專利名稱：：檢測感染的多元方法檢測感染的多元方法本發(fā)明涉及用于體外檢測感染性微生物、特別是病毒感染的方法。本發(fā)明涉及同時檢測針對該相同感染性微生物的總免疫球蛋白和免疫球蛋白M的方法。更具體來說，本發(fā)明涉及同時檢測針對人類肝炎病毒的總免疫球蛋白和免疫球蛋白M的方法?？偟膩碚f，由人體內(nèi)微生物、特別是病毒例如肝炎病毒引起的感染，構成了引人注目的健康問題，這個問題長期以來已經(jīng)被意識到了，特別是在輸血和診斷中?！銇碚f，為了阻止感染因子、特別是肝炎病毒不受控制的蔓延，重要的是盡可能早地確定來自患者或輸血用血袋的樣品是否被這樣的因子或病毒污染。此外，同樣重要的是能夠在感染的整個過程中跟蹤患者的免疫狀態(tài)，以便確定患者是否已進入恢復期，從而當后者發(fā)生時使用適合的治療步驟和/或免疫接種。用于體外檢測這種類型的感染的方法，最通常是基于通過針對感染因子的抗體的免疫分析(或定量免疫測定)進行的檢測。免疫球蛋白M("IgMs")出現(xiàn)得較早并且短暫，是最近的急性、或原發(fā)感染的標志?？偯庖咔虻鞍祝瑢⒏鞣N免疫球蛋白同種型(IgM、IgG和IgA)聚集在一起，是慢性感染或感染持續(xù)時間、或患者的恢復期的標志。在急性感染后相當長的時間內(nèi)，總免疫球蛋白主要由IgG構成，用于支持長期免疫(Hollinger等，F(xiàn)ieldsVirology,p.735-785,1996)。因此，重要的是能夠在整個感染過程中在患者中區(qū)分IgMs和總免疫球蛋白。這在體外血清學中是非常普遍的情況。具體來說，這種類型的問題發(fā)現(xiàn)在由肝炎病毒引起的人類感染病例中甲型肝炎病毒感染被稱為HAV;乙型肝炎病毒感染被稱為HBV，等等。類似的情況也發(fā)現(xiàn)在人類的其它血液病毒的情況HSV(單純性皰疹病毒)，CMV(細胞肥大病毒)，登革熱病毒，其它黃病毒(例如西尼羅病毒)，風疹病毒，流感病毒，VZV(水痘帶狀皰疹病毒)等，各種不同細菌的情況(梅毒密螺旋體(Tr印onemapallidum)、博氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)等)，以及各種單細胞寄生生物中(例如剛地弓形蟲(Toxoplasmagondii))。通過間接形式(將樣品在帶有靶抗原的固相上反應，然后通過標記的抗人類免疫球蛋白抗體觀察)檢測總免疫球蛋白，已經(jīng)被了解許多年了，尤其是隨著1970年代開創(chuàng)性的ELISA專利。但是，這種形式不是優(yōu)選的，因為它易受非特異性干擾的影響，尤其是受可能存在于被測試樣品中的類風濕因子的影響。此外，F(xiàn)XHeinz等的"用于在血清和腦脊液中檢測蜱媒腦炎病毒的兩種不同酶免疫分析方法的比較，，(〃Comparisonoftwodifferentenzymeimmunoassaysfordetectionoftick_borneencephalitisvirusinser咖andcerebrospinalfluid"(JournalofClinicalMicrobiology,!^:p.141-146，(1981))中提到，在用于檢測IgM的間接EIA分析(免疫酶法分析)中，存在IgMs與IgGs之間的競爭，影響了最終檢測的靈敏性和特異性。通過"雙抗原夾心(doubleantigensandwich)"形式檢測總免疫球蛋白(將待檢測的帶有免疫球蛋白的樣品與帶有抗原的固相進行反應，然后使用被可檢測地標記的第二抗原觀察)，自從1978年就已經(jīng)知道(Maiolini等，JournalofImmunologicalMethods,巡(1978)p.25-34;還有公開的法國專利申請FR2383446)。通過"免疫球蛋白捕獲"形式檢測類型特異性免疫球蛋白，其本身也已被知道許多年了。它在1979年由DuermeyerW.等(Journalo預edicalVirology4(1979):p.25-32)描述，用于通過ELISA特異性檢測抗HAVIgMs(也參見美國專利4，292，403)。該分析方法的原理是基于使用包被有抗人類IgM抗體的微板孔，向其中加入含有待檢測IgMs的血樣。在溫育期后，洗滌微板的孔，加入已知量的HAV抗原，然后溫育。最后，在進一步洗滌后，通過在存在針對HAV抗原并用酶標記的抗體(F(ab')2)的情況下進行最后的溫育，檢測了任何與孔結(jié)合的抗原。美國專利4，273，756以同樣的方式描述了類型特異性的"免疫球蛋白捕獲"形式，用于檢測針對各種不同肝炎病毒(HAV，HBV)的IgAs、IgDs、IgEs、IgGs和IgMs?？偟膩碚f，在僅涉及HAV的診斷之外，出于明顯的成本和簡化的原因，當然已經(jīng)進行了嘗試，以開發(fā)同時檢測早期的IgMs和較晚期的IgGs(—般來說占總免疫球蛋白的大部分)的方法。正如011iMeurman("抗病毒IgM抗體的檢測及其問題——綜述"，在PeterA.Bachma皿主編的《診斷病毒學新進展》中("DetectionofantiviralIgMantibodiesanditsproblems-Areview，，，inNewDevelopmentsinDiagnosticVirology,PeterA.Bachmanneditor,Springer-Verlag,BerlinHeidelbergNewYork1983"禾口W.Duermeyer(《在A型肝炎的ELISA中使用的特異性IgM抗體檢測的新原理》(《AnewprincipleforthedetectionofspecificIgMantibodies即pliedinanEUSAforh印atitisA》，JournalofMedicalVirology4(1979):p.25-32))所報道的，進行的嘗i式已被證明是費時的并過于繁瑣。這是因為它們包含了分離各種不同免疫球蛋白類型的基本步驟，分離或者通過區(qū)帶或蔗糖梯度超離心，或者通過凝膠過濾，或者通過使用葡萄球菌蛋白A或使用抗Fcy抗體吸附IgGs，或者通過用13-巰基乙醇裂解IgMs進行。另一種替代方案是組合兩種不同的觀察方法。Angarano等(JournalofClinicalMicrobiology,June1984，p.905-910)提出了用于同時檢測抗HBcIgMs和總Igs(主要為IgG)的系統(tǒng)，被稱為RIELISA(放射免疫酶聯(lián)免疫吸附分析)，它將用于檢測總的抗HBc免疫球蛋白的競爭性放射免疫分析(來自AbbottLaboratories的C0RAB分析)與用于檢測抗HBcIgMs的間接ELISA免疫分析相組合。在兩種分析方法中，將同樣的抗原(重組HBc抗原)吸附到一個、并且只在一個固相上(聚苯乙烯珠子，放置在孔中)，但是另一方面，使用了針對HBc抗原和放射活性標記(碘125)的抗體來檢測總的抗HBc免疫球蛋白，并且在另一方面使用酶標記(使用過氧化物酶)的抗IgM抗體來檢測抗HBcIgMs。Angarano等(如上)指出，唯一的關鍵點是抗原特異性抗體的標記應該是不同的，并且不應該干擾免疫球蛋白類型特異性抗體的標記。顯然，Angarano等的具有兩種強制的不同的信號系統(tǒng)(即帶有兩種可檢測標記)的系統(tǒng)決不是簡單的在首先同時進行兩種分析方法的免疫步驟后，必須以復雜的方式分別并連續(xù)地測量信號。事實上，方法首先測量第一個與固相結(jié)合的放射活性信號，從而反映出總的抗HBc免疫球蛋白的滴度，然后在第二個步驟中，向珠子加入過氧化物酶標記的抗IgM抗體，然后在溫育后，加入底物01202)+發(fā)色體(0PD)混合物。在溫育和顯色后，使用鹽酸終止該最后的反應并測量獲得的最終光密度，它反映出抗HBcIgM滴度。此外，正如可以注意到的，Angarano等的復合系統(tǒng)，值得贊揚的是明顯區(qū)分了總的抗HBc免疫球蛋白滴度和抗HBcIgM滴度，但是需要采取特定的預防措施，這是由于與操作放射活性化合物(即碘125)相關的風險。最后，Angarano等的方法仍然不得不依靠在稀釋緩沖液中加入熱聚集免疫球蛋白G，來事先消除類風濕性因子(在用于檢測IgM的間接免疫分析系統(tǒng)中固有的)的干擾。所有這些使得Angarano等的方法相對不利。常規(guī)情況下，針對同樣病毒的IgMs和IgGs的檢測，主要通過在分離的側(cè)相上執(zhí)行兩種免疫分析來進行，從而避免兩種分析方法之間任何可能的干擾，從而獲得清楚地區(qū)分的IgM和IgG信號。因此，在常規(guī)的"免疫球蛋白捕獲"形式中，不得不使用兩種不同的固相，例如按照DuermeyerW.等(如上)的兩個微禾反的孑L或按照VentureTechnologiesMalaisie的技術(M6decinesetmaladiesinfectieuses[Medicinesandinfectiousdiseases"!，33，2003，p.396-412)的兩種硝酸纖維素條板。一種包被有抗IgM抗體，另一種包被有抗IgG抗體，樣品加入到每種分析方法中。因此，這些技術需要執(zhí)行兩種不同的測試，因此相對不利。此外，有可能使用多種類型的技術通過免疫分析方法檢測免疫球蛋白除了上面提到的ELISA和放射免疫分析之外，還存在著在異質(zhì)或均質(zhì)相等中，通過免疫熒光、免疫發(fā)光等的技術。還存在著基于顆粒免疫凝集的技術，其最終信號可以目測檢測，或使用檢測儀器進行定量，尤其是使用通過流式細胞術進行檢測的儀器。通過流式細胞術進行測量的廣為人知的優(yōu)點之一是，它構成了檢測被分析物的快速且靈敏的手段。流式細胞術是基于微粒的懸浮液，以液流的形式在光線前方通過。電-光學傳感器確保在一個時間只有單個顆粒通過光線前方。然后檢測并記錄由顆粒通過時光線的障礙引起的信號。具體來說，美國專利6，872，578B2描述了多元免疫分析系統(tǒng)(即同時檢測單一樣品中幾種被分析物的免疫分析系統(tǒng))。該系統(tǒng)在異質(zhì)質(zhì)免疫分析中，組合使用了流式細胞術和幾組固體顆粒。這些顆粒是磁性的，分別帶有特異性可檢測參數(shù)(即物理特征例如尺寸、獨特的顏色或特異性熒光)。每組微粒含有一定范圍的值，用于將顆粒區(qū)分成幾個不重疊的組，可以通過適合于所指參數(shù)的自動化檢測方法來進行辨別。這些顆粒在不同組之間，各帶有與表面結(jié)合的不同分析試劑。同一組的所有顆粒帶有相同的試劑。這些顆粒的磁性特征允許在洗滌過程中自動化分離固相和液相。具體來說，美國專利6，872，578B2描述了同時檢測針對風疹病毒抗原的各種不同免疫球蛋白類型抗體(IgG和IgM)的例子。在該例子中，IgGs和IgMs使用第一種磁性顆粒進行免疫純化，該顆粒用特異性針對待檢測的IgGs和IgMs的抗原致敏。在該第一次溫育后，在洗滌過程中消除了非特異性的免疫球蛋白。然后通過加入乙酸，將被吸附在顆粒上的抗原捕獲的特異性免疫球蛋白釋放到上清液中。然后將該上清液轉(zhuǎn)移到另一個管中，通過夾心形式，使用固相和含有抗人類IgM和抗人類IgG抗體的結(jié)合物，對IgGs和IgMs進行分析。該技術是繁瑣的，因為它需要預先處理樣品，以便只保留抗原特異性Igs。如同在MultimetrixGmbH公司(海德堡，德國)的"Multimetrix疏螺旋體IgG或IgM分析"系統(tǒng)的情況中那樣，使用顆粒的混合物也是可能的，每種顆粒包被有不同的重組疏螺旋體抗原，并通過間接形式，使用熒光標記物(藻紅蛋白)標記的抗IgG抗體和抗IgM抗體差異檢測IgMs和IgGs。每個珠子的最終復合物的熒光，通過流式細胞術，使用LuminexCorporation公司的分析儀來測量。不需要洗滌步驟，因此使它成為簡化的免疫分析方法。然而，方案需要幾個反應管和幾種在不同的試劑盒指稱物下銷售的試劑。按照6獲得的商業(yè)手冊，該系統(tǒng)被描述為是靈敏和可靠的。在Klutts等(JournalofClinicalMicrobiology,November2004，p.4996-5000)的出版物中描述的在Bioplex2200⑧上進行抗EBVIgG和IgM抗體的檢測，其原理是相同的。與上述相同，它需要兩種不同的試劑，免疫反應在兩種不同的反應管中進行。這兩種EBV分析使用了顆?；旌衔铮糠N包被有不同的EBV抗原，通過間接形式，使用兩種不同試劑盒，使用熒光標記物(藻紅蛋白)標記的抗IgG抗體和抗IgM抗體差異檢測IgMs和IgGs。每個顆粒的最終復合物的熒光，通過流式細胞術，使用LuminexCorporation公司的檢測器來測量。因此，對于能夠簡單執(zhí)行、快速、靈敏、特異、定量或半定量并可重復的方法存在著真正的需求，為了在感染的整個持續(xù)時間并且也在免疫接種之前或之后的跟蹤過程中進行篩查，該方法應該可以完全同時地自動檢測并區(qū)分IgMs和總免疫球蛋白(總Igs)，即使用一個并且只有一個未預先處理的樣品，在一個并且只有一個分析容器中，在同樣數(shù)量的溫育中，使用單一信號系統(tǒng)，并且在一個并且只有一個信號讀取時間中進行。
發(fā)明內(nèi)容因此，本發(fā)明的作者力圖解決上面陳述的問題，為此，開發(fā)了使用一個并且只有一個優(yōu)選未預先處理的生物樣品，在一個并且只有一個容器中，同時檢測針對同一個抗原的IgMs和總免疫球蛋白的替代方法。因此，本發(fā)明的主題是用于微生物感染的體外診斷性檢測的方法，包括同時檢測生物樣品中存在的、針對所述微生物的免疫球蛋白G或總免疫球蛋白以及免疫球蛋白M，該方法包括下列步驟a)將所述生物樣品在存在顆粒的情況下放置在單一分析容器中，每個顆粒具有至少一個特異性可檢測的物理參數(shù)，并屬于至少兩個不同的組，一組帶有抗IgM捕獲抗體，另一組帶有源于所述微生物的捕獲抗原，b)在允許免疫復合物在每組顆粒上形成的條件下，將混合物溫育，c)除去沒有結(jié)合到顆粒上的免疫球蛋白，d)將步驟b)的混合物與至少一種標記的結(jié)合物溫育，所述至少一種結(jié)合物只含有源于所述微生物的檢測抗原，e)除去沒有結(jié)合到步驟b)的免疫復合物上的檢測抗原，f)利用能夠區(qū)分上面提到的兩組顆粒的檢測器，同時檢測每個顆粒上的步驟d)的免疫復合物，由此顯示出針對所述微生物的免疫球蛋白G或總免疫球蛋白和/或免疫球蛋白M的存在或不存在。根據(jù)具體的實施方案，所述顆粒的組彼此之間利用可以通過適合的檢測器檢測的熒光染料來區(qū)分。有利的情況下，適合的檢測器與流式細胞儀相關。檢測抗原的標記可以是直接的或間接的。例如，檢測抗原可以帶有生物素，它通過加入標記的親和素或鏈親和素來顯示。優(yōu)選情況下，微生物是人類病毒，特別是人類肝炎病毒。本發(fā)明的主題還有用于執(zhí)行檢測方法的診斷試劑盒或一組試劑，具體來說包含顆粒，每個顆粒帶有至少一個特異性可檢測的物理參數(shù)，并屬于至少兩個不同的組，一組帶有抗IgM捕獲抗體，另一組帶有源于待檢測微生物的捕獲抗原。發(fā)明詳述為了解決所述問題，本發(fā)明人首先進行了多元分析，用于在單一容器中同時檢測樣品(血清或血漿)中的抗HAVIgG和IgM，測試組合了兩種免疫捕獲形式(參見實驗部分比較例1中方案和結(jié)果的詳細情況，分析形式顯示在圖1中)-第一種使用帶有抗人類IgG抗體的超順磁性顆粒，-第二種使用帶有抗人類IgM抗體的超順磁性顆粒。在溫育(樣品IgGs和IgMs的捕獲以及第一種免疫復合物的形成)和第一次洗滌后，加入HAV抗原。在第二次溫育后，HAV抗原(AgHAV)結(jié)合到形成的兩種類型的復合物上。第二次洗滌后，通過加入與熒光染料(藻紅蛋白，用PE表示)結(jié)合的抗HAV單克隆抗體(Mab)來顯示兩種反應。在該結(jié)合物溫育和第三次洗滌后，通過流式細胞術讀取每個顆粒上的信號。通過使用流式細胞儀的兩種適合的激光束分別讀取信號，獲得了IgM和IgG結(jié)果。IgM檢測達到了可接受的靈敏度，即使在低濃度下，這代表了HAV感染后相當常見的情況。另一方面，在這種構型中，IgG檢測的靈敏度明顯不夠，這是由于樣品中IgGs的高的天然豐度(包含了所有抗原性特異性)。事實上，抗IgG超順磁性顆粒非常快速地被樣品中存在的對HAV非特異性的IgGs飽和，并且不再捕獲足夠的抗HAVIgG，特別是在低濃度的抗HAVIgG下。這導致分析靈敏度不足。在總的抗HAV免疫球蛋白的檢測中正是發(fā)生了這種情況，在這種檢測中存在著臨床靈敏度閾值，該閾值對于在免疫接種保護后跟蹤的情況中檢測抗HAV抗體來說是必需的。根據(jù)共識，這種保護性閾值被固定為20mUI/ml，與WHO的抗HAV抗體標準(97/646)相關。低于該值，個體沒有受到保護；高于該值，IgG滴度足以確保個體受到保護以對抗病毒。因此，本發(fā)明人設計了另一種分析形式，以解決上面的分析中描述的缺乏"IgG靈敏度"的問題。完全令人吃驚的是，本發(fā)明人顯示出下面實施例2描述的組合兩種形式的多元系統(tǒng)(參見實驗部分實施例2中方案和結(jié)果的詳細情況，分析形式顯示在圖2中)，能夠在單一容器中同時檢測低的IgG濃度而不降低IgM檢測的靈敏度，此外，使得以完全靈敏和特異的方式區(qū)分抗HAVIgM抗體和總的抗HAV免疫球蛋白成為可能。因此，該用于在單一容器中同時檢測樣品(血清或血槳)中的抗HAVIgG和IgM的方法[因此該方法是本發(fā)明的方法]，組合了兩種分析形式(根據(jù)DuermeyerW.等的"免疫球蛋白捕獲"分析形式用于IgMs，根據(jù)MaioliniR.等的"雙抗原夾心"分析形式用于IgGs):-第一種使用帶有抗人類IgM抗體的超順磁性顆粒，-第二種使用帶有HAV捕獲抗原的超順磁性顆粒。在溫育(樣品IgGs和IgMs的捕獲以及第一種免疫復合物的形成)和第一次洗滌后，加入生物素酰化的HAV抗原。在第二次溫育后，HAV抗原結(jié)合到形成的兩種類型的復合物上。第二次洗滌后，通過加入與熒光染料(藻紅蛋白)結(jié)合的鏈親和素來顯示兩種反8應。在溫育和洗滌后，通過流式細胞術讀取每個顆粒上的信號。通過使用流式細胞儀的兩種適合的激光束分別讀取信號，獲得了IgM和IgG結(jié)果。本發(fā)明，導致了抗HAVIgMs和總Igs的靈敏和差異的檢測，是完全令人吃驚的這是因為在單一容器中按照本發(fā)明的方法組合兩種形式是有高度風險的，在固定化的HAV抗原與固定化的抗IgM抗體之間存在著對樣品中抗HAVIgMs的競爭。換句話說，因為在顯d容器中同時執(zhí)行上述的兩種形式，存在著樣品的某些抗HAVIgMs將被精確用于捕獲IgGs的帶有HAV抗原的超順磁性顆粒捕獲(在圖2中用虛線箭頭表示)，從而不再被檢測為IgM的風險。這樣的競爭將不可避免地導致IgM響應的檢測完全不足(缺少靈敏性)，因此使得在初期檢測IgMs成為不可能。本領域技術人員將會完全認識到這種風險的大小，因此已經(jīng)被清楚地被勸阻采用本發(fā)明的這種組合(多元系統(tǒng))。本發(fā)明人同樣使用了本發(fā)明的多元方法來同時檢測針對乙型肝炎病毒衣殼的IgG和IgM抗體(檢測HB核心IgG和IgM抗體)。為此，參見實驗部分實施例3以及圖3中的分析形式。在此基礎上，發(fā)明人提出了以多元形式檢測IgGs和IgMs的通用方法，可以適用于從診斷的觀點來說重要的許多微生物，以檢測IgGs和IgMs。在下面的部分中，提供了對于理解本發(fā)明有用的一定數(shù)量的定義。定義在本發(fā)明的文本中，"生物樣品"優(yōu)選包括生物流體，例如血液、血漿、血清、尿液、腦脊液、唾液。優(yōu)選情況下，樣品是血漿或血清。測試樣品優(yōu)選為人類來源的，但是也可以源于需要進行微生物感染檢測的動物。在本發(fā)明的文本中，術語"多元檢測"是指同時檢測針對相同的或幾種感染性微生物的至少兩種類型的抗體，抗體選自血液中的免疫球蛋白M、G、A、D和E以及總免疫球蛋白。術語"抗體"是指任何完整的抗體或抗體的含有或由至少一個抗原結(jié)合位點組成、允許所述抗體結(jié)合到抗原性化合物的至少一個抗原決定簇上的功能性片段。對于抗體片段的例子來說，可以提到的是Fab、Fab'和F(ab')2片段，以及scFv鏈(單鏈可變片段)、dsFv鏈(雙鏈可變片段)等。這些功能性片段具體來說可以通過遺傳工程獲得。術語"抗原性片段"或"抗原"，是指感染性微生物例如甲型肝炎病毒的、能夠在被感染的患者或在免疫接種的動物中誘導抗體合成的天然或重組蛋白的全部或一部分。具體來說，表述"源于微生物的抗原"，不論是用于捕獲還是檢測，都是指選自所述微生物的裂解物、其已經(jīng)被半純化或純化的天然抗原之一、重組蛋白、其片段和合成的肽的任何抗原。術語"捕獲抗原"是指與固相連接的抗原性片段，它能夠被針對微生物的抗體例如抗HAV抗體所識別，并允許與后者親和性結(jié)合。術語"捕獲抗體"是指與固相連接的抗體或抗體的一部分，它能夠通過親和性結(jié)合留住生物樣品中存在的抗原性化合物的至少一個抗原性決定簇?？笽gM捕獲抗體和捕獲抗原可以通過任何適合的技術連接到顆粒上。它們可以通過直接共價，或非共價的、特別是通過親和性連接。直接共價連接可以通過活化顆粒上存在的羧基，經(jīng)例如羥基琥珀酰亞胺或碳二亞胺引入鍵合來進行。術語"檢測抗原"是指標記的抗原，它使得通過免疫捕獲方法檢測IgM抗體，或通過常規(guī)的抗原_抗體_抗原夾心方法、也被稱為"雙抗原夾心"方法(Maiolini等，(1978))檢測IgG抗體，成為可能。檢測抗原與捕獲抗原可以是相同的，也可以是不同的。術語"標記的"是指直接標記(利用熒光染料，發(fā)光化合物等)和間接標記(例如利用本身被直接標記的抗體或抗原，或使用標記的"親和對"試劑，例如但不是排他性的標記的親和素-生物素對等)。可用于本發(fā)明的情況中的單克隆抗體或多克隆抗體的生產(chǎn)，是常規(guī)技術的結(jié)果。單克隆抗體可以按照K6hler和Milstein描述的淋巴細胞融合和雜交瘤培養(yǎng)的常規(guī)方法(Nature,^,p.495-497(1975))來獲得。其它用于制備單克隆抗體的方法也是已知的(Harlow等主編《抗體實驗指南》，AntibodiesALaboratoryManual,ColdSpringHarborLaboratory(1988))。可以通過免疫哺乳動物(例如小鼠、大鼠、兔或甚至人類等)并通過產(chǎn)生雜交瘤的淋巴細胞融合技術(K6hler和Milstein，1975，同上)，來制備單克隆抗體。還存在著這種常規(guī)技術的可替代技術。例如，可以通過表達從雜交瘤克隆的核酸來生產(chǎn)單克隆抗體?？贵w也可以通過噬菌體展示技術，通過將抗體cDNAs導入載體、典型為絲狀噬菌體(例如用于大腸桿菌的Fuse5，Scott等，(Science,249，卯.386-390(1990)))來生產(chǎn)。后者構成了文庫，并在其表面上顯示scFv片段。構建這些抗體文庫的方案描述在Marks等(1991)(J.Mol.Biol.，222，pp.581—597，(1991))中。多克隆抗體可以按照常用的方案，從用本性為肽的抗原免疫的動物的血清獲得。—般來說，多肽、特別是重組多肽，或寡肽，可以用作例如免疫原。根據(jù)常規(guī)的方案，按照Benoit等描述的步驟[PNASUSA，79，卯.917-921(1982)]，將兔用相當于lmg的月太免疫原進行免疫。以4周的間期給動物注射200yg抗原，并在10到14天后取血。在第三次注射后，評估抗血清與使用氯胺-T方法制備的碘放射性標記的抗原性肽的結(jié)合能力。然后將它通過層析在含有羧甲基纖維素(CMC)的離子交換柱上純化。然后將通過洗脫收集的抗體分子，通過本領域技術人員熟知的方法，例如使用DEAES印hadex調(diào)整到所需濃度，以獲得IgG級份。術語"顆粒"是指任何顆粒，優(yōu)選形狀為接近球形的(因此它們一般被稱為珠子)，其尺寸可以為直徑在0.3iim到100ym之間，優(yōu)選在0.5ym到40ym之間。這樣的顆粒由例如Lumi證、Merck或Dynal公司制造。顆粒優(yōu)選由對生物樣品的成分惰性的聚合物構成；它們是固態(tài)的，在樣品中不溶解。使用的聚合物可以是聚酯、聚醚、聚烯烴、聚酰胺、多糖、聚氨基甲酸酯或纖維素。也可以使用粘合劑為顆粒提供完整性和結(jié)構?？梢詫⒐δ芑鶊F與這些聚合物摻和在一起，以便允許連接或結(jié)合生物學重要的大分子(蛋白、脂類、糖類、核酸)。這些本領域技術人員已知的功能基團，可以是酰胺官能團(_NH2)或銨官能團(-Ntf+或-NR"、醇官能團(-0H)、羧酸官能團(-C00H)或異氰酸官能團(-NC0)。最常用于將C00H官能團導入聚烯烴的單體是丙烯酸或甲基丙烯酸。試劑與顆粒表面的連接可以通過靜電吸引、親和相互作用、疏水相互作用或共價結(jié)合來進行。共價結(jié)合是優(yōu)選的。這里使用的顆粒的區(qū)別在于它們帶有特異的可檢測的物理參數(shù)，即用于通過流式細胞術將它們彼此區(qū)別開的差異標志物。優(yōu)選情況下，使用至少兩種類型的不同的標記物或參數(shù)。例如，顆?？梢杂靡环N或多種各種適合濃度的染料(例如熒光、發(fā)光染料等)浸漬，或者用放射性同位素、酶等類型的標記物(VenkatasubbaraoS.，"微陣列——現(xiàn)狀與展望，，，〃Microarrays-Statusandprospects"TrendsinBiotechnologyDec2004，22(12):630-637;Morgan等，"細胞測量珠陣列適用于生物學各種領域的多元化分析平臺，，，〃Cytometricbeadarray:amultiplexedassayplatformwithapplicationsinvariousareasofbiology"，Clin.Immunol.(2004)100:252-266)?；蛘?，可以使用各種不同尺寸的顆粒。在優(yōu)選實施方案中，可辨別的顆粒發(fā)射出發(fā)光或熒光信號。可以使用例如來自Luminex的超順磁性熒光珠。這些生理化學性質(zhì)，也可以使在與生物樣品反應過程中將這些微粒捕獲的級份與沒有結(jié)合的級份分離開，成為可能。這種分離可以通過尤其是離心、過濾或磁化來進行。通過磁化進行分離是優(yōu)選的，為此，可以使用含有順磁性、鐵磁性、亞鐵磁性和變磁性成分的珠子。順磁性成分是優(yōu)選的，例如鐵、鈷、鎳或金屬氧化物例如Mn203、Cr20或Fe304。磁性成分的含量可以在2%到50%(以重量計)之間，優(yōu)選在3%到25%之間。在優(yōu)選實施方案中，本發(fā)明使用了免疫分析方法，該方法將流式細胞術與使用顆粒狀、優(yōu)選為超順磁性支持物作為固相(在同一個容器中使用幾類或幾組不同顆粒)相結(jié)合。每組顆粒對于免疫反應來說是特異性的，并且可以通過生理化學性質(zhì)(尺寸、顆粒尺寸分布、熒光和/或光密度)與其它顆粒區(qū)分。超順磁性顆粒的性質(zhì)便于洗滌步驟中固相與液相之間的分離，允許分析自動化。但是，所用的珠子不強制是超順磁性的。對于可以使用的超順磁性珠子來說，具體可以提到的是在美國專利6，872，578中描述的。根據(jù)本發(fā)明的方法，最終檢測相一般包含i)利用能夠區(qū)分上面提到的兩組顆粒的信號的檢測器，同時讀取每個顆粒上步驟c)的標記的免疫復合物，ii)分別獲得每組顆粒的結(jié)果，以及iii)將這些結(jié)果解釋為針對所述微生物的總免疫球蛋白(總Igs)和/或免疫球蛋白M的存在或不存在的指示。優(yōu)選情況下，按照例如在Luminex的專利申請W097/14028中的描述，通過流式細胞術對顆粒進行測量。因此，將帶有試劑(抗體或抗原)的顆粒亞組暴露于生物樣品，每個亞組具有一種或多種分類參數(shù)，使得能夠?qū)⒁粋€亞組的顆粒相對于其它亞組的顆粒區(qū)分開。然后將這些暴露于樣品的顆粒通入檢測區(qū)(即細胞計數(shù)器)，在那里收集與分類參數(shù)相關的數(shù)據(jù)(例如熒光發(fā)射強度)，優(yōu)選也收集與試劑和目標被分析物之間形成的復合物的存在或不存在相關的數(shù)據(jù)。因此，例如在顆粒發(fā)射熒光信號的情況下，在加入被分析的樣品和特異性結(jié)合物(例如使用熒光標記物標記的)后，使用帶有激光讀取器的顆粒流式細胞儀(例如Luminex類型的裝置)，測量了每個顆粒上形成的免疫復合物所發(fā)射的熒光信號。對于所有顆粒來說，分別、但同時地記錄對每個顆粒特異的熒光。最終獲得了每組顆粒的總的獨立地和不同的信號。11因此，本發(fā)明使得利用簡單的、可自動化的方案，獲得兩個獨立的、靈敏的測量成為可能，其中一個測量用于IgMs，另一個用于總免疫球蛋白，它們都針對同樣的感染性微生物。下面將對本發(fā)明進行更具體的描述，涉及同時檢測針對甲型肝炎病毒和乙型肝炎病毒的IgMs和IgGs(或總Igs)，以及同時檢測針對造成梅毒的感染性細菌因子梅毒密螺旋體(Treponemapallidum)的IgMs禾口IgGs(或總Igs)。然而，不必多說，本發(fā)明廣泛適用于所有病毒(HSV，登革熱病毒，其它黃病毒例如西尼羅病毒，風疹和流感病毒，VZV，CMV等)、所有細菌(梅毒密螺旋體，博氏疏螺旋體等)和/或所有寄生生物(剛地弓形蟲等)，其中同樣存在著在同樣的分析容器中同時檢測IgMs和IgGs(或總免疫球蛋白)，而不損失任何靈敏度的需求。在本發(fā)明的方法中，樣品不需要經(jīng)過預處理，例如酶反應、消化或修飾，或例如化學反應或修飾等(例如通過區(qū)帶或蔗糖梯度超離心，凝膠過濾，通過葡萄球菌蛋白A或通過抗YFc抗體IgGs吸附，或用13_巰基乙醇裂解IgMs)。但是，對于已經(jīng)經(jīng)過這樣的預處理的樣品，實施本發(fā)明的方法也是可能的。容器可以是任何固體容器，例如試管、微板的孔或由聚丙烯制成的反應池。未結(jié)合的試劑可以通過本領域技術人員已知的任何技術來除去，例如通過重復的離心步驟進行洗滌，或利用珠子的超順磁性性質(zhì)，通過使用磁體來進行。在本發(fā)明的方法的具體實施方案中，微生物從人類病毒、細菌和寄生生物、優(yōu)選為單細胞寄生生物中選擇。在本發(fā)明的方法的優(yōu)選實施方案中，微生物選自人類病毒。在本發(fā)明的方法的特別優(yōu)選實施方案中，微生物選自人類肝炎病毒，例如HAV和HBV病毒。在優(yōu)選實施方案中，所述微生物是人類甲型肝炎病毒(HAV)，對它來說，有可能獲得的總抗HAV免疫球蛋白的檢測下限為大約20mIU/ml。本發(fā)明的主題還包括一組用于實施本發(fā)明的方法的試劑。本發(fā)明的主題還包括用于實施本發(fā)明的方法的試劑的試劑盒。在本發(fā)明的文本中，同時并組合地檢測針對感染性微生物的IgMs和針對該同樣感染性微生物的IgG抗體或總Igs的檢測類型，被稱為"多元檢測"，這與"單式檢測"相反(其中IgM和IgG或總Ig的檢測獨立地進行，即不是組合的)。本發(fā)明還涉及并包含了同時檢測方法的所有變體形式，這些變體可以通過本身已知的方法獲得，或由本領域技術人員在不背離本發(fā)明的精神的情況下推演出來?，F(xiàn)在將參考下面的實施例更詳細地解釋本發(fā)明。下面的圖和實施例對本發(fā)明進行了說明，但是不對其范圍構成限制。圖1是顯示了通過雙免疫捕獲形式(現(xiàn)有技術)檢測抗HAVIgGs和IgMs的流程圖。圖2是顯示了本發(fā)明的以夾心形式檢測總抗HAVIgs和通過免疫捕獲檢測抗HAVIgMs的方法的流程圖。圖3是顯示了本發(fā)明的以夾心形式檢測總抗HBcIgs和通過免疫捕獲檢測抗HBcIgMs的方法的流程圖。圖4是顯示了通過IgG單元形式(免疫捕獲)和通過總Ig單元夾心形式分析測定的總抗HAVIgs的標準范圍的比較圖。圖5是顯示了通過單元夾心形式和通過多元方式分析測定的總抗HAVIgs的標準范圍的比較圖。圖6是顯示了本發(fā)明的以夾心形式檢測總抗梅毒密螺旋體Igs和通過免疫捕獲檢測抗梅毒密螺旋體IgMs的方法的流程圖。輔漁實施例1:現(xiàn),有技術的方法該根據(jù)現(xiàn)有技術的分析方法的原理顯示在圖1中。材料和方法:材料1.分析系統(tǒng)BioPlex2200⑧分析儀(Bio-Rad，MarneslaCoquette,法國)按照制造商的說明書使用。該自動化免疫分析裝置包含流式細胞儀和Luminex10(T檢測器(LuminexCorp.，奧斯汀，德克薩斯，美國)，使用了異質(zhì)的超順磁性顆粒組。每組顆粒，由聚苯乙烯和甲基丙烯酸(C00H官能團)構成，粒度為8ym，被制造成具有各種不同的熒光染料(CL1和CL2)百分率，產(chǎn)生了為每組顆粒指定的獨特的身份編碼，可以被L咖inexIOOTM檢測器(LuminexCorp.，奧斯汀，德克薩斯，美國)的激光檢測到。在免疫反應后，珠子一個接一個地通過位于液體基質(zhì)中心的流動池，以便被兩束分離的激光激發(fā)并讀數(shù)。測量在每個珠子通過時進行。638nm的紅色激光激發(fā)嵌入在每個顆粒表面上的識別熒光染料(CL1和CL2)，復合的信號被解釋，以便識別顆粒的被分析物。通過識別顆粒的類別，該激光因此用于鑒定正在進行的分析。532nm綠色激光激發(fā)熒光探針(用藻紅蛋白(PE)標記的結(jié)合物)，發(fā)射出的熒光與連接到顆粒上的結(jié)合物成正比。因此該激光用于測量固定化在所述顆粒上的被分析物的反應性。系統(tǒng)軟件將結(jié)合物的信號轉(zhuǎn)變成相對熒光強度(RFI)值。然后將該信號與分析特異性的標準曲線進行比較，以確定被分析物的濃度。也可以計算出比率，以便將結(jié)果定性分類為陽性或陰性。2.固相使用了兩種不同組的Luminex超順磁性顆粒(LuminexCorp.，奧斯汀，德克薩斯，美國)。每組顆粒包被有特異性針對特定分析的配體。每種配體使用異源雙功能試劑偶聯(lián)。-第1組以lOiig/mg微粒的量固定化的抗人類IgM小鼠單克隆抗體(Hytest，F(xiàn)inland)。-^1|§二以20iig/mg微粒的量固定化的抗人類IgG小鼠單克隆抗體(FcY，JacksonImm皿oResearch,美國)。3.HAV抗原HAV抗原來自ViralAntigen(Memphis,田納西，美國)。4.熒光染料藻紅蛋白來自Cyanotech(Hawaii，美國)。5.結(jié)合物抗HAV小鼠單克隆抗體(Bio-Rad，MarneslaCoquette,法國)使用本領域技術人員已知的異源雙功能試劑與藻紅蛋白(PE)相偶聯(lián)。[O130]6.稀釋劑6.1.用于超順磁性顆粒的稀釋劑20mM擰檬酸緩沖溶液，pH5.6含有116mMNaCl，5.6mMEDTA，2%Triton,10%綿羊血清，O.5g/l小鼠IgG，O.5%Proclin300(Supelco公司的商標)，25%牛奶(100%脫月旨)，O.13%IgGBS3。6.2.用于HAV抗原和用于結(jié)合物的稀釋劑50mM磷酸緩沖溶液，pH7.l，含有150mMNaCl，O.1%NaN3，l%BSA，2.75%PEG6000，0.1%Tween20(Sigma公司的商標)，1%綿羊血清，lg/1小鼠IgG。6.3.用于步驟1的稀釋劑或洗滌溶液磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含有:150mMNaCl，O.1%Tween20(Sigma公司的商標)，0.034%Proclin300(Supelco公司的商標)，0.095%NaN3。7.反應池免疫反應在體積為1ml的聚丙烯反應池中進行。8.標準品將WHO總抗HAV免疫球蛋白標準品(編碼97/646)按照推薦的方法重新溶解在溶液中并稀釋，提供下列標準點0，20，80，160,320和640mIU/ml。方法分析方案:歩驟1:1.將下列物質(zhì)相繼分配到每個反應池中51樣品或標準品+2501用于步驟1的稀釋劑101免疫反應性顆粒(第1組和第2組顆粒的50:50混合物)+250yl用于步驟l的稀釋劑。2.均化后，將混合物在37t:溫育40分鐘。3.然后進行洗滌步驟固相與液相的分離通過磁化進行，使用至少3001洗滌溶液連續(xù)洗滌3次。在最后一次洗滌時，將顆粒重新懸浮。歩驟2:4.將50iUHAV抗原(AgHAV)溶液分配到每個反應池中。5.均化后，將混合物在37t:溫育15分鐘。6.然后進行洗滌步驟(同上第3點)。歩驟3:7.將50ill結(jié)合物(抗HAV抗體-藻紅蛋白，即Mab-PE)分配到每個反應池中。8.均化后，將混合物在37t:溫育15分鐘。9.然后進行洗滌步驟(同上第3點)。10.通過向每個孔中加入35洗滌溶液，利用攪拌將每個孔的顆粒重新懸浮。11.通過流式細胞儀將每個孔的顆粒懸浮液吸出。12.使用兩種激光光線讀取每個反應池的顆粒懸浮液。13.讀數(shù)結(jié)果由流式細胞儀直接加工，并記錄為相對熒光強度單位(RFI單位)。14.為了解釋結(jié)果，對于每個標準品點(或樣品)，計算相對于截止值的比率。對于總抗HAVIgs來說，截止值對應于被當作保護性截止值的20mIU/ml的標準品點的RFI值。因此，樣品的比率以下列方式計算樣品比率=樣品的1^1信號的平均值*截止值其比率大于1的樣品被宣布為陽性，比率小于1的樣品被宣布為陰性。*所有人類樣品的分析進行雙份(作為兩個平行測定)，使用的RFI結(jié)果來自于兩個平行測定的平均值。斜示7佳細力則亍條白媳果通過免疫捕獲檢測IgMs沒有出現(xiàn)任何問題。對于抗HAVIgG免疫捕獲形式進行了特別的注意，以便獲得20mIU/ml的分析靈敏度。但是，在進行的分析中，用于檢測抗HAVIgGs的免疫捕獲形式顯示出明顯缺乏靈敏度(參見表l和圖1)。這是因為對0到80mIU/ml之間的標準品計算的比率彼此之間沒有顯著差別，它們與可靠地選擇的20mIU/ml標準品的比率(比率=1.0)極為接近。只有對于160到640mIU/ml之間的標準品來說，比率才開始增加，因此反映了總Ig的檢測。^i:總的抗HAVIg標準品范圍的分析測定通過IgG免疫捕獲分析測定IgGs標準品(mlU/ml)RFI比率0190.7910220.9220241.0040291.2180411.71160602.50320893.716401335.54這種靈敏度的缺乏是由于這樣的事實，即使用的固相(抗人類IgG顆粒)使得特15異性捕獲針對被分析物的IgGs成為不可能。因此，固相被血清中所有其它IgGs所飽和。這種現(xiàn)象在對IgMs進行的免疫捕獲形式中沒有看到，因為在急性感染過程中，同時具有幾種感染，并在血清中具有針對多種不同感染性因子的IgMs，是非常罕見的。因此，這種免疫捕獲形式對于IgM檢測來說被保留了，但是對于IgG檢測來說被舍棄了，而代以夾心形式。后一種形式獲得的結(jié)果將下下面描述。實施例2:應用于抗HAV總Igs和IgMs柃測l的本發(fā)明的柃測l方法本發(fā)明的多元檢測方法在下面和圖2中進行描述。材料和方法:材料除了下面指出的例外之外，材料基本上與實施例1中使用的相同。1.分析系統(tǒng)參見實施例1的描述。2.固相使用了兩種不同組的Luminex超順磁性顆粒(LuminexCorp.，奧斯汀，德克薩斯，美國)-第1組以lOiig/mg微粒的量固定化的抗人類IgM小鼠單克隆抗體(Hytest，F(xiàn)inland);-第2組以2.5iig/mg微粒的量固定化的HAV抗原(ViralAg，Memphis,田納西，美國)。3.結(jié)合物1:HAV抗原(ViralAg，Memphis,田納西，美國)用生物素(Pierce,羅克福德，伊利諾伊州，美國)標記。4.結(jié)合物2:鏈親和素(縮寫為"Str印ta"，RocheMannheim,德國)與來自Cyanotech(夏威夷，美國)的藻紅蛋白(縮寫為"PE")相偶聯(lián)。5.稀釋劑用于珠子和用于結(jié)合物1和2的稀釋劑，用于步驟1的稀釋劑和洗滌溶液與實施例1中的相同。6.標準品WHO總抗HAV免疫球蛋白標準品(編碼97/646)與實施例1中使用的相同。7.樣品被分析的人類樣品是對抗HAV總免疫球蛋白和/或IgMs陽性或陰性的血漿或血清樣品。這些樣品源于由樣本包構成的內(nèi)樣品庫，以及來自于下列公司銷售的樣品ABOPharmaceuticals-7930ArjonsDrive,SuiteA，圣地亞哥，CA92126,美國，Teragenix-5440麗33rdAve騰，Suite108，F(xiàn)t丄auderdale，F(xiàn)L33309,美國，PromedDx-10Co騰rceWay,Norton,MA02766，美國，Z印tometrixCorporation-872MainSt.，布法羅，NY14202，美國，BBIDiagnostoc-375WestStreet,WestBridgewater，MA02379，美國，LifeSera-780ParkNorthBlvd，Suite100，Clarkston，GA30021，美國。被分析的人類樣品可以分組如下方案)-30份樣品對抗HAV總免疫球蛋白和/或IgMs陰性(雙陰性)-26份樣品對抗HAV總免疫球蛋白陽性，對抗HAVIgM陰性。-15份樣品對抗HAVIgM陽性，對總抗HAV免疫球蛋白陰性。方法備則i式錄在下面描述的分析測試中，實施了三種分析測試方案本發(fā)明的多元方案(即總Ig方案+IgM方案)和兩種單元方案(總Ig方案和IgM這三種方案除了加入所使用的免疫反應性超順磁性顆粒的步驟之外，是相同的。多元步驟使用了兩組珠子，每個單元方案使用單一一組珠子。在IgM單元方案和多元方案中使用的第l組顆粒(帶有抗IgM抗體)的量保持相同。同樣地，在總Ig單元方案和多元方案中使用的第2組顆粒(帶有HAV抗原)的量保持相同。A.用于檢測I總杭HAVIgs的單元方案歩驟1;1.將下列物質(zhì)相繼分配到每個反應池中251樣品或標準品+2251用于步驟1的稀釋劑，10ill第2組免疫反應性顆粒(HAV抗原)+2501用于步驟1的稀釋劑。2.均化后，將混合物在37t:溫育40分鐘。3.然后進行洗滌步驟同上實施例1第3點。歩驟2:4.將50ill結(jié)合物1溶液(生物素?；腍AV抗原，即"AgHAV生物素")分配到反應池中。5.均化后，將混合物在37t:溫育15分鐘。6.然后進行洗滌步驟同上第3點。歩驟3:7.將50iU結(jié)合物2(鏈親和素-藻紅蛋白，S卩"Str印ta-PE")分配到每個反應8.均化后，將混合物在37t:溫育15分鐘。9.然后進行洗滌步驟同上第3點。10.通過向每個反應池中加入35iU洗滌溶液，利用攪拌將每個反應池的顆粒重其比率大于1的樣品被宣布為陽性，比率小于1的樣品被宣布為陰性。*所有人類樣品的分析測試進行雙份(作為兩個平行測定)，使用的RFI結(jié)果來自于兩個平行測定的平均值。B.用于柃測I抗HAVIgMs的單元方案歩驟1:1.將下列物質(zhì)相繼分配到每個反應池中25ii1樣品或標準品+225y1用于步驟1的稀釋劑，10ill第1組免疫反應性顆粒(抗IgM抗體)+250y1用于步驟1的稀釋劑。IgM單元方案的所有其它步驟(2-13)與總Ig單元方案的步驟2-13嚴格相同。14.為了計算樣品的比率，對于HAVIgM來說，截止值是陰性樣品的RFIs的平均值+12個標準偏差。因此，樣品的比率計算如下樣品比率=樣品的RFI信號的平均值t截止值其比率大于1的樣品被宣布為陽性，比率小于1的樣品被宣布為陰性。*所有人類樣品的分析測試進行雙份(作為兩個平行測定)，使用的RFI結(jié)果來自于兩個平行測定的平均值。C.本發(fā)明的多元方案(同時柃測抗HAV總Igs和IgMs):歩驟1:1.將下列物質(zhì)相繼分配到每個反應池中25ii1樣品或標準品+225y1用于步驟1的稀釋劑，101免疫反應性顆粒(第1組和第2組顆粒的50:50混合物)+250yl用于步驟l的稀釋劑。多元方案的所有其它步驟(2-14)與總Ig和IgM單元方案的步驟2-14嚴格相同。淑導白媳果:1.校iH范圍1.1.通過單元夾心法分析的總抗HAVIg標準品范圍通過單元夾心法，使用標準品范圍(0到640mIU/ml)獲得的結(jié)果顯示，總Ig夾心格式比實施例1的IgG免疫捕獲格式靈敏得多(參見表2和圖4)。:通過IgG單元免疫捕獲格式(實施例1)和通過總Ig單元夾心格式(實施例2)分析測試的總抗HAVIg標準品范圍的比較18<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>1.2.通過多元方案分析測試的總抗HAVIg標準品范圍根據(jù)本發(fā)明的多元方案，通過夾心法，使用標準品范圍獲得的結(jié)果，報告在表3和圖5中。:通過單元夾心格式和通過多元格式分析測試的總Ig標準品范圍的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>注意到多元總Ig夾心格式的靈敏度，相對于通過單元夾心格式獲得的靈敏度來說，保持不變。2.樣品2.1.通過單元夾心和通過多元夾心分析樣品的總抗HAVIgs:使用人類樣品獲得的總抗HAVIgs的結(jié)果報告在表4中。^i:通過單元夾心格式和通過本發(fā)明的多元格式分析測試樣品的總抗HAVIgs的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>在總抗HAVIg夾心分析測試中，在陰性樣品(n=30)和陽性樣品(n=26)之間注意到了非常好的區(qū)分，不論它是通過單元格式還是通過本發(fā)明的多元格式進行的。因此，這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的多元方法中，總抗HAVIgs的檢測的靈敏度沒有降低。通過本發(fā)明的方法，事實上所有陽性樣品都被發(fā)現(xiàn)是陽性的，因此這也使獲得良好的臨床靈敏度成為可能。2.2.通過單元和多元免疫捕獲格式分析測試樣品的抗HAVIgM:使用人類樣品獲得的抗HAVIgM的結(jié)果報告在表5中。^:通過單元免疫捕獲格式和本發(fā)明的多元免疫捕獲格式分析測試樣品的抗HAVIgM的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>在通過免疫捕獲進行的抗HAVIgM分析測試中，在抗HAVIgM陰性樣品(n=30+26)和抗HAVIgM陽性樣品(n=15)之間注意到了非常好的區(qū)分，不論它是通過單元格式還是通過本發(fā)明的多元格式進行的。因此，這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的多元方法中，通過免疫捕獲檢測IgMs的靈敏度沒有被與夾心分析測試的組合所降低。通過本發(fā)明的方法，事實上所有陽性樣品都被發(fā)現(xiàn)是陽性的，因此這也使獲得良好的臨床靈敏度成為可能。實施例3:應用于杭HBc總Igs和IgMs檢測l的本發(fā)明的檢測l方法本發(fā)明的多元檢測方法也用于分析測試抗HBc總Igs和IgMs。這種方法顯示在圖3中并在下面描述。材料和方法:材料除了顆粒、生物素?；慕Y(jié)合物1和測試的樣品之外，使用的材料與實施例2中的等價。1.固相使用了兩種不同組的Luminex超順磁性顆粒(LuminexCorp.，Austin,德克薩斯，美國)。-第1組以10iig/mg微粒的量固定化的抗人類IgM山羊多克隆抗體(Bio-Rad，MarneslaCoquette);-第2組以10iig/mg微粒的量固定化的重組HB抗原(Virogen，Watertown，MA，美國)。2.結(jié)合物1:重組HBc抗原(Biokit，Barcelona,西班牙)用生物素(Pierce,Rockford，IL，美國)標記。3.樣品被分析的人類樣品是對總抗HBc免疫球蛋白和/或抗HBcIgM陽性或陰性的血漿或血清樣品。這些樣品來自于內(nèi)樣品庫，以及來自于下列公司銷售的樣品ABOPharmaceuticals-7930ArjonsDrive,SuiteA，圣地亞哥，CA92126,美國，PromedDx-10Co騰rceWay,Norton,MA02766，美國，Z印tometrixCorporation-872MainSt.，布法羅，NY14202，美國。被分析的人類樣品可以分組如下-10份樣品對總抗HBc免疫球蛋白和抗HBcIgM陰性(雙陰性)。-10份樣品對總抗HBc免疫球蛋白陽性，對抗HBcIgM陰性。-10份樣品對抗HBcIgM陽性，對總抗HBc免疫球蛋白陰性。^￡:分析測li式方案:使用的方案與上面在實施例2中描述的方案A、B和C相同，除了在步驟1中使用的樣品體積之外，該樣品是51+2501用于步驟1的稀釋劑。其它步驟相同，包括解釋步驟。對于總抗HBcIgs和抗HBcIgMs分析測試來說，截止值是陰性樣品的RFIs的平均值+12個標準偏差。因此，樣品相對于截止值的比率計算如下樣品比率=樣品的RFI信號的平均值t截止值其比率大于1的樣品被宣布為陽性，比率小于1的樣品被宣布為陰性。*所有人類樣品的分析測試進行雙份(作為兩個平行測定)，使用的RFI結(jié)果來自于兩個平行測定的平均值。淑導白媳果::通過單元夾心格式和通過本發(fā)明的多元格式分析測試的樣品的總抗HBcIgs的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>在總抗HBcIg夾心分析測試中，在陰性樣品(n=10)和陽性樣品(n=20)之間注意到了非常好的區(qū)分，不論它是通過單元格式還是通過本發(fā)明的多元格式進行的。因此，這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的多元方法中，總抗HBcIgs的檢測靈敏度沒有降低。通過本發(fā)明的方法，事實上所有陽性樣品都被發(fā)現(xiàn)是陽性的，因此這也使獲得良好的臨床靈敏度成為可能。:通過單元免疫捕獲格式和通過本發(fā)明的多元免疫捕獲格式分析測試的樣品的抗HBcIgM的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>在抗HBcIgM免疫捕獲分析測試中，在抗HBcIgM陰性樣品(n=10+10)和抗HBcIgM陽性樣品(n=10)之間注意到了非常好的區(qū)分，不論它是通過單元格式還是通過本發(fā)明的多元格式進行的。因此，這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的多元方法中，通過免疫捕獲檢測IgMs的靈敏度沒有被與夾心分析測試的組合所降低。通過本發(fā)明的方法，事實上所有陽性樣品都被發(fā)現(xiàn)是陽性的，因此這也使獲得良好的臨床靈敏度成為可能。實施例4:應用于杭梅毒總Igs和IgMs的檢測l的本發(fā)明的檢測l方法本發(fā)明的多元檢測方法也用于分析測試總的抗梅毒密螺旋體Igs和抗梅毒密螺旋體IgMs，梅毒密螺旋體是造成梅毒的感染性細菌因子。該方法顯示在圖6中，并描述如下。材料和方法:材料除了顆粒、生物素?；慕Y(jié)合物1和測試樣品之外，使用的材料與實施例2和3中的相當。1.固相使用了兩種不同組的Luminex超順磁性顆粒(LuminexCorp.，Austin,德克薩斯，美國)。-第1組以2.5iig/mg微粒的量固定化的抗人類IgM小鼠單克隆抗體(Hytest，F(xiàn)inland);-第2組分別以5iig/mg和1.25yg/mg微粒的量固定化的梅毒密螺旋體的重組抗原TpN17禾口TpN47(NewMarketLaboratoriesLtd,Kentford，英格蘭)。2.結(jié)合物1:重組抗原TpN17和TpN47(NewMarketLaboratoriesLtd,Kentford，英格蘭)用生物素(Pierce,Rockford，IL，美國)標記。3.樣品被分析的人類樣品是對總抗梅毒密螺旋體免疫球蛋白和/或抗梅毒密螺旋體IgMs陽性或陰性的血漿或血清樣品。這些樣品來自于內(nèi)樣品庫EtablissementFra罕isduSang(EFS)[法國血庫]-83潔desAlpes，94150Rungis，法國，或來自于下列公司銷售的樣品PromedDx-10Co騰rceWay,Norton,MA02766，美國，SeraCareLifeScience-375WestStreet,WestBridgewater，廳2379，美國。被分析的人類樣品可以分組如下-35份樣品對總抗梅毒密螺旋體免疫球蛋白和/或抗梅毒密螺旋體IgMs陰性(雙陰性)。-3份樣品對總抗梅毒密螺旋體免疫球蛋白陽性，對抗梅毒密螺旋體IgM陰性(樣品1、2、3)。-4份樣品對抗梅毒密螺旋體IgM陽性，對總抗梅毒密螺旋體免疫球蛋白陰性(樣品4、5、6、7)。^￡:分析測試方案:使用的方案與上面描述的實施例2中的方案A、B和C相同，例外之處為步驟1中的體積，是100ill樣品和100ill珠子，以及在步驟2中，是100ill結(jié)合物1(生物素?；拿范久苈菪w抗原)溶液。其它步驟相同，包括解釋步驟。魏,嫌:為了分析測試總抗梅毒密螺旋體Igs和抗梅毒密螺旋體IgMs，截止值是陰性樣品的RFIs的平均值除以O.3。因此，樣品相對于截止值的比率計算如下樣品比率=樣品的RFI信號的平均值t截止值其比率大于或等于1的樣品被宣布為陽性，比率小于1的樣品被宣布為陰性。*所有人類樣品的分析測試進行三份，使用的RFI結(jié)果來自于三個平行測定的平均值。淑導白媳果:^:通過單元夾心格式和通過本發(fā)明的多元格式分析測試的樣品的總抗梅毒密螺旋體Igs的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>在總抗梅毒密螺旋體Ig夾心分析測試中，在陰性樣品(n=35)和陽性樣品(n=3)之間注意到了非常好的區(qū)分，不論它是通過單元格式還是通過本發(fā)明的多元格式進行的。因此，這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的多元方法中，總抗梅毒密螺旋體Igs的檢測靈敏度沒有降低。通過本發(fā)明的方法，事實上所有陽性樣品都被發(fā)現(xiàn)是陽性的，因此這也使獲得良好的臨床靈敏度成為可能。:通過單元免疫捕獲格式和通過本發(fā)明的多元免疫捕獲格式分析測試的樣品的抗梅毒密螺旋體IgM的比較<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>在通過免疫捕獲進行的抗梅毒密螺旋體IgM分析測試中，在抗梅毒密螺旋體IgM陰性樣品(n=35+3)和抗梅毒密螺旋體IgM陽性樣品(n=3)之間注意到了非常好的區(qū)分，不論它是通過單元格式還是通過本發(fā)明的多元格式進行的。因此，這些結(jié)果顯示，在本發(fā)明的多元方法中，通過免疫捕獲檢測IgMs的靈敏度沒有被與夾心分析測試的組合所降低。通過本發(fā)明的方法，事實上所有陽性樣品都被發(fā)現(xiàn)是陽性的，因此這也使獲得良好的臨床靈敏度成為可能?？傊?，在實施例2、3和4中，使用本發(fā)明的組合了通過免疫捕獲檢測IgM和通過夾心檢測總Ig的多元方法獲得的結(jié)果，清楚地顯示，本發(fā)明的方法允許靈敏地檢測和區(qū)分針對同樣微生物的總Ig類型抗體或IgGs與IgMs。本領域技術人員將可以容易地從中得出結(jié)論，本發(fā)明的IgGs和IgMs多元檢測方法，事實上是一種廣范圍的方法，可以適用于許多種從診斷的觀點來看檢測其總Igs和IgMs是重要的微生物。此外，本發(fā)明的方法可以通過使用自動化裝置，例如來自Bio-Rad的BioPlex2200，容易地進行自動化，這使得分析測試方案可以在單一容器中同時快速地進行，并可以在單一步驟中讀取信號。權利要求用于微生物感染的體外診斷性檢測的方法，包括同時檢測生物樣品中存在的、針對所述微生物的免疫球蛋白G或總免疫球蛋白以及免疫球蛋白M，該方法包括下列步驟a)將所述生物樣品在存在顆粒的情況下放置在單一分析容器中，每個顆粒具有至少一種特異性可檢測的物理參數(shù)，并屬于至少兩個不同的組，一組帶有抗IgM捕獲抗體，另一組帶有源于所述微生物的捕獲抗原，b)在允許免疫復合物在每組顆粒上形成的條件下，將混合物溫育，c)除去沒有結(jié)合到顆粒上的免疫球蛋白，d)將步驟b)的混合物與至少一種標記的結(jié)合物溫育，所述至少一種結(jié)合物只含有源于所述微生物的檢測抗原，e)除去沒有結(jié)合到步驟b)的免疫復合物上的檢測抗原，f)利用能夠區(qū)分上面提到的兩組顆粒的檢測器，同時檢測每個顆粒上的步驟d)的免疫復合物，由此顯示出針對所述微生物的免疫球蛋白G或總免疫球蛋白和/或免疫球蛋白M的存在或不存在。2.權利要求1的方法，其特征在于源于微生物的抗原選自所述微生物的裂解物，已經(jīng)被半純化或純化的天然抗原之一，重組蛋白，其片段以及合成的肽。3.權利要求1或2的方法，其特征在于所述顆粒的組彼此之間利用可以通過適合的檢測器檢測的熒光染料來區(qū)分。4.權利要求1至3任一項的方法，其中適合的檢測器是流式細胞儀。5.權利要求1至4任一項的方法，其中檢測抗原帶有生物素，所述生物素通過加入標記的親和素或標記的鏈親和素來顯示。6.權利要求1至5任一項的方法，其中生物樣品是血漿或血清。7.權利要求1至6任一項的方法，其中生物樣品是人類來源的。8.權利要求1至7任一項的方法，其特征在于所述微生物選自病毒、細菌和單細胞寄生生物。9.權利要求8的方法，其特征在于所述微生物選自人類肝炎病毒。10.權利要求9的方法，其特征在于所述微生物選自人類甲型肝炎病毒(HAV)和人類乙型肝炎病毒(HBV)。11.權利要求10的方法，其特征在于所述微生物是人類甲型肝炎病毒(HAV)，獲得的總抗HAV免疫球蛋白的檢測下限為大約20mIU/ml。12.權利要求8的方法，其特征在于所述微生物是梅毒密螺旋體(Tr印onemapallidum)。13.權利要求1至12任一項的方法，其中顆粒是超順磁性顆粒。14.用于實施權利要求1至13任一項的檢測方法的試劑組，含有顆粒，每個顆粒具有至少一種特異性可檢測的物理參數(shù)，并屬于至少兩個不同的組，一組帶有抗IgM捕獲抗體，另一組帶有源于待檢測微生物的捕獲抗原。15.權利要求14的試劑組，其特征在于所述微生物選自病毒、細菌和單細胞寄生生物。16.權利要求15的試劑組，其特征在于所述微生物選自人類肝炎病毒。17.權利要求16的試劑組，其特征在于所述微生物選自人類甲型肝炎病毒(HAV)和人類乙型肝炎病毒(HBV)。18.權利要求15的試劑組，其特征在于所述微生物是梅毒密螺旋體(Tr印onemapallidum)。全文摘要本發(fā)明涉及用于體外診斷性檢測微生物感染的方法，包括將生物樣品在存在顆粒的情況下放置在單一分析容器中，其中每個顆粒帶有至少一種特異性的、可檢測的物理參數(shù)，并屬于至少兩個不同的組，一組帶有抗IgM捕獲抗體，另一組帶有源于所述微生物的捕獲抗原。文檔編號G01N33/543GK101711361SQ200880019283公開日2010年5月19日申請日期2008年6月6日優(yōu)先權日2007年6月8日發(fā)明者克里斯汀·沙彭蒂耶,安帕羅·桑阮,斯特凡·加德勒,納丁·蘭伯特申請人:博瑞巴斯德公司