專利名稱：一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及神經(jīng)元細(xì)胞誘導(dǎo)的方法，具體涉及一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的方法。
背景技術(shù)：
神經(jīng)系統(tǒng)疾病如腦損傷、脊髓損傷、中風(fēng)、帕金森病、神經(jīng)元性肌萎縮側(cè)索硬化癥、阿爾茨海默病等社會危害大、治療難度高，長期以來是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題。已有研究表明，利用人神經(jīng)元細(xì)胞研究神經(jīng)損傷的機理，篩選干預(yù)神經(jīng)功能的新藥，并用于移植修復(fù)受損神經(jīng)功能是有效且具應(yīng)用前景的方法；但功能神經(jīng)細(xì)胞的來源途徑有限，以往常用胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells, ES 細(xì)胞)分化獲得人神經(jīng)細(xì)胞(Wichterle H，Lieberam I,Porter JA, et al. Directed differentiation of embryonic stem cells into motorneurons. Cell. 2002; 110(3) : 385-397)，而ES細(xì)胞的使用又一直受到倫理學(xué)的爭議，因此，獲得大量可用于基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的功能性神經(jīng)元細(xì)胞具有重要的科學(xué)和社會意義。2006 年，Yamanaka 等通過四種轉(zhuǎn)錄因子(Oct-3/4, Sox2, c_Myc, KLF4)介導(dǎo)，將小鼠成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樵谛螒B(tài)、增殖和畸胎瘤形成能力等方面與ES細(xì)胞相似的“誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞” (induced pluripotent stem cell, iPS 細(xì)胞)(Takahashi K，Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblastcultures by defined factors. Cell. 2006; 126(4): 663-676);所述的 iPS 細(xì)胞不涉及倫理爭議，可分化為神經(jīng)細(xì)胞(Dimos JT, Rodolfa KT, Eggan K，et al. Inducedpluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiatedinto motor neurons. Science. 2008; 321 (5893): 1218-1221),其開創(chuàng)的外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)細(xì)胞重編程的方式成為近年來干細(xì)胞研究的重大突破。但是，制備所述iPS細(xì)胞引入了 c-Myc和KLF4兩個致癌因子，其分化潛能又決定了有產(chǎn)生畸胎瘤的危險，這些缺陷嚴(yán)重影響了 iPS細(xì)胞的推廣和應(yīng)用；因此，利用外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的方法，從皮膚細(xì)胞獲得安全、具功能的神經(jīng)細(xì)胞，是一種較為理想的策略。2008年，哈佛大學(xué)Douglas Melton教授領(lǐng)導(dǎo)的研究團隊使用一套以三個轉(zhuǎn)錄因子為主的誘導(dǎo)體系將胰島外分泌細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化為胰島內(nèi)分泌P細(xì)胞(Zhou Q, BrownJ, Kanarek A, et al. In vivo reprogramming of adult pancreatic exocrine cellsto ^ -cells. Nature, 2008, 455: 627-632)。2010 年 I 月，美國斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院的Marius Wernig等在《Nature》雜志上報道,誘導(dǎo)細(xì)胞重編程可繞過iPS這一步驟,直接在體外將小鼠的胚胎和成體皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)檎T導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞(Vierbuchen T, OstermeierA, Pang ZP, et al. Direct conversion of fibroblasts to functional neuronsby defined factors. Nature. 2010; 463 (7284) : 1035-41 )。2010 年 8 月，美國和日本的研究人員在《Cell》雜志網(wǎng)絡(luò)版上報道，他們通過在小鼠成纖維原細(xì)胞中植入特定基因，成功培育出可自發(fā)收縮的心肌細(xì)胞(Ieda M, Fu JD, Delgado-Olguin P，et al.Direct reprogramming of fibroblasts into functional cardiomyocytes by definedfactors. Cell. 142:375-386)。2011年3月，美國的科研人員報道，使用制備iPS細(xì)胞的4個轉(zhuǎn)錄因子也可直接將小鼠皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變成心臟細(xì)胞(Efe JA, Hilcove S，KimJH, et al. Conversion of mouse fibroblasts into cardiomyocytes using a directreprogramming strategy. Nature Cell Biology. 2011; 13 (3) : 215-223)。上述的動物研究成果表明，利用外源轉(zhuǎn)錄因子誘導(dǎo)的方法，有望不需經(jīng)過多能干細(xì)胞(iPS細(xì)胞)這一步驟，直接從皮膚細(xì)胞獲得誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞，且此種細(xì)胞類型轉(zhuǎn)換方法不使用腫瘤相關(guān)因子，所獲細(xì)胞不會在體內(nèi)形成畸胎瘤，具有很好的安全性。但是，上述的技術(shù)方法尚存以下缺陷1)到目前為止，使用誘導(dǎo)小鼠的轉(zhuǎn)錄因子組合來誘導(dǎo)人的皮膚細(xì)胞，不能得到人的誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞；2)在動物實驗中，可通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將標(biāo)識細(xì)胞類型轉(zhuǎn)變的報告基因整合到小鼠基因組中，制成轉(zhuǎn)基因小鼠，當(dāng)皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變成為神經(jīng)細(xì)胞后，就可通過熒光或抗生素抗性篩選將需要的神經(jīng)細(xì)胞挑選出來，但因轉(zhuǎn)基因技術(shù)不能直接應(yīng)用于人，故此種細(xì)胞篩選方法不能應(yīng)用于誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的制備；3)普遍認(rèn)為，要全面評價一類新型細(xì)胞的特征和功能，須提供完整的體外和體內(nèi)實驗數(shù)據(jù)，但前述研究在評估小鼠誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞時只開展了體外實驗，未將獲得的功能細(xì)胞 移植到體內(nèi)進行分析鑒定，從而缺乏對這一類新細(xì)胞特征的完整認(rèn)識。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)獲得神經(jīng)元細(xì)胞的方法；進一步提供一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明方法通過將包含重編程轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Ascll和Mytll的cDNA導(dǎo)入離體成人皮膚細(xì)胞后，篩選表達人神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞克隆，直接制得能穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞。上述制備方法中，所述的cDNA通過病毒載體導(dǎo)入所述的人皮膚細(xì)胞；
所述的人皮膚細(xì)胞來源于離體的成人頭皮組織；
所述的病毒載體為慢病毒載體(基礎(chǔ)載體購自美國Addgene公司)；
所述的慢病毒載體以組合形式攜帶的轉(zhuǎn)錄因子包括Sox2、Ascll和Mytll。上述制備方法中，篩選過程是采用流式細(xì)胞術(shù)分選多唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子(PSA-NCAM)標(biāo)記呈陽性的細(xì)胞克隆。具體而言，本發(fā)明從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)獲得神經(jīng)元細(xì)胞的方法，其特征在于，包括以下步驟
(1)人皮膚細(xì)胞的收集和培養(yǎng)
無菌收集離體成人頭皮組織，按常規(guī)方法經(jīng)酶消化、接種和傳代等步驟培養(yǎng)出成人皮膚細(xì)胞；
(2)篩選可促成人皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子
從與人神經(jīng)發(fā)育密切相關(guān)或在重編程過程中具重要作用的轉(zhuǎn)錄因子中篩選出備選因子,如Ascll、Brn2、Lhx2、Mytll、Pax6、Sox2等,經(jīng)過不同組合的多次測試,找到可促使人皮膚細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵因子組合——Sox2, Ascll和Mytll ；
在人皮膚細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞轉(zhuǎn)變的過程中，所述的Sox2可首先結(jié)合到涉及此類細(xì)胞類型轉(zhuǎn)變的染色體上，打開染色體本身的致密結(jié)構(gòu)，以利于其他誘導(dǎo)性轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合；所述的Ascll在神經(jīng)元細(xì)胞的產(chǎn)生、類型決定和分化中起重要作用，且是小鼠皮膚細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的轉(zhuǎn)變最為關(guān)鍵的因子；所述的Mytll通常以轉(zhuǎn)錄激活因子的角色參與神經(jīng)系統(tǒng)和垂體內(nèi)多個調(diào)控基因的表達；上述的三個因子協(xié)同作用，開啟細(xì)胞類型變換的級聯(lián)反應(yīng)，實現(xiàn)人皮膚細(xì)胞向神經(jīng)元細(xì)胞的直接轉(zhuǎn)變；
(3)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體
分別將Sox2、Ascll和Mytll等3個轉(zhuǎn)錄因子的cDNA連接到慢病毒(Lentivirus)穿梭質(zhì)粒表達載體上(載體主要包含5’端的巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子(MIEP)，目的基因，多克隆位點以及3’端的SV40 PolyA位點等元件);使用293T細(xì)胞進行病毒包裝和生產(chǎn)；利用綠色熒光蛋白(GFP)作為報告基因；
(4)病毒感染離體成人皮膚細(xì)胞
采用步驟(3)所獲得的病毒液，感染步驟(I)獲得的成人皮膚細(xì)胞，培養(yǎng)I天后將細(xì)胞轉(zhuǎn)置于不含病毒液的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加有B27、N2、bFGF、EGF等生長因子)中；
(5)篩選表達人神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的細(xì)胞克隆
挑選具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞，用流式細(xì)胞分選術(shù)篩選出表達人神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白PSA-NCAM (神經(jīng)元細(xì)胞早期標(biāo)志)的陽性細(xì)胞克隆；
(6)誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的長期培養(yǎng)
將篩選得來的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體外繼續(xù)傳代培養(yǎng)，得到穩(wěn)定表達各種人神經(jīng)元標(biāo)志性特征的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞系。本發(fā)明提供了一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明中，將所述的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞移植于閉合性腦外傷模型(免疫缺陷小鼠腦內(nèi))，結(jié)果證實，該神經(jīng)元細(xì)胞是誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞，其具有下述完全的功能性神經(jīng)元細(xì)胞體外體內(nèi)特征(I)在體外表達人神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白；(2)在體內(nèi)可存活并表現(xiàn)出一定的功能特征。具體為
本發(fā)明所述的神經(jīng)元細(xì)胞中，所述的標(biāo)志蛋白包括神經(jīng)元核(NeuN)蛋白和突觸素(Synapsin)蛋白。本發(fā)明所述的神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)的功能特征包括
(1)移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞可在體內(nèi)存活；
(2)移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)表達神經(jīng)元細(xì)胞亞類特異性標(biāo)志蛋白；
(3)移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)參與移植受體神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)；
(4)移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)有助于腦損傷小鼠運動功能的改善；
其中，
所述的特征(I)中檢測誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞存活的指標(biāo)包括倒置熒光顯微鏡下觀察到小鼠腦內(nèi)存在形態(tài)完整、帶有綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的外源移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞；所述的特征(2)中的標(biāo)志蛋白包括乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)蛋白和I型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體(VGLUTl)等。所述的特征(3)中，檢測神經(jīng)電生理的指標(biāo)包括在細(xì)胞貼附模式(cell-attached mode)下記錄到所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的動作電流信號；在全細(xì)胞模式(whole-cell mode)下記錄到所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的自發(fā)性動作電位信號；在電流鉗模式(current clamp)下記錄到的注入不同大小去極化電流后，所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生快速變化的誘發(fā)性動作電位信號；
所述的特征(4)中檢測移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)影響腦損傷小鼠運動能力改善的指標(biāo)包括依據(jù)改良的BBB運動能力評分標(biāo)準(zhǔn)，觀察到移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)有助于腦損傷小鼠運動功能的改善。本發(fā)明對從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元細(xì)胞(誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞)進行體外體內(nèi)特征鑒定，鑒定步驟為
(1)誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的體外特征鑒定
在體外對誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞進行細(xì)胞免疫熒光染色等指標(biāo)檢測，鑒定人皮膚細(xì)胞起源的誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞的體外特征；
(2)誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的體內(nèi)特征鑒定
首先，制作閉合性腦外傷免疫缺陷小鼠模型；然后將帶有GFP標(biāo)記的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞移植于小鼠腦內(nèi)；具體步驟為
1)熒光顯微鏡下觀察所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)的存活和分布情況；
2)組織免疫化學(xué)等方法檢測所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)的分化情況；
3)在誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞移植于小鼠腦內(nèi)61周后檢測是否有腫瘤產(chǎn)生，確證誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的安全性；
4)利用腦片膜片鉗技術(shù)分析所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在受體動物體內(nèi)的電生理特
征；
5)依據(jù)改良的BBB運動能力評分標(biāo)準(zhǔn)，評價所移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞對腦損傷小鼠運動能力改善的影響。本發(fā)明對從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)得到的神經(jīng)元細(xì)胞(誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞)進行體外體內(nèi)特征鑒定，包括鑒定結(jié)果為
(1)誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體外
表達人神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白，包括神經(jīng)元核(NeuN)蛋白和突觸素(Synapsin)蛋白；
(2)移植于小鼠腦內(nèi)的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在受體體內(nèi)
1)可存活且未見有致瘤性；
2)移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)表達神經(jīng)元細(xì)胞亞類特異性標(biāo)志蛋白，包括乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)蛋白和I型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體(VGLUTl)；
3)移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)參與移植受體神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)，可發(fā)放動作電流、自發(fā)或誘發(fā)性動作電位等電生理信號；
4)依據(jù)改良的BBB運動能力評分標(biāo)準(zhǔn)，誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞移植組小鼠的運動能力恢復(fù)情況明顯優(yōu)于其他細(xì)胞移植組和對照組，說明移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)有助于腦損傷小鼠運動功能的改善。本發(fā)明從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)獲得神經(jīng)元細(xì)胞的方法具有如下優(yōu)點，
有助于獲取到大量可用于基礎(chǔ)研究及臨床應(yīng)用的人功能性神經(jīng)元細(xì)胞。在本發(fā)明中，誘導(dǎo)和培養(yǎng)所述的誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞均在無異源飼養(yǎng)層細(xì)胞的條件下進行，且所用重編程誘導(dǎo)因子不包括腫瘤相關(guān)因子，使所獲細(xì)胞具備更好的生物安全性。與已有的各類直接誘導(dǎo)型功能細(xì)胞相比，本發(fā)明的從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)得到的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞，在體外表達人神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白；被移植于閉合性腦外傷模型免疫缺陷小鼠腦內(nèi)后，可在體內(nèi)存活，表達神經(jīng)元細(xì)胞亞類特異性標(biāo)志蛋白，參與移植受體神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)，并有助于腦損傷小鼠運動功能的改善，從而具備了較完整、充分的新型細(xì)胞體內(nèi)外特征評價數(shù)據(jù)。本發(fā)明還提供了一種適用于人神經(jīng)元細(xì)胞體外篩選的方法，本發(fā)明所用流式細(xì)胞術(shù)分選誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞，安全有效地實現(xiàn)了對特定類型人類細(xì)胞的篩選和富集。本發(fā)明全面地檢測了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞的生物學(xué)特征和功能，為所述誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞的研究和應(yīng)用提供了可靠的數(shù)據(jù)，也為其他新型細(xì)胞的評估提供了一套可供參考的方法體系；采用本發(fā)明獲得具有功能的人神經(jīng)元細(xì)胞不需經(jīng)過多能干細(xì)胞的過程，技術(shù)更簡單有效；無異源飼養(yǎng)層參與，臨床應(yīng)用前景更好；采用的轉(zhuǎn)錄因子未見有致瘤相關(guān)報道，生物安全性更高。


圖I顯示了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞在倒置顯微鏡下的檢測結(jié)果，其中，由人皮膚細(xì)胞誘導(dǎo)而來的神經(jīng)元細(xì)胞胞體呈圓形或多角形，有突起伸出，且與鄰近細(xì)胞交織成網(wǎng)狀。圖2顯示了經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)分選PSA-NCAM標(biāo)記呈陽性的人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞克隆。紅色方框表示的是篩選陽性細(xì)胞的范圍。圖3顯示了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞在體外的免疫熒光染色結(jié)果，其中，a是神經(jīng)元核(NeuN)蛋白染色(紅色)，NeuN是現(xiàn)今識別神經(jīng)元的標(biāo)準(zhǔn)免疫細(xì)胞化學(xué)標(biāo)志物；b是突觸素(Synapsin)蛋白染色(紅色點狀)，Synapsin是神經(jīng)元軸突終末特異性標(biāo)志物；細(xì)胞核均使用DAPI染色(藍(lán)色)。圖4顯示了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞移植于小鼠腦內(nèi)后在倒置熒光顯微鏡下觀察腦切片的結(jié)果，其中，通過綠色熒光蛋白標(biāo)記的人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞(綠色)在小鼠腦內(nèi)保持形態(tài)完整，具有神經(jīng)細(xì)胞樣形態(tài)和突起。圖5顯示了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞移植于小鼠腦內(nèi)后的免疫熒光染色結(jié)果，其中，a是乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶(ChAT)蛋白染色(紅色點狀)，ChAT是膽堿能神經(jīng)元的標(biāo)志酶，而乙酰膽堿作為神經(jīng)遞質(zhì)在神經(jīng)沖動傳遞中起重要作用；b是I型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體(VGLUTl)蛋白染色(紅色)，VGLUTl標(biāo)記谷氨酸能神經(jīng)元，而谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，研究發(fā)現(xiàn)其在癲癇的發(fā)病中發(fā)揮重要作用；細(xì)胞核均使用DAPI染色。圖6顯示了利用腦片膜片鉗技術(shù)記錄人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞在被移植于小鼠腦內(nèi)后的神經(jīng)電生理信號，其中，a是在細(xì)胞貼附模式(cell-attached mode)下記錄到的動作電流信號；b是在全細(xì)胞模式(whole-cell mode)下記錄到的自發(fā)性動作電位信號；c是在電流鉗模式(current clamp)下記錄到的注入不同大小去極化電流后，細(xì)胞產(chǎn)生快速變化的誘發(fā)性動作電位信號。圖7顯示了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞在被移植于小鼠腦內(nèi)后，響應(yīng)外源添加神經(jīng)遞質(zhì)抑制劑Y -氨基丁酸(GABA)對神經(jīng)電活動的影響情況，其中，a是在未有外源GABA影響下記錄到的自發(fā)性電信號；b是在外源施加了 10 ii M GABA于細(xì)胞表面的情況下記錄到的自發(fā)性電信號；C是在停止外源施加GABA，并用常規(guī)人工腦脊液沖洗細(xì)胞一段時間后記錄到的自發(fā)性電信號。圖8顯示了人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞被移植于閉合性腦外傷模型免疫缺陷小鼠腦內(nèi)后，受體運動能力的變化情況，其中，a是細(xì)胞移植前，隨機分成的3組腦損傷模型小鼠(n=10)運動能力的評分情況，數(shù)據(jù)顯示，各組之間沒有顯著性差異(P>0. 05) ；b是進行細(xì)胞移植后，分別對對照組、人成纖維細(xì)胞移植組和人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞移植組小鼠運動能力進行評分的情況，數(shù)據(jù)顯示，人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞移植組與另外兩組間均有顯著性差異(p ( 0. 05)。
具體實施例方式以下結(jié)合具體實施例，對本發(fā)明作進一步說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
下列實施例中，未具體注明實施條件和方法處，均為按照常規(guī)實驗方案，如《分子克隆實驗指南(第三版)》([美]J.薩姆布魯克，D. W拉塞爾著，2003)中所述方法或試劑生產(chǎn)商建議方案來開展。實施例I :成人皮膚細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
從接受神經(jīng)外科手術(shù)的病人脫落頭皮中獲取頭皮組織并分離成人皮膚細(xì)胞。具體分離培養(yǎng)方法如下將術(shù)中清除的頭皮組織立即置于冰預(yù)冷的PBS中，反復(fù)用PBS沖洗去除血塊；膠原酶+胰酶兩步消化法獲得單細(xì)胞懸液，置于含2 mmol/L谷氨酰胺、10 % FBS,50 U/ml青霉素/50 U /ml鏈霉素的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液中(均購自GIBCO公司)；調(diào)整細(xì)胞密度至lX105/ml，置于37°C、5%C02的細(xì)胞培養(yǎng)箱進行培養(yǎng)，24h后更換新培養(yǎng)液；將原代培養(yǎng)5d后的細(xì)胞離心，用0. 25%的胰蛋白酶消化，用所述DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液終止消化反應(yīng)，將細(xì)胞懸液按5 X 105/ml密度傳代接種于培養(yǎng)瓶中，在37°C、5%C02條件下靜置培養(yǎng)，每3天換液I次，每6天按1:2或1:3傳代。將所獲原代細(xì)胞在培養(yǎng)液中培養(yǎng)3飛代后，根據(jù)形態(tài)學(xué)等特點，剔除雜細(xì)胞，純化所得細(xì)胞類型。實施例2 :病毒載體構(gòu)建及包裝
以人總cDNA為模板，擴增S0X2、Ascll和Mytll等3個基因；按常規(guī)分子克隆方法將基因整合進慢病毒基礎(chǔ)表達載體(Addgene公司)；使用293T細(xì)胞(Invitrogen公司)包裝并大量擴增已攜帶有轉(zhuǎn)錄因子的重構(gòu)病毒載體。所有基因克隆產(chǎn)物均經(jīng)PCR和基因測序檢測驗證。實施例3 :病毒載體感染人皮膚細(xì)胞
在轉(zhuǎn)染前一天，將皮膚細(xì)胞以8X 105/ml的密度接種；將含有S0X2、Ascll和Mytll等3個基因的病毒表達載體等量混合，加入到培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)過夜；轉(zhuǎn)染24小時后，用新鮮的神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液替換掉含病毒的培養(yǎng)液；培養(yǎng)72小時后檢測外源基因的表達情況。每天觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，收集轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂猩窠?jīng)元樣形態(tài)特征的細(xì)胞。神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)液的主要成分是DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液(GIBC0公司)，并添加有
IXGlutaMax (Invitrogen 公司)、2% B27 無血清培養(yǎng)基添加因子(Invitrogen 公司)、1%N2神經(jīng)細(xì)胞生長添加劑(Invitrogen公司)、100 ng/ml堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basicfibroblast growth factor, bFGF, Sigma 公司)、100 ng/ml 表皮生長因子(epidermalgrowth factor,EGF, Sigma公司)、0. 16% D-葡萄糖(Sigma公司)和 0. 2 mM抗壞血酸(Sigma公司)。實施例4 :流式細(xì)胞術(shù)篩選人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞克隆
收集前期挑選的具有典型神經(jīng)元形態(tài)特征的細(xì)胞，常規(guī)酶消化，PBS洗滌，制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度為I X 106/ml。取300 Ul細(xì)胞，加入I Ul抗人的PSA-NCAM抗體(Millipore公司)，4°C避光孵育30 min, 2000 r/min離心5 min,棄上清，Buffer洗漆，吹打混勻。BDFACS Aria流式細(xì)胞分選儀上機檢測，篩選PSA-NCAM陽性細(xì)胞克隆。實施例5 :免疫細(xì)胞化學(xué)反應(yīng)鑒定人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞
細(xì)胞用4%多聚甲醛室溫固定10 min, PBS沖洗，用含5%正常山羊血清或驢血清(Millipore 公司)、1%BSA、0. 1% Triton X-100 的 PBS 處理 45 min。一 抗包括 NeuN,Synapsin ;一抗使用濃度按試劑盒提供的使用濃度；二抗使用Cy3標(biāo)記的驢抗兔IgM(1:200, Invitrogen), Alexa Fluor 555 標(biāo)記驢抗小鼠 IgG (1:200, Invitrogen)。細(xì)胞核染色采用4’，6- 二脒基-2-苯基吲哚(DAPI，Sigma公司)。實施例6 :制作閉合性腦外傷小鼠模型
參照文獻(Nawashiro H，Messing A, Azzam N，et al. Mice lacking GFAP arehypersensitive to traumatic cerebrospinal injury. Neuroreport 1998;9:1691-1696及Okuyama S, Imagawa Y, Ogawa S, et al. The effect of VA-045 on disturbance inconsciousness in experimental animal models. Res Commun Chem Pathol Pharmacol.1993;82(1) :91-100)的方法制作閉合性腦外傷小鼠模型。具體為將麻醉好的小鼠固定在泡沫平臺上，用直徑約為5 mm的鋼珠以80(T200 g_cm的力量，通過撞擊矢中線一側(cè)頂骨造成閉合性腦外傷模型。實施例7 :人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞移植及體內(nèi)鑒定
通過立體定向，將帶有GFP標(biāo)記的人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞移植于閉合性腦外傷模型免疫缺陷小鼠腦內(nèi)，移植方向為沿受損一側(cè)皮層的前后軸，共設(shè)置5個移植位點，每個位點約注A I X IO5個細(xì)胞。移植61周后通過觀察腦部形態(tài)，并對腦組織切片行HE染色，檢查是否有腫瘤產(chǎn)生。制作小鼠腦冰凍切片的基本步驟為小鼠經(jīng)左心室先后灌注0. 9%生理鹽水20ml，4%多聚甲醛20ml ;固定完成后斷頭取腦置于4%多聚甲醛中固定4 6h，分別經(jīng)15%、30%蔗糖梯度脫水后行冰凍切片，切片厚度約為10-30 iim。利用組織免疫化學(xué)法，檢測所移植人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞在受體腦內(nèi)的存活、分布和分化情況，基本操作參照前述腦冰凍切片制作方法和上述實施例5進行。利用腦片膜片鉗技術(shù)分析人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞在所移植小鼠腦內(nèi)的電生理特征。離體腦片制備的基本步驟為小鼠行腹腔注射麻醉，快速斷頭取腦，浸入預(yù)先冰冷且持續(xù)通混合氣體(95% 02+5% CO2)的人工腦脊液中，其配方為(單位mM) :254 sucrose, 10D-glucose，25 NaHCO3, 2 CaCl2, 3 KC1，2 MgSO4 和 I. 25 NaH2PO4 (pH 7. 4);將腦組織固定于振動切片機(Leica公司)上，冠狀切片，厚度約為30011111，28 321條件下預(yù)孵育I h，以利于腦片活性的恢復(fù)。微電極用兩步法拉成，充灌電極液后的電阻在2 3MQ之間。將微電極連于膜片鉗儀(Axopatch 700B, Axon USA)的探頭上，將單細(xì)胞置于浴槽中，人工腦脊液以3ml/min恒速灌流沖洗細(xì)胞表面，灌流用人工腦脊液成分包括(單位mM) :125 NaCl, 2. 5 KCl, I. 25NaH2PO4, 25 NaHCO3,10 D_glucose，2 MgSO4 和 I CaCl20 形成高阻封接(>10G Q )后，用脈沖式抽吸打破細(xì)胞膜，形成全細(xì)胞構(gòu)型，用電壓鉗和電流鉗模式進行刺激和記錄。實驗過程由PCLAMP 9. 0 (Axon Instrument)控制，數(shù)-模轉(zhuǎn)換器完成刺激信號的產(chǎn)生、反饋信號的采集及數(shù)據(jù)分析，信號輸入經(jīng)過IKHz的濾波。實驗在室溫(19 22°C)下進行，檢測單個人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞的電信號。檢測指標(biāo)包括在細(xì)胞貼附模式(cell-attached mode)下記錄動作電流信號；在全細(xì)胞模式(whole-cell mode)下記錄自發(fā)性動作電位信號；在電流鉗模式(current clamp)下記錄注入不同大小去極化電流后,細(xì)胞產(chǎn)生快速變化的誘發(fā)性動作電位信號等。實施例8 :評價人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞對腦損傷小鼠運動能力改善的影響
從移植術(shù)后第I天起，對小鼠進行開放場式(open filed)試驗。在恢復(fù)階段早期，可觀察到后肢運動受限，小鼠無力支撐體重以至于拖著軀干、后腿和臀部；在恢復(fù)階段中期， 小鼠逐漸可以走路并支撐自己的體重，前后肢的協(xié)調(diào)運動開始恢復(fù)；在恢復(fù)階段后期，一些精細(xì)運動如持續(xù)協(xié)調(diào)步態(tài)等逐步恢復(fù)。依據(jù)改良的BBB運動能力評分標(biāo)準(zhǔn)對以上幾個階段按周評分，持續(xù)12周，對所獲數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析處理，評價人誘導(dǎo)型神經(jīng)元細(xì)胞對腦損傷小鼠運動能力改善的影響。
權(quán)利要求
1.一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)神經(jīng)元細(xì)胞的方法，其特征在于，將包含重編程轉(zhuǎn)錄因子S0X2、Ascll和Mytll的cDNA導(dǎo)入成人皮膚細(xì)胞后，篩選表達人神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞克隆，直接制得能穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞；包括步驟 (1)收集和培養(yǎng)人皮膚細(xì)胞，所述的人皮膚細(xì)胞來源于離體的成人頭皮組織 (2)篩選可促成人皮膚細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)元細(xì)胞的關(guān)鍵誘導(dǎo)因子 從備選因子中Ascll、Brn2、Lhx2、Mytll、Pax6、Sox2,經(jīng)過不同組合的測試,找到關(guān)鍵因子組合Sox2、Ascll 和 Mytll ； (3)構(gòu)建攜帶轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體 分別將轉(zhuǎn)錄因子S0X2、Ascll和Mytll的cDNA連接到慢病毒穿梭質(zhì)粒表達載體上；用293T細(xì)胞進行病毒包裝和生產(chǎn)；用綠色熒光蛋白作為報告基因； (4)病毒感染離體成人皮膚細(xì)胞 采用步驟(3)所獲得的病毒液，感染步驟(I)獲得的成人皮膚細(xì)胞，培養(yǎng)I天后將細(xì)胞轉(zhuǎn)置于不含病毒液的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液中； (5)篩選表達人神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白的細(xì)胞克隆 挑選具有典型神經(jīng)元形態(tài)的細(xì)胞，篩選出表達人神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)志蛋白PSA-NCAM的陽性細(xì)胞克隆。
2.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的cDNA通過慢病毒載體導(dǎo)入所述的人皮膚細(xì)胞。
3.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的慢病毒載體以組合形式攜帶轉(zhuǎn)錄因子 Sox2、Ascll 和 Mytll。
4.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(3)的慢病毒載體主要包含5’端的巨細(xì)胞病毒立即早期啟動子MIEP，目的基因，多克隆位點以及3’端的SV40 PolyA位點。
5.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(5)篩選過程中，采用流式細(xì)胞術(shù)分選多唾液酸-神經(jīng)細(xì)胞黏附分子標(biāo)記呈陽性的細(xì)胞克隆。
6.按權(quán)利要求I所述的方法，其特征在于，所述步驟(4)的神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液為DMEM/Fl2基礎(chǔ)培養(yǎng)液，其中添加有B27、N2、bFGF和EGF生長因子。
7.一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞,其特征在于,所述的神經(jīng)元細(xì)胞通過權(quán)利要求I所述的方法制得，具有特征 (1)在體外表達人神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白； (2)在體內(nèi)可存活并發(fā)揮功能。
8.按權(quán)利要求7所述的神經(jīng)元細(xì)胞，其特征在于，所述的標(biāo)志蛋白包括神經(jīng)元核蛋白和突觸素蛋白。
9.按權(quán)利要求7所述的神經(jīng)元細(xì)胞，其特征在于，將所述的神經(jīng)元細(xì)胞移植后具有以下特征 (1)移植后的神經(jīng)元細(xì)胞可在體內(nèi)存活； (2)移植后的神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)表達神經(jīng)元細(xì)胞亞類特異性標(biāo)志蛋白； (3)移植后的神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)參與移植受體神經(jīng)電信號的傳導(dǎo)； (4)移植后的神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)改善腦損傷的運動功能。
10.按權(quán)利要求9所述的神經(jīng)元細(xì)胞，其特征在于，所述的特征(I)中，通過下述指標(biāo)檢測誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞存活狀態(tài)倒置熒光顯微鏡下觀察到小鼠腦內(nèi)存在形態(tài)完整、帶有綠色熒光蛋白標(biāo)記的外源移植誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞。
11.按權(quán)利要求9所述的神經(jīng)元細(xì)胞，其特征在于，所述的特征(2))中的標(biāo)志蛋白包括乙酰膽堿轉(zhuǎn)移酶蛋白和I型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運體。
12.按權(quán)利要求9所述的神經(jīng)元細(xì)胞，其特征在于，所述的特征(3)中，檢測神經(jīng)電生理的指標(biāo)包括在細(xì)胞貼附模式下記錄到所移植神經(jīng)元細(xì)胞的動作電流信號；在全細(xì)胞模式下記錄到所移植神經(jīng)元細(xì)胞的自發(fā)性動作電位信號；在電流鉗模式下記錄到的注入不同大小去極化電流后，所移植神經(jīng)元細(xì)胞產(chǎn)生快速變化的誘發(fā)性動作電位信號。
13.按權(quán)利要求9所述的神經(jīng)元細(xì)胞，其特征在于，所述的特征(4)中，檢測移植后的神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)影響腦損傷后運動能力改善的指標(biāo)包括依據(jù)改良的BBB運動能力評分標(biāo)準(zhǔn)，觀察到移植后的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞在體內(nèi)有助于腦損傷后運動功能的改善。
全文摘要
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，涉及一種從人皮膚細(xì)胞直接誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞及其制備方法；本發(fā)明方法通過將包含重編程轉(zhuǎn)錄因子Sox2、Ascl1和Myt1l的cDNA導(dǎo)入離體成人皮膚細(xì)胞后，篩選表達人神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)記物的細(xì)胞克隆，直接制得能穩(wěn)定傳代的誘導(dǎo)型人神經(jīng)元細(xì)胞。所述的神經(jīng)元細(xì)胞具有以下特征(1)在體外表達人神經(jīng)元細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白；(2)在體內(nèi)可存活并發(fā)揮功能。本發(fā)明獲得具有功能的人神經(jīng)元細(xì)胞不需經(jīng)過多能干細(xì)胞的過程，技術(shù)更簡單有效；無異源飼養(yǎng)層參與，臨床應(yīng)用前景更好；采用的轉(zhuǎn)錄因子未見有致瘤相關(guān)報道，生物安全性更高。
文檔編號C12N5/0793GK102796696SQ20111014048
公開日2012年11月28日 申請日期2011年5月27日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月27日
發(fā)明者朱劍虹, 王璞, 沙紅英, 徐成仕, 吳惺 申請人:復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院