專利名稱：：ABCA1基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及的是一種生物基因
技術(shù)領(lǐng)域：
多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法，特別是一種ABCA1(ATP-bindingcassettetransportersubfamilyAnumber1,ABCA1)基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法。
背景技術(shù)：
：糖尿病是一種由遺傳和環(huán)境因素相互作用而引起的復(fù)雜病。由于其病因不清，目前臨床上只能對(duì)糖尿病患者進(jìn)行對(duì)癥治療。個(gè)體在患病程度、肝腎功能、營(yíng)養(yǎng)狀況、生活方式等有一定差異，可導(dǎo)致機(jī)體對(duì)藥物反應(yīng)大小不一。此外由于個(gè)體之間存在遺傳差異，決定了個(gè)體對(duì)藥物的敏感性、毒副作用等反應(yīng)也存在一定的差異。因此揭示遺傳因素對(duì)藥物反應(yīng)的影響將有助于研究和預(yù)測(cè)患者對(duì)藥物治療反應(yīng)的關(guān)系，為指導(dǎo)個(gè)體化合理用藥打下基礎(chǔ)。ABCA1基因位于染色體9q31.1，約147kb，包含50個(gè)外顯子，其編碼2261個(gè)氨基酸組成的跨膜糖蛋白，參與生物體內(nèi)脂類、膽固醇、代謝產(chǎn)物及藥物等的膜間轉(zhuǎn)運(yùn)。目前研究表明，ABCA1在脂代謝中主要參與膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)，可以介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流，最后膽固醇被轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟分解代謝并通過膽道排泄。最近又有研究見到，ABCA1亦參與糖代謝，與糖耐量及胰島素分泌相關(guān)，Abcal基因敲除小鼠表現(xiàn)為糖耐量及胰島素分泌受損，且對(duì)羅格列酮治療無(wú)效BnmhamLR，Kruit了K,PapeTD，Ti腿insJ"M，ReuwerAQ，VasanjiZetal.Beta-cellABCA1influencesinsulinsecretion,glucosehomeostasisandresponsetothiazolidinedionetreatment.NatMed2007;13:340-7.。研究表明ABCA1基因的表達(dá)受過氧化物酶體增殖激活受體y(PPARy)的調(diào)控，PPARy可通過活化肝X受體a上調(diào)ABCA1基因的表達(dá)。已明確PPARy是羅格列酮等噻唑垸二酮類胰島素增敏劑的主要作用靶點(diǎn)，該類藥物主要通過結(jié)合和活化PPARY，誘導(dǎo)脂肪生成酶和與糖代謝調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)脂肪細(xì)胞和其他細(xì)胞的分化，并增強(qiáng)靶組織對(duì)胰島素的敏感性，減輕胰島素抵抗，且對(duì)于胰島功能有保護(hù)作用ElteJW，BlickleJF.Thiazolidinedionesforthetreatmentoftype2diabetes.EurJInternMed2007;18:18-25.。對(duì)現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的分析表明，ABCAl基因變異可能影響PPARY介導(dǎo)的靶組織對(duì)胰島素的敏感性以及血糖水平的改變，但在目前的遺傳學(xué)研究中僅有ABCAl多態(tài)位點(diǎn)與2型糖尿病易感性相關(guān)的報(bào)道，未見到有ABCAl基因變異與糖尿病患者用羅格列酮后胰島素敏感性和血糖水平變化存在相關(guān)的研究報(bào)道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種ABCAl基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法。本發(fā)明同時(shí)涉及一種分離核酸、一種特異性核酸引物，還揭示了ABCAl基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)在預(yù)測(cè)糖尿病患者用羅格列酮后胰島素敏感性和血糖水平變化方面的用途。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明所涉及的ABCAl基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)，在人ABCAl基因第7號(hào)外顯子的SEQIDNO:1所示序列的第150位核苷酸，所述的ABCAl基因第7號(hào)外顯子的SEQIDNO:1所示序列的第150位存在G具有單核苷酸多態(tài)性，在其互補(bǔ)鏈上為C等位基因。所述的第7號(hào)外顯子的SEQIDNO:l所示序列，其第150位的A—G的變異會(huì)造成ABCAl基因第219個(gè)氨基酸序列由精氨酸到賴氨酸的改變。其中攜帶A/A基因型的糖尿病個(gè)體用羅格列酮后，降糖作用最明顯，A/G基因型次之，G/G基因型攜帶者的降糖作用最差；攜帶G等位基因(其DNA互補(bǔ)鏈上為C等位基因)的糖尿病患者用羅格列酮后胰島素敏感性改善程度和血糖降低程度較非G等位基因攜帶者差。本發(fā)明所涉及的ABCAl基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法，包括以下步驟-(a)用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正到50ng/u1，作為DNA模板；(b)設(shè)計(jì)特異性核酸引物，加入dNTP，Taq酶，DNA模板滅菌雙蒸水等試劑，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因；(c)用內(nèi)切酶XagI限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性方法測(cè)定rs2230806多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明還涉及一種分離核酸，它具有SEQIDNO:l所示序列，且第150位為G。本發(fā)明還涉及一種特異性核酸引物，其長(zhǎng)度為26—27bp，可特異性擴(kuò)增出含SEQIDNO:1所示序列中第150位核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明還涉及一種預(yù)測(cè)糖尿病個(gè)體用羅格列酮后胰島素敏感性和血糖水平變化的檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物，dNTP，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)的內(nèi)切酶XagI。包括dNTP，Taq酶，DNA模板可用于PCR擴(kuò)增反應(yīng)的其他試劑，用于特異性擴(kuò)增包含ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)的目標(biāo)基因的引物對(duì)，識(shí)別ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)與糖尿病個(gè)體用羅格列酮后胰島素敏感性和血糖水平的變化相關(guān)，ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)可在人體樣本如全血中檢出。本發(fā)明提供的檢測(cè)試劑盒可用來(lái)預(yù)測(cè)糖尿病個(gè)體用羅格列酮的反應(yīng)，將有望對(duì)糖尿病的個(gè)體化臨床工作提供新的思路和見解。圖1為ABCA1基因結(jié)構(gòu)及rs2230806多態(tài)位點(diǎn)示意圖。圖中ABCA1基因包含50個(gè)外顯子。圖2為聚合酶鏈反應(yīng)一限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)檢測(cè)rs2230806多態(tài)位點(diǎn)的結(jié)果示意圖。圖中1:PGEM-7Zf(+)/HaeIIIDNA標(biāo)記；6、9:A/A基因型；7:G/G基因型；24、8:A/G基因型。具體實(shí)施例方式以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例作詳細(xì)說明本實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方式和過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)施方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人所著分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1998)中所述條件，或按照制造廠商所建議的條件。實(shí)施例1:樣本的獲得和基因組DNA的抽提從上海地區(qū)采集到新診斷的2型糖尿病患者105例，所有患者均符合1999年世界衛(wèi)生組織糖尿病分型診斷標(biāo)準(zhǔn)。所有患者初診時(shí)均未接受過任何降糖治療，且滿足以下條件年齡在30-70歲；糖化血紅蛋白(HbAlc)》6.5%;體重指數(shù)(BMI》18.5kg/nf);女性已絕經(jīng)或絕育或已有效避孕?？崭寡?FPG)〉13腿ol/L和/或餐后2小時(shí)血糖(2hPG)>18mmol/L，全體參與者均為漢族，參與者均簽署了知情同意書。用常規(guī)酚氯仿法從人全血中提取基因組DNA。實(shí)施例2:糖尿病患者用藥方案、用藥過程中的臨床指標(biāo)監(jiān)測(cè)和評(píng)估方法所有受試者均進(jìn)行口服羅格列酮單藥治療，為期48周。藥物劑量調(diào)整方法如下羅格列酮起始劑量為4mg/天，8周后血糖控制良好者繼續(xù)該劑量至48周，血糖控制不佳者(標(biāo)準(zhǔn)FPG〉7腿ol/L和/或2hPG〉10咖ol/L)改為8mg/天至48周。若12周時(shí)HbAlc》8。/。，或連續(xù)2次FPG>13mmol/L或2hPG〉18mmol/L(第2次檢查在第1次檢查后6天內(nèi)進(jìn)行)，患者退出本研究。對(duì)所有受試者在治療前及治療后48周分別測(cè)量人體基本參數(shù)包括身高、體重、腰圍、臀圍、股圍、收縮壓和舒張壓。計(jì)算BMI二體重/身高2(kg/m2)、腰臀比(WHR)=腰圍/臀圍。并抽取靜脈血檢測(cè)各項(xiàng)臨床指標(biāo)，包括糖代謝治療前后的FPG和75g葡萄糖負(fù)荷后2hPG以及HbAlc;胰島素分泌功能檢測(cè)應(yīng)用精氨酸刺激試驗(yàn)(靜脈推注10y。精氨酸溶液50ml，推注時(shí)間30-60秒)分別測(cè)定0、2、4、6分鐘時(shí)的血糖及血胰島素(INSo、INS2、肌、肌)。采用穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法(H0MA)公式，以FPG及空腹胰島素(FINS)計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(H0MA-IR)和胰島P細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-B)。H0MA-IR=FPGXFINS/22.5;H0MA-B=20XFINS/(FPG—3.5)，分別反映胰島素敏感性及基礎(chǔ)狀態(tài)下的胰島e細(xì)胞分泌功能。精氨酸刺激后的胰島素分泌量Arg-INS=(INS2+INS4+INS6)/3—INS。，反映胰島素急性相分泌。評(píng)估羅格列酮對(duì)糖尿病個(gè)體有明顯降糖作用的標(biāo)準(zhǔn)以受試者治療后48周時(shí)測(cè)得的FPG、2hPG和HbAlc值較基線時(shí)均下降15%為降糖作用明顯。實(shí)施例3:ABCA1基因rs2230806基因型檢測(cè)方法本方法采用PCR擴(kuò)增目標(biāo)基因序列和采用限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性方法檢測(cè)ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)。PCR擴(kuò)增和酶切反應(yīng)均在9700DNA熱循環(huán)儀(AppliedBiosystem)上進(jìn)行?；蛐蜋z測(cè)包括以下2個(gè)步驟。引物序列如下PCR正向引物:5'-GCAAGGCTACCAGTTACATTTGACAAG-3，(如圖2中SEQIDN02所示)PCR反向引物:5,-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGG-3'(如圖2中SEQIDN03所示)PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，反應(yīng)體系及步驟如下反應(yīng)體系10XPCR緩沖液為3.Oy1;25mMMgC12為2.1;2.OmMdNTP為3.Oy1;混合引物為0.6ul;Taq酶為0.3u1;DNA模板為:l.Ou1;ddH20為:19.7li1?？傮w積為30Ul。反應(yīng)步驟94。C預(yù)變性為5min;94。C變性為1min;58'C退火為1min;72'C延伸為1min;72'C延伸為10min。共30個(gè)循環(huán)。用限制性內(nèi)切酶XagI對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng)，在反應(yīng)溫度水浴2小時(shí)后，取酶切產(chǎn)物20ul，加入6X電泳上樣緩沖液4ul，12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，電壓300V，電泳2小時(shí)。以溴乙錠染色(工作濃度為0.5ug/ml)510分鐘，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察并攝片，讀取基因型。酶切反應(yīng)體系如下PCR產(chǎn)物為10.0Ul;IOX酶切反應(yīng)緩沖液為2.0ul;Xagl為l.Oul;ddH20為:7.Oyl。總體積為20.Oul。實(shí)施例4ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)與羅格列酮治療糖尿病療效的相關(guān)性統(tǒng)計(jì)方法數(shù)據(jù)資料均以均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)誤表示。計(jì)算各基因型及等位基因頻率，使用Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)確認(rèn)研究樣本的群體代表性。采用Sh鄰iro-Wilk檢驗(yàn)各變量的正態(tài)性，正態(tài)性變量采用t檢驗(yàn)、方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，非正態(tài)性變量采用Wilcoxon非參數(shù)檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)?；蛐烷g治療有效性的比較采用卡方檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)資料均使用SAS6.12版統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析處理。結(jié)果糖尿病患者羅格列酮治療前后的臨床指標(biāo)變化所有105個(gè)入選本研究的糖尿病患者中，93例患者[男/女65/28例，年齡52.09±9.09歲(均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差)]完成整個(gè)研究?；€及治療后48周的臨床指標(biāo)如表l所示。通過48周羅格列酮單藥治療，治療后48周血糖(FPG，2hPG)及HbAlc水平較基線時(shí)顯著下降，胰島素敏感指標(biāo)(H0MR-IR)、胰島素分泌指標(biāo)(H0MA-B)顯著改善，精氨酸刺激后胰島素原分泌也顯著下降(P值均〈0.001)，此外治療前后舒張壓也有明顯下降。表1羅格列酮治療48周前后的臨床性狀比較基線治療48周后P值柳I(kg/m2)25.08±0.3124.85±0.370.7688腰圍(cm)88.58±0.9087,37±0.960.0962腰臀比0.91±0,010.90±0.010.1709收縮壓(mmHg)129.19±1.63125.41±1.840.0816舒張壓(mmHg)83.44±0.9979.22±0.99<0.0001空腹血糖(FPG)(mmol/1)9.09±0.186.58±0.13<0.0001餐后2h血糖(2hPG)(腦1/1)13.51±0.308.87±0.25<0.0001HbAlc(%)8.24±0.156.36±0.09<0.0001空腹胰島素(FINS)(uU/ml)14.22±0,6916.33±1.020.2819HOMA-IR5.69±0.284.80±0.370.0002HOMA-B57.51±3.76114.17±6.43<0.0001急性相胰島素分泌"U/ml)30,69±2.3830.15±2.850.4782急性相胰島素原分泌"U/ml)11.05±1.107.28±0.81<0.0001ABCA1基因rs2230806變異與糖尿病患者對(duì)羅格列酮治療效果的關(guān)系本研究見到A/A、A/G、G/G三種基因型在中國(guó)人中的頻率分別為32.38%(34例)，48.57%(51例)，19.05%(20例)，A、G等位基因頻率分別為56.67%和43.33%，符合Hardy-Weinberg平衡。糖尿病患者對(duì)羅格列酮療效的總有效率為39.8%。rs2230806基因型與羅格列酮療效的關(guān)系如表2所示。A/A基因型攜帶者使用羅格列酮后的療效最好，A/G基因型次之，G/G基因型攜帶者的療效較差。此外，通過比較基因型與羅格列酮治療前后臨床指標(biāo)變化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，攜帶A/A基因型的糖尿病個(gè)體使用羅格列酮后，胰島素敏感性(HOMA-IR)改善程度優(yōu)于G等位基因攜帶者(表3)。表2.rs2230806基因型與羅格列酮療效的關(guān)系<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表3.rs2230806基因型與羅格列酮治療前后臨床指標(biāo)變化的關(guān)系治療前后臨床指標(biāo)變化A/A(n=29)A/G+G/G(n=64)P值FPG(mmol/l)-2.79±0.30-2.28±0.270.16982hPG(mmol/l)-4.72±0.77-4.27±0.500.6216HbAlc(%)—2.09±0.27—1.73±0.220.1644HOMA-IR—2.39±0.46-0.69±0.510.0114HOMA-B43.89±7.7257.14±9.120.3020FINS(uU/ml)一l.40±1.042.93±1.500.0535急性胰島素分泌UU/ml)一2.54±4.79-1.06±4.230.9226急性期胰島素原分泌(yU/ml)—5.02±1.67—4.03±1.550.5695BMI(kg/m2)—0.34±0.270.05±0.160.1298腰圍(cm)-2.OO士O.94—0.35±0.610.1364腰臀比—0.02±0.01-0.OO士O.010.0949實(shí)施例5用于檢測(cè)ABCA1基因rs2230806多態(tài)位點(diǎn)的試劑盒該試劑盒含有PCR正向引物5，-GCAAGGCTACCAGTTACATTTGACAAG—3，PCR反向引物5，-GATTGGCTTCAGGATGTCCATGTTGG_3，Taq酶，dNTP，DNA模板，PCR緩沖液，限制性內(nèi)切酶XagI。操作步驟抽取待檢測(cè)對(duì)象外周血3ml，使用常規(guī)方法抽提基因組DNA，按實(shí)施例3所述方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增目標(biāo)序列，用限制性內(nèi)切酶內(nèi)切PCR產(chǎn)物，電泳鑒定酶切DNA片段?；蛐蜋z測(cè)結(jié)果如圖2所示。ABCA1基因rs2230806多態(tài)性位點(diǎn)的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示〈110〉上海交通大學(xué)〈120〉A(chǔ)BCAl基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法〈160〉2〈210〉1〈211〉360〈212〉腿〈213〉人(Homosapiens)〈220〉〈221〉raise—feature〈222〉(150)〈223〉n=a或g<400〉1tcttgtgcttgtctctctttcttccaggtatttttgc犯ggctaccagtt,60acatttgacaagtctgtgcaa^C3ga^gagatgattcaacttggtgacca120agaagtttctgagctttgtggcctaccaanggagaaactggCtgC3gC8gagcgagtact180tcgttccaacatggacatcctga^gccaatcctggtgagtagacttgctc240cttcaagcactaatgctttcgg肌tgtgaggcttttccttggaiC3gC3tgactttgtttt300gtagaa^agt3CggCtggCtgggagtttgtgatataattt8gttC8gtggtattctaagt360ABCA1基因CDS及其rs2230806多態(tài)性位點(diǎn)的氨基酸序列如SEQIDNO.2氨基酸序列所示〈210〉2〈211〉2261〈212〉PRT<213〉人(Homosapiens)〈220〉<221>CDS<222>(219)〈223〉X朋=Lys或Arg<400〉2MetAlaCysTrpProGinLeuArgLeuLeuLeuTrpLysAsnLeuThr151015PheArgArgArgGinThrCysGinLeuLeuLeuGluValAlaTrpPro202530LeuPheliePheLeulieLeulieSerValArgLeuSerTyrProPro354045TyrGluGinHisGluCysHisPheProAsnLysAlaMetProSerAla505560GlyThrLeuProTrpValGinGlylielieCysAsnAlaAsnAsnPro65707580CysPheArgTyrProThrProGlyGluAlaProGlyValValGlyAsn859095PheAsnLysSerlieValAlaArgLeuPheSerAspAlaArgArgLeu100105110LeuLeuTyrSerGinLysAspThrSerMetLysAspMetArgLysVal115120125LeuArgThrLeuGinGinlieLysLysSerSerSerAsnLeuLysLeu130135140GinAspPheLeuValAspAsnGluThrPheSerGlyPheLeuTyrHis145150155160AsnLeuSerLeuProLysSerThrValAspLysMetLeuArgAlaAsp165170175VallieLeuHisLysValPheLeuGinGlyTyrGinLeuHisLeuThr180185190SerLeuCysAsnGlySerLysSerGluGluMetlieGinLeuGlyAsp195200205GinGluValSerGluLeuCysGlyLeuProX朋GluLysLeuAlaAla210215220AlaGluArgValLeuArgSerAsnMetAsplieLeuLysProlieLeu225230235240ArgThrLeuAsnSerThrSerProPheProSerLysGluLeuAlaGlu245250255AlaThrLysThrLeuLeuHisSerLeuGlyThrLeuAlaGinGluLeu260265270PheSerMetArgSerTrpSerAspMetArgGinGluValMetPheLeu275280285ThrAsnValAsnSerSerSerSerSerThrGinlieTyrGinAlaVal290295300SerArglieValCysGlyHisProGluGlyGlyGlyLeuLyslieLys305310315320SerLeuAsnTrpTyrGluAspAsnAsnTyrLysAlaLeuPheGlyGly325330335AsnGlyThrGluGluAspAlaGluThrPheTyrAspAsnSerThrThr340345350ProTyrCysAsnAspLeuMetLysAsnLeuGluSerSerProLeuSer355360365ArglielieTrpLysAlaLeuLysProLeuLeuValGlyCyslieLeu370375380TyrThrProAspThrProAlaThrArgGinValMetAlaGluValAsn385390395400LysThrPheGinGluLeuAlaValPheHisAspLeuGluGlyMetTrp405410415GluGluLeuSerProLyslieTrpThrPheMetGluAsnSerGinGlu420425430MetAspLeuValArgMetLeuLeuAspSerArgAspAsnAspHisPhe435440445TrpGluGinGinLeuAspGlyLeuAspTrpThrAlaGinAsplieVal450455460AlaPheLeuAlaLysHisProGluAspValGinSerSerAsnGlySer465470475480ValTyrThrTrpArgGluAlaPheAsnGluThrAsnGinAlalieArg485柳495ThrlieSerArgPheMetGluCysValAsnLeuAsnLysLeuGluPro500505510lieAlaThrGluValTrpLeulieAsnLysSerMetGluLeuLeuAsp515520525GluArgLysPheTrpAlaGlylieValPheThrGlylieThrProGly530535540SerlieGluLeuProHisHisValLysTyrLyslieArgMetAsplie545550555560AspAsnValGluArgThrAsnLyslieLysAspGlyTyrTrpAspPro565570575GlyProArgAlaAspProPheGluAspMetArgTyrValTrpGlyGly580585590PheAlaTyrLeuGinAspValValGluGinAlalielieArgValLeu595600605ThrGlyThrGluLysLysThrGlyValTyrMetGinGinMetProTyr610615620ProCysTyrValAspAspliePheLeuArgValMetSerArgSerMet625630635640ProLeuPheMetThrLeuAlaTrplieTyrSerValAlaVallielie645650655LysGlylieValTyrGluLysGluAlaArgLeuLysGluThrMetArg660665670lieMetGlyLeuAspAsnSerlieLeuTrpPheSerTrpPhelieSer675680685SerLeulieProLeuLeuValSerAlaGlyLeuLeuValVallieLeu690695700LysLeuGlyAsnLeuLeuProTyrSerAspProSerValValPheVal705710715720PheLeuSerValPheAlaValValThrlieLeuGinCysPheLeulie725730735SerThrLeuPheSerArgAlaAsnLeuAlaAlaAlaCysGlyGlylie740745750lieTyrPheThrLeuTyrLeuProTyrValLeuCysValAlaTrpGin755760765AspTyrValGlyPheThrLeuLysliePheAlaSerLeuLeuSerPro770775780ValAlaPheGlyPheGlyCysGluTyrPheAlaLeuPheGluGluGin785790795■GlylieGlyValGinTrpAspAsnUuPheGluSerProValGluGlu805810815AspGlyPheAsnLeuThrThrSerValSerMetMetLeuPheAspThr820825830PheLeuTyrGlyValMetThrTrpTyrlieGluAlaValPheProGly835840845GinTyrGlylieProArgProTrpTyrPheProCysThrLysSerTyr850855860TrpPheGlyGluGluSerAspGluLysSerHisProGlySerAsnGin865870875880LysArglieSerGlulieCysMetGluGluGluProThrHisLeuLys885890895LeuGlyValSerlieGinAsnLeuValLysValTyrArgAspGlyMet900905910LysValAlaValAspGlyLeuAlaUuAsnPheTyrGluGlyGinlie915920925ThrSerPheLeuGlyHisAsnGlyAlaGlyLysThrThrThrMetSer930935940lieLeuThrGlyLeuPheProProThrSerGlyThrAlaTyrlieLeu945950955960GlyLysAsplieArgSerGluMetSerThrlieArgGinAsnLeuGly965970975ValCysProGinHisAsnValLeuPheAspMetLeuThrValGluGlu980985990HislieTrpPheTyrAlaArgLeuLysGlyLeuSerGluLysHisVal99510001005LysAlaGluMetGluGinMetAlaLeuAspValGlyLeuProSerSer101010151020LysLeuLysSerLysThrSerGinLeuSerGlyGlyMetGinArgLys102510301035]L040LeuSerValAlaLeuAlaPheValGlyGlySerLysValVallieLeu104510501055AspGluProThrAlaGlyValAspProTyrSerArgArgGlylieTrp106010651070GluLeuLeuLeuLysTyrArgGinGlyArgThrlielieLeuSerThr107510801085HisHisMetAspGluAlaAspValLeuGlyAspArglieAlalielie109010951100SerHisGlyLysLeuCysCysValGlySerSerLeuPheLeuLysAsn1105111011151120GluLeuGlyThrGlyTyrTyrLeuThrLeuValLysLysAspValGlu112511301135SerSerLeuSerSerCysArgAsnSerSerSerThrValSerTyrLeu114011451150LysLysGluAspSerValSerGinSerSer■SerAspAlaGlyLeuGly115511601165SerAspHisGluSerAspThrLeuThrlieAspValSerAlalieSer117011751180AsnLeulieArgLysHisValSerGluAlaArgLeuValGluAsplie1185119011951200GlyHisGluLeuThrTyrValLeuProTyrGluAlaAlaLysGluGly120512101215AlaPheValGluLeuPheHisGlulieAspAspArgLeuSerAspLeu122012251230GlylieSerSerTyrGlylieSerGluThrThrLeuGluGluliePhe123512401245LeuLysValAlaGluGluSerGlyValAspAlaGluThrSerAspGly125012551260ThrLeuProAlaArgArgAsnArgArgAlaPheGlyAspLysGinSer1265127012751280CysLeuArgProPheThrGluAspAspAlaAlaAspProAsnAspSer128512901295AsplieAspProGluSerArgGluThrAspLeuLeuSerGlyMetAsp130013051310GlyLysGlySerTyrGinValLysGlyTrpLysLeuThrGinGinGin131513201325PheValAlaLeuLeuTrpLysArgLeuLeulieAlaArgArgSerArg133013351340LysGlyPhePheAlaGinlieValLeuProAlaValPheValCyslie1345135013551360AlaLeuValPheSerLeulieValProProPheGlyLysTyrProSer136513701375LeuGluLeuGinProTrpMetTyrAsnGluGinTyrThrPheValSer138013851390AsnAspAlaProGluAspThrGlyThrLeuGluLeuLeuAsnAlaLeu139514001405ThrLysAspProGlyPheGlyThrArgCysMetGluGlyAsnProlie141014151420ProAspThrProCysGinAlaGlyGluGluGluTrpThrThrAlaPro1425143014351440ValProGinThrlieMetAspLeuPheGinAsnGlyAsnTrpThrMet144514501455GinAsnProSerProAlaCysGinCysSerSerAspLyslieLysLys146014651470MetLeuProValCysProProGlyAlaGlyGlyLeuProProProGin147514801485ArgLysGinAsnThrAlaAsplieLeuGinAspLeuThrGlyArgAsn149014951500lieSerAspTyrLeuValLysThrTyrValGinlielieAlaLysSer1505151015151520LeuLysAsnLyslieTrpValAsnGluPheArgTyrGlyGlyPheSer152515301535LeuGlyValSerAsnThrGinAlaLeuProProSerGinGluValAsn154015451550AspAlalieLysGinMetLysLysHisLeuLysLeuAlaLysAspSer155515601565SerAlaAspArgPheLeuAsnSerLeuGlyArgPheMetThrGlyLeu157015751580AspThrLysAsnAsnValLysValTrpPheAsnAsnLysGlyTrpHis1585159015951600AlalieSerSerPheLeuAsnVallieAsnAsnAlalieLeuArgAla160516101615AsnLeuGinLysGlyGluAsnProSerHisTyrGlylieThrAlaPhe162016251630AsnHisProLeuAsnLeuThrLysGinGinLeuSerGluValAlaLeu163516401645MetThrThrSerValAspValLeuValSerlieCysValliePheAla165016551660MetSerPheValProAlaSerPheValValPheLeulieGinGluArg1665167016751680ValSerLysAlaLysHisLeuGinPhelieSerGlyValLysProVal168516901695lieTyrTrpLeuSerAsnPheValTrpAspMetCysAsnTyrValVal170017051710ProAlaThrLeuVallielieliePhelieCysPheGinGinLysSer171517201725TyrValSerSerThrAsnLeuProValLeuAlaLeuLeuLeuLeuLeu173017351740TyrGlyTrpSerlieThrProLeuMetTyrProAlaSerPheValPhe1745175017551760LyslieProSerThrAlaTyrValValLeuThrSerValAsnLeuPhe176517701775lieGlylieAsnGlySerValAlaThrPheValLeuGluLeuPheThr178017851790AspAsnLysLeuAsnAsnlieAsnAsplieLeuLysSerValPheLeu179518001805liePheProHisPheCysLeuGlyArgGlyLeulieAspMetValLys181018151820AsnGinAlaMetAlaAspAlaLeuGluArgPheGlyGluAsnArgPhe1825183018351840ValSerProLeuSerTrpAspLeuValGlyArgAsnLeuPheAlaMet184518501855AlaValGluGlyValValPhePheLeulieThrValLeulieGinTyr186018651870ArgPhePhelieArgProArgProValAsnAlaLysLeuSerProLeu187518801885AsnAspGluAspGluAspValArgArgGluArgGinArglieLeuAsp189018951900GlyGlyGlyGinAsnAsplieLeuGlulieLysGluLeuThrLyslie1905191019151920TyrArgArgLysArgLysProAlaValAspArglieCysValGlylie192519301935ProProGlyGluCysPheGlyLeuLeuGlyValAsnGlyAlaGlyLys194019451950SerSerThrPheLysMetLeuThrGlyAspThrThrValThrArgGly195519601965AspAlaPheLeuAsnLysAsnSerlieLeuSerAsnlieHisGluVal197019751980HisGinAsnMetGlyTyrCysProGinPheAspAlalieThrGluLeu1985199019952000LeuThrGlyArgGluHisValGluPhePheAlaLeuLeuArgGlyVal200520102015ProGluLysGluValGlyLysValGlyGluTrpAlalieArgLysLeu202020252030GlyLeuValLysTyrGlyGluLysTyrAlaGlyAsnTyrSerGlyGly203520402045AsnLysArgLysLeuSerThrAlaMetAlaLeulieGlyGlyProPro205020552060ValValPheLeuAspGluProThrThrGlyMetAspProLysAlaArg2065207020752080ArgPheLeuTrpAsnCysAlaLeuSerValValLysGluGlyArgSer208520902095ValValLeuThrSerHisSerMetGluGluCysGluAlaLeuCysThr210021052110ArgMetAlalieMetValAsnGlyArgPheArgCysLeuGlySerVal211521202125GinHisLeuLysAsnArgPheGlyAspGlyTyrThrlieValValArg213021352140lieAlaGlySerAsnProAspLeuLysProValGinAspPhePheGly2145215021552160LeuAlaPheProGlySerValLeuLysGluLysHisArgAsnMetLeu216521702175GinTyrGinLeuProSerSerLeuSerSerLeuAlaArgliePheSer218021852190lieLeuSerGinSerLysLysArgLeuHislieGluAspTyrSerVal219522002205SerGinThrThrLeuAspGinValPheValAsnPheAlaLysAspGin221022152220SerAspAspAspHisLeuLysAspLeuSerLeuHisLysAsnGinThr2225223022352240ValValAspValAlaValLeuThrSerPheLeuGinAspGluLysVal224522502255LysGluSerTyrVal權(quán)利要求1、一種ABCA1基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)，其特征在于，在人ABCA1基因第7號(hào)外顯子的SEQIDNO1所示序列的第150位核苷酸，所述的ABCA1基因第7號(hào)外顯子的SEQIDNO1所示序列的第150位存在G具有單核苷酸多態(tài)性，在其互補(bǔ)鏈上為C等位基因。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的ABCAl基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)，其特征是，所述的第7號(hào)外顯子的SEQIDNO:l所示序列，其第150位的A—G的變異會(huì)造成ABCAl基因第219個(gè)氨基酸序列由精氨酸到賴氨酸的改變。3、根據(jù)權(quán)利要求1所述的ABCAl基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)的檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟①用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正到50ng/ul，作為DNA模板；②設(shè)計(jì)特異性核酸引物，加入dNTP，Taq酶，DNA模板滅菌雙蒸水等試劑，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因；③用內(nèi)切酶XagI限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性方法測(cè)定rs2230806多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。4、一種分離核酸，其特征是，它具有SEQIDNO:1所示序列，且第150位為G。5、一種特異性核酸引物，其特征是，其長(zhǎng)度為26—27bp，可特異性擴(kuò)增出含SEQIDNO:l所示序列中第150位核苷酸多態(tài)性的擴(kuò)增產(chǎn)物。6、一種預(yù)測(cè)糖尿病個(gè)體用羅格列酮后胰島素敏感性和血糖水平變化的檢測(cè)試劑盒，其特征是，包括擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物，dNTP，Taq酶，DNA模板，以及用于限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性檢測(cè)的內(nèi)切酶XagI。全文摘要本發(fā)明涉及的是一種生物基因
技術(shù)領(lǐng)域：
的ABCA1基因第7號(hào)外顯子上的rs2230806多態(tài)位點(diǎn)及其檢測(cè)方法。在人ABCA1基因第7號(hào)外顯子的SEQIDNO1所示序列的第150位核苷酸，所述的ABCA1基因第7號(hào)外顯子的SEQIDNO1所示序列的第150位存在G具有單核苷酸多態(tài)性，在其互補(bǔ)鏈上為C等位基因。檢測(cè)方法包括①用常規(guī)酚氯仿法從人的血液中提取DNA，濃度校正到50ng/μl，作為DNA模板；②設(shè)計(jì)特異性核酸引物，加入dNTP，Taq酶，DNA模板滅菌雙蒸水等試劑，用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增目的基因；③用內(nèi)切酶XagI限制性片斷長(zhǎng)度多態(tài)性方法測(cè)定rs2230806多態(tài)位點(diǎn)基因型，檢測(cè)在所述位置是否存在單核苷酸多態(tài)性。本發(fā)明用來(lái)預(yù)測(cè)糖尿病個(gè)體用羅格列酮的反應(yīng)，將有望對(duì)糖尿病的個(gè)體化臨床工作提供新的思路和見解。文檔編號(hào)C12Q1/68GK101182582SQ20071017123公開日2008年5月21日申請(qǐng)日期2007年11月29日優(yōu)先權(quán)日2007年11月29日發(fā)明者蓉張,婕王,王從容,承胡,賈偉平申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)