專利名稱：一種定向誘導(dǎo)nsc分化為多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的方法及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體地說是涉及一種定向誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞(neuralstem cells，NSC)分化為多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞方法的建立及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
帕金森(PD)病是中老年期一種常見的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病，其主要病理變化是黑質(zhì)多巴胺(DA)神經(jīng)元及黑質(zhì)紋狀體通路神經(jīng)纖維變性和消失，因而導(dǎo)致DA的產(chǎn)生減少或DA的運輸障礙，致使受其支配的紋狀體中DA含量減少。
細(xì)胞移植已成為治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病中細(xì)胞變性壞死的新希望和重要途徑。NSC能分化成為神經(jīng)系統(tǒng)各種神經(jīng)細(xì)胞類型，部分補(bǔ)償損傷和丟失細(xì)胞的功能，而且由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)特殊的血腦屏障的存在，不同個體甚至不同物種間的NSC移植幾乎無排斥反應(yīng)，除此之外NSC可作為基因表達(dá)的載體，導(dǎo)入需要的外源基因而表達(dá)相應(yīng)功能蛋白，NSC是腦部疾病細(xì)胞治療的理想種子細(xì)胞。
在胚胎發(fā)育過程中，很多部位，包括大腦皮層、紋狀體、小腦等均存在一定數(shù)量的神經(jīng)干細(xì)胞，這已由體外細(xì)胞培養(yǎng)所證實。目前的研究已分別從胎鼠的端腦半球、中腦、海馬、皮層、紋狀體、坐骨神經(jīng)和腦室區(qū)分離培養(yǎng)出NSC。Vescovi等(Trends Neurosci.1996，19(9)387-393.Review；Exp Neurol.1999，156(1)71-83.)也從胚胎期人腦皮層和紋狀體中分離并克隆出NSC，證實了它能自我更新，持續(xù)自發(fā)分化為神經(jīng)元、星形和少突膠質(zhì)細(xì)胞，這些長時間培養(yǎng)的NSC通過移植可在大鼠損傷的紋狀體中有效地生存。
NSC的體外擴(kuò)增是細(xì)胞移植的前提，NSC的培養(yǎng)采用無血清選擇性培養(yǎng)，通過促分裂因子EGF和bFGF的聯(lián)合應(yīng)用對NSC進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)擴(kuò)增。(Gritti，A.等In Protocols for Neural Cell Culture，2001，pp.173-197)的作用得以傳代培養(yǎng)擴(kuò)增。NSC能分化為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，具有多向分化能力和很強(qiáng)的自我更新能力，經(jīng)體外傳代培養(yǎng)20代后仍然具有克隆形成能力。
WNT家族是一類分泌型的細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白，可以通過復(fù)雜的信號傳遞通路調(diào)控胚胎的早期發(fā)育，并對細(xì)胞分化、細(xì)胞增殖及生長有重要的調(diào)節(jié)作用。該家族的許多成員以不同的作用機(jī)制參與了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，對神經(jīng)細(xì)胞的增殖和分化有促進(jìn)作用。在轉(zhuǎn)基因小鼠的神經(jīng)上皮前體細(xì)胞中，穩(wěn)定表達(dá)有WNT信號通路中成員之一β-catenin，表明在發(fā)育的腦中，WNT信號可通過促進(jìn)細(xì)胞循環(huán)來擴(kuò)增前體細(xì)胞的數(shù)目。在中腦中檢測到WNT家族成員分泌的糖蛋白的表達(dá)，他們調(diào)節(jié)著前體細(xì)胞的擴(kuò)增、及神經(jīng)元的分化。WNT3a的過表達(dá)增加了脊髓中有絲分裂細(xì)胞的數(shù)目。在體外神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)過程中，加入有活性的WNT3a可減少NSC神經(jīng)球的形成，而促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞向神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的分化。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的關(guān)鍵技術(shù)問題是建立一種誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元的方法。
為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明利用NSC具有自我增殖多向分化的潛能，采用無血清培養(yǎng)體系擴(kuò)增NSC(Gritti，A.等In Protocols for Neural Cell Culture，2001，pp.173-197)，同時將WNT3a基因轉(zhuǎn)染NSC，通過WNT3a基因的表達(dá)引發(fā)其下游基因的表達(dá)，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號以擴(kuò)增多巴胺能前體細(xì)胞，再加入抗壞血酸定向誘導(dǎo)其分化為有功能的多巴胺能神經(jīng)元，可為制備治療帕金森疾病的細(xì)胞制劑提供大量的目的細(xì)胞，而且還為治療帕金森病藥物的開發(fā)及藥物篩選提供了細(xì)胞模型。
本發(fā)明中運用的無血清培養(yǎng)體系是聯(lián)合應(yīng)用細(xì)胞因子bFGF和EGF支持神經(jīng)干細(xì)胞的增殖、維持神經(jīng)干細(xì)胞的狀態(tài)并抑制其向各類神經(jīng)細(xì)胞的分化。
本發(fā)明中的神經(jīng)干細(xì)胞包括人或哺乳動物胚胎的端腦半球、中腦、海馬、大腦皮層、紋狀體、坐骨神經(jīng)和腦室區(qū)以及成體的紋狀體、海馬、皮層和腦室室管膜或室管膜下層等來源的nestin+神經(jīng)干細(xì)胞。
本發(fā)明中運用的體外誘導(dǎo)方法，是利用電轉(zhuǎn)、病毒載體感染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法，將WNT3a基因轉(zhuǎn)染NSC，通過WNT3a基因的表達(dá)引發(fā)其下游基因的表達(dá)，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號以擴(kuò)增多巴胺能前體細(xì)胞，再通過抗壞血酸的誘導(dǎo)作用，產(chǎn)生大量有功能活性的多巴胺能神經(jīng)元。
本發(fā)明中運用的WNT3a基因是以小鼠胎盤cDNA為模板通過PCR方法來調(diào)取的。
具體實施方案如下1.神經(jīng)干細(xì)胞的分離。取哺乳動物或人胚胎的端腦和中腦組織，剝離腦膜后剪碎，2～10ml胰酶消化組織塊，通過篩網(wǎng)收集單細(xì)胞懸液，培養(yǎng)于含bFGF和EGF的常規(guī)培養(yǎng)基中，傳代純化神經(jīng)干細(xì)胞。
2.以腺病毒載體為例構(gòu)建重組WNT3a基因的腺病毒載體。以小鼠胎盤cDNA為模板通過PCR方法調(diào)取WNT3a基因，按照AdEasy Vector Systerm操作方法構(gòu)建WNT3a重組腺病毒。并對重組腺病毒載體進(jìn)行包裝、病毒的純化和滴度測定。
3.NSC的定向誘導(dǎo)分化。重組的WNT3a腺病毒感染NSC，待WNT3a在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，并引發(fā)其下游基因的表達(dá)，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號，再加入抗壞血酸AA，進(jìn)一步誘導(dǎo)其向多巴胺能神經(jīng)元分化。
本發(fā)明的有益效果是按照本發(fā)明提供的技術(shù)方法，可以在體外獲得大量有功能的多巴胺能神經(jīng)元，為制備用于治療帕金森病的細(xì)胞制劑提供大量的目的細(xì)胞，同時可為治療帕金森病藥物的開發(fā)、藥物篩選提供細(xì)胞模型。


圖1 分離培養(yǎng)的大鼠神經(jīng)干細(xì)胞。
A光鏡下觀察大鼠神經(jīng)干細(xì)胞球；Bnestin抗體染色陽性神經(jīng)干細(xì)胞圖2 目的基因WNT3a電泳結(jié)果，大小為1058堿基。
1DL2000分子量標(biāo)志物；2目的基因WNT3a。
圖3 是重組腺病毒質(zhì)粒pAd-WNT3a的構(gòu)建流程圖。
圖4 重組質(zhì)粒電泳條帶。
1重組質(zhì)粒1；2重組質(zhì)粒2(重組質(zhì)粒1，重組質(zhì)粒2分別是來自pAd-WNT3a的不同克隆)；3DNA marker(DL15000)。
圖5 pAd-WNT3a重組病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切得到的電泳條帶。
1pAd-WNT3a經(jīng)Pac I酶切電泳結(jié)果；2DNA marker(DL15000)，箭頭所指的為pAd-WNT3a重組病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切得到的電泳條帶。
圖6 多巴胺能前體細(xì)胞標(biāo)志Nurr1表達(dá)量隨時間變化情況。
圖7 定向誘導(dǎo)分化后RT-PCR結(jié)果。
A孤核受體1(Nurr1)B酪氨酸羥化酶(TH)圖8 定向誘導(dǎo)分化后免疫組化結(jié)果。
A酪氨酸羥化酶(TH)B多巴胺轉(zhuǎn)運子(DAT)的表達(dá)圖9 定向誘導(dǎo)分化后Western結(jié)果，TH大小為62kb。
具體實施例方式
實施例1、以Wistar大鼠為例進(jìn)行神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)取懷孕12.5d的Wistar大鼠(北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司)，用戊巴比妥納(北京化學(xué)試劑廠)肌注麻醉孕鼠，無菌條件下剖腹并剪開子宮，取出胎鼠，剝離胞膜，用D-Hanks液輕輕沖洗；乳鼠全身消毒后分層剪開頭皮和顱骨，暴露兩側(cè)大腦半球，取出端腦和中腦，用D-Hanks液清洗腦組織塊并去除血管等結(jié)締組織后剪碎成糊狀，離心吸棄上清，轉(zhuǎn)入8ml 0.125％胰酶(Amresco)中，細(xì)口吸管輕輕吹打幾次后置37℃消化30min，每5min振蕩1次。加入100μl胎牛血清(GIBCO)、10μl DNase I混勻(TakaRa公司)，將細(xì)胞懸液過400目細(xì)胞篩網(wǎng)，200g離心10min，棄上清液，沉淀用1ml無血清培養(yǎng)液重懸，培養(yǎng)。神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)如圖1A。對神經(jīng)球的巢蛋白(nestin)表達(dá)，一抗(Chemicon公司)結(jié)合后采用熒光素標(biāo)記的二抗(中山公司)孵育30min，熒光顯微鏡觀察如圖1B。
實施例2、人腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)取3～4月齡胚胎，并取出端腦和中腦，小心剝離腦膜，用D-Hanks清洗腦組織塊并去除血管等結(jié)締組織后剪碎成糊狀，離心吸棄上清，轉(zhuǎn)入8ml 0.125％胰酶中，細(xì)口吸管輕輕吹打幾次后置37℃消化30min，每5min振蕩1次。加入100μl血清、10μlDNase I混勻，將細(xì)胞懸液過200目細(xì)胞篩，200g離心10min，棄上清液，沉淀用1ml無血清培養(yǎng)液重懸，培養(yǎng)。
實施例3、WNT3a重組腺病毒的構(gòu)建(詳細(xì)步驟參見PCT/CN2004/001109)1.WNT3a基因的獲得以小鼠胎盤cDNA為摸板，根據(jù)WNT3a-cDNA編碼區(qū)的序列并分別引入XbaI，Hpa I和BamH I酶切位點合成引物，引物序列及其多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的條件如下P1 5′-TCT AGA GTT AACATGGCTCCTCTCGGATACCT-3′P2 5′-AGA TCT GGA TCCCTACTTGCAGGTGTGCACGT-3′20μl反應(yīng)體系包括1ul cDNA(100ng/ul)，primerl和2各0.5μl(20μM)，1.5μl dNTP(2.5mM)，0.25μl La Taq DNA聚合酶(TakaRa公司，5u/μl)，2μl 5×GCBuffer I，14.75μl滅菌水。反應(yīng)條件為94℃變性3min；94℃ 45s，56℃ 45s，72℃ 2min，28個循環(huán)；72℃ 7min。電泳結(jié)果如圖2所示，泳道1為DNA分子量標(biāo)記(DL2000)，泳道2為目的基因，箭頭所指的為目的基因WNT3a電泳條帶，大小在1058bp。反應(yīng)產(chǎn)物克隆至pGEM-T eassy載體(Promega公司，美國)，獲得克隆質(zhì)粒T-WNT3a。
提取T-WNT3a質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶XbaI消化，回收WNT3a基因片段插入到pAdTrack(pAdTrack來自AdEasy Vector System(Quantum Biotechnologies)載體的XbaI位點上，獲得重組質(zhì)粒pAdTrack-WNT3a。對其進(jìn)行正、反向測序及分析表明，其開放閱讀框正確，沒有發(fā)生移碼改變。表明克隆的目的基因序列正確，重組質(zhì)粒pAdTrack-WNT3a構(gòu)建成功。
取1ug pAdTrack-WNT3a用Pme I線性化后，進(jìn)行1％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠回收10000bp的目的片段，用牛小腸堿性磷酸酶去磷酸化，乙醇沉淀備用。按AdEasy Vector System說明書提供的方法，先將腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1轉(zhuǎn)入BJ5183菌中，挑取含有pAdEasy-1的BJ5183菌制備高效感受態(tài)菌，再將1ug線性化的pAdTrack-WNT3a轉(zhuǎn)入含有pAdEasy-1的BJ5183菌，在50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)板中，37℃培養(yǎng)16-20h，挑取克隆，抽提質(zhì)粒，進(jìn)行0.7％瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果如圖2所示，表明質(zhì)粒的大小為43000bp，得到重組病毒質(zhì)粒，命名為pAd-WNT3a。將pAd-WNT3a再轉(zhuǎn)入DH5α菌中。圖3中，泳道1為重組質(zhì)粒1，泳道2為重組質(zhì)粒2(重組質(zhì)粒1，重組質(zhì)粒2分別是來自pAd-WNT3a的不同克隆)，泳道3為DNA marker(DL15000)，箭頭所指的為質(zhì)粒電泳條帶。
2、對重組病毒質(zhì)粒pAd-WNT3a中目的基因的鑒定用Pac I對pAd-WNT3a重組病毒質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定，鑒定結(jié)果如圖4所示，表明得到大小分別為39000bp和4500b的兩條帶，根據(jù)腺病毒特性可知重組成功。圖4中，泳道1為pAd-WNT3a經(jīng)Pac I酶切電泳結(jié)果，泳道2為DNA marker(DL15000)，箭頭所指的為pAd-WNT3a重組病毒質(zhì)粒經(jīng)Pac I酶切得到的電泳條帶。
3、重組病毒載體在293細(xì)胞的包裝、病毒的純化和滴度測定從步驟1中的含有重組病毒質(zhì)粒pAd-WNT3a的DH5α菌中提取質(zhì)粒DNA 10ug，用Pac I酶切使之線形化。按照說明用lipofectAMINE(GIBCO公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染293細(xì)胞。7-10d后用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，觀察到多數(shù)293細(xì)胞中有GFP的表達(dá)。然后收取細(xì)胞，在-70℃/37℃條件下反復(fù)凍融4次裂解細(xì)胞，離心取含病毒的上清，再次感染293細(xì)胞以擴(kuò)增重組病毒，3d后收集細(xì)胞，反復(fù)凍融3次。用CsCl密度梯度超離心法進(jìn)行病毒的純化，將濃縮后的病毒貯存液以不同比例稀釋。取400μl稀釋液加至293細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃孵育3小時，換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18-24h，于熒光顯微鏡下計數(shù)GFP陽性細(xì)胞數(shù)，按以下公式計算病毒滴度病毒滴度＝GFP細(xì)胞陽性數(shù)×病毒上清稀釋倍數(shù)/0.4ml(pfu/ml)。測得病毒滴度為3.16×107pfu/L。
實施例4、神經(jīng)干細(xì)胞體外定向誘導(dǎo)分化1.多巴胺能前體細(xì)胞的擴(kuò)增新鮮傳代的神經(jīng)干細(xì)胞以5×105個/ml接種于包被有多聚賴氨酸的培養(yǎng)瓶中，貼壁培養(yǎng)3d后，將重組的WNT3a腺病毒感染神經(jīng)干細(xì)胞，3h后更換培養(yǎng)液為DMEM/F12，2％B27，分別在0h、24h、48h、72h、96h收集細(xì)胞，做RT-PCR，進(jìn)行Nurr1半定量測定，如圖5。
2.多巴胺能細(xì)胞的獲得新鮮傳代的神經(jīng)干細(xì)胞以5×105個/ml接種于包被有多聚賴氨酸的24孔板內(nèi)，1ml/孔，貼壁培養(yǎng)后，感染重組WNT3a腺病毒，感染72h后更換培養(yǎng)液DMEM/F12，2％B-27并加入抗壞血酸，AA終濃度為100μmol/L，3d后半量換液，第6天時終止誘導(dǎo)。
實施例5、RT-PCR檢測基因的表達(dá)取誘導(dǎo)后的細(xì)胞(2×106個/ml)，用Trizol試劑(Invitrogen)提取RNA。各取2μg RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，鑒定Nurr1、DAT、TH基因的表達(dá)。引物由上海生工合成，以β-actin為內(nèi)參，如圖6。序列如下Nurr1引物設(shè)計為上游5’-CTTGTACCAAATGCCCCTG-3’下游5’-CATCGGGCTATGCTGTACC-3’，58℃，擴(kuò)增片斷196bp；DAT引物設(shè)計為上游5’-TGCTGGTCATTGTTCTGCTC-3’下游5’-ATCCACACAGATGCCTCACA-3’，58℃，擴(kuò)增片斷202bp；TH引物設(shè)計為上游，5’-CAGAGTCTCATCGAGGATGC-3’下游，5’-CTTGTCCTCTCTGGCACTGC-3’，52℃，擴(kuò)增片斷為376bp。
實施例6、細(xì)胞免疫熒光檢測對誘導(dǎo)后的細(xì)胞進(jìn)行酪氨酸羥化酶(TH)和多巴胺遞質(zhì)轉(zhuǎn)運子(DAT)的免疫細(xì)胞化學(xué)檢測，方法如下4％多聚甲醛固定室溫固定20min，PBS沖洗，0.3％Triton X-100室溫10min，3％H2O2室溫10min，PBS沖洗，山羊血清封閉30min，一抗工作液4℃孵育過夜，生物素標(biāo)記二抗，37℃，30min，DAB顯色2～10min，蒸餾水充分沖洗，重加PBS，顯微鏡下計數(shù)TH陽性細(xì)胞個數(shù)，如圖7，計數(shù)5個孔，每孔隨機(jī)取3個視野。
實施例7、Western blot檢測TH蛋白的表達(dá)表達(dá)的蛋白質(zhì)用聚丙烯酰胺凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡進(jìn)行檢測。收集細(xì)胞用蛋白裂解液于冰浴裂解30min，離心上清經(jīng)12％SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，用5％的脫脂奶粉封閉30min，TBST緩沖液洗脫3次，每次15min。一抗為抗大鼠的TH單克隆抗體，按1∶1000稀釋，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗脫3次，每次15min。二抗為辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗小鼠IgG，按1∶2000稀釋，37℃孵育2h，TBST緩沖液洗脫3次，每次15min。暗室曝光，如圖8，TH蛋白大小為62kd。
權(quán)利要求
1.一種定向誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞分化的方法，其特征是將WNT3a基因轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞，通過WNT3a基因的表達(dá)引發(fā)其下游基因的表達(dá)，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號以擴(kuò)增多巴胺能前體細(xì)胞，再通過抗壞血酸的誘導(dǎo)作用，產(chǎn)生大量有功能活性的多巴胺能神經(jīng)元。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的神經(jīng)干細(xì)胞可來源于哺乳動物或人胚胎的端腦、中腦、海馬、大腦皮層、紋狀體、坐骨神經(jīng)和腦室區(qū)以及成體的紋狀體、海馬、皮層和腦室室管膜或室管膜下層等組織來源的nestin+神經(jīng)干細(xì)胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的WNT3a轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的方法，是利用電轉(zhuǎn)、病毒載體感染或脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染等的方法進(jìn)行。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或3所述的轉(zhuǎn)染神經(jīng)干細(xì)胞的方法，所用的病毒載體包括腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和腺相關(guān)病毒等。
5.神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化后多巴胺能神經(jīng)元的用途，其特征在于誘導(dǎo)分化后的多巴胺能神經(jīng)元可為制備用于治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞制劑提供大量的目的細(xì)胞。
6.神經(jīng)干細(xì)胞向多巴胺能神經(jīng)元分化后多巴胺能神經(jīng)元的用途，其特征在于誘導(dǎo)分化后的多巴胺能神經(jīng)元可為治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病藥物的開發(fā)或藥物篩選提供細(xì)胞模型。
全文摘要
本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，目的是提供一種將神經(jīng)干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化為多巴胺能神經(jīng)細(xì)胞的方法。本發(fā)明將WNT3a基因轉(zhuǎn)染NSC，通過WNT3a基因的表達(dá)引發(fā)其下游基因的表達(dá)，產(chǎn)生誘導(dǎo)信號以擴(kuò)增多巴胺能前體細(xì)胞，再加入抗壞血酸AA，誘導(dǎo)神經(jīng)干細(xì)胞定向分化為多巴胺能神經(jīng)元。該定向誘導(dǎo)分化體系的建立不僅可為制備治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病的細(xì)胞制劑提供大量的目的細(xì)胞，而且還為治療帕金森病等神經(jīng)退行性疾病藥物的開發(fā)及藥物篩選提供了細(xì)胞模型。此方法的建立將在以基因工程、細(xì)胞工程乃至組織工程等為基礎(chǔ)的再生醫(yī)學(xué)中具有極佳的應(yīng)用前景，并將產(chǎn)生巨大的社會效益和經(jīng)濟(jì)效益。
文檔編號C12N5/10GK1978655SQ20051012797
公開日2007年6月13日 申請日期2005年12月9日 優(yōu)先權(quán)日2005年12月9日
發(fā)明者裴雪濤, 韓姝, 師偉, 李艷華, 閆舫, 陳琳, 王韞芳, 白慈賢, 施雙雙, 南雪 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院野戰(zhàn)輸血研究所