2pl NTP標(biāo)記混合物 2(il RNA酶抑制劑 l^il RNA聚合酶(T7或SP6 ) 2pl 模板DNA l嗎 蒸餾水 共20^1
37°C 2h之后，于37。C進(jìn)行DNase I (Roche)處理15min，通過乙醇沉淀 收集DIG-RNA探針。
接著，摘出12,5日小鼠胚胎，用4% PFA (WAKO)/PBS于4。C固定2 小時(shí)。然后，用20%蔗糖(WAKO)/PBS于4。C置換該溶液過夜后，用OCT (SakuraSeikiCo.,Ltd.)包埋該胚胎。制備12pm厚的切片，在載玻片上干燥， 然后用4% PFA室溫再固定30分鐘。用PBS洗滌后，于68°C進(jìn)行雜交[1 pg/ml DIG-RNA探針、50。/。曱酰胺(Nacalai Tesque, Inc.)、 5 x SSC、 1%SDS、 50ng/ml 酵母RNA(Sigma)、 50jiig/ml肝素]40小時(shí)。然后，于68。C進(jìn)行洗滌(50%曱酰胺、5xSSC、 1%SDS),進(jìn)一步于68。C進(jìn)行洗滌(50%曱酰胺、5x SSC)。用1 xTBST于室溫洗滌后，進(jìn)行封閉(封閉劑Roche)。用堿性 磷酸酶標(biāo)記的抗-DIG抗體(DAKO)于4。C與其反應(yīng)過夜，洗滌(1 x TBST、 2mM左旋咪唑)后，用NBT/BCIP (DAKO)作為底物染色。
結(jié)果表明，在處于產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元階段的12.5日小鼠胚月臺(tái)中，顯 示了 187A5的mRNA在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)(腦室區(qū)VZ區(qū))(其中存在 Lrp4-陽性多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞)和中腦最背側(cè)頂板區(qū)中選擇性表達(dá)(圖 4)。另一方面，在后腦腹側(cè)區(qū)中未識(shí)別該表達(dá)。由此，證實(shí)了 187A5的 mRNA不在Lrp4陽性的后腦底板細(xì)胞中表達(dá)。
根據(jù)上述結(jié)果，顯示了 187A5的mRNA在多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞 中選擇性表達(dá)。同時(shí)表達(dá)Lrp4和187A5基因的細(xì)胞限于中腦最腹側(cè)腦室區(qū) 中存在的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。因此，認(rèn)為可聯(lián)合利用這些標(biāo)志物 以更高的準(zhǔn)確度鑒別多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。 187A5基因在從ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元中的表
達(dá)
研究了當(dāng)ES細(xì)胞被體外誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元時(shí)187A5基因是否 表達(dá)。
首先，根據(jù)SDIA方法(Kawasaki等人.Neuron. 2000 Oct; 28 (1): 31-40)， 將ES細(xì)胞(由Riken CDB的Mr. Nishikawa提供的源自小鼠的CCE抹， Kawasaki et al. Neuron. 2000 28 (1): 31-40.)誘導(dǎo)分化成多巴胺能神經(jīng)元。誘 導(dǎo)后第6天從該細(xì)胞分離Lrp4-陽性和Lrp4-陰性細(xì)胞(WO 2004/065599的 實(shí)施例5),分離后立即從該細(xì)胞制備總RNA。利用該總RNA作為模板， 合成和擴(kuò)增了 cDNA。
此外，根據(jù)5階段法〔Lee et al. (2000) Nat. Biotech. 18: 675-679,小鼠 多巴胺能神經(jīng)元分化試劑盒(R&D系統(tǒng))〕，將ES細(xì)胞(CCE)誘導(dǎo)分化成 多巴胺能神經(jīng)元。階段4的第7天從該細(xì)胞分離Lrp4-陽性和Lrp4-陰性細(xì) 胞(WO 2004/065599的實(shí)施例8),分離后立即從該細(xì)胞制備總RNA。利 用該總RNA作為模板，合成和擴(kuò)增了cDNA。
接著，使用相當(dāng)于4ng、 0.4ng和0.04ng擴(kuò)增cDNA的cDNA作為模板， 在以下的反應(yīng)系統(tǒng)中進(jìn)行PCR。
63ExTaq lOO^M引物
2.5mM dNTP
10xExTaq
O.一
各O.ljxl
DMSO
cDNA
蒸餾水
l|Lll
0.3|il 6.65^il
94。C保溫2min后，進(jìn)行如下擴(kuò)增反應(yīng)94°C 30s， 65°C 30s和72°C 2min，最后，于72。C保溫2min。 PCR擴(kuò)增進(jìn)行26個(gè)循環(huán)。 以下引物用在PCR中。
Lmxla: TGGTTCAGGTGTGGTTCCAGAACCAG (SEQ ID NO: 33) TCTGAGGTTGCCAGGAAGCAGTCTCC (SEQ ID NO: 52)
另外，對(duì)于Lrp4和187A5,使用實(shí)施例1的引物。
結(jié)果表明，證實(shí)了 187A5基因在使用任何一種方法的分化誘導(dǎo)中均表 達(dá)，特別是在Lrp4-陽性細(xì)胞中強(qiáng)表達(dá)(圖5和圖6)。因此可見，不管是 在源自小鼠和大鼠胚胎中腦的細(xì)胞中，還是在通過SDIA方法和5階段法中 任何一種方法所誘導(dǎo)分化的細(xì)胞中，187A5的mRNA均在多巴胺能神經(jīng)元 祖細(xì)胞中表達(dá)。具體地說，由此可見187A5基因?qū)τ阼b別源自胚胎中腦的 多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞，以及對(duì)于鑒別由ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的多巴胺能 神經(jīng)元祖細(xì)胞，都可以作為有用的標(biāo)志物。 187A5蛋白在細(xì)胞表面的表達(dá)
在187A5蛋白中，存在一處被認(rèn)為是跨膜區(qū)的序列。如果187A5蛋白 在細(xì)胞表面表達(dá)，則可以利用能與187A5蛋白結(jié)合的抗體通過流式細(xì)胞儀 分離187A5-陽性活細(xì)胞，它們可望用于制備帕金森病等的移植材料。因此， 研究了 187A5蛋白的細(xì)胞內(nèi)定位。
(1)信號(hào)序列的分析
就I型跨膜蛋白來說，信號(hào)序列通常存在于N-末端的附近，緊隨信號(hào) 序列之后被切割，使得蛋白可在膜上表達(dá)。計(jì)算機(jī)檢索的結(jié)果表明(PSORT II， http:〃psort.ims.utokyo,ac.jp/form2.html),未在小鼠187A5基因中發(fā)現(xiàn)被 預(yù)測(cè)為信號(hào)序列的序列。另一方面，人187A5基因N-末端的附近存在類似
64信號(hào)序列的序列。因此，研究了 187A5基因中是否存在功能性信號(hào)序列。
制備一種構(gòu)建體，其中將編碼小鼠cDNA中從N-末端至第45位氨基酸 的區(qū)域連接至缺少信號(hào)序列的分泌型堿性磷酸酶cDNA,并將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)染 至293E細(xì)胞。收集培養(yǎng)第4天的培養(yǎng)上清液，用Aurora試劑盒(ICN)檢測(cè) 堿性磷酸酶活性(圖7 )。
結(jié)果表明，當(dāng)表達(dá)缺少信號(hào)序列的分泌型堿性磷酸酶(對(duì)照)時(shí)，由 于不分泌該蛋白質(zhì)，從而在上清液中未發(fā)現(xiàn)堿性磷酸酶活性。相反，就其 中連接了 N-末端序列的融合蛋白來說，在上清液中發(fā)現(xiàn)了強(qiáng)活性。由此可 見，融合蛋白借助187A5的N-末端序列被高效地分泌(圖8)。由此證明， 187A5的N-末端附近存在功能性信號(hào)序列。這表明187A5蛋白是I型單次 跨膜分子。
(2) 187A5在細(xì)胞表面的表達(dá)(生物素化方法)
為了確定187A5蛋白是否在細(xì)胞表面表達(dá)，研究了當(dāng)用生物素僅標(biāo)記 細(xì)胞表面上的蛋白質(zhì)時(shí)，187A5蛋白是否被生物素標(biāo)記。
將187A5 C-末端添加HA標(biāo)簽的構(gòu)建體轉(zhuǎn)染至NS20Y細(xì)胞。2天后， 用冷PBS洗滌該細(xì)胞2次，然后向其中加入5ml 0.5mg/ml的EZ-連接的磺 基-NHS-SS-生物素(PIERCE)(溶于PBS+lmMCaCl2、 0.5mM MgCl2)。室 溫反應(yīng)30分鐘。用冷PBS洗滌2次后，收集細(xì)胞，然后懸于600|il溶解緩 沖液(1。/。SDS、 10mMTris-Cl、 100mMNaCl、 lmMEDTA)中，經(jīng)超聲處 理。14000rpm離心3分鐘后，收集上清液。向其中加入20|ul鏈霉抗生物素 蛋白珠子(PIERCE),室溫旋轉(zhuǎn)1小時(shí)后，用溶解緩沖液洗滌兩次。將75|al SDS-PAGE樣品緩沖液加至所述珠子中，IO(TC 3分鐘后，通過離心收集結(jié) 合蛋白。利用抗-HA抗體(Roche)通過Western印跡檢測(cè)187A5蛋白。
結(jié)果顯示了 187A5蛋白以高效率被生物素標(biāo)記(圖9)。因此，認(rèn)為 187A5蛋白在細(xì)胞表面表達(dá)。
(3) 187A5在細(xì)胞表面的表達(dá)(FACS分析)
研究了是否可用FACS方法檢測(cè)187A5蛋白。制備了一種構(gòu)建體，其 中將編碼從預(yù)測(cè)的187A5剪切位點(diǎn)(第39位氨基酸)起C-末端側(cè)的cDNA 連接到緊隨前胰蛋白酶原(preprotrypsin)的信號(hào)序列和編碼FLAG標(biāo)簽的序 列之后。通過表達(dá)該構(gòu)建體，可在信號(hào)序列剪切后表達(dá)其中N-末端添加了 FLAG標(biāo)簽的187A5。通過反轉(zhuǎn)錄病毒載體將該構(gòu)建體穩(wěn)定引入B300.19細(xì)胞。用FACS緩沖液[PBS+l。/。胎牛血清(JRH)+lmM EDTA]洗滌親本細(xì)胞和轉(zhuǎn)化體。然后，與10嗎/ml抗-FLAG抗體(SIGMA)冰上反應(yīng)30分鐘，用FACS緩沖液洗滌。繼續(xù)與PE-標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體(Jackson)(稀釋至1/200 )冰上反應(yīng)30分鐘，用FACS緩沖液洗滌。染色后，用流式細(xì)胞儀(FACS calibur:Becton Dickinson沐行分析。
結(jié)果表明，與親本抹不同，在穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體中檢測(cè)到了與FLAG抗體強(qiáng)反應(yīng)的群體(圖10)。由此可見，187A5以N-末端側(cè)位于細(xì)胞外朝向表達(dá)在細(xì)胞表面上，可利用抗體通過FACS檢測(cè)。具體地，認(rèn)為187A5作為分離多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的活細(xì)胞的標(biāo)志物是有用的。 187A5蛋白的表達(dá)分析
使用187A5基因中編碼胞外區(qū)的基因序列，根據(jù)以下方案生產(chǎn)了抗-187A5抗體，用免疫組織染色進(jìn)行表達(dá)分析。
首先，將小鼠187A5基因中編碼胞外區(qū)(SEQ ID NO: 15的氨基酸1-919 )的基因序列基因?qū)胫?93E細(xì)胞，表達(dá)并回收187A5蛋白的胞外區(qū)。用回收的蛋白質(zhì)免疫大鼠，然后提取淋巴細(xì)胞并與骨髓瘤細(xì)胞融合。從融合的細(xì)胞群體選擇能與187A5反應(yīng)的克隆。從該克隆的培養(yǎng)上清液純化抗-187八5單克隆抗體。接著，用4。/。PFA/PBS(-)于4'C將11.5日小鼠胚胎固定2小時(shí)。然后，用20。/。蔗糖/PBS(-)于4。C置換過夜，之后用OCT包埋。制備12um厚的切片，貼到載玻片上，然后室溫干燥30分鐘，再用PBS(-)潤(rùn)濕。然后，室溫進(jìn)4亍封閉[25% Blockace ( Dainippon Sumitomo Pharma Co.,Ltd) ]30分鐘。將制備的抗-187A5單克隆抗體(稀釋2倍的培養(yǎng)上清液，2.5% Blockace/PBS )于室溫與其反應(yīng)2.5小時(shí)，然后用0.01% TritonX-100/PBS(-)于室溫洗滌4次，每次10分鐘。使Cy3-標(biāo)記的抗-大鼠IgG抗體(Jackson, 10|xg/ml， 2.5% Blockace/PBS )于室溫與其反應(yīng)1小時(shí)，以同樣的方式進(jìn)行洗滌。然后，用PBS(-)于室溫進(jìn)行洗滌5分鐘，進(jìn)行封固。
利用制備的抗-187A5單克隆抗體通過免疫組織染色的表達(dá)分析結(jié)果表明，與實(shí)施例2的結(jié)果一樣，在處于產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元階段的E11.5的中腦腹側(cè)區(qū)中發(fā)現(xiàn)了 187A5蛋白的存在，而在其中不產(chǎn)生多巴胺能神經(jīng)元的后腦腹側(cè)區(qū)中則未發(fā)現(xiàn)187A5蛋白的存在(圖11)。
根據(jù)這些結(jié)果，證實(shí)了多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞中存在187A5蛋白。[實(shí)施例6]存在187A5蛋白的細(xì)胞的檢測(cè)
使用實(shí)施例5中制備的抗-187A5單克隆抗體，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)了其中存在187A5蛋白的細(xì)胞。
首先，用細(xì)胞解離液(Invitrogen)分散小鼠E12.5胚胎的中腦和后腦腹側(cè)區(qū)，然后不經(jīng)固定和透化處理，使用抗-187A5單克隆抗體(純化抗體稀釋至1/10、 1%胎牛血清、lmMEDTA/PBS)和抗-Lrp4抗體(培養(yǎng)上清液稀釋至1/2、 1%胎牛血清、lmMEDTA/PBS)于4。C將細(xì)胞染色20min。然后，使用1%胎牛血清和lmM EDTA/PBS-,于4。C洗滌3次，每次3min。用生物素標(biāo)記的抗-亞美尼亞(Armenian)倉(cāng)鼠IgG抗體(Jackson, 10嗎/ml， 1%胎牛血清，lmM EDTA/PBS )于4'C將細(xì)胞染色20min，以同樣的方式進(jìn)行洗滌。然后，用APC-標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen, 8(ig/ml, 1%胎牛血清，lmM EDTA/PBS )和PE-標(biāo)記的抗-大鼠IgG抗體(Jackson, 20|ig/ml，1%胎牛血清，lmMEDTA/PBS)于4。C將細(xì)胞染色20min,以同樣的方式進(jìn)行洗滌。染色后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。
通過使用制備的抗-187A5單克隆抗體的流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果表明，檢測(cè)到了其中存在187A5蛋白的細(xì)胞群體(圖12)。這里，可以不經(jīng)固定和透化處理^r測(cè)其中存在187A5蛋白的細(xì)胞，由此提示可通過使用帶有細(xì)胞分選儀的流式細(xì)胞儀將其中存在187A5蛋白的細(xì)胞以活細(xì)胞狀態(tài)加以分離。此外，證實(shí)了 187A5蛋白存在于所有中腦Lrp4-陽性細(xì)胞，即多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞中。另 一方面，證實(shí)了在不含有多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的后腦Lrp4-陽性細(xì)胞中不存在187A5蛋白。
根據(jù)這些結(jié)果，顯示了 187A5抗體對(duì)于分離多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞是有用的。 187A5蛋白在從ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元中的表
達(dá)
用細(xì)胞解離液(Invitrogen)分散含有通過SDIA方法從ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞群，然后不經(jīng)固定和透化處理，使用實(shí)施例5中制備的抗-187A5單克隆抗體(純化抗體稀釋至1/10、 10%敲除血清替代品、1%胎牛血清、lmMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)和抗-Lrp4抗體(培養(yǎng)上清液稀釋至1/2、 10%敲除血清替代品、1%胎牛血清、lmMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)于4。C將細(xì)胞染色20min。然后，使用10%敲除血清替代品、1%胎牛血清和lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基，于4。C洗滌3次，每次3min。用生物素標(biāo)記的抗亞美尼亞倉(cāng)鼠IgG抗體(Jackson， 10(ig/ml，10%敲除血清替代品，1%胎牛血清，lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)于4。C將細(xì)胞染色20min，以同樣的方式進(jìn)行洗涂。然后，用APC-標(biāo)記的鏈霉抗生物素蛋白(Pharmingen, 8嗎/ml， 10%敲除血清替代品，1%胎牛血清，lmM EDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)和PE-標(biāo)記的抗-大鼠IgG抗體(Jackson，20jug/ml， 10%敲除血清替代品，1%胎牛血清，lmMEDTA/SDIA分化培養(yǎng)基)于4。C將細(xì)胞染色20min,以同樣的方式進(jìn)行洗滌。染色后，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)187A5-和Lrp4-表達(dá)細(xì)胞。
流式細(xì)胞儀的結(jié)果表明，與小鼠胚胎中腦同樣地檢測(cè)到了其中存在187A5和Lrp4蛋白的細(xì)胞群體(圖13 )。
根據(jù)這些結(jié)果，顯示了 187A5抗體對(duì)于分離源自ES細(xì)胞的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞也是有用的。利用抗體分離Lrp4-表達(dá)細(xì)胞
為了證實(shí)分離的187A5/Lrp4-共陽性細(xì)胞分化成多巴胺能神經(jīng)元，使用Nurrl (—種有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物)進(jìn)行了以下實(shí)驗(yàn)。 將通過SDIA方法從ES細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化后分離的細(xì)胞接種到包被了聚-L-鳥氨酸(Sigma ， PBS中0.002% )、層粘連蛋白(Invitrogen,PBS中2.5昭/ml)和纖連蛋白(Sigma， PBS中5嗎/ml)的載玻片上，在N2 (Invitrogen, 1 x ) 、 B27 (Invitrogen， 1 x )、抗壞血酸(Sigma， 200岸)BDNF (Invitrogen, 20ng/ml)和10%敲除血清替代品(Invitrogen)/ SDIA分化培養(yǎng)基中于37。C培養(yǎng)6天。用2% PFA/PBS將培養(yǎng)的細(xì)胞于4°C固定20分鐘，用PBS于4。C洗滌兩次，每次10分鐘。然后，用0.3% Triton X-100/PBS于室溫進(jìn)行透化處理30分鐘，用10。/。正常驢血清/Blockace于室溫進(jìn)行封閉20分鐘。接著，于室溫與抗-Nurrl抗體(自制培養(yǎng)上清液稀釋至1/1000,10%正常驢血清，2.5% Blockace, 0.1% Triton X-100/PBS )和抗-HuC/D抗體(Molecular Probe， 1/50,4嗎/ml, 10%正常驢血清，2.5% Blockace， 0.1% TritonX-100/PBS)反應(yīng)1小時(shí)，繼續(xù)于4。C反應(yīng)過夜。第二天，使用0.1% TritonX-100/PBS,室溫洗滌4次，每次10分鐘。然后，于室溫與FITC-標(biāo)記的抗-小鼠IgG抗體和Cy3-標(biāo)記的抗-大鼠IgG抗體(均為Jackson, 3jj,g/ml， 10%正常驢血清，2.5%Blockace， 0.1% Triton X-100/PBS )反應(yīng)1小時(shí)。之后以同樣的方式進(jìn)行洗滌，并用PBS室溫洗滌5分鐘。封固后觀察細(xì)胞。
通過流式細(xì)胞儀分離的細(xì)胞體外培養(yǎng)6天的結(jié)果表明，與作為對(duì)照的未分離細(xì)胞相比較，明顯誘導(dǎo)了許多Nurrl-陽性多巴胺能神經(jīng)元(圖14)。
才艮據(jù)這些結(jié)果，顯示了 187A5/Lrp4-共陽性細(xì)胞確實(shí)是多巴胺能神經(jīng)元譜系的祖細(xì)胞，并可在體外成熟。
權(quán)利要求
1. 一種用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的檢測(cè)或選擇的探針或引物，該探針或引物能夠與選自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)中的多核苷酸，或者編碼選自以下(v)、(vi)、(vii)和(viii)中的蛋白的多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交(i)包含SEQ ID NO1的核苷酸序列的多核苷酸；(ii)編碼蛋白的多核苷酸，其中所述蛋白由下述氨基酸序列構(gòu)成且具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能所述氨基酸序列由在SEQ ID NO1的核苷酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的插入、取代、缺失和/或在該序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而成的核苷酸序列所編碼；(iii)與由SEQ ID NO1的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交，并且編碼具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；和(iv)與由SEQ ID NO1的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸具有70％以上的同一性，并且編碼具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸；(v)包含SEQ ID NO2的氨基酸序列的蛋白；(vi)由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO2的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或在該序列的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；(vii)由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID NO2的氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜交；和(viii)由與SEQ ID NO2的氨基酸序列具有70％以上同一性的氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的探針或引物，其中，所述多核苷酸來自人、小鼠、大鼠、牛、犬或黑猩猩。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的探針或引物，其中，所述多核苷酸的核芬酸序列選自由SEQIDN0:1、 SEQIDN0:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQIDNO:ll、 SEQ ID NO:13、 SEQ ID NO:14、 SEQ ID NO: 16、 SEQIDNO:18、 SEQIDNO:20、 SEQIDNO:21、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27構(gòu)成的組。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1~3中任一項(xiàng)所述的探針或引物，其中，所述多核苷 酸的核苷酸序列是包含SEQ ID NO:l所示核苷酸序列之774位 1221位或 2403位~2666位的核苷酸序列的一部分或全部的核苷酸序列。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1~4中任一項(xiàng)所述的探針或引物，該探針或引物由包 含所述多核苷酸的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列的至少10個(gè)連續(xù)核苷酸的多核 苷酸所構(gòu)成。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1 5中任一項(xiàng)所述的探針或引物，該探針或引物的長(zhǎng) 度至少為25個(gè)堿基。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1~6中任一項(xiàng)所述的探針或引物，其中，所述多巴胺 能神經(jīng)元祖細(xì)胞為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
8. —種引物組，其由兩種以上的權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的引物構(gòu)成o
9. 能夠與選自以下的(v)、 (vi)、 (vii)和(viii)中的蛋白或其部分結(jié)合的抗體(v) 包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列的蛋白；(vi) 由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或在該序列 的 一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生 一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；(vii) 由與編碼SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多核苷酸在嚴(yán)格條件下雜 交的多核苷酸所編碼、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白 等同的功能的蛋白；(viii) 由與SEQ IDNO:2的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序 列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的 蛋白。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中，所述蛋白或其部分是包含下述 多肽的蛋白，所述多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸248位~397位或792位~877 位的氨基酸序列的至少5個(gè)氨基酸殘基或其全部所構(gòu)成。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，其中，所述蛋白或其部分是表達(dá)于細(xì) 胞外的多肽區(qū)。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的抗體，其中，所述蛋白或其部分包含下述 多肽，所述多肽由SEQ ID NO:2的氨基酸28位~927位、SEQ ID NO:4的氨 基酸16位 1267位、SEQIDNO:6的氨基酸1位 550位、SEQ ID NO:8的 氨基酸1位~542位、SEQ ID NO: 10的氨基酸1位~418位、SEQ ID NO: 12 的氨基酸76位~964位、SEQ ID NO: 15的氨基酸40位~928位、SEQ ID NO: 17 的氨基酸1位~540位、SEQ ID NO: 19的氨基酸40位~1106位、SEQ ID NO:22 的氨基酸24位 1524位、SEQIDNO:24的氨基酸43位 1018位、SEQ ID NO:26的氨基酸43位~908位或SEQ ID NO:28的氨基酸1位~866位的氨基 酸序列的至少5個(gè)氨基酸殘基或其全部所構(gòu)成。
13. 根據(jù)權(quán)利要求9 12中任一項(xiàng)所述的抗體，其中，所述蛋白或其部 分為由至少6個(gè)氨基酸構(gòu)成的多肽。
14. 根據(jù)權(quán)利要求9 13中任一項(xiàng)所述的抗體，其中，所述多巴胺能神 經(jīng)元祖細(xì)胞為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
15. —種檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的方法，該方法包括檢測(cè) 權(quán)利要求1的多核苷酸的表達(dá)的步驟，或者檢測(cè)權(quán)利要求9的蛋白的步驟。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中，所述多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞 為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
17. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，檢測(cè)多核苦酸的表達(dá)的 步驟包括(a) 使權(quán)利要求1 8中任一項(xiàng)所述的探針、引物或引物組與受試細(xì)胞樣 品接觸的步驟；和(b) ^r測(cè)有無反應(yīng)性的步驟。
18. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，檢測(cè)多核苷酸的表達(dá)的 步驟包括(a-l)使權(quán)利要求1 7中任一項(xiàng)所述的探針與受試細(xì)胞樣品來源的多核 苦酸接觸的步驟；和(b-l)檢測(cè)雜交復(fù)合物的步驟。
19. 根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，其中，在步驟(a-l)中，使由受試細(xì) 胞樣品制備的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA與所述探針接觸。
20. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，檢測(cè)多核苷酸的表達(dá)的 步驟包括(a-2)以受試細(xì)胞樣品來源的多核苷酸為模板，使用權(quán)利要求1 7中任 一項(xiàng)所述的引物或權(quán)利要求8所述的引物組實(shí)施核酸擴(kuò)增方法的步驟；和 (b-2)檢測(cè)形成的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。
21. 根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中，在步驟(a-2)中，使用由受試 細(xì)胞樣品制備的mRNA或由該mRNA轉(zhuǎn)錄的互補(bǔ)DNA作為沖莫板。
22. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，檢測(cè)蛋白的步驟包括(c) 使權(quán)利要求9 14中任一項(xiàng)所述的抗體與受試細(xì)胞樣品接觸的步驟；和(d) 檢測(cè)有無反應(yīng)性的步驟。
23. 根據(jù)權(quán)利要求15或16所述的方法，其中，檢測(cè)蛋白的步驟包括 (c-l)使權(quán)利要求9~14中任一項(xiàng)所述的抗體與受試細(xì)胞樣品來源的蛋白接觸的步驟；和(d-l)檢測(cè)抗體抗原復(fù)合物的步驟。
24. 根據(jù)權(quán)利要求17~23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試細(xì)胞樣 品是被誘導(dǎo)向多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞分化的ES細(xì)胞。
25. 根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述分化誘導(dǎo)通過SDIA法 進(jìn)行。
26. 根據(jù)權(quán)利要求17~23中任一項(xiàng)所述的方法，其中，所述受試細(xì)胞樣 品是得自胚胎中腦腹側(cè)區(qū)域的細(xì)胞。
27. 根據(jù)權(quán)利要求17~26中任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，在步驟(a) 或步驟(c)中使用下述細(xì)胞作為受試細(xì)胞樣品檢測(cè)到了除所述多核香酸以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基 因的表達(dá)的細(xì)胞、或者檢測(cè)到了除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖 細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的細(xì)胞；未檢測(cè)到有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該 基因的蛋白的細(xì)胞；檢測(cè)到了除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的 表達(dá)的細(xì)胞、或者檢測(cè)到了除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的細(xì)胞；或者未檢測(cè)到成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該基因的蛋白 的細(xì)月包。
28. 根據(jù)權(quán)利要求17 26中任一項(xiàng)所述的方法，其中，在步驟(b)或步驟 (d)之后還包括(e-l)檢測(cè)除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基 因的表達(dá)、或者除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白 的步驟；(e-2)檢測(cè)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該 基因的蛋白的步驟；(e-3)檢測(cè)除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的 表達(dá)、或者除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的步驟； 或者(e-4)檢測(cè)成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該基因的蛋白 的步驟。
29. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)樵谥心X最腹側(cè)腦室區(qū)域中表達(dá)的 基因。
30. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苦酸以外的 多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因選自由Lrp4基因、Msxl基因、Msx2 基因、Nato3基因和Mashl基因構(gòu)成的組。
31. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白為在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)域表達(dá)的蛋白。
32. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白為下述基因的蛋白，所述基因選自由 Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基因、Nato3基因和Mashl基因構(gòu)成的組。
33. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，有絲分裂后多巴胺能神 經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)樵谥心X最腹側(cè)套層區(qū)中表達(dá)的基因。
34. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因選自由Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3基 因、TH基因或65B13基因構(gòu)成的組。
35. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的 多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)樵谥心X最腹側(cè)區(qū)域中表達(dá)的基因。
36. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述多核苷酸以外的 多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)長(zhǎng)mxla基因。
37. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴 胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白為在中腦最腹側(cè)表達(dá)的蛋白。
38. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴 胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白為L(zhǎng)mxla基因的蛋白。
39. 根據(jù)權(quán)利要求27或28所述的方法，其中，所述成熟多巴胺能神經(jīng) 元細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)镈AT基因。
40. 根據(jù)權(quán)利要求17 39中任一項(xiàng)所述的方法，其中，該方法還包括用 下述載體轉(zhuǎn)化受試細(xì)胞樣品，并檢測(cè)該受試細(xì)胞樣品中標(biāo)志物基因的表達(dá) 的步驟，所述載體包含由所述多核苷酸的啟動(dòng)子與標(biāo)志物基因可操作連接 而成的基因構(gòu)建體。
41. 用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的試劑盒，該試劑盒至少包 含權(quán)利要求1~7中任一項(xiàng)所述的探針或引物、權(quán)利要求8所述的引物組或 權(quán)利要求9~14中任一項(xiàng)所述的抗體。
42. 根據(jù)權(quán)利要求41所述的試劑盒，其中，所述多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì) 胞為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
43. 根據(jù)權(quán)利要求41或42所述的試劑盒，該試劑盒還包含 能夠檢測(cè)除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或者除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的 探針、引物、引物組或抗體；能夠檢測(cè)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該 基因的蛋白的探針、引物、引物組或抗體；能夠檢測(cè)除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的 表達(dá)或者除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的探針、引 物、引物組或抗體；或者能夠檢測(cè)成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該基因的蛋白的探針、引物、引物組或抗體。
44. 根據(jù)權(quán)利要求41 43中任一項(xiàng)所述的試劑盒，該試劑盒還包含下述 載體，所述載體包含由所述多核苷酸的啟動(dòng)子與標(biāo)志物基因可操作連接而 成的基因構(gòu)建體。
45. 用于檢測(cè)或選擇多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的試劑，該試劑至少包含權(quán) 利要求1 7中任一項(xiàng)所述的探針或引物、權(quán)利要求8所述的引物組或權(quán)利 要求9~14中4壬一項(xiàng)所述的抗體。
46. 根據(jù)權(quán)利要求45所述的試劑，其中，所述多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞 為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
47. 根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的試劑，該試劑還包含 能夠;險(xiǎn)測(cè)除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或者除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的 探針、引物、引物組或抗體；能夠檢測(cè)有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該 基因的蛋白的探針、引物、引物組或抗體；能夠檢測(cè)除所述多核苷酸以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的 表達(dá)或者除所述蛋白以外的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的探針、引 物、引物組或抗體；或者能夠檢測(cè)成熟多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該基因的蛋白 的探針、引物、引物組或抗體。
48. 根據(jù)權(quán)利要求45~47中任一項(xiàng)所述的試劑，該試劑還包含下述載 體，所述載體包含由所述多核苷酸的啟動(dòng)子與標(biāo)志物基因可操作連接而成 的基因構(gòu)建體。
49. 一種用于篩選對(duì)多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的分化誘導(dǎo)有效的物質(zhì)的 方法，該方法包括以下步驟(i) 使能夠分化成多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞與受試物質(zhì)接觸的步 驟；和(ii) 檢測(cè)與受試物質(zhì)接觸后的所述細(xì)胞中權(quán)利要求1的多核苷酸的表 達(dá)或權(quán)利要求9的蛋白的步驟。
50. 根據(jù)權(quán)利要求49所述的篩選方法，其中，多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞 為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
51. 才艮據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，該方法還包括(iii-l)檢測(cè)與受試物質(zhì)接觸后的所述細(xì)胞中、除所述多核苷酸以外的多 巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或者除所述蛋白以外的多巴胺 能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白的步驟。
52. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，除所述多核香酸以外的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)樵谥心X最腹側(cè)腦室區(qū)域表達(dá)的基因。
53. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，除所述多核苦酸以外的多巴 胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物基因選自由Lrp4基因、Msxl基因、Msx2基 因、Nato3基因和Mashl基因構(gòu)成的組。
54. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白為在中腦最腹側(cè)腦室區(qū)域中表達(dá)的蛋白。
55. 根據(jù)權(quán)利要求51所述的方法，其中，除所述蛋白以外的多巴胺能 神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞標(biāo)志物蛋白為下述基因的蛋白，所述基因選自由Lrp4基 因、Msxl基因、Msx2基因、Nato3基因和Mashl基因構(gòu)成的組。
56. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，該方法還包括(iii-2)檢測(cè)與受試物質(zhì)接觸后的所述細(xì)胞中、有絲分裂后多巴胺能神經(jīng) 元前體細(xì)胞標(biāo)志物基因的表達(dá)或該基因的蛋白的步驟。
57. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元 前體細(xì)胞標(biāo)志物基因?yàn)樵谥心X最腹側(cè)套層區(qū)域中表達(dá)的基因。
58. 根據(jù)權(quán)利要求56所述的方法，其中，有絲分裂后多巴胺能神經(jīng)元 前體細(xì)胞標(biāo)志物基因選自由Nurrl基因、Enl基因、En2基因、Ptx3基因、 TH基因或65B13基因構(gòu)成的組。
59. 根據(jù)權(quán)利要求50所述的方法，該方法還包括(iii-3)用載體轉(zhuǎn)化與受試物質(zhì)接觸后的所述細(xì)胞，并檢測(cè)該細(xì)胞中標(biāo)志 物基因的表達(dá)的步驟，所述載體包含由所述多核苷酸的啟動(dòng)子與標(biāo)志物基 因可操作連接而成的基因構(gòu)建體。
60. —種制備多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的方法，該方法包括(i) 獲得可能包含多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的細(xì)胞的步驟；(ii) 采用權(quán)利要求15-40中任一項(xiàng)所述的方法檢測(cè)多巴胺能神經(jīng)元祖 細(xì)胞的步驟；和(iii) 培養(yǎng)步驟(ii)中檢測(cè)出或選擇出的細(xì)胞的步驟。
61. 根據(jù)權(quán)利要求60所述的制備方法，其中，所述多巴胺能神經(jīng)元祖 細(xì)胞為用于帕金森病治療的多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞。
62. 根據(jù)權(quán)利要求60或61所述的制備方法，其中，所述多巴胺能神經(jīng) 元祖細(xì)胞為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
63. 選自以下的(i)、 (ii)、 (iii)和(iv)中的多核苷酸(i) 包含SEQIDN0:1的核苷酸序列的多核苷酸；(ii) 編碼由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQIDN0:2的氨基酸序 列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白的多核苷酸，其中，所述氨基酸序列由下 述核苦酸序列編碼，所述核苷酸序列是在SEQ ID NO: 1的核苷酸序列中發(fā) 生一個(gè)或多個(gè)核苦酸的插入、取代、缺失和/或在該序列的一個(gè)或兩個(gè)末端 發(fā)生一個(gè)或多個(gè)核苷酸的增加而成的核苷酸序列；(iii) 與由SEQ ID NO:l的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸在嚴(yán)才各條件下雜 交，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能 的蛋白的多核苷酸；(iv) 與由SEQ IDNO:l的核苷酸序列構(gòu)成的多核苷酸具有70%以上的同 一性，并且編碼具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功 能的蛋白的多核苷酸。
64. 根據(jù)權(quán)利要求63所述的多核苷酸，該多核苷酸來自人、小鼠、大 鼠、牛、犬或黑猩猩。
65. 根據(jù)權(quán)利要求63或64所述的多核苷酸，該多核苷酸選自由SEQID NO:l、 SEQIDNO:3、 SEQIDNO:5、 SEQIDNO:7、 SEQIDNO:9、 SEQ ID NO:ll、 SEQIDNO:13、 SEQIDNO:14、 SEQIDNO:16、 SEQIDNO:18、 SEQIDNO:20、 SEQIDNO:21、 SEQIDNO:23、 SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27構(gòu)成的組。
66. 選自以下的(v)、 (vi)、 (vii)和(viii)中的蛋白(v) 包含SEQIDNO:2的氨基酸序列的蛋白；(vi) 由下述氨基酸序列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID NO:2的氨基酸序列 構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述氨基酸序列是在SEQ ID NO:2 的氨基酸序列中發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的插入、取代、缺失和/或在該序列 的一個(gè)或兩個(gè)末端發(fā)生一個(gè)或多個(gè)氨基酸的增加而成的氨基酸序列；(vii) 由下述多核苷酸編碼、且具有與由SEQIDNO:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的蛋白，其中，所述多核苷酸與編碼SEQ ID N0:2的 氨基酸序列的多核苦酸在嚴(yán)格條件下雜交；和(viii)由與SEQIDNO:2的氨基酸序列具有70。/。以上同一性的氨基酸序 列構(gòu)成、且具有與由SEQ ID N0:2的氨基酸序列構(gòu)成的蛋白等同的功能的 蛋白。
67. 根據(jù)權(quán)利要求66所述的蛋白，該蛋白為I型跨膜蛋白。
68. 包含下述多肽的蛋白由SEQ ID NO:2的氨基酸248位-397位或者792位-877位氨基酸序列 的至少5個(gè)氨基酸殘基或其全部所構(gòu)成的多肽，或者由SEQ ID NO:2的氨基酸28位~927位、SEQ ID NO:4的氨基酸16位 1267位、SEQ ID NO:6的氨基酸1位 550位、SEQ ID NO:8的氨基酸1位 ~542位、SEQ ID NO: 10的氨基酸1位~418位、SEQ ID NO: 12的氨基酸76 位 964位、SEQ ID NO: 15的氨基酸40位~928位、SEQ ID NO: 17的氨基酸 1位~540位、SEQ ID NO: 19的氨基酸40位~1106位、SEQ ID NO:22的氨 基酸24位 1524位、SEQIDNO:24的氨基酸43位 1018位、SEQIDNO:26 的氨基酸43位~908位或SEQ ID NO:28的氨基酸1位~866位的氨基酸至少 5個(gè)氨基酸殘基或其全部所構(gòu)成的多肽。
69. 編碼權(quán)利要求66 68中任一項(xiàng)所述蛋白的多核苷酸。
70. 權(quán)利要求66~68中任一項(xiàng)所述蛋白作為用于檢測(cè)或選擇多巴胺能 神經(jīng)元祖細(xì)胞的指標(biāo)的用途。
71. 根據(jù)權(quán)利要求70所述的用途，其中，所述多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞 為多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明的目的是提供用于多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞的檢測(cè)或選擇的探針、引物、引物組和抗體。根據(jù)本發(fā)明，提供了能夠與187A5基因的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列雜交的、用于中腦多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞(優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞)的檢測(cè)或選擇的探針、引物和引物組，以及用于中腦多巴胺能神經(jīng)元祖細(xì)胞優(yōu)選多巴胺能神經(jīng)元增殖祖細(xì)胞的檢測(cè)或選擇的、對(duì)187A5蛋白具有結(jié)合性的抗體。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101466836SQ20078002173
公開日2009年6月24日 申請(qǐng)日期2007年4月11日 優(yōu)先權(quán)日2006年4月11日
發(fā)明者坂本佳正, 尾野雄一 申請(qǐng)人:衛(wèi)材R&D管理有限公司